取代的α－羟基酸天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其用途
阅读：472发布：2021-01-29
专利汇可以提供取代的α－羟基酸天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新颖的取代的α－羟基酸,由通式(I)所代表,其中R1－R5、X和Z是如本文所定义的。本发明还涉及式(I)化合物是有 力 的天冬 氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶与编程性细胞死亡的 抑制剂 这一发现。因此,本发明的抑制剂能够延缓或阻滞各种临床 疾病 中的细胞死亡,其中发生细胞、组织或整个器官的损失。，下面是取代的α－羟基酸天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其用途专利的具体信息内容。
1、式I化合物： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中 R1是可选被取代的烷基或氢； R2是氢或可选被取代的烷基； R3和R4独立地是氢、可选被取代的芳基、可选被取代的杂环基、可选被 取代的碳环、可选被取代的杂芳基、可选被取代的烷基、可选被取代的 烯基或可选被取代的炔基； R5是可选被取代的烷基、可选被取代的碳环、可选被取代的杂环基、可 选被取代的芳基或可选被取代的杂芳基； Z是O、S、NR8或(CR9R10)n，其中R8、R9和R10独立地是氢、烷基或环烷基， n是0、1、2或3； X是1-2个氨基酸的肽或一条键。
2、权利要求1的化合物，其中R3和R4独立地是氢、芳基、杂环基、 杂芳基、C1-10烷基、烯基、炔基、或被一个或多个羟基、卤素、羧基、氨 基、酰胺、酯、胍基、巯基、烷基巯基、芳基、杂环基或杂芳基取代的 C1-10烷基；R5是可选被取代的烷基、C4-C7环烷基、饱和或不饱和的杂环基、 芳基或杂芳基。
3、根据权利要求1的化合物，其中R1是H、Me、Et或乙酰氧基甲基。
4、根据权利要求1的化合物，其中R2是氢、氟甲基、酰氧基甲基、 芳酰氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基或氨基甲基。
5、根据权利要求1的化合物，其中X是一条键。
6、根据权利要求1的化合物，其中Z是O、S、NH或CH2。
7、根据权利要求1的化合物，其中R3是氢，R4是直链或支链C1-6烷 基、环烷基、芳基或杂芳基。
8、根据权利要求1的化合物，其中R3是氢，R4是直链或支链C1-6烷 基，它可选地被羟基、卤素、羧基、氨基、酰胺、酯、胍基、巯基、烷 基巯基、芳基、杂环基或杂芳基取代。
9、根据权利要求1的化合物，其中R5是可选被取代的苄基。
10、根据权利要求1的化合物，其中R5是可选被取代的苯基、萘基 或杂芳基。
11、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式II结构： 或其药学上可接受的盐，其中 R6和R7独立地是氢、烷基、可选被取代的烷基、C4-C7环烷基、杂环基、 芳基、杂芳基，或者R6和R7联合氮一起构成杂环。
12、根据权利要求11的化合物，其中R2是氢、氟甲基、酰氧基甲基、 芳酰氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基或氨基甲基。
13、根据权利要求11的化合物，其中R1是H、Me、Et或乙酰氧基甲 基。
14、根据权利要求11的化合物，其中R3是氢，R4是直链或支链C1-6 烷基、环烷基、芳基或杂芳基。
15、根据权利要求11的化合物，其中R3是氢，R4是直链或支链C1-6 烷基，它可选地被羟基、卤素、羧基、氨基、酰胺、酯、胍基、巯基、 烷基巯基、芳基、杂环基或杂芳基取代。
16、根据权利要求11的化合物，其中R6是氢，R7是可选被取代的苯 基、萘基、杂芳基或苄基。
17、根据权利要求11的化合物，其中R6是氢，R7是可选被取代的烷 基。
18、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物选自下组： 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，5-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，4-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸 酯，和 Z-缬氨酸2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基酯。
19、根据权利要求1的化合物，其中所述化合物选自下组： 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3，4-二氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-苯氧基苯基)氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)-2-丙烯基N-苯基氨基甲酸酯， 2-(4-咪唑基)-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 3-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(2-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(4-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-环己基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 2-氯-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯，和 2，2，2-三氟-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯。
20、药物组合物，包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
21、抑制细胞或组织的细胞死亡的方法，包含使所述细胞或组织与 有效量的权利要求1化合物接触。
22、治疗或改善动物中枢或外周神经系统、视网膜神经元、心肌或 免疫系统细胞中的细胞死亡的方法，包含将有效量的权利要求1化合物 对需要接受这种治疗或改善的动物给药。
23、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡位于中枢或外周神经系 统，是由下列之一引起的：
(a)缺血性与兴奋毒性疾病，选自由中风引起的局灶性缺血和由心搏 停止引起的普遍性缺血；
(b)创伤性损伤；
(c)病毒感染；
(d)辐射诱导的神经细胞死亡；
(e)神经变性性障碍，选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、蛋白感染 病毒病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和脊髓延髓萎缩；
(f)脊髓损伤；或
(g)急性细菌性脑膜炎。
24、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡位于中枢或外周神经系 统，是由亨廷顿氏病基因的三核苷酸重复扩展引起的。
25、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡是由亨廷顿氏病引起的。
26、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡位于心肌组织，是由心 肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌病或心脏的病毒感染引起的。
27、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡位于视网膜神经元，是 由眼内压力增加、与衰老有关的黄斑变性或色素性视网膜炎引起的。
28、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡位于免疫系统，是由免 疫缺陷障碍引起的，选自获得性免疫缺陷综合征、严重联合免疫缺陷综 合征和辐射诱导免疫抑制。
29、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡是由自体免疫障碍引起 的，选自红斑狼疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。
30、权利要求22的方法，其中所述细胞死亡是由I型糖尿病引起的。
31、治疗或预防动物多囊性肾疾病、肾淀粉样变性、急性肾衰、环 孢菌素A诱导鼠管状上皮细胞死亡、HIV诱导肾病或贫血/红细胞生成的 方法，包含将有效量的权利要求1化合物对需要接受这种治疗或预防的 动物给药。
32、保护哺乳动物器官或组织不由正常血液供应缺乏引起细胞死亡 的方法，包含使所述器官或组织与有效量的权利要求1化合物接触。
33、权利要求32的方法，其中所述器官或组织在移植到哺乳动物体 内之前存在于贮存培养基中。
34、权利要求32的方法，其中所述组织是胚胎黑质组织。
35、权利要求32的方法，其中所述接触包含所述化合物输注给器官 或组织，或者所述器官或组织浸泡在包含所述化合物的贮存培养基中。
36、减少或预防供体器官或组织在被移植到宿主内后由宿主免疫细 胞的作用引起的细胞死亡的方法，包含在必要时将有效量的式I化合物 对所述宿主给药。
37、减少或预防用于体外受精程序的哺乳动物精子或卵子死亡的方 法，包含使所述精子或卵子与有效量的权利要求1化合物接触。
38、延长哺乳动物或酵母细胞系的寿命的方法，包含使所述细胞系 与权利要求1化合物接触。
39、权利要求38的方法，其中所述接触包含在细胞生长培养基中包 括所述化合物。
40、治疗或改善哺乳动物脱发或毛发早白的方法，包含在必要时使 哺乳动物毛发或毛囊与权利要求1化合物接触。
41、权利要求40的方法，其中所治疗的是脱发，所述脱发是由男性 秃发、辐射、化学疗法或情绪紧张引起的。
42、治疗或改善哺乳动物由暴露于高水平辐射、热或化学品引起的 皮肤损害的方法，包含在必要时对哺乳动物皮肤施用权利要求1化合物。
43、权利要求42的方法，其中所述化合物是作为软膏剂的一部分而 用药的。
44、权利要求42的方法，其中所述皮肤损害是由急性过度曝晒引起 的，其中所述治疗减少皮肤起疱和脱皮。
45、治疗或改善动物脓毒症的方法，包含在必要时将有效量的权利 要求1化合物对该动物给药。
46、治疗或改善动物肝炎的方法，包含在必要时将有效量的权利要 求1化合物对该动物给药。
47、治疗或改善动物1型遗传性酪氨酸血症的方法，包含在必要时 将有效量的权利要求1化合物对该动物给药。
48、治疗或改善动物慢性酒精摄入诱导的动物颊黏膜细胞死亡的方 法，包含在必要时将有效量的权利要求1化合物对该动物给药。
49、治疗或改善植物或花卉细胞死亡的方法，包含在必要时将有效 量的权利要求1化合物对该植物或花卉给药。
50、治疗或改善辐射或紫外照射诱导的动物细胞死亡的方法，包含 在必要时将有效量的权利要求1化合物对该动物给药。
51、治疗或改善脊髓发育不良综合征(MDS)中的骨髓细胞编程性细胞 死亡的方法，包含在必要时将有效量的权利要求1化合物对动物给药。
52、治疗或改善急性胰腺炎中的编程性细胞死亡的方法，包含在必 要时将有效量的权利要求1化合物对动物给药。
53、治疗或预防牛皮癣或炎性肠疾病中的炎性反应的方法，包含在 必要时将有效量的权利要求1化合物对动物给药。
54、治疗或改善灼伤后的器官编程性细胞死亡的方法，包含在必要 时将有效量的权利要求1化合物对动物给药。
55、治疗或改善肠缺血-再灌注后的小肠组织损伤的方法，包含在必 要时将有效量的权利要求1化合物对动物给药。
56、治疗、改善或预防由癌症化学疗法或放射疗法导致的动物口腔 黏膜炎、胃肠黏膜炎、膀胱黏膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞 死亡或脱发的方法，包含在必要时将有效量的权利要求1化合物对该动 物给药。
57、权利要求56的方法，其中所述化合物是局部或口服给药的。
58、权利要求57的方法，其中将所述化合物配制成口腔洗液的一部 分，用于治疗、改善或预防口腔黏膜炎。
59、权利要求57的方法，其中将所述化合物配制成缓释颊用锭剂的 一部分。
60、权利要求57的方法，其中将所述化合物配制成栓剂的一部分。
61、权利要求57的方法，其中将所述化合物配制成凝胶剂的一部分。
62、权利要求56的方法，其中所述化合物是通过膀胱导管给药的， 用于治疗、改善或预防膀胱黏膜炎。
63、权利要求56的方法，其中所述化合物是作为灌肠剂的一部分给 药的，用于治疗、改善或预防直肠炎。
64、权利要求56的方法，其中将所述化合物配制成能够覆盖胃肠表 面的口服制剂，用于治疗、改善或预防胃肠黏膜炎。
65、权利要求64的方法，其中所述胃肠黏膜炎是食管黏膜炎、胃黏 膜炎或肠黏膜炎。
66、权利要求56的方法，其中所述化合物是通过i.v.注射给药的， 用于治疗、改善或预防骨髓细胞死亡。
67、权利要求56的方法，其中所述化合物是作为药物组合物的一部 分给药的，该组合物还包含药学上可接受的载体。
68、权利要求56的方法，其中所述化合物是在所述动物癌症的化学 疗法或放射疗法之后给药的。
69、权利要求56的方法，其中所述化合物是在所述动物癌症的化学 疗法或放射疗法期间给药的。
70、权利要求56的方法，其中所述化合物是在所述动物癌症的化学 疗法或放射疗法之前给药的。
发明领域
本发明属于医药化学领域。确切地说，本发明涉及取代的α-羟基酸， 它们是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的抑制剂。本发明还 涉及这些取代的α-羟基酸的用途，用于减少或治疗编程性细胞死亡和/ 或减少白介素1-β产生。
背景技术
生物体排除所不需要的细胞的过程已知为调节性细胞死亡、细胞程 序死亡或编程性细胞死亡。这类细胞死亡是动物发育以及组织体内稳态 和衰老中的一个正常方面(Glucksmann，A.，Biol.Rev.Cambridge Philos.Soc.26：59-86(1951)；Glucksmann，A.，Archives de Biologie (生物学文献)76：419-437(1965)；Ellis等，Dev.(发育)112：591-603 (1991)；Vaux等，Cell(细胞)76：777-779(1994))。编程性细胞死 亡调节细胞数量，有利于形态发生，除去有害或异常的细胞，排除已经 完成其功能的细胞。另外，编程性细胞死亡响应于各种生理应激反应引 起的，例如低氧或缺血(PCT申请公报WO 96/20721)。
有大量形态改变为经历调节性细胞死亡的细胞所共有，包括血浆与 核膜的水泡状生长、细胞皱缩(核质与胞质的缩合)、细胞器的再定位 与压缩、染色质缩合和编程性细胞死亡的细胞体的产生(含有细胞内材 料的膜限内粒子)(Orrenius，S.，J.Internal Medicine(内科学杂 志)237：529-536(1995))。
编程性细胞死亡是通过细胞自杀的内源性机理而被实现的(Wyllie， A.H.，Cell Death in Biology and Pathology(生物学与病理学中的 细胞死亡)，Bowen和Lockshin编，Chapman and Hall(1981)，pp.9-34)。 作为内部或外部信号的结果，细胞激活它的内部编码的自杀程序。自杀 程序是通过小心调节的遗传程序活化而被执行的(Wylie等，Int.Rev. Cyt.68：251(1980)；Ellis等，Ann.Rev.Cell Bio.(细胞生物学 年评)7：663(1991))。编程性细胞死亡的细胞和细胞体在溶解之前通 常被相邻细胞或巨噬细胞所识别和清除。由于这种清除机理，即使清除 大量细胞也不诱发炎症(Orrenius，S.，J Internal Medicine(内科学 杂志)237：529-536(1995))。
哺乳动物的白介素-1β(IL-1β)在各种病理过程中扮演重要角色，包 括慢性与急性炎症和自体免疫疾病(Oppenheim，J.H.等，Immunology Today(今日免疫学)，7，45-56(1986))。IL-1β是作为与细胞缔合的 前体多肽(IL-1β原)而被合成的，它不能结合IL-1受体，是生物学上 无活性的(Mosley等，J Biol.Chem.(生物化学杂志)262：2941-2944 (1987))。通过抑制前体IL-1β向成熟IL-1β的转化，能够抑制白介素-1 的活性。白介素-1β转化酶(ICE)是负责白介素-1β(IL-1β)活化的蛋白酶 (Thornberry，N.A.等，Nature(自然)356：768(1992)；Yuan，J. 等，Cell(细胞)75：641(1993))。ICE是底物特异性半胱氨酸蛋白 酶，它裂解无活性白介素-1原，产生成熟IL-1。编码ICE和CPP32的基 因是哺乳动物ICE/Ced-3家族基因的成员，该家族目前包括至少十二种 成员：ICE、CPP32/Yama/Apopain、mICE2、ICE4、ICH1、TX/ICH-2、MCH2、 MCH3、MCH4、FLICE/MACH/MCH5、ICE-LAP6和ICErelIII。该家族半胱氨酸 蛋白酶的活性部位(半胱氨酸残基)是ICE介导的编程性细胞死亡所必 需的，其蛋白分解活性似乎是介导细胞死亡的关键(Miura等，Cell(细 胞)75：653-660(1993))。该基因家族最近已经被命名为天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶(Alnernri，E.S.等，Cell(细胞)，87，171(1996)， 和Thornberry，N.A.等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272， 17907-17911(1997))，根据其已知功能分为三组。表1总结了这些已 知的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。
表1 酶* 第I组：炎症介质 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(ICE) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-4(ICErel-II，TX，ICH-2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-5(ICErel-III，TY) 第II组：编程性细胞死亡效应物 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2(ICH-1，mNEDD2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(apopain，CPP-32，YAMA) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7(Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1) 第III组：编程性细胞死亡激活剂 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-6(Mch2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(MACH，FLICE，Mch5) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(ICE-LAP6，Mch6) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10
IL-1还是参与介导广泛生物学反应的细胞因子，包括炎症、脓毒性 休克、伤口愈合、血细胞生成和某些白血病的发展(Dinarello，C.A.， Blood(血液)77：1627-1652(1991)；diGiovine等，Immunology Today (今日免疫学)11：13(1990))。
根据天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的肽底物结构，已经制备了很 多有力的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。不过，据报道与它们 的体外效力相反，在编程性细胞死亡的全细胞模型中很少有功效良好的 抑制剂(IC50＜1μM)(Thornberry，N.A.Chem.Biol.(化学与生物学)5： R97-103(1998))。因此存在对细胞死亡抑制剂的需求，它们在编程性 细胞死亡的全细胞模型中是有效的，在编程性细胞死亡的动物模型中是 活性的。这些抑制剂因而能够作为治疗剂，用于治疗调节性细胞死亡和 IL-1的细胞因子活性在其中扮演角色的疾病状态。
WO 93/05071公开了下式的肽ICE抑制剂：
Z-Q2-Asp-Q1 其中Z是N-末端保护基团；Q2是0至4个氨基酸，以便序列Q2-Asp相当 于序列Ala-Tyr-Val-His-Asp的至少一部分；Q1包含负电性离去基团。
WO 96/03982公开了下式的天冬氨酸类似物是ICE抑制剂： 其中R2是H或烷基；R3是离去基团，例如卤素；R1是杂芳基-CO或氨基酸 残基。
美国专利5,585,357公开了下式的肽酮是ICE抑制剂： 其中n是0-2；每个AA独立地是L-缬氨酸或L-丙氨酸；R1选自由N-苄 氧羰基等组成的组；R8、R9、R10各自独立地是氢、低级烷基等。
Mjalli等(Bioorg.Med Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学快 报)，3，2689-2692，1993)报道了肽苯基烷基酮的制备，它们是可逆性 ICE抑制剂，例如：
Thornberry等(Biochemistry(生物化学)，33，3934-3940，1994) 报道了肽酰氧基甲基酮对ICE的不可逆灭活作用： 其中Ar是COPh-2，6-(CF3)2、COPh-2，6-(CH3)2、Ph-F5等。
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)37，563-564，1994)报 道了P1天冬氨酸盐类肽α-((2，6-二氯苯甲酰基)氧基)甲基酮的制备，它 们是有力的时间依赖性ICE抑制剂，例如：
Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，4，1965-1968，1994)报道了活化酮的制备，它们是有力的可逆 性ICE抑制剂： 其中X是NH(CH2)2、OCO(CH2)2、S(CH2)3等。
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)37，3863-3866，1994) 报道了α-((1-苯基-3-(三氟甲基)-吡唑-5-基)氧基)甲基酮的制备，它们 是不可逆性ICE抑制剂，例如： Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，5，1405-1408，1995)报道了N-酰基-天冬氨酸酮对ICE的抑制 作用： 其中XR2是NH(CH2)2Ph、OCO(CH2)2环己基等。
Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，5，1409-1414，1995)报道了N-酰基-天冬氨酰芳氧基甲基酮对 ICE的抑制作用：
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)38，220-222，1995)报 道了天冬氨酰α-((二苯氧膦基)氧基)甲基酮的制备，它们是不可逆性ICE 抑制剂，例如：
Graybill等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化 学快报)，7，41-46，1997)报道了α-((特窗酰基(tetronoyl))氧基)- 与α-((四氨酰基(tetramoyl))氧基)甲基酮的制备，它们是ICE抑制剂， 例如：
Semple等(Bioorg Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学快 报)，8，959-964，1998)报道了拟肽氨基亚甲基酮的制备，它们是ICE 抑制剂，例如：
Okamoto等(Chem.Pharm.Bull.(化学与药学通报)47，11-21， 1999)报道了肽类ICE抑制剂的制备，使P1羧基转化为酰胺，例如：
EP 618223专利申请公开了作为抗炎剂的ICE抑制剂：
R-A1-A2-X-A3 其中R是保护基团或可选被取代的苄氧基；A1是α-羟基或α-氨基酸残基 或下式原子团： 其中A环可选地被羟基或C1-4烷氧基取代，Ra是CO或CS；A2是α-羟基或 α-氨基酸残基，或者A1和A2一起构成假二肽或拟二肽残基；X是从Asp 衍生的残基；A3是-CH2-X1-CO-Y1、-CH2-O-Y2、-CH2-S-Y3，其中X1是O或S； Y1、Y2或Y3是脂环族残基和可选被取代的芳基。
WO 99/18781公开了下式的二肽： 其中R1是N-末端保护基团；AA是任意天然或非天然的α-氨基酸、β-氨基 酸、α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4是负 电性离去基团；R3是烷基或H，其条件是AA不是His、Tyr、Pro或Phe。 这些二肽在细胞类系统中惊人地是编程性细胞死亡的有力的天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。这些化合物有体内全身活性，在小鼠肝脏 编程性细胞死亡模型中是抗Fas诱导致死性的有力抑制剂，在大鼠缺血 性中风模型中具有强健的神经保护作用。
WO 99/47154公开了下式的二肽： 其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸的残基；R2 是可选被取代的烷基或H。
WO 00/01666公开了C-末端修饰的草氨酰二肽是ICE/ced-3家族半 胱氨酸蛋白酶的抑制剂： 其中A是天然或非天然氨基酸；B是氢原子、氘原子、烷基、环烷基等； R1是烷基、环烷基等；R2是氢、低级烷基等。
WO 00/23421公开了ICE/ced-3家族半胱氨酸蛋白酶的(取代的)酰基 二肽抑制剂： 其中A是天然或非天然氨基酸；B是氢原子、氘原子、烷基、环烷基等； X是CH2、C＝O、O、S、NH、C＝ONH或CH2OC＝ONH；n是0、1或2；q是1 或2；R1是可选被取代的芳基和杂芳基；R2是氢、烷基等；R3是氢、烷基 等。
WO 00/32620公开了γ-酮酸四肽是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3 的抑制剂： 其中R是H和COR1；R1是氢、烷氧基等；R2是氢、CH3等；R3是氢、CH3等； R4是氢、CH3等；R5是C1-6烷基、芳基C1-6烷基等；X2、X3和X4独立地是H， 或者X2与R2、X3与R3或X4与R4可以一起构成饱和的单环。
发明概述
本发明涉及式I化合物： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中 R1是可选被取代的烷基或氢； R2是氢或可选被取代的烷基； R3和R4独立地是氢、可选被取代的芳基、可选被取代的杂环基、可选被 取代的碳环、可选被取代的杂芳基、可选被取代的烷基、可选被取代的 烯基或可选被取代的炔基； R5是可选被取代的烷基、可选被取代的碳环、可选被取代的杂环基、可 选被取代的芳基或可选被取代的杂芳基； Z是O、S、NR8或(CR9R10)n，其中R8、R9和R10独立地是氢、烷基或环烷基， n是0、1、2或3； X是1-2个氨基酸的肽或一条键。
本发明提供药物组合物，包含减少动物编程性细胞死亡有效量的式I 化合物。
本发明涉及由式I代表的化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 的抑制剂这一发现。本发明还涉及本发明化合物的用途，用于减少、预 防或治疗以编程性细胞死亡为原因或结果的疾病。本发明用途的实例包 括治疗或改善动物中枢或外周神经系统、视网膜神经元、心肌或免疫系 统细胞的细胞死亡；治疗或预防动物多囊性肾疾病、肾淀粉样变性、急 性肾衰、环孢菌素A诱导鼠管状上皮细胞死亡、HIV诱导肾病或贫血/红 细胞生成；保护哺乳动物器官或组织不由正常血液供应缺乏引起细胞死 亡；减少或预防供体器官或组织在被移植到宿主内后由宿主免疫细胞的 作用引起的细胞死亡；减少或预防用于体外受精程序的哺乳动物精子或 卵子死亡；延长哺乳动物或酵母细胞系的寿命；治疗或改善哺乳动物脱 发或毛发早白；治疗或改善哺乳动物由暴露于高水平辐射、热或化学品 引起的皮肤损害；治疗或改善动物脓毒症；治疗或改善动物肝炎；治疗 或改善动物1型遗传性酪氨酸血症；治疗或改善慢性酒精摄入诱导的动 物颊黏膜细胞死亡；治疗或改善植物或花卉细胞死亡；治疗或改善辐射 或紫外照射诱导的动物细胞死亡；治疗或改善脊髓发育不良综合征(MDS) 中的骨髓细胞编程性细胞死亡；治疗或改善急性胰腺炎中的编程性细胞 死亡；治疗或预防牛皮癣或炎性肠疾病中的炎性反应；治疗或改善灼伤 后的器官编程性细胞死亡；治疗或改善肠缺血-再灌注后的小肠组织损 伤；和治疗、改善或预防由癌症化学疗法或放射疗法导致的动物口腔黏 膜炎、胃肠黏膜炎、膀胱黏膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死 亡或脱发。
发明的详细说明
本发明的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶与编程性细胞死亡的抑制 剂是通式I化合物： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中 R1是可选被取代的烷基或氢； R2是氢或可选被取代的烷基； R3和R4独立地是氢、可选被取代的芳基、可选被取代的杂环基、可选被 取代的碳环、可选被取代的杂芳基、可选被取代的烷基、可选被取代的 烯基或可选被取代的炔基； R5是可选被取代的烷基、可选被取代的碳环、可选被取代的杂环基、可 选被取代的芳基或可选被取代的杂芳基； Z是O、S、NR8或(CR9R10)n，其中R8、R9和R10独立地是氢、烷基或环烷基， n是0、1、2或3； X是1-2个氨基酸的肽或一条键。若X是一个氨基酸，则它可以是普通 20种氨基酸的任意一种，例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、 Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Asn、Glu、Asn、Lys、Arg和His。 若X是肽，则它可以是Asp-Glu、Asp-Ala、Asp-Phe、Val-Glu、Leu-Glu、 Thr-Glu、Ile-Glu、Tyr-Glu和Trp-Glu。
关于R1，优选的烷基是C1-6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、 异丁基、戊基和己基；取代的C1-6烷基，例如CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM)。
优选的R2是被负电性基团或离去基团取代的烷基，包括氟甲基、氯 甲基、烷氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基、烷硫基甲基、芳硫基 甲基、氨基甲基、酰氧基甲基和芳酰氧基甲基。可以出现在R2烷基上的 其他可选取代基的实例非限制性地包括可选在2、4与5位被低级烷基取 代的3-吡唑氧基；3-(1-苯基-3-三氟甲基)吡唑氧基；2，6-二(三氟甲基) 苯甲酰氧基；2，6-二甲基苯甲酰氧基；五氟苯氧基；2，6-二氯苯甲酰氧 基；2-(3-(2-咪唑基)萘基)氧基；二苯氧膦基氧基；特窗酰氧基；和四 氨酰氧基。
关于R3和R4，优选的基团是将匹配天然氨基酸或非天然氨基酸的侧 链的那些。在一种实施方式中，优选的R3是氢，优选的R4是直链或支链 C1-6烷基，包括甲基、乙基、异丙基和异丁基；或者优选的R4是环烷基、 芳基或杂芳基；或者优选的R4是可选被一个或多个羟基、卤素、羧基、 氨基、酰胺、酯、胍基、巯基、烷基巯基、芳基、杂环或杂芳基取代的 直链或支链C1-6烷基。
关于R5，优选的烷基是甲基、乙基、异丙基、异丁基；烷基上的优 选取代基是羟基、羧基、卤素、C4-C7环烷基、饱和与不饱和杂环基、芳 基或杂芳基；优选的环烷基是环戊基和环己基；优选的饱和与不饱和杂 环基是哌啶基和吗啉基；优选的芳基是苯基和萘基；优选的杂芳基是吡 啶基、吲哚基、呋喃基和噻吩基；芳基和杂芳基上的优选取代基是甲基、 乙基、氯、氟、溴、三氟甲基、甲氧基、羟基、羧基、氰基和硝基。尤 其优选的R5是可选被取代的苯基、萘基、杂芳基或苄基。优选的Z是O、 NH或CH2。
本发明涉及由式I代表的化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 的抑制剂这一发现。这些抑制剂减缓或阻滞各种临床疾病和工业应用中 的细胞死亡，其中发生细胞、组织或整个器官的损失。因此，本发明还 涉及治疗、预防或减少编程性细胞死亡在其中起作用的疾病的方法。这 些疾病在下文中有更充分的描述。该方法包含在必要时将抑制编程性细 胞死亡有效量的本发明抑制剂或其药学上可接受的盐或前体药物对动物 给药。
可以用作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物的优 选实施方式是由式II代表的： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中R1-R4是如前文关于式I所定义 的；R6和R7独立地是氢、烷基、可选被取代的烷基、C4-C7环烷基、饱和 或不饱和杂环基、芳基、杂芳基，或者R6和R7联合氮一起构成杂环。
优选的R1是H、Me、Et、t-Bu或AM。优选的R2是氟甲基、酰氧基甲 基、芳酰氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基和氨基甲基。关于R6和 R7，优选的烷基是甲基、乙基、异丙基、异丁基；烷基上的优选取代基是 羟基、羧基、氨基甲酰基、羧基酯、卤素、C4-C7环烷基、饱和与不饱和 杂环基、芳基或杂芳基；优选的环烷基是环戊基和环己基；优选的饱和 与不饱和杂环基是哌啶基和吗啉基；优选的芳基是苯基和萘基；优选的 杂芳基是吡啶基、吲哚基、呋喃基和噻吩基；芳基和杂芳基上的优选取 代基是甲基、乙基、氯、氟、溴、三氟甲基、甲氧基、羟基、羧基、氰 基和硝基。R6和R7与氮一起构成的杂环优选为哌啶、吗啉和哌嗪。
关于R3和R4，优选的R3是氢，优选的R4是将匹配天然氨基酸或非天 然氨基酸的侧链的那些。具体来说，优选的R3和R4与所连接的碳、氧和 羰基一起是α-羟基酸的残基。这些α-羟基酸包括但不限于3-甲氧基扁桃 酸、4-甲氧基扁桃酸、2-甲氧基扁桃酸、4-溴扁桃酸、4-甲基扁桃酸、 2，5-二甲基扁桃酸、4-甲硫基扁桃酸、4-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、2-氯 扁桃酸、4-氟扁桃酸、2，3-二氟扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸、2，5-二氟扁 桃酸、3，5-二氟扁桃酸、3，4-二氟扁桃酸、2，6-二氟扁桃酸、2，3，5-三 氟扁桃酸、2，3，6-三氟扁桃酸、3，4-亚甲二氧基扁桃酸、4-三氟甲基扁 桃酸、3-硝基扁桃酸、4-硝基扁桃酸、扁桃酸、六氢扁桃酸、2-羟基-3- 甲基丁酸、2-羟基-3，3-二甲基丁酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基丁酸、 2-羟基丁炔酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸、2-羟基-3-丁烯酸、2-羟基-3- 甲基戊酸、2-羟基-4-甲基戊酸、3-苯基乳酸、乳酸、3-氯乳酸、3-咪唑 乳酸、3，3，3-三氟乳酸、3，3-二氟-3-(4-氟苯基)乳酸、3，3-二氟-3-(4- 甲氧基苯基)乳酸、3，3-二氟-3-(4-氯苯基)乳酸、3，3-二氟-3-苯基乳酸、 3-(1-萘氧基)乳酸、闪白酸、乙醇酸、2-羟基己酸、2-羟基戊酸、2-羟 基辛酸和吲哚-3-乳酸。这些α-羟基酸在商业上可从Aldrich、Sigma、 Lancaster、Maybridge等公司获得。
示范性优选的式I与II的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂非 限制性地包括： 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，5-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，4-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸 酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3，4-二氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-苯氧基苯基)氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)-2-丙烯基N-苯基氨基甲酸酯， 2-(4-咪唑基)-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 3-甲基--1(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(2-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(4-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-环己基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 2-氯-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2，2，2-三氟-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯，和 Z-缬氨酸2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基酯。 其中Z是苄氧羰基，DPP是二苯氧膦基氧基，PTP是1-苯基-3-(三氟甲基) 吡唑-5-基氧基，DCB是2，6-二氯苯甲酰氧基。
有用的芳基是C6-14芳基，尤其是C6-10芳基。典型的C6-14芳基包括苯基、 萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基和芴基。
有用的环烷基是C3-8环烷基。典型的环烷基包括环丙基、环丁基、环 戊基、环己基和环庚基。
有用的饱和或部分饱和碳环基团是如上所定义的环烷基，以及环烯 基，例如环戊烯基、环庚烯基和环辛烯基。
有用的卤代或卤素基团包括氟、氯、溴和碘。
有用的烷基包括直链与支链C1-10烷基，更优选为C1-6烷基。典型的C1-10 烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、 己基和辛基。还涵盖取代在本发明化合物苯环上两个邻接位置上的1，3- 亚丙基。
有用的烯基包括直链与支链C2-10烯基，更优选为C2-6烯基。典型的C2-10 烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基和辛烯 基。
有用的炔基包括直链与支链C2-10炔基，更优选为C2-6炔基。典型的C2-10 炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基和辛炔基。
有用的芳烷基包括被任意上述C6-14芳基取代的任意上述C1-10烷基。有 用的基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。
有用的卤代烷基包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的C1-10 烷基，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1，1-二氟乙基、 氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。
有用的烷氧基包括被上述C1-10烷基之一取代的氧。
有用的烷硫基包括被上述C1-10烷基之一取代的硫。还包括这类烷硫基 的亚砜和砜。
有用的酰氨基是与氨基氮连接的任意C1-6酰基(烷酰基)，例如乙酰 氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、戊酰氨基、己酰氨基以及芳基取代的C2-6 取代酰基。
有用的酰氧基是与氧基(-O-)连接的任意C1-6酰基(烷酰基)，例如 甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基等。
有用的芳酰氧基包括取代在上述任意酰氧基上的上述任意芳基，例 如2，6-二氯苯甲酰氧基、2，6-二氟苯甲酰氧基和2，6-二(三氟甲基)苯甲 酰氧基。
有用的氨基包括-NH2、-NHR11和-NR11R12，其中的R11和R12是如上所定 义的C1-10烷基或环烷基。
有用的饱和或部分饱和杂环基包括四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、 哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、 奎宁环基、吗啉基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、吡唑烷基、 吡唑啉基、特窗酰基和四氨酰基。
有用的杂芳基包括下列任意一种：噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并 [2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、 呫吨基、吩噁噻基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡 嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑 基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉 基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、啶基、 菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基、吩噁嗪 基、1，4-二氢喹喔啉-2，3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并[1，2-a]嘧啶 -4-酮、1，2-苯并异噁唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟吲哚基和2-氧代苯并 咪唑基。若杂芳基在环中含有氮原子，则该氮原子可以是N-氧化物的形 式，例如吡啶基N-氧化物、吡嗪基N-氧化物、嘧啶基N-氧化物等。
可选的取代基包括一个或多个烷基；卤代；卤代烷基；环烷基；芳 基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代、卤代烷基或杂芳基取代；芳 氧基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代、卤代烷基或杂芳基取代； 芳烷基；杂芳基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代； 杂芳氧基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代；烷氧 基；烷硫基；芳硫基；氨基；酰氧基；芳酰氧基，可选地被一个或多个 低级烷基、卤代烷基和芳基取代；二苯氧膦基氧基，可选地被一个或多 个低级烷基、卤代或卤代烷基取代；杂环基，可选地被一个或多个低级 烷基、卤代烷基和芳基取代；杂环烷氧基，可选地被一个或多个低级烷 基、卤代烷基和芳基取代；部分不饱和的杂环烷基，可选地被一个或多 个低级烷基、卤代烷基和芳基取代；或部分不饱和的杂环烷氧基，可选 地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代。
某些本发明化合物可以存在立体异构体，包括旋光异构体。本发明 包括所有立体异构体和这类立体异构体的外消旋混合物以及个别的对映 异构体，它们可以按照本领域普通技术人员熟知的方法加以分离。
药学上可接受的加成盐实例包括无机与有机酸加成盐，例如盐酸盐、 氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、 富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；和无机与有机碱加成盐，碱例如氢氧化 钠和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS，tromethane)。
前体药物的实例包括式I-II化合物，其中R1是烷基或取代的烷基， 例如CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM酯)。
本发明还涉及治疗动物对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制有应 答的障碍的方法。特别优选用于本发明方法的化合物的实施方式是由如 前文所定义的式I-II所代表的。
本发明的化合物可以利用本领域技术人员已知的方法加以制备。具 体来说，具有氟甲基(CH2F)的式I-II化合物可以如流程1中的示范性反 应所述加以制备。羟基酸与异氰酸苯基酯的反应得到氨基甲酸酯保护的 酸。该酸与中间体羟基胺的偶联(Revesz等，Tetrahedron Lett.(四面 体快报)35：9693-9696(1994))生成酰胺。按照Revesz等(Tetrahedron Lett.(四面体快报)35：9693-9696(1994))，羟基被Dess-Martin试 剂氧化得到酮，为非对映体混合物。可以使用其他氧化剂代替 Dess-Martin试剂，包括氯铬酸吡啶鎓(PCC)。TFA催化t-Bu酯的裂解， 生成酸。
流程1
具有二氯苯甲酰氧基(DCB)的式I-II化合物可以如流程2中的示范 性反应所述加以制备。溴甲基酮与二氯苯甲酸的反应得到酯。通过氢化 作用除去Z保护基团，得到胺，与酸偶联生成酰胺。用TFA裂解t-Bu酯， 得到酸。
流程2
类似地，具有1-苯基-3-(三氟甲基)吡唑-5-基氧基(PTP)和二苯氧膦 基氧基(DPP)的式I-II化合物可以分别如流程3和4中的示范性反应所 述加以制备。
流程3
流程4
本发明的一个重要方面是式I-II化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶的抑制剂这一发现。因此，这些抑制剂预期减缓或阻滞各种临床 疾病中的细胞死亡，其中发生细胞、组织或整个器官的损失。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防神经系统(脑、脊髓 和外周神经系统)在各种缺血和兴奋毒性条件下的细胞死亡，包括但不 限于由中风引起的局灶性缺血和由心搏停止引起的普遍性缺血，以及脊 髓损伤(Emery等，J.Neurosurgery(神经外科学杂志)89：911-920 (1998)和Springer等，Nat.Med.(天然医药)5：943-946(1999))。 一种特定的用途是治疗缺氧后果，这可能发生在高危分娩婴儿出生或淹 溺期间。细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由创伤性损伤(例如头 部创伤)引起的神经系统细胞死亡、病毒感染或辐射诱导的神经细胞死 亡(例如是癌症放射疗法的副作用)。细胞死亡抑制剂还可以用于减少 或预防一定范围神经变性障碍中的细胞死亡，包括但不限于阿尔茨海默 氏病(Mattson等，Brain Res.(脑研究)807：167-176(1998))、亨 廷顿氏病、帕金森氏病、蛋白感染病毒(prion)病、多发性硬化、肌萎 缩性侧索硬化和脊髓延髓萎缩。在大鼠短暂的局灶性脑缺血模型中可以 试验本发明细胞死亡抑制剂的体内神经保护性质(Xue等，Stroke(中风) 21：166(1990))。
细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善由急性细菌性脑膜炎引起的 中枢或外周神经系统中的细胞死亡。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防任何潜在导致心肌死 亡的疾病中的细胞死亡(Black等，J.Mol.Cel.Card.(分子与细胞心 脏病学杂志)30：733-742(1998)和Maulik等，Free Radic.Biol.Med. (自由基与生物医学)24：869-875(1998))。这包括由心肌缺血与再灌 注引起的心肌梗塞、充血性心力衰竭和心肌病。一种特定的应用是减少 或预防发生在心脏的某些病毒感染中的心肌细胞死亡。
利用Rodriguez等所述“小鼠肝脏编程性细胞死亡”模型(Rodriguez 等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)184：2067-2072(1996))可以试验 本发明细胞死亡抑制剂的体内活性。该模型中，将小鼠用抗Fas抗体静 脉内(IV)处理，该抗体诱导肝脏和其他器官中的大量编程性细胞死亡， 引起全身性器官衰竭和死亡。该模型可用于间接试验本发明细胞死亡抑 制剂的全身生物利用度以及它们的体内抗编程性细胞死亡性质。本发明 的细胞死亡抑制剂因此可以用于减少或预防肝细胞的编程性细胞死亡 (Jones等，Hepatology(肝脏病学)27：1632-1642(1998))，例如 脓毒症(Jaeschke等，J.Immunol.(免疫学杂志)160：3480-3486 (1998))和1型遗传性酪氨酸血症(HT1)(Kubo等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(美国国家科学院院报)95：9552-9557(1998))。本发明的细胞死 亡抑制剂还可以用于治疗肝炎(Suzuki，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(实 验生物学与实验医学会会志)217：450-454(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防视网膜神经元的细胞 死亡(Kermer等，J Neurosci.(神经科学杂志)18：4656-4662(1998) 和Miller等，Am.J.Vet.Res.(美国兽医研究杂志)59：149-152 (1998))，这可能发生在增加眼内压力的障碍(例如青光眼)或与衰老 过程有关的视网膜障碍(例如与衰老有关的黄斑变性)中。抑制剂还可 以用于治疗视网膜的遗传变性性障碍，例如色素性视网膜炎。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防肾脏中的细胞死 亡。这包括肾淀粉样变性(Hiraoka等，Nippon Jinzo Gakkai Shi(日 本肾脏学会志)40：276-83(1998))、急性肾衰(Lieberthal等.Semin Nephrol.18：505-518(1998))、由环孢菌素A诱导的鼠管状上皮细胞 死亡(Ortiz等，Kidney International Supp.(国际肾脏学增刊)68： S25 S29(1998))和HIV诱发的肾病(Conaldi等，J Clin.Invest.(临 床检查杂志)102：2041-2049(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由慢性酒精摄入引 起的颊黏膜细胞死亡(Slomiany等，Biochem.Mol.Biol.Int.(国际 生物化学与分子生物学)45：1199-1209(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防急性胰腺炎中的编 程性细胞死亡(Iovanna，Int.J.Pancreatol.(国际胰腺病学杂志)20： 77-84(1996)和Sata等，Pancreas(胰腺)19：76-82(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防植物中的细胞死亡 (Richberg等，Curr.Opin.Plant Biol.(植物生物学最新观点)1： 480-485(1998))，例如由病原体引起的植物细胞死亡(Pozo等，Curr. Biol.(最新生物学)8：1129-1132(1998)和Greenberg等，Cell(细 胞)，77：551-563(1994))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由辐射和紫外照射 引起的细胞死亡(Sheikh等，Oncogene(致癌基因)17：2555-2563 (1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防脊髓发育不良综合 征(MDS)中的骨髓细胞编程性细胞死亡(Mundle等，Am.J.Hematol.(美 国血液学杂志)60：36-47(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防在灼伤后早期的器 官编程性细胞死亡，例如胸腺和脾(Fukuzuka等，Ann.Surg(外科学纪 事)229：851-858(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防免疫系统细胞的早 熟性死亡，特别可用于治疗免疫缺陷性障碍，例如获得性免疫缺陷综合 征(AIDS)、严重联合免疫缺陷综合征(SCIDS)和有关疾病。细胞死亡抑制 剂还可以用于治疗辐射诱发的免疫抑制。
细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善自体免疫障碍，包括红斑狼 疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。
人体器官与组织移植是器官衰竭的普通治疗措施。不过，在移植过 程期间，供体器官或组织面临细胞死亡的危险，因为它在植入宿主之前 缺乏正常的血液供应。这种缺血状态可以用细胞死亡抑制剂处理，将其 输注到供体器官或组织内，或者直接将细胞死亡抑制剂加入到器官/组织 贮存培养基中，也就是说，在将器官或组织移植到哺乳动物体内之前， 将器官或组织浸泡在含有化合物的贮存培养基中。细胞死亡抑制剂还可 以对动物给药，以减少或预防供体器官/组织被移植后的细胞死亡，以保 护它不受宿主免疫细胞的作用，后者通过触发编程性细胞死亡杀死它们 的靶。这类器官和组织的实例非限制性地包括肾、肝、心、胰腺、肺、 角膜、手和胚胎黑质组织。
细胞死亡抑制剂的细胞保护作用还可以用于预防用于体外受精程序 的人或动物精子和卵子死亡。可以在收获过程期间使用这些抑制剂，还 可以在贮存培养基中包括它们。
哺乳动物细胞系、昆虫细胞和酵母细胞常用于产生大量工业或医药 用途的重组蛋白质(例如抗体、酶或激素)。有些细胞系的寿命受到生 长条件、被表达重组分子的本性(有些是有毒的)和其他未知因素的限 制。通过在生长培养基中包括浓度为1-100μM的细胞死亡抑制剂，能够 延长工业细胞系的寿命。
支配毛发生长和脱落的因素多半是未知的。不过有一些证据表明， 编程性细胞死亡至少部分可以引起毛囊退化(称为毛发生长退化期)。 因此，预期通过对动物毛发或毛囊给药，本发明的细胞死亡抑制剂可以 用于治疗由各种条件引起的脱发，包括但不限于男性型秃发、辐射或化 学疗法诱发的脱发和由情绪紧张引起的脱发。还有证据表明，编程性细 胞死亡可能在毛发褪色中起作用。因此，预期本发明的细胞死亡抑制剂 还可以用于治疗或预防毛发早白的情况。
皮肤上皮细胞在暴露于高水平辐射、热或化学品之后可能发生死亡。 预期本发明的细胞死亡抑制剂可以用于治疗、减少或预防这种类型的皮 肤损害。在一种特定的应用中，细胞死亡抑制剂作为局部制剂、例如软 膏剂的一部分，可以涂抹于动物皮肤上，治疗急性曝晒过度，预防皮肤 起疱和脱皮。
Goldberg等(Nature Genetics(自然遗传学)13：442-449(1996)) 最近报道了亨廷顿氏病(HD)基因的蛋白产物huntingtin能够被CPP32而 不是ICE裂解。作为HD基础的突变是HD基因5’末端CAG三核苷酸的扩 展。重复超过36次的三核苷酸扩展与HD的临床表现有关。CAG扩展促进 huntingtin被CPP32裂解，因而与CPP32在HD编程性细胞死亡中的角色 联系起来。具有CPP32抑制活性的本发明化合物可用于阻滞CPP32诱导 的编程性细胞死亡，因而可用于预防和治疗HD和其他以三核苷酸重复扩 展为特征的障碍，例如肌强直性营养不良、脆弱性X精神发育迟缓、脊 髓延髓肌萎缩、I型脊髓小脑性共济失调和Dentato-Rubro pallidoluysian萎缩。
通过在必要时对动物给药，细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善 肠缺血-再灌注后的小肠组织损伤。参见Farber，A.等，J.Vascular Surg. (血管外科学杂志)30：752-760(1999)。
本发明涉及治疗、改善或预防由癌症化学疗法或放射疗法导致的动 物口腔黏膜炎、胃肠黏膜炎、膀胱黏膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮 肤细胞死亡和脱发的方法，包含将有效量的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂对有此需要的动物给药。
在用化学治疗剂和/或辐射治疗动物以杀死癌细胞时，所不需要的副 作用是迅速分化中的非癌细胞的编程性细胞死亡。这类非癌细胞包括胃 肠道、皮肤、毛发和骨髓的细胞。按照本发明，将天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂对这类非癌细胞给药，以预防这类细胞的编程性细胞 死亡。在优选的实施方式中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂是 局部给药的，例如对胃肠道、口腔、皮肤或头皮，以预防胃肠、口腔、 皮肤或毛发细胞的编程性细胞死亡，但不妨碍癌细胞的死亡。因而，在 一种实例中，通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的局部给药， 有可能用化学疗法或放射疗法治疗脑癌，并保护外部皮肤、毛发细胞、 胃肠道和骨髓。在口腔黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂的用药形式例如可以是口腔洗液或漱口液、凝胶或口用缓释锭 剂，以预防由化学治疗剂或辐射诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 活化和编程性细胞死亡。在胃肠黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂的用药形式可以是这样的，它不是被全身吸收的，或 者覆盖胃肠道的表面，或者是胃肠黏膜炎治疗用栓剂。在直肠炎的情况 下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂在用药时可以作为灌肠剂或 栓剂的一部分。在膀胱黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂可以通过膀胱导管用药。关于预防放射或化学疗法诱发的脱发， 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂在用于头皮时可以是润丝、发胶、 香波或毛发护理剂的形式。重要的是，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抑制剂用药可以在化学治疗剂或辐射给药之前，因而预防或减少化学治 疗剂或辐射对正常细胞的损害作用发生。
本发明范围内的组合物包括所有这样的组合物，其中本发明化合物 的含量对实现其预期目的来说是有效的。尽管个体的需要各不相同，不 过确定每种组分的最佳有效量范围属于本领域技术范围。通常，化合物 可以对哺乳动物、例如人口服给药的剂量为0.0025至50mg/kg体重的受 治疗编程性细胞死亡介导障碍的哺乳动物每天，或其药学上可接受的盐 的等价量，例如神经元细胞死亡、心脏病、视网膜障碍、多囊性肾疾病、 免疫系统障碍和脓毒症。优选地，口服给药约0.01至约10mg/kg，以治 疗或预防这类障碍。关于肌内注射，剂量一般是口服剂量的大约一半。 例如，关于治疗或预防神经元细胞死亡，适合的肌内剂量将是约0.0025 至约25mg/kg，最优选地从约0.01至约5mg/kg。
单位口服剂量可以包含约0.01至约50mg、优选为约0.1至约10mg 化合物。单位剂量可以每日给药一次或多次，分一片或多片，每片含有 约0.1至约10、适宜为约0.25至50mg化合物或其溶剂化物。
在局部制剂中，化合物的浓度可以是约0.01至100mg每克载体。
除了将化合物作为生化学品给药以外，本发明的化合物可以作为药 物制剂的一部分给药，制剂含有适合的药学上可接受的载体，包含赋形 剂和助剂，有利于化合物加工成能够药用的制剂。优选地，制剂、特别 是可以口服或局部给药并且可以用于优选的给药类型的那些制剂，例如 片剂、锭剂、缓释锭剂与胶囊剂、漱口剂与口腔洗液、凝胶、液体悬液、 润丝、发胶、香波，和可以直肠给药的制剂，例如栓剂，以及适合于通 过注射、局部或口服给药的溶液，含有约0.01至99％、优选地从约0.25 至75％活性化合物，以及赋形剂。
在本发明的范围内还包括本发明化合物的无毒性药学上可接受的 盐。将特定的本发明细胞死亡抑制剂的溶液与药学上可接受的无毒性酸 的溶液混合，生成酸加成盐，酸例如盐酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、 乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等。将特定的本发明细胞死 亡抑制剂的溶液与药学上可接受的无毒性碱的溶液混合，生成碱盐，碱 例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆碱、碳酸钠Tris等。
本发明的药物组合物可以对任何可以体验到本发明化合物有益效果 的动物给药。这类动物中最重要的是哺乳动物，例如人，不过本发明不 会局限于此。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其药物组合物可以通过任 何达到预期目的的方式给药。例如，给药可以通过胃肠外、皮下、静脉 内、肌内、腹膜内、透皮、颊、鞘内、颅内、鼻内或局部途径。作为替 代选择或者与此同时，给药可以通过口服途径。给药剂量将取决于受者 的年龄、健康和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率和 所需作用的本性。一般来说，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂是 独立于化学治疗剂而对组织局部给药的，保护该组织不发生编程性细胞 死亡。例如，顺铂可以通过i.v.注射给药，以治疗癌症，例如脑、肺、 乳腺、肝、肾、胰腺、卵巢、前列腺的癌症，而天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶抑制剂可以局部给药，以治疗、改善或预防口腔或胃肠道中的 编程性细胞死亡，例如用于治疗口腔黏膜炎的口腔洗液；用于治疗骨髓 细胞死亡的可IV注射的水溶液；适合于覆盖胃肠表面的口用制剂；或用 于治疗胃肠黏膜炎、包括直肠炎的灌肠剂或栓剂。天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂还可以通过膀胱导管用药，用于治疗、改善或预防膀 胱黏膜炎。作为替代选择或者与此同时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂可以对皮肤和/或头皮局部用药，以治疗、改善或预防毛发与皮 肤细胞中的编程性细胞死亡。在进一步的实施方式中，化学治疗剂或辐 射可以局部施用，以治疗局部化癌症，例如脑、肺、乳腺、肝、肾、胰 腺、卵巢、前列腺的癌症，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂可 以全身给药，例如通过i.v.注射，以治疗、改善或预防胃肠道细胞、口 腔上皮细胞、骨髓细胞、皮肤细胞和毛发细胞中的编程性细胞死亡。例 如在脑癌治疗中的口腔黏膜炎的情况下，不会穿过血-脑屏障的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂例如可以通过i.v.注射全身用药，然后照 射脑肿瘤。这将保护口腔黏膜不受辐射的有害作用，但是天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶抑制剂不会保护脑肿瘤不受辐射的治疗作用。重要的 是，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以在施用辐射之前用药， 因而预防辐射对正常黏膜细胞的损害作用发生。
本发明的药物制剂是按照本身已知的方式生产的，例如借助于常规 的混合、造粒、成型、溶解或冷冻干燥过程。因而，口用药物制剂可以 这样获得，混合活性化合物与固体赋形剂，可选地研磨所得混合物，加 工颗粒混合物，如果需要或必要的话加入适合的助剂后，得到片剂或锭 剂核心。
适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖类，如乳糖或蔗糖，甘露糖 醇或山梨糖醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及 粘合剂，例如淀粉糊，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉， 明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚 乙烯吡咯烷酮。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如上述淀粉，和羧 甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，例如藻酸钠。 助剂尤其是流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅，滑石，硬脂酸或其盐、 如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。为锭剂核心提供适合的包衣， 如果需要的话是耐受胃液的。为此，可以使用浓糖溶液，它可以可选地 含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶 液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐受胃液的包衣，使用适 合的纤维素制剂的溶液，例如乙酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤 维素邻苯二甲酸酯。可以向片剂或锭剂包表中加入染料或色素，例如用 于鉴别或者为了描绘活性化合物剂量的组合。
其他口服用药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊剂以及由明 胶和增塑剂、例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊剂。推入配合式胶 囊剂可以含有颗粒形式的活性化合物，并可以混合有填充剂，例如乳糖， 粘合剂，例如淀粉，和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁，和可选的稳定 剂。在软胶囊剂中，活性化合物是优选地溶解或悬浮在适合的液体中， 例如脂肪油或液体石蜡。另外，可以加入稳定剂。
可能的直肠用药物制剂例如包括由一种或多种活性化合物与栓剂基 质的组合组成的栓剂。适合的栓剂基质例如是天然或合成的甘油三酯、 或石蜡烃。另外，还可能使用由活性化合物与基质的组合组成的直肠用 胶囊剂。可能的基质材料例如包括液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
适合于胃肠外给药的制剂包括水溶性活性化合物的水溶液和碱性溶 液，例如水溶性盐。另外，可以将活性化合物的适当的油性注射悬液给 药。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪 酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或聚乙二醇-400(这些化合物可溶于 PEG-400)。水性注射悬液可以含有增加悬液粘度的物质，例如包括羧甲 基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。可选地，悬液还可以含有稳定剂。
按照本发明的一个方面，在局部和胃肠外制剂中采用本发明的化合 物，用于治疗皮肤损害，例如由暴露于高水平辐射(包括紫外辐射)、 热或化学品所导致的皮肤损害。
还可以在组合物中掺入另外一种或多种对皮肤具有治疗作用的物 质。因而，组合物还可以含有一种或多种能够增加皮肤环AMP水平的化 合物。适合的化合物包括腺苷或核酸水解产物，含量为约0.1-1％，和罂 粟碱，含量为约0.5-5％，二者均基于组合物的重量。还适合的是β-肾上 腺素能激动剂，例如异丙肾上腺素，含量为约0.1-2％，或环AMP，含量 为约0.1-1％，二者仍基于组合物的重量。可以掺入本发明组合物中的其 他适合类型的另外的活性成分包括任何已知对皮肤具有有益效果的化合 物。这类化合物包括类视黄醇，例如维生素A，含量为约0.003-0.3重量 ％，和苯并二氢吡喃醇，例如维生素E或其衍生物，含量为约0.1-10重 量％，二者均基于组合物的重量。另外，可以在美容组合物中掺入抗炎剂 和角膜成形剂。典型的抗炎剂是皮质甾类，例如氢化可的松或其乙酸盐， 含量为约0.25-5重量％，或皮质甾类，例如地塞米松，含量为约0.025-0.5 重量％，二者均基于组合物的重量。典型的角膜成形剂是煤焦油，含量为 约0.1-20重量％，或蒽林，含量为约0.05-2重量％，二者均基于组合物 的重量。
通过适当载体的选择，本发明的局部组合物优选地配制成油剂、霜 剂、洗剂、软膏剂等。适合的载体包括植物或矿物油、白矿脂(白软石 蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和大分子醇(大于C12)。优选的载体是 活性成分可溶于其中的那些。还可以包括乳化剂、稳定剂、湿润剂和抗 氧化剂，如果需要的话，以及赋予颜色或香味的试剂。另外，在这些局 部制剂中可以采用透皮渗入增强剂。这类增强剂的实例可以在美国专利 No.3,989,816和4,444,762中找到。
霜剂优选地从矿物油、自乳化蜂蜡与水的混合物配制而成，在该混 合物中混合有溶解在少量油、例如杏仁油中的活性成分。这样一种霜剂 的典型实例包括约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1份杏仁 油。
软膏剂可以这样配制，将活性成分在植物油、例如杏仁油中的溶液 与热的软石蜡混合，使混合物冷却。这样一种软膏剂的典型实例包括约 30重量％杏仁油和约70重量％白软石蜡。
洗剂适宜这样制备，将活性成分溶于适合的大分子醇，例如丙二醇 或聚乙二醇。
另外，这些组合物可以包括其他药物、生长因子、伤口密封剂、载 体等，它们是为本领域技术人员已知的或显而易见的。本发明的组合物 对已经患有皮肤损害、例如灼伤的温血动物、例如人的给药量足以使愈 合过程比宿主未被治疗时更快。可以根据需要调整长期阶段的维持剂量。 关于兽医用途，可以根据需要给以更高水平的剂量。
在动物患有毛发生长减少的情况下，本发明组合物的给药量足以增 加毛发生长的速率。对该用途有效的量将取决于毛发生长减少的程度和 所治疗患者的一般健康状态。可以根据需要调整长期阶段的维持剂量。 关于兽医用途，可以根据需要给以更高水平的剂量。
当化合物对植物给药时，例如可以喷洒于植物的叶和/或茎和/或花。 所喷洒的化合物可以是颗粒形式或者溶解或悬浮在适当的载体中，例如 水或油-水乳剂。化合物还可以与植物的土壤混合。在这种实施方式中， 化合物被植物的根吸收。
在优选的实施方式中，将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂配 制成口腔洗液的一部分，用于治疗、改善或预防口腔黏膜炎。这类口腔 洗液是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的水溶液，其中还可以含 有醇、甘油、合成甜味剂、表面活性剂、矫味剂和着色剂。它们还可以 含有抗感染剂，例如海克替啶和氯化鲸蜡基吡啶鎓。口腔洗液还可以含 有局部麻醉剂(例如苯佐卡因、可卡因、盐酸达克罗宁、利多卡因、盐 酸丙美卡因或盐酸丁卡因)，例如减轻放射或化学疗法诱发的疮痛。口 腔洗液可以具有酸性或碱性的pH。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington氏药物科学)，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company(1990)，pp.1045，1046，1526和1965。
在另一种优选的实施方式中，将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂配制成能够覆盖胃肠表面的口服制剂，用于治疗、改善或预防胃肠 黏膜炎。胃肠黏膜炎的实例包括食管黏膜炎、胃黏膜炎和肠黏膜炎。这 类制剂可以包含抗胃酸剂，例如碳酸铝、氢氧化铝凝胶、碱式硝酸铋、 碱式水杨酸铋、碳酸钙、碳酸二羟铝钠、镁加铝、碳酸镁、氢氧化镁、 氧化镁、碳酸氢钠、铋乳、氨基乙酸二羟铝、磷酸镁、三硅酸镁和它们 的混合物。其他添加剂非限制性地包括H2-受体拮抗剂、助消化剂、止吐 剂、吸附剂和杂剂(miscellaneous agent)。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington氏药物科学)，A.R.Gennaro，ed.， Mack Publishing Company(1990)，pp.774-778。
诸如顺铂等化学治疗剂和放射疗法经常诱发患者发生早期与晚期呕 吐。因而，在一种实施方式中，将止吐剂与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂一起给药，以避免呕吐，保持天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂与胃肠道的接触。这类止吐剂的实例非限制性地包括阻滞多巴 胺能呕吐受体的化合物，例如甲氧氯普胺和曲美苄胺，和大麻素类。甲 氧氯普胺可以在化学疗法/放射疗法/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂疗法之前和/或期间口服给药，以预防早期呕吐反应，然后按照美国 专利No.5,760,086和4,536,386进行鼻内给药，以预防迟发的呕吐。 在化学疗法/放射疗法后的期间，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂 和止吐剂可以共同给药，以治疗、改善或预防胃肠黏膜炎。
在进一步的实施方式中，可以将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂配制成可IV注射的溶液，用于治疗、改善或预防骨髓细胞死亡。
本发明的组合物可以对已经患有化学疗法或放射疗法诱导非癌细胞 死亡的温血动物、例如人给药，或者更优选地在化学疗法或放射疗法之 前或期间给药。
下列实施例是本发明方法和组合物的例证而非限制。常见于临床疗 法中的各种条件和参数的其他适合的修改和调整属于本发明的精神和 范围，它们对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
S-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.叔丁基5-氟-3-[S-2-(苯氨基)羰基氧基丙酰氨基]-4-羟基 戊酸酯
将S-(-)-2-[(苯氨基)羰基氧基]丙酸(201mg，0.96mmol)、EDCI (98mg，0.51mmol)、HOBT(74mg，0.48mmol)、DMAP(28mg，0.23mmol) 与叔丁基3-氨基-5-氟-4-羟基戊酸酯(101mg，0.49mmol)在THF(6ml)中 的混合物在室温下搅拌17小时。将其用1∶1己烷/EtOAc(80ml)稀释， 用水、2N HCl、水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，经Na2SO4干燥。蒸发溶液， 残余物经过快速色谱纯化(己烷/EtOAc 3/2)，得到标题化合物，为白色 固体(80mg，0.21mmol，43％)。1H NMR(CDCl3)：7.40-7.05(m，6H)， 5.18(q，J＝6.9，1H)，4.54-3.95(m，4H)，2.75-2.51(m，2H)，1.51(d，J＝6.9， 3H)，1.42(m，9H).
步骤B.1-(羰基-Asp(O-Bu-t)-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
将periodinane(0.49g，1.16mmol)与叔丁基5-氟-3-[S-2-(苯氨基) 羰基氧基丙酰氨基]-4-羟基戊酸酯(80mg，0.21mmol)在二氯甲烷(6ml)中 的混合物回流20小时。冷却至室温后，加入含有0.5g Na2S2O3的饱和碳 酸氢钠水溶液(10ml)。将所得混合物搅拌1小时，用1∶1己烷/EtOAc(80ml) 萃取。有机相用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，在真空中浓缩，得到标 题化合物，为吸湿性白色固体(69mg，0.18mmol，85％)。
1H NMR(CDCl3)：7.40-7.25(m，5H)，7.13-7.00(m，2H)，5.30- 4.87(m，4H)，3.05-2.71(m，2H)，1.56-1.53(m，3H)，1.42(s，9H).
步骤C.1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
向1-(羰基-Asp(O-Bu-t)-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯(69mg， 0.18mmol)的3ml CH2Cl2溶液中加入1ml TFA。将所得溶液在室温下搅拌 1小时，用EtOAc(80ml)稀释，用饱和Na2HPO4中和至pH~5，用水和盐水 洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩，得到标题化合物，为白色固体(26mg， 0.078mmol，44％)。 1H NMR(DMSO-d6)：9.86(br s， 1H)，8.67(br s，1H)，7.45-7.27(m，4H)，6.99(br s，1H)，5.30-4.80(m，4H)， 4.59(br s，1H)，2.72(br s，2H)，1.37(br s，3H).
实施例2
2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.2-苯氨基羰基氧基-3-甲基丁酸
向2-羟基-3-甲基丁酸(0.20g，1.7mmol)的吡啶(8ml)溶液中加入异 氰酸苯基酯(0.184ml)。将所得溶液在室温下搅拌4小时，用2N HCl酸 化至pH~2，用EtOAc(30ml)稀释。分离有机相，用水和盐水洗涤，经Na2SO4 干燥，在真空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶2己烷/EtOAc，然后是 EtOAc)，得到标题化合物，为无色的油(200mg，0.85mmol，50％)。
1H NMR(DMSO- d6)：9.80(s，1H)，7.47(d，J＝7.8，2H)，7.28(t，J＝7.8，2H)，7.00(t，J＝7.8， 1H)，4.71(d，J＝4.2，1H)，2.17(m，1H)，1.02-0.97(m，6H).
如实施例1所述，从2-苯氨基羰基氧基-3-甲基丁酸和叔丁基3-氨 基-5-氟-4-羟基戊酸酯分三步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.79(s，1H)， 8.62(s，1H)，7.47(d，J＝7.8，2H)，7.28(t，J＝7.8，2H)，7.00(t，J＝7.8，1H)， 5.14-4.60(m，4H)，2.80-2.60(m，2H)，2.10(m，1H)，0.97-0.93(m，6H).
实施例3
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苯基酯 分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.79(s，1H)，8.60(s，1H)，7.47(d，J＝7.5， 2H)，7.28(t，J＝8.2，2H)，7.00(t，J＝7.2，1H)，5.14-4.58(m，4H)，2.80-2.71 (m，2H)，2.10(m，1H)，0.98-0.93(m，6H).
实施例4
S-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从L-(+)-乳酸和异氰酸苄基酯分四步制备标 题化合物。 1H NMR (丙酮-d6)：7.81-7.00(m，7H)，5.37-4.33(m，6H)，2.89-2.67(m，2H)，1.40 (d，J＝6.9，3H).
实施例5
2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苄基酯分四步 制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：12.48(s，1H)，8.59-8.51(m，1H)，7.90-7.80 (m，1H)，7.33-7.24(m，5H)，5.34-4.99(m，2H)，4.70-4.29(m，3H)，4.18(d，J＝ 6.0，2H)，2.85-2.53(m，2H)，2.01(m，1H)，0.92-0.87(m，6H).
实施例6
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苄基酯 分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：8.46(s，1H)，7.86(t，J＝6.3，1H)，7.34-7.21 (m，5H)，4.97-4.56(m，4H)，4.18(d，J＝6.0，2H)，2.68(m，2H)，2.02(m，1H)， 0.91-0.86(m，6H).
实施例7
S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨 基甲酸酯
步骤A.S，S-1-羧基-2-甲基丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基 甲酸酯
向S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸(0.2g，1.69mmol)的吡啶(10ml)溶液中 加入甲基(S)-(-)-2-异氰基-3-甲基丁酸酯(0.243ml，1.69mmol)。然后 将所得溶液在室温下搅拌24小时，用2N HCl酸化至pH~2，用EtOAc(30ml) 稀释。分离有机相，用水和盐水洗涤，在真空中浓缩。将残余物溶于饱 和NaHCO3，用4∶1己烷∶EtOAc洗涤。将含水相用2N HCl酸化至pH~2， 用乙酸乙酯萃取(2×30ml)。合并有机层，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干 燥，在真空中浓缩，得到标题化合物，为无色的油(92mg，0.334mmol， 20％)。 1H NMR(DMSO- d6)：6.42(d，J＝8.7，1H)，4.08-3.99(m，2H)，3.62(d，J＝0.9，3H)，2.04-1.93( m，2H)，0.94-0.83(m，12H).
步骤B.S，S-2-甲基-1-(氨基甲酰基-N-(叔丁基5-氟-4-羟基戊酸酯 -3-基)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯
将S，S-1-羧基-2-甲基丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯 (92mg，0.335mmol)、EDCI(66mg，0.335mmol)、HOBt(45mg，0.335mmol)、 DMAP(20mg，0.17mmol)与叔丁基3-氨基-5-氟-4-羟基戊酸酯(69mg， 0.335mmol)在THF(10ml)中的混合物在室温下搅拌20小时，过滤，在真 空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶2己烷/EtOAc)，得到标题化合物，为 无色的油(20mg，0.043mmol，13％)。
1H NMR(CDCl3)：6.98-6.86(m，1H)，5.50(d，J＝9.3，1H)， 5.10-5.05(m，1H)，4.90(d，J＝4.2，1H)，4.50-4.00(m，5H)，3.76(s，3H)，2.74- 2.48(m，2H)，2.33-2.13(m，2H)，1.44(s，9H)，0.99-0.93(m，12H).
步骤C.S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2F)丙基N-(2-甲基-1- 甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯
将Dess-Martin试剂(0.2g，0.47mmol)与S，S-2-甲基-1-(氨基甲酰 基-N-(叔丁基5-氟-4-羟基戊酸酯-3-基)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙 基)氨基甲酸酯(20mg，0.043mmol)在二氯甲烷(10ml)中的混合物回流20 小时，冷却至室温，加入含有0.2g Na2S2O3的25ml饱和碳酸氢钠水溶液。 将所得混合物搅拌2天，用EtOAc(50ml)稀释，用水和盐水洗涤，经Na2SO4 干燥，在真空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶1己烷/EtOAc)，得到标题 化合物，为无色的油(12mg，0.026mmol，60％)。1H NMR(CDCl3)：
7.25-7.10(m，1H)，5.52-5.44(m，1H)，5.31-4.84(m，4H)，4.34-4.25(m，1H)，
3.77(d，J＝1.2，3H)，3.09-2.66(m，2H)，2.34-2.12(m，2H)，1.42(d，J＝1.8，
9H)，1.00-0.88(m，12H).
步骤D.S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基 丙基)氨基甲酸酯
向S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧 羰基丙基)氨基甲酸酯(12mg，0.026mmol)的1.5ml CH2Cl2溶液中加入 0.5ml TFA。将所得溶液在室温下搅拌4小时，用CHCl3稀释(3×15ml)， 在真空中浓缩，得到标题化合物，为浅黄色固体(10.25mg，0.025mmol， 96％)。1HNMR(丙酮-d6)：
7.75-7.40(m，1H)，6.85-6.82(m，1H)，5.34-5.12(m，1H)，4.84-
4.80(m，2H)，4.58-4.43(m，1H)，4.18-4.11(m，1H)，3.71(s，3H)，2.88-2.60
(m，2H)，2.16-2.05(m，2H)，0.98-0.86(m，12H).
实施例8
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB
向苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2Br(300mg，0.75mmol)、2，6-二氯苯甲 酸(215mg，1.12mmol)与KF(217mg，3.75mmol)的混合物中加入无水DMF (5ml)。将混合物在室温Ar下搅拌12小时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。 将溶液用饱和氯化铵水溶液、盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥。除去溶剂， 残余物用快速柱色谱纯化(己烷∶EtOAc，2∶1)。得到标题化合物，为无色 的油(296mg，0.67mmol，89％)。1H NMR(CDCl3)：7.34(m，8H)，5.97(d，J＝8.7，1H)，5.21(d，J＝6.6，2H)，5.16 (s，2H)，4.70(m，1H)，2.90(m，2H)，1.28(s，9H).
步骤B.S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲 酸酯
向苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB(150mg，0.34mmol)的乙醇(20ml) 溶液中加入Pd/C(30mg)和含水HCl(0.2ml，6N)。将混合物在H2下搅拌 3小时，然后过滤除去Pd/C。浓缩乙醇溶液，残余物用于下面的反应。 将S-2-苯氨基-1-羰氧基-3-甲基丁酸(81mg，0.34mmol)、EDCI(65mg， 0.34mmol)、HOBt(52mg，0.34mmol)、DMAP(24mg，0.20mmol)与 NH2-Asp(OBu-t)-CH2DCB-HCl在THF(10ml)中的混合物在室温下搅拌16 小时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。将溶液用含水NaOH(1N)、含水HCl(1N)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥。浓缩溶液，残余物经过快速柱色谱纯 化，得到标题化合物，为淡黄色固体(41mg，0.07mmol，22％)。
1H NMR(CDCl3)：7.28(m，8H)，5.05(m，3H)，4.67(m，1H)，2.88 (m，2H)，2.31(m，1H)，1.42(s，9H)，0.91(m，6H).
步骤C.S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯
向S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯 的CH2Cl2(2ml)溶液中加入TFA(1ml)。将混合物在25℃Ar下搅拌12小 时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。将溶液用饱和含水Na2HPO4洗涤，经Na2SO4 干燥。蒸发之，在真空下干燥残余物。得到标题化合物，为黄色固体(18mg， 0.03mmol，47％)。
1H NMR(CDCl3)：7.29(m，8H)，5.00(m，3H)，4.21(m， 1H)，2.91(m，2H)，2.35(m，1H)，0.97(m，6H).
实施例9
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3-氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和3-氟苯基异 氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：10.09(bs，1H)，8.73(m，1H)，8.29(m，1H)， 7.35(m，3H)，6.83(s，1H)，5.18(m，1H)，4.69(m，3H)，2.60(m，2H)，2.11(m， 1H)，0.96(m，6H).
实施例10
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和4-氟苯基异 氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.73(bs，1H)，8.56(bs，1H)， 7.33(s，2H)，7.00(s，2H)，5.05(m，1H)，4.55(m，3H)，2.52(m，2H)，1.97(m， 1H)，0.81(m，6H).
实施例11
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3，4-二氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和3，4-二氟苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：10.09(bs，1H)，8.65(bs， 1H)，7.56(m，1H)，7.37(m，1H)，7.24(m，1H)，5.05(m，1H)，4.65(m，3H)， 2.73(m，2H)，2.11(m，1H)，0.95(m，6H).
实施例12
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-苯氧基苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和4-苯氧基苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：12.45(bs，1H)，9.84(bs，
1H)，8.65(m，1H)，7.48(d，J＝8.7Hz，2H)，7.35(dd，J＝7.5，8.4Hz，2H)，7.08
(dd，J＝7.2，7.5Hz，2H)，6.95(m，3H)，5.22(m，1H)，4.69(m，3H)，2.62(m，
2H)，2.09(m，1H)，0.93(m，6H).
实施例13
S-1-环己基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯
通过实施例1和2所述方法，从S-(+)-六氢扁桃酸和异氰酸苯基酯 制备标题化合物，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：9.76(bs，1H)，8.68
(bs，1H)，7.44-7.27(m，4H)，6.99(bs，1H)，5.30-4.80(m，4H)，1.80-1.45(m，
6H)，1.14(bs，5H).
实施例14
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，5-二氯苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和2，5-二氯苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.39(s，1H)，8.69(bs，1H)，
7.75(d，J＝6.6Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(d，J＝8.7Hz，1H)，5.19
(m，1H)，4.72(m，3H)，2.75(m，2H)，2.10(m，1H)，0.93(m，6H).
实施例15
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，4-二氯苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和2，4-二氯苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：8.10(dd，J＝8.7，3.9Hz，1H)，7.39(m，1H)，7.26
(m，3H)，5.12(m，2H)，4.88(m，2H)，2.87(m，2H)，2.32(m，1H)，0.97(m，
6H).
实施例16
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-苯基氨基甲酸酯
如实施例8所述，从苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2Br和5-羟基-1-苯基 -3-(三氟甲基)吡唑分3步制备标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：7.72(m，1H)，7.32(m，10H)，
7.17(m，2H)，5.08(m，3H)，4.86(m，1H)，2.81(m，2H)，2.31(m，1H)，1.03
(m，6H).
实施例17
酶活性
在荧光酶测定法中测量S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨 基甲酸酯作为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂的活性。利用连 接有荧光离去基团的合成肽底物测量酶活性。合成底物被酶裂解产生荧 光信号，在分光荧光计或荧光微量滴定板读数器中读取该信号。
在酶测定法中试验从30pM至10μM不等的12种浓度供试化合物。在 2ng(rCaspase 3)天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(购自Becton分 公司PharMingen，San Diego，CA)、各种浓度供试化合物、10μM天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物Ac-DEVD-AMC(SEQ ID NO：1，购自 Quality Controlled Biochemicals，Inc.Hopkinton，MA)和天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶缓冲液(20mM PIPES、100mM NaCl、10mM DTT、 1mM EDTA、0.1％ CHAPS和10％蔗糖，pH7.2)的存在下进行酶反应，总 体积为100μl。在96孔平板中进行酶反应，在37℃下培养30分钟。然 后利用355nm激发滤光器/460nm发射滤光器，用荧光平板读数器(EG&G WALLAG 1420-002)读数。利用GraphPrism软件分析数据，得到关于S-2- 甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯的IC50值为17nM。
实施例18
细胞保护活性
通过检查S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯阻滞 TNF-α诱导HeLa细胞死亡的能力，测定细胞保护活性。该测定法中，在 试验前24小时将25,000个HeLa细胞接种在96孔平板中。在测定当天， 将细胞与八种不同浓度的供试化合物预培养30分钟，然后用TNF-α (25ng/ml)和环己酰亚胺(30μg/ml)攻击细胞，进一步培养24小时。然后 通过两次PBS洗涤除去死亡的细胞，加入100μl细胞群指示溶液(钙黄 绿素AM，最终浓度8μM)。培养20分钟后，在485/510nm下测量荧光信 号，数据以对照百分比表示，对照培养物仅用环己酰亚胺处理。在这些 实验中，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯关于细胞 保护作用的EC50为150nM。
在充分描述本发明的基础上，本领域技术人员将领会到，在广泛而 等价的条件、制剂和其他参数范围内可以实施相同的发明，而不影响本 发明或其任意实施方式的范围。本文引用的所有专利、专利申请和公开 出版物均全文结合在此作为参考文献。
有大量形态改变为经历调节性细胞死亡的细胞所共有，包括血浆与 核膜的水泡状生长、细胞皱缩(核质与胞质的缩合)、细胞器的再定位 与压缩、染色质缩合和编程性细胞死亡的细胞体的产生(含有细胞内材 料的膜限内粒子)(Orrenius，S.，J.Internal Medicine(内科学杂 志)237：529-536(1995))。
编程性细胞死亡是通过细胞自杀的内源性机理而被实现的(Wyllie， A.H.，Cell Death in Biology and Pathology(生物学与病理学中的 细胞死亡)，Bowen和Lockshin编，Chapman and Hall(1981)，pp.9-34)。 作为内部或外部信号的结果，细胞激活它的内部编码的自杀程序。自杀 程序是通过小心调节的遗传程序活化而被执行的(Wylie等，Int.Rev. Cyt.68：251(1980)；Ellis等，Ann.Rev.Cell Bio.(细胞生物学 年评)7：663(1991))。编程性细胞死亡的细胞和细胞体在溶解之前通 常被相邻细胞或巨噬细胞所识别和清除。由于这种清除机理，即使清除 大量细胞也不诱发炎症(Orrenius，S.，J Internal Medicine(内科学 杂志)237：529-536(1995))。
哺乳动物的白介素-1β(IL-1β)在各种病理过程中扮演重要角色，包 括慢性与急性炎症和自体免疫疾病(Oppenheim，J.H.等，Immunology Today(今日免疫学)，7，45-56(1986))。IL-1β是作为与细胞缔合的 前体多肽(IL-1β原)而被合成的，它不能结合IL-1受体，是生物学上 无活性的(Mosley等，J Biol.Chem.(生物化学杂志)262：2941-2944 (1987))。通过抑制前体IL-1β向成熟IL-1β的转化，能够抑制白介素-1 的活性。白介素-1β转化酶(ICE)是负责白介素-1β(IL-1β)活化的蛋白酶 (Thornberry，N.A.等，Nature(自然)356：768(1992)；Yuan，J. 等，Cell(细胞)75：641(1993))。ICE是底物特异性半胱氨酸蛋白 酶，它裂解无活性白介素-1原，产生成熟IL-1。编码ICE和CPP32的基 因是哺乳动物ICE/Ced-3家族基因的成员，该家族目前包括至少十二种 成员：ICE、CPP32/Yama/Apopain、mICE2、ICE4、ICH1、TX/ICH-2、MCH2、 MCH3、MCH4、FLICE/MACH/MCH5、ICE-LAP6和ICErelIII。该家族半胱氨酸 蛋白酶的活性部位(半胱氨酸残基)是ICE介导的编程性细胞死亡所必 需的，其蛋白分解活性似乎是介导细胞死亡的关键(Miura等，Cell(细 胞)75：653-660(1993))。该基因家族最近已经被命名为天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶(Alnernri，E.S.等，Cell(细胞)，87，171(1996)， 和Thornberry，N.A.等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272， 17907-17911(1997))，根据其已知功能分为三组。表1总结了这些已 知的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。
表1 酶* 第I组：炎症介质 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(ICE) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-4(ICErel-II，TX，ICH-2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-5(ICErel-III，TY) 第II组：编程性细胞死亡效应物 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2(ICH-1，mNEDD2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(apopain，CPP-32，YAMA) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7(Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1) 第III组：编程性细胞死亡激活剂 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-6(Mch2) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(MACH，FLICE，Mch5) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(ICE-LAP6，Mch6) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10
IL-1还是参与介导广泛生物学反应的细胞因子，包括炎症、脓毒性 休克、伤口愈合、血细胞生成和某些白血病的发展(Dinarello，C.A.， Blood(血液)77：1627-1652(1991)；diGiovine等，Immunology Today (今日免疫学)11：13(1990))。
根据天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的肽底物结构，已经制备了很 多有力的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。不过，据报道与它们 的体外效力相反，在编程性细胞死亡的全细胞模型中很少有功效良好的 抑制剂(IC50＜1μM)(Thornberry，N.A.Chem.Biol.(化学与生物学)5： R97-103(1998))。因此存在对细胞死亡抑制剂的需求，它们在编程性 细胞死亡的全细胞模型中是有效的，在编程性细胞死亡的动物模型中是 活性的。这些抑制剂因而能够作为治疗剂，用于治疗调节性细胞死亡和 IL-1的细胞因子活性在其中扮演角色的疾病状态。
WO 93/05071公开了下式的肽ICE抑制剂：
Z-Q2-Asp-Q1 其中Z是N-末端保护基团；Q2是0至4个氨基酸，以便序列Q2-Asp相当 于序列Ala-Tyr-Val-His-Asp的至少一部分；Q1包含负电性离去基团。
WO 96/03982公开了下式的天冬氨酸类似物是ICE抑制剂： 其中R2是H或烷基；R3是离去基团，例如卤素；R1是杂芳基-CO或氨基酸 残基。
美国专利5,585,357公开了下式的肽酮是ICE抑制剂： 其中n是0-2；每个AA独立地是L-缬氨酸或L-丙氨酸；R1选自由N-苄 氧羰基等组成的组；R8、R9、R10各自独立地是氢、低级烷基等。
Mjalli等(Bioorg.Med Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学快 报)，3，2689-2692，1993)报道了肽苯基烷基酮的制备，它们是可逆性 ICE抑制剂，例如：
Thornberry等(Biochemistry(生物化学)，33，3934-3940，1994) 报道了肽酰氧基甲基酮对ICE的不可逆灭活作用： 其中Ar是COPh-2，6-(CF3)2、COPh-2，6-(CH3)2、Ph-F5等。
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)37，563-564，1994)报 道了P1天冬氨酸盐类肽α-((2，6-二氯苯甲酰基)氧基)甲基酮的制备，它 们是有力的时间依赖性ICE抑制剂，例如：
Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，4，1965-1968，1994)报道了活化酮的制备，它们是有力的可逆 性ICE抑制剂： 其中X是NH(CH2)2、OCO(CH2)2、S(CH2)3等。
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)37，3863-3866，1994) 报道了α-((1-苯基-3-(三氟甲基)-吡唑-5-基)氧基)甲基酮的制备，它们 是不可逆性ICE抑制剂，例如： Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，5，1405-1408，1995)报道了N-酰基-天冬氨酸酮对ICE的抑制 作用： 其中XR2是NH(CH2)2Ph、OCO(CH2)2环己基等。
Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学 快报)，5，1409-1414，1995)报道了N-酰基-天冬氨酰芳氧基甲基酮对 ICE的抑制作用：
Dolle等(J.Med.Chem.(医药化学杂志)38，220-222，1995)报 道了天冬氨酰α-((二苯氧膦基)氧基)甲基酮的制备，它们是不可逆性ICE 抑制剂，例如：
Graybill等(Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化 学快报)，7，41-46，1997)报道了α-((特窗酰基(tetronoyl))氧基)- 与α-((四氨酰基(tetramoyl))氧基)甲基酮的制备，它们是ICE抑制剂， 例如：
Semple等(Bioorg Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学快 报)，8，959-964，1998)报道了拟肽氨基亚甲基酮的制备，它们是ICE 抑制剂，例如：
Okamoto等(Chem.Pharm.Bull.(化学与药学通报)47，11-21， 1999)报道了肽类ICE抑制剂的制备，使P1羧基转化为酰胺，例如：
EP 618223专利申请公开了作为抗炎剂的ICE抑制剂：
R-A1-A2-X-A3 其中R是保护基团或可选被取代的苄氧基；A1是α-羟基或α-氨基酸残基 或下式原子团： 其中A环可选地被羟基或C1-4烷氧基取代，Ra是CO或CS；A2是α-羟基或 α-氨基酸残基，或者A1和A2一起构成假二肽或拟二肽残基；X是从Asp 衍生的残基；A3是-CH2-X1-CO-Y1、-CH2-O-Y2、-CH2-S-Y3，其中X1是O或S； Y1、Y2或Y3是脂环族残基和可选被取代的芳基。
WO 99/18781公开了下式的二肽： 其中R1是N-末端保护基团；AA是任意天然或非天然的α-氨基酸、β-氨基 酸、α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4是负 电性离去基团；R3是烷基或H，其条件是AA不是His、Tyr、Pro或Phe。 这些二肽在细胞类系统中惊人地是编程性细胞死亡的有力的天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。这些化合物有体内全身活性，在小鼠肝脏 编程性细胞死亡模型中是抗Fas诱导致死性的有力抑制剂，在大鼠缺血 性中风模型中具有强健的神经保护作用。
WO 99/47154公开了下式的二肽： 其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸的残基；R2 是可选被取代的烷基或H。
WO 00/01666公开了C-末端修饰的草氨酰二肽是ICE/ced-3家族半 胱氨酸蛋白酶的抑制剂： 其中A是天然或非天然氨基酸；B是氢原子、氘原子、烷基、环烷基等； R1是烷基、环烷基等；R2是氢、低级烷基等。
WO 00/23421公开了ICE/ced-3家族半胱氨酸蛋白酶的(取代的)酰基 二肽抑制剂： 其中A是天然或非天然氨基酸；B是氢原子、氘原子、烷基、环烷基等； X是CH2、C＝O、O、S、NH、C＝ONH或CH2OC＝ONH；n是0、1或2；q是1 或2；R1是可选被取代的芳基和杂芳基；R2是氢、烷基等；R3是氢、烷基 等。
WO 00/32620公开了γ-酮酸四肽是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3 的抑制剂： 其中R是H和COR1；R1是氢、烷氧基等；R2是氢、CH3等；R3是氢、CH3等； R4是氢、CH3等；R5是C1-6烷基、芳基C1-6烷基等；X2、X3和X4独立地是H， 或者X2与R2、X3与R3或X4与R4可以一起构成饱和的单环。
发明概述
本发明涉及式I化合物： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中 R1是可选被取代的烷基或氢； R2是氢或可选被取代的烷基； R3和R4独立地是氢、可选被取代的芳基、可选被取代的杂环基、可选被 取代的碳环、可选被取代的杂芳基、可选被取代的烷基、可选被取代的 烯基或可选被取代的炔基； R5是可选被取代的烷基、可选被取代的碳环、可选被取代的杂环基、可 选被取代的芳基或可选被取代的杂芳基； Z是O、S、NR8或(CR9R10)n，其中R8、R9和R10独立地是氢、烷基或环烷基， n是0、1、2或3； X是1-2个氨基酸的肽或一条键。
本发明提供药物组合物，包含减少动物编程性细胞死亡有效量的式I 化合物。
本发明涉及由式I代表的化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 的抑制剂这一发现。本发明还涉及本发明化合物的用途，用于减少、预 防或治疗以编程性细胞死亡为原因或结果的疾病。本发明用途的实例包 括治疗或改善动物中枢或外周神经系统、视网膜神经元、心肌或免疫系 统细胞的细胞死亡；治疗或预防动物多囊性肾疾病、肾淀粉样变性、急 性肾衰、环孢菌素A诱导鼠管状上皮细胞死亡、HIV诱导肾病或贫血/红 细胞生成；保护哺乳动物器官或组织不由正常血液供应缺乏引起细胞死 亡；减少或预防供体器官或组织在被移植到宿主内后由宿主免疫细胞的 作用引起的细胞死亡；减少或预防用于体外受精程序的哺乳动物精子或 卵子死亡；延长哺乳动物或酵母细胞系的寿命；治疗或改善哺乳动物脱 发或毛发早白；治疗或改善哺乳动物由暴露于高水平辐射、热或化学品 引起的皮肤损害；治疗或改善动物脓毒症；治疗或改善动物肝炎；治疗 或改善动物1型遗传性酪氨酸血症；治疗或改善慢性酒精摄入诱导的动 物颊黏膜细胞死亡；治疗或改善植物或花卉细胞死亡；治疗或改善辐射 或紫外照射诱导的动物细胞死亡；治疗或改善脊髓发育不良综合征(MDS) 中的骨髓细胞编程性细胞死亡；治疗或改善急性胰腺炎中的编程性细胞 死亡；治疗或预防牛皮癣或炎性肠疾病中的炎性反应；治疗或改善灼伤 后的器官编程性细胞死亡；治疗或改善肠缺血-再灌注后的小肠组织损 伤；和治疗、改善或预防由癌症化学疗法或放射疗法导致的动物口腔黏 膜炎、胃肠黏膜炎、膀胱黏膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死 亡或脱发。
发明的详细说明
本发明的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶与编程性细胞死亡的抑制 剂是通式I化合物： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中 R1是可选被取代的烷基或氢； R2是氢或可选被取代的烷基； R3和R4独立地是氢、可选被取代的芳基、可选被取代的杂环基、可选被 取代的碳环、可选被取代的杂芳基、可选被取代的烷基、可选被取代的 烯基或可选被取代的炔基； R5是可选被取代的烷基、可选被取代的碳环、可选被取代的杂环基、可 选被取代的芳基或可选被取代的杂芳基； Z是O、S、NR8或(CR9R10)n，其中R8、R9和R10独立地是氢、烷基或环烷基， n是0、1、2或3； X是1-2个氨基酸的肽或一条键。若X是一个氨基酸，则它可以是普通 20种氨基酸的任意一种，例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、 Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp、Asn、Glu、Asn、Lys、Arg和His。 若X是肽，则它可以是Asp-Glu、Asp-Ala、Asp-Phe、Val-Glu、Leu-Glu、 Thr-Glu、Ile-Glu、Tyr-Glu和Trp-Glu。
关于R1，优选的烷基是C1-6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、 异丁基、戊基和己基；取代的C1-6烷基，例如CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM)。
优选的R2是被负电性基团或离去基团取代的烷基，包括氟甲基、氯 甲基、烷氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基、烷硫基甲基、芳硫基 甲基、氨基甲基、酰氧基甲基和芳酰氧基甲基。可以出现在R2烷基上的 其他可选取代基的实例非限制性地包括可选在2、4与5位被低级烷基取 代的3-吡唑氧基；3-(1-苯基-3-三氟甲基)吡唑氧基；2，6-二(三氟甲基) 苯甲酰氧基；2，6-二甲基苯甲酰氧基；五氟苯氧基；2，6-二氯苯甲酰氧 基；2-(3-(2-咪唑基)萘基)氧基；二苯氧膦基氧基；特窗酰氧基；和四 氨酰氧基。
关于R3和R4，优选的基团是将匹配天然氨基酸或非天然氨基酸的侧 链的那些。在一种实施方式中，优选的R3是氢，优选的R4是直链或支链 C1-6烷基，包括甲基、乙基、异丙基和异丁基；或者优选的R4是环烷基、 芳基或杂芳基；或者优选的R4是可选被一个或多个羟基、卤素、羧基、 氨基、酰胺、酯、胍基、巯基、烷基巯基、芳基、杂环或杂芳基取代的 直链或支链C1-6烷基。
关于R5，优选的烷基是甲基、乙基、异丙基、异丁基；烷基上的优 选取代基是羟基、羧基、卤素、C4-C7环烷基、饱和与不饱和杂环基、芳 基或杂芳基；优选的环烷基是环戊基和环己基；优选的饱和与不饱和杂 环基是哌啶基和吗啉基；优选的芳基是苯基和萘基；优选的杂芳基是吡 啶基、吲哚基、呋喃基和噻吩基；芳基和杂芳基上的优选取代基是甲基、 乙基、氯、氟、溴、三氟甲基、甲氧基、羟基、羧基、氰基和硝基。尤 其优选的R5是可选被取代的苯基、萘基、杂芳基或苄基。优选的Z是O、 NH或CH2。
本发明涉及由式I代表的化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 的抑制剂这一发现。这些抑制剂减缓或阻滞各种临床疾病和工业应用中 的细胞死亡，其中发生细胞、组织或整个器官的损失。因此，本发明还 涉及治疗、预防或减少编程性细胞死亡在其中起作用的疾病的方法。这 些疾病在下文中有更充分的描述。该方法包含在必要时将抑制编程性细 胞死亡有效量的本发明抑制剂或其药学上可接受的盐或前体药物对动物 给药。
可以用作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物的优 选实施方式是由式II代表的： 或其药学上可接受的盐或前体药物，其中R1-R4是如前文关于式I所定义 的；R6和R7独立地是氢、烷基、可选被取代的烷基、C4-C7环烷基、饱和 或不饱和杂环基、芳基、杂芳基，或者R6和R7联合氮一起构成杂环。
优选的R1是H、Me、Et、t-Bu或AM。优选的R2是氟甲基、酰氧基甲 基、芳酰氧基甲基、芳氧基甲基、杂芳氧基甲基和氨基甲基。关于R6和 R7，优选的烷基是甲基、乙基、异丙基、异丁基；烷基上的优选取代基是 羟基、羧基、氨基甲酰基、羧基酯、卤素、C4-C7环烷基、饱和与不饱和 杂环基、芳基或杂芳基；优选的环烷基是环戊基和环己基；优选的饱和 与不饱和杂环基是哌啶基和吗啉基；优选的芳基是苯基和萘基；优选的 杂芳基是吡啶基、吲哚基、呋喃基和噻吩基；芳基和杂芳基上的优选取 代基是甲基、乙基、氯、氟、溴、三氟甲基、甲氧基、羟基、羧基、氰 基和硝基。R6和R7与氮一起构成的杂环优选为哌啶、吗啉和哌嗪。
关于R3和R4，优选的R3是氢，优选的R4是将匹配天然氨基酸或非天 然氨基酸的侧链的那些。具体来说，优选的R3和R4与所连接的碳、氧和 羰基一起是α-羟基酸的残基。这些α-羟基酸包括但不限于3-甲氧基扁桃 酸、4-甲氧基扁桃酸、2-甲氧基扁桃酸、4-溴扁桃酸、4-甲基扁桃酸、 2，5-二甲基扁桃酸、4-甲硫基扁桃酸、4-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、2-氯 扁桃酸、4-氟扁桃酸、2，3-二氟扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸、2，5-二氟扁 桃酸、3，5-二氟扁桃酸、3，4-二氟扁桃酸、2，6-二氟扁桃酸、2，3，5-三 氟扁桃酸、2，3，6-三氟扁桃酸、3，4-亚甲二氧基扁桃酸、4-三氟甲基扁 桃酸、3-硝基扁桃酸、4-硝基扁桃酸、扁桃酸、六氢扁桃酸、2-羟基-3- 甲基丁酸、2-羟基-3，3-二甲基丁酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基丁酸、 2-羟基丁炔酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸、2-羟基-3-丁烯酸、2-羟基-3- 甲基戊酸、2-羟基-4-甲基戊酸、3-苯基乳酸、乳酸、3-氯乳酸、3-咪唑 乳酸、3，3，3-三氟乳酸、3，3-二氟-3-(4-氟苯基)乳酸、3，3-二氟-3-(4- 甲氧基苯基)乳酸、3，3-二氟-3-(4-氯苯基)乳酸、3，3-二氟-3-苯基乳酸、 3-(1-萘氧基)乳酸、闪白酸、乙醇酸、2-羟基己酸、2-羟基戊酸、2-羟 基辛酸和吲哚-3-乳酸。这些α-羟基酸在商业上可从Aldrich、Sigma、 Lancaster、Maybridge等公司获得。
示范性优选的式I与II的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂非 限制性地包括： 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，5-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，4-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-(2，6-二氯苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DPP)丙基N-(2，6-二氯苯基)-氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸 酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3，4-二氟苯基)氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-苯氧基苯基)氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(羰基-Asp-CH2F)-2-丙烯基N-苯基氨基甲酸酯， 2-(4-咪唑基)-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 3-甲基--1(羰基-Asp-CH2F)丁基N-苯基氨基甲酸酯， 1-苯基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(2-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-(4-氯苯基)-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 1-环己基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯， 2-氯-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯， 2，2，2-三氟-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯，和 Z-缬氨酸2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基酯。 其中Z是苄氧羰基，DPP是二苯氧膦基氧基，PTP是1-苯基-3-(三氟甲基) 吡唑-5-基氧基，DCB是2，6-二氯苯甲酰氧基。
有用的芳基是C6-14芳基，尤其是C6-10芳基。典型的C6-14芳基包括苯基、 萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基和芴基。
有用的环烷基是C3-8环烷基。典型的环烷基包括环丙基、环丁基、环 戊基、环己基和环庚基。
有用的饱和或部分饱和碳环基团是如上所定义的环烷基，以及环烯 基，例如环戊烯基、环庚烯基和环辛烯基。
有用的卤代或卤素基团包括氟、氯、溴和碘。
有用的烷基包括直链与支链C1-10烷基，更优选为C1-6烷基。典型的C1-10 烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、 己基和辛基。还涵盖取代在本发明化合物苯环上两个邻接位置上的1，3- 亚丙基。
有用的烯基包括直链与支链C2-10烯基，更优选为C2-6烯基。典型的C2-10 烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基和辛烯 基。
有用的炔基包括直链与支链C2-10炔基，更优选为C2-6炔基。典型的C2-10 炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基和辛炔基。
有用的芳烷基包括被任意上述C6-14芳基取代的任意上述C1-10烷基。有 用的基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。
有用的卤代烷基包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的C1-10 烷基，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1，1-二氟乙基、 氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。
有用的烷氧基包括被上述C1-10烷基之一取代的氧。
有用的烷硫基包括被上述C1-10烷基之一取代的硫。还包括这类烷硫基 的亚砜和砜。
有用的酰氨基是与氨基氮连接的任意C1-6酰基(烷酰基)，例如乙酰 氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、戊酰氨基、己酰氨基以及芳基取代的C2-6 取代酰基。
有用的酰氧基是与氧基(-O-)连接的任意C1-6酰基(烷酰基)，例如 甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基等。
有用的芳酰氧基包括取代在上述任意酰氧基上的上述任意芳基，例 如2，6-二氯苯甲酰氧基、2，6-二氟苯甲酰氧基和2，6-二(三氟甲基)苯甲 酰氧基。
有用的氨基包括-NH2、-NHR11和-NR11R12，其中的R11和R12是如上所定 义的C1-10烷基或环烷基。
有用的饱和或部分饱和杂环基包括四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、 哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、 奎宁环基、吗啉基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、吡唑烷基、 吡唑啉基、特窗酰基和四氨酰基。
有用的杂芳基包括下列任意一种：噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并 [2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基、 呫吨基、吩噁噻基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡 嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑 基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉 基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、啶基、 菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基、吩噁嗪 基、1，4-二氢喹喔啉-2，3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并[1，2-a]嘧啶 -4-酮、1，2-苯并异噁唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟吲哚基和2-氧代苯并 咪唑基。若杂芳基在环中含有氮原子，则该氮原子可以是N-氧化物的形 式，例如吡啶基N-氧化物、吡嗪基N-氧化物、嘧啶基N-氧化物等。
可选的取代基包括一个或多个烷基；卤代；卤代烷基；环烷基；芳 基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代、卤代烷基或杂芳基取代；芳 氧基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代、卤代烷基或杂芳基取代； 芳烷基；杂芳基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代； 杂芳氧基，可选地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代；烷氧 基；烷硫基；芳硫基；氨基；酰氧基；芳酰氧基，可选地被一个或多个 低级烷基、卤代烷基和芳基取代；二苯氧膦基氧基，可选地被一个或多 个低级烷基、卤代或卤代烷基取代；杂环基，可选地被一个或多个低级 烷基、卤代烷基和芳基取代；杂环烷氧基，可选地被一个或多个低级烷 基、卤代烷基和芳基取代；部分不饱和的杂环烷基，可选地被一个或多 个低级烷基、卤代烷基和芳基取代；或部分不饱和的杂环烷氧基，可选 地被一个或多个低级烷基、卤代烷基和芳基取代。
某些本发明化合物可以存在立体异构体，包括旋光异构体。本发明 包括所有立体异构体和这类立体异构体的外消旋混合物以及个别的对映 异构体，它们可以按照本领域普通技术人员熟知的方法加以分离。
药学上可接受的加成盐实例包括无机与有机酸加成盐，例如盐酸盐、 氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、 富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；和无机与有机碱加成盐，碱例如氢氧化 钠和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS，tromethane)。
前体药物的实例包括式I-II化合物，其中R1是烷基或取代的烷基， 例如CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM酯)。
本发明还涉及治疗动物对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制有应 答的障碍的方法。特别优选用于本发明方法的化合物的实施方式是由如 前文所定义的式I-II所代表的。
本发明的化合物可以利用本领域技术人员已知的方法加以制备。具 体来说，具有氟甲基(CH2F)的式I-II化合物可以如流程1中的示范性反 应所述加以制备。羟基酸与异氰酸苯基酯的反应得到氨基甲酸酯保护的 酸。该酸与中间体羟基胺的偶联(Revesz等，Tetrahedron Lett.(四面 体快报)35：9693-9696(1994))生成酰胺。按照Revesz等(Tetrahedron Lett.(四面体快报)35：9693-9696(1994))，羟基被Dess-Martin试 剂氧化得到酮，为非对映体混合物。可以使用其他氧化剂代替 Dess-Martin试剂，包括氯铬酸吡啶鎓(PCC)。TFA催化t-Bu酯的裂解， 生成酸。
流程1
具有二氯苯甲酰氧基(DCB)的式I-II化合物可以如流程2中的示范 性反应所述加以制备。溴甲基酮与二氯苯甲酸的反应得到酯。通过氢化 作用除去Z保护基团，得到胺，与酸偶联生成酰胺。用TFA裂解t-Bu酯， 得到酸。
流程2
类似地，具有1-苯基-3-(三氟甲基)吡唑-5-基氧基(PTP)和二苯氧膦 基氧基(DPP)的式I-II化合物可以分别如流程3和4中的示范性反应所 述加以制备。
流程3
流程4
本发明的一个重要方面是式I-II化合物是天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶的抑制剂这一发现。因此，这些抑制剂预期减缓或阻滞各种临床 疾病中的细胞死亡，其中发生细胞、组织或整个器官的损失。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防神经系统(脑、脊髓 和外周神经系统)在各种缺血和兴奋毒性条件下的细胞死亡，包括但不 限于由中风引起的局灶性缺血和由心搏停止引起的普遍性缺血，以及脊 髓损伤(Emery等，J.Neurosurgery(神经外科学杂志)89：911-920 (1998)和Springer等，Nat.Med.(天然医药)5：943-946(1999))。 一种特定的用途是治疗缺氧后果，这可能发生在高危分娩婴儿出生或淹 溺期间。细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由创伤性损伤(例如头 部创伤)引起的神经系统细胞死亡、病毒感染或辐射诱导的神经细胞死 亡(例如是癌症放射疗法的副作用)。细胞死亡抑制剂还可以用于减少 或预防一定范围神经变性障碍中的细胞死亡，包括但不限于阿尔茨海默 氏病(Mattson等，Brain Res.(脑研究)807：167-176(1998))、亨 廷顿氏病、帕金森氏病、蛋白感染病毒(prion)病、多发性硬化、肌萎 缩性侧索硬化和脊髓延髓萎缩。在大鼠短暂的局灶性脑缺血模型中可以 试验本发明细胞死亡抑制剂的体内神经保护性质(Xue等，Stroke(中风) 21：166(1990))。
细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善由急性细菌性脑膜炎引起的 中枢或外周神经系统中的细胞死亡。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防任何潜在导致心肌死 亡的疾病中的细胞死亡(Black等，J.Mol.Cel.Card.(分子与细胞心 脏病学杂志)30：733-742(1998)和Maulik等，Free Radic.Biol.Med. (自由基与生物医学)24：869-875(1998))。这包括由心肌缺血与再灌 注引起的心肌梗塞、充血性心力衰竭和心肌病。一种特定的应用是减少 或预防发生在心脏的某些病毒感染中的心肌细胞死亡。
利用Rodriguez等所述“小鼠肝脏编程性细胞死亡”模型(Rodriguez 等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)184：2067-2072(1996))可以试验 本发明细胞死亡抑制剂的体内活性。该模型中，将小鼠用抗Fas抗体静 脉内(IV)处理，该抗体诱导肝脏和其他器官中的大量编程性细胞死亡， 引起全身性器官衰竭和死亡。该模型可用于间接试验本发明细胞死亡抑 制剂的全身生物利用度以及它们的体内抗编程性细胞死亡性质。本发明 的细胞死亡抑制剂因此可以用于减少或预防肝细胞的编程性细胞死亡 (Jones等，Hepatology(肝脏病学)27：1632-1642(1998))，例如 脓毒症(Jaeschke等，J.Immunol.(免疫学杂志)160：3480-3486 (1998))和1型遗传性酪氨酸血症(HT1)(Kubo等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(美国国家科学院院报)95：9552-9557(1998))。本发明的细胞死 亡抑制剂还可以用于治疗肝炎(Suzuki，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(实 验生物学与实验医学会会志)217：450-454(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防视网膜神经元的细胞 死亡(Kermer等，J Neurosci.(神经科学杂志)18：4656-4662(1998) 和Miller等，Am.J.Vet.Res.(美国兽医研究杂志)59：149-152 (1998))，这可能发生在增加眼内压力的障碍(例如青光眼)或与衰老 过程有关的视网膜障碍(例如与衰老有关的黄斑变性)中。抑制剂还可 以用于治疗视网膜的遗传变性性障碍，例如色素性视网膜炎。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防肾脏中的细胞死 亡。这包括肾淀粉样变性(Hiraoka等，Nippon Jinzo Gakkai Shi(日 本肾脏学会志)40：276-83(1998))、急性肾衰(Lieberthal等.Semin Nephrol.18：505-518(1998))、由环孢菌素A诱导的鼠管状上皮细胞 死亡(Ortiz等，Kidney International Supp.(国际肾脏学增刊)68： S25 S29(1998))和HIV诱发的肾病(Conaldi等，J Clin.Invest.(临 床检查杂志)102：2041-2049(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由慢性酒精摄入引 起的颊黏膜细胞死亡(Slomiany等，Biochem.Mol.Biol.Int.(国际 生物化学与分子生物学)45：1199-1209(1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防急性胰腺炎中的编 程性细胞死亡(Iovanna，Int.J.Pancreatol.(国际胰腺病学杂志)20： 77-84(1996)和Sata等，Pancreas(胰腺)19：76-82(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防植物中的细胞死亡 (Richberg等，Curr.Opin.Plant Biol.(植物生物学最新观点)1： 480-485(1998))，例如由病原体引起的植物细胞死亡(Pozo等，Curr. Biol.(最新生物学)8：1129-1132(1998)和Greenberg等，Cell(细 胞)，77：551-563(1994))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防由辐射和紫外照射 引起的细胞死亡(Sheikh等，Oncogene(致癌基因)17：2555-2563 (1998))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防脊髓发育不良综合 征(MDS)中的骨髓细胞编程性细胞死亡(Mundle等，Am.J.Hematol.(美 国血液学杂志)60：36-47(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防在灼伤后早期的器 官编程性细胞死亡，例如胸腺和脾(Fukuzuka等，Ann.Surg(外科学纪 事)229：851-858(1999))。
本发明的细胞死亡抑制剂还可以用于减少或预防免疫系统细胞的早 熟性死亡，特别可用于治疗免疫缺陷性障碍，例如获得性免疫缺陷综合 征(AIDS)、严重联合免疫缺陷综合征(SCIDS)和有关疾病。细胞死亡抑制 剂还可以用于治疗辐射诱发的免疫抑制。
细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善自体免疫障碍，包括红斑狼 疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。
人体器官与组织移植是器官衰竭的普通治疗措施。不过，在移植过 程期间，供体器官或组织面临细胞死亡的危险，因为它在植入宿主之前 缺乏正常的血液供应。这种缺血状态可以用细胞死亡抑制剂处理，将其 输注到供体器官或组织内，或者直接将细胞死亡抑制剂加入到器官/组织 贮存培养基中，也就是说，在将器官或组织移植到哺乳动物体内之前， 将器官或组织浸泡在含有化合物的贮存培养基中。细胞死亡抑制剂还可 以对动物给药，以减少或预防供体器官/组织被移植后的细胞死亡，以保 护它不受宿主免疫细胞的作用，后者通过触发编程性细胞死亡杀死它们 的靶。这类器官和组织的实例非限制性地包括肾、肝、心、胰腺、肺、 角膜、手和胚胎黑质组织。
细胞死亡抑制剂的细胞保护作用还可以用于预防用于体外受精程序 的人或动物精子和卵子死亡。可以在收获过程期间使用这些抑制剂，还 可以在贮存培养基中包括它们。
哺乳动物细胞系、昆虫细胞和酵母细胞常用于产生大量工业或医药 用途的重组蛋白质(例如抗体、酶或激素)。有些细胞系的寿命受到生 长条件、被表达重组分子的本性(有些是有毒的)和其他未知因素的限 制。通过在生长培养基中包括浓度为1-100μM的细胞死亡抑制剂，能够 延长工业细胞系的寿命。
支配毛发生长和脱落的因素多半是未知的。不过有一些证据表明， 编程性细胞死亡至少部分可以引起毛囊退化(称为毛发生长退化期)。 因此，预期通过对动物毛发或毛囊给药，本发明的细胞死亡抑制剂可以 用于治疗由各种条件引起的脱发，包括但不限于男性型秃发、辐射或化 学疗法诱发的脱发和由情绪紧张引起的脱发。还有证据表明，编程性细 胞死亡可能在毛发褪色中起作用。因此，预期本发明的细胞死亡抑制剂 还可以用于治疗或预防毛发早白的情况。
皮肤上皮细胞在暴露于高水平辐射、热或化学品之后可能发生死亡。 预期本发明的细胞死亡抑制剂可以用于治疗、减少或预防这种类型的皮 肤损害。在一种特定的应用中，细胞死亡抑制剂作为局部制剂、例如软 膏剂的一部分，可以涂抹于动物皮肤上，治疗急性曝晒过度，预防皮肤 起疱和脱皮。
Goldberg等(Nature Genetics(自然遗传学)13：442-449(1996)) 最近报道了亨廷顿氏病(HD)基因的蛋白产物huntingtin能够被CPP32而 不是ICE裂解。作为HD基础的突变是HD基因5’末端CAG三核苷酸的扩 展。重复超过36次的三核苷酸扩展与HD的临床表现有关。CAG扩展促进 huntingtin被CPP32裂解，因而与CPP32在HD编程性细胞死亡中的角色 联系起来。具有CPP32抑制活性的本发明化合物可用于阻滞CPP32诱导 的编程性细胞死亡，因而可用于预防和治疗HD和其他以三核苷酸重复扩 展为特征的障碍，例如肌强直性营养不良、脆弱性X精神发育迟缓、脊 髓延髓肌萎缩、I型脊髓小脑性共济失调和Dentato-Rubro pallidoluysian萎缩。
通过在必要时对动物给药，细胞死亡抑制剂还可以用于治疗或改善 肠缺血-再灌注后的小肠组织损伤。参见Farber，A.等，J.Vascular Surg. (血管外科学杂志)30：752-760(1999)。
本发明涉及治疗、改善或预防由癌症化学疗法或放射疗法导致的动 物口腔黏膜炎、胃肠黏膜炎、膀胱黏膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮 肤细胞死亡和脱发的方法，包含将有效量的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂对有此需要的动物给药。
在用化学治疗剂和/或辐射治疗动物以杀死癌细胞时，所不需要的副 作用是迅速分化中的非癌细胞的编程性细胞死亡。这类非癌细胞包括胃 肠道、皮肤、毛发和骨髓的细胞。按照本发明，将天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂对这类非癌细胞给药，以预防这类细胞的编程性细胞 死亡。在优选的实施方式中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂是 局部给药的，例如对胃肠道、口腔、皮肤或头皮，以预防胃肠、口腔、 皮肤或毛发细胞的编程性细胞死亡，但不妨碍癌细胞的死亡。因而，在 一种实例中，通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的局部给药， 有可能用化学疗法或放射疗法治疗脑癌，并保护外部皮肤、毛发细胞、 胃肠道和骨髓。在口腔黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂的用药形式例如可以是口腔洗液或漱口液、凝胶或口用缓释锭 剂，以预防由化学治疗剂或辐射诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 活化和编程性细胞死亡。在胃肠黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂的用药形式可以是这样的，它不是被全身吸收的，或 者覆盖胃肠道的表面，或者是胃肠黏膜炎治疗用栓剂。在直肠炎的情况 下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂在用药时可以作为灌肠剂或 栓剂的一部分。在膀胱黏膜炎的情况下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂可以通过膀胱导管用药。关于预防放射或化学疗法诱发的脱发， 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂在用于头皮时可以是润丝、发胶、 香波或毛发护理剂的形式。重要的是，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抑制剂用药可以在化学治疗剂或辐射给药之前，因而预防或减少化学治 疗剂或辐射对正常细胞的损害作用发生。
本发明范围内的组合物包括所有这样的组合物，其中本发明化合物 的含量对实现其预期目的来说是有效的。尽管个体的需要各不相同，不 过确定每种组分的最佳有效量范围属于本领域技术范围。通常，化合物 可以对哺乳动物、例如人口服给药的剂量为0.0025至50mg/kg体重的受 治疗编程性细胞死亡介导障碍的哺乳动物每天，或其药学上可接受的盐 的等价量，例如神经元细胞死亡、心脏病、视网膜障碍、多囊性肾疾病、 免疫系统障碍和脓毒症。优选地，口服给药约0.01至约10mg/kg，以治 疗或预防这类障碍。关于肌内注射，剂量一般是口服剂量的大约一半。 例如，关于治疗或预防神经元细胞死亡，适合的肌内剂量将是约0.0025 至约25mg/kg，最优选地从约0.01至约5mg/kg。
单位口服剂量可以包含约0.01至约50mg、优选为约0.1至约10mg 化合物。单位剂量可以每日给药一次或多次，分一片或多片，每片含有 约0.1至约10、适宜为约0.25至50mg化合物或其溶剂化物。
在局部制剂中，化合物的浓度可以是约0.01至100mg每克载体。
除了将化合物作为生化学品给药以外，本发明的化合物可以作为药 物制剂的一部分给药，制剂含有适合的药学上可接受的载体，包含赋形 剂和助剂，有利于化合物加工成能够药用的制剂。优选地，制剂、特别 是可以口服或局部给药并且可以用于优选的给药类型的那些制剂，例如 片剂、锭剂、缓释锭剂与胶囊剂、漱口剂与口腔洗液、凝胶、液体悬液、 润丝、发胶、香波，和可以直肠给药的制剂，例如栓剂，以及适合于通 过注射、局部或口服给药的溶液，含有约0.01至99％、优选地从约0.25 至75％活性化合物，以及赋形剂。
在本发明的范围内还包括本发明化合物的无毒性药学上可接受的 盐。将特定的本发明细胞死亡抑制剂的溶液与药学上可接受的无毒性酸 的溶液混合，生成酸加成盐，酸例如盐酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、 乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等。将特定的本发明细胞死 亡抑制剂的溶液与药学上可接受的无毒性碱的溶液混合，生成碱盐，碱 例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆碱、碳酸钠Tris等。
本发明的药物组合物可以对任何可以体验到本发明化合物有益效果 的动物给药。这类动物中最重要的是哺乳动物，例如人，不过本发明不 会局限于此。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其药物组合物可以通过任 何达到预期目的的方式给药。例如，给药可以通过胃肠外、皮下、静脉 内、肌内、腹膜内、透皮、颊、鞘内、颅内、鼻内或局部途径。作为替 代选择或者与此同时，给药可以通过口服途径。给药剂量将取决于受者 的年龄、健康和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率和 所需作用的本性。一般来说，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂是 独立于化学治疗剂而对组织局部给药的，保护该组织不发生编程性细胞 死亡。例如，顺铂可以通过i.v.注射给药，以治疗癌症，例如脑、肺、 乳腺、肝、肾、胰腺、卵巢、前列腺的癌症，而天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶抑制剂可以局部给药，以治疗、改善或预防口腔或胃肠道中的 编程性细胞死亡，例如用于治疗口腔黏膜炎的口腔洗液；用于治疗骨髓 细胞死亡的可IV注射的水溶液；适合于覆盖胃肠表面的口用制剂；或用 于治疗胃肠黏膜炎、包括直肠炎的灌肠剂或栓剂。天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂还可以通过膀胱导管用药，用于治疗、改善或预防膀 胱黏膜炎。作为替代选择或者与此同时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂可以对皮肤和/或头皮局部用药，以治疗、改善或预防毛发与皮 肤细胞中的编程性细胞死亡。在进一步的实施方式中，化学治疗剂或辐 射可以局部施用，以治疗局部化癌症，例如脑、肺、乳腺、肝、肾、胰 腺、卵巢、前列腺的癌症，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂可 以全身给药，例如通过i.v.注射，以治疗、改善或预防胃肠道细胞、口 腔上皮细胞、骨髓细胞、皮肤细胞和毛发细胞中的编程性细胞死亡。例 如在脑癌治疗中的口腔黏膜炎的情况下，不会穿过血-脑屏障的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂例如可以通过i.v.注射全身用药，然后照 射脑肿瘤。这将保护口腔黏膜不受辐射的有害作用，但是天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶抑制剂不会保护脑肿瘤不受辐射的治疗作用。重要的 是，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以在施用辐射之前用药， 因而预防辐射对正常黏膜细胞的损害作用发生。
本发明的药物制剂是按照本身已知的方式生产的，例如借助于常规 的混合、造粒、成型、溶解或冷冻干燥过程。因而，口用药物制剂可以 这样获得，混合活性化合物与固体赋形剂，可选地研磨所得混合物，加 工颗粒混合物，如果需要或必要的话加入适合的助剂后，得到片剂或锭 剂核心。
适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖类，如乳糖或蔗糖，甘露糖 醇或山梨糖醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及 粘合剂，例如淀粉糊，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉， 明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚 乙烯吡咯烷酮。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如上述淀粉，和羧 甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，例如藻酸钠。 助剂尤其是流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅，滑石，硬脂酸或其盐、 如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。为锭剂核心提供适合的包衣， 如果需要的话是耐受胃液的。为此，可以使用浓糖溶液，它可以可选地 含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶 液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐受胃液的包衣，使用适 合的纤维素制剂的溶液，例如乙酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤 维素邻苯二甲酸酯。可以向片剂或锭剂包表中加入染料或色素，例如用 于鉴别或者为了描绘活性化合物剂量的组合。
其他口服用药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊剂以及由明 胶和增塑剂、例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊剂。推入配合式胶 囊剂可以含有颗粒形式的活性化合物，并可以混合有填充剂，例如乳糖， 粘合剂，例如淀粉，和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁，和可选的稳定 剂。在软胶囊剂中，活性化合物是优选地溶解或悬浮在适合的液体中， 例如脂肪油或液体石蜡。另外，可以加入稳定剂。
可能的直肠用药物制剂例如包括由一种或多种活性化合物与栓剂基 质的组合组成的栓剂。适合的栓剂基质例如是天然或合成的甘油三酯、 或石蜡烃。另外，还可能使用由活性化合物与基质的组合组成的直肠用 胶囊剂。可能的基质材料例如包括液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
适合于胃肠外给药的制剂包括水溶性活性化合物的水溶液和碱性溶 液，例如水溶性盐。另外，可以将活性化合物的适当的油性注射悬液给 药。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪 酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或聚乙二醇-400(这些化合物可溶于 PEG-400)。水性注射悬液可以含有增加悬液粘度的物质，例如包括羧甲 基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。可选地，悬液还可以含有稳定剂。
按照本发明的一个方面，在局部和胃肠外制剂中采用本发明的化合 物，用于治疗皮肤损害，例如由暴露于高水平辐射(包括紫外辐射)、 热或化学品所导致的皮肤损害。
还可以在组合物中掺入另外一种或多种对皮肤具有治疗作用的物 质。因而，组合物还可以含有一种或多种能够增加皮肤环AMP水平的化 合物。适合的化合物包括腺苷或核酸水解产物，含量为约0.1-1％，和罂 粟碱，含量为约0.5-5％，二者均基于组合物的重量。还适合的是β-肾上 腺素能激动剂，例如异丙肾上腺素，含量为约0.1-2％，或环AMP，含量 为约0.1-1％，二者仍基于组合物的重量。可以掺入本发明组合物中的其 他适合类型的另外的活性成分包括任何已知对皮肤具有有益效果的化合 物。这类化合物包括类视黄醇，例如维生素A，含量为约0.003-0.3重量 ％，和苯并二氢吡喃醇，例如维生素E或其衍生物，含量为约0.1-10重 量％，二者均基于组合物的重量。另外，可以在美容组合物中掺入抗炎剂 和角膜成形剂。典型的抗炎剂是皮质甾类，例如氢化可的松或其乙酸盐， 含量为约0.25-5重量％，或皮质甾类，例如地塞米松，含量为约0.025-0.5 重量％，二者均基于组合物的重量。典型的角膜成形剂是煤焦油，含量为 约0.1-20重量％，或蒽林，含量为约0.05-2重量％，二者均基于组合物 的重量。
通过适当载体的选择，本发明的局部组合物优选地配制成油剂、霜 剂、洗剂、软膏剂等。适合的载体包括植物或矿物油、白矿脂(白软石 蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和大分子醇(大于C12)。优选的载体是 活性成分可溶于其中的那些。还可以包括乳化剂、稳定剂、湿润剂和抗 氧化剂，如果需要的话，以及赋予颜色或香味的试剂。另外，在这些局 部制剂中可以采用透皮渗入增强剂。这类增强剂的实例可以在美国专利 No.3,989,816和4,444,762中找到。
霜剂优选地从矿物油、自乳化蜂蜡与水的混合物配制而成，在该混 合物中混合有溶解在少量油、例如杏仁油中的活性成分。这样一种霜剂 的典型实例包括约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1份杏仁 油。
软膏剂可以这样配制，将活性成分在植物油、例如杏仁油中的溶液 与热的软石蜡混合，使混合物冷却。这样一种软膏剂的典型实例包括约 30重量％杏仁油和约70重量％白软石蜡。
洗剂适宜这样制备，将活性成分溶于适合的大分子醇，例如丙二醇 或聚乙二醇。
另外，这些组合物可以包括其他药物、生长因子、伤口密封剂、载 体等，它们是为本领域技术人员已知的或显而易见的。本发明的组合物 对已经患有皮肤损害、例如灼伤的温血动物、例如人的给药量足以使愈 合过程比宿主未被治疗时更快。可以根据需要调整长期阶段的维持剂量。 关于兽医用途，可以根据需要给以更高水平的剂量。
在动物患有毛发生长减少的情况下，本发明组合物的给药量足以增 加毛发生长的速率。对该用途有效的量将取决于毛发生长减少的程度和 所治疗患者的一般健康状态。可以根据需要调整长期阶段的维持剂量。 关于兽医用途，可以根据需要给以更高水平的剂量。
当化合物对植物给药时，例如可以喷洒于植物的叶和/或茎和/或花。 所喷洒的化合物可以是颗粒形式或者溶解或悬浮在适当的载体中，例如 水或油-水乳剂。化合物还可以与植物的土壤混合。在这种实施方式中， 化合物被植物的根吸收。
在优选的实施方式中，将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂配 制成口腔洗液的一部分，用于治疗、改善或预防口腔黏膜炎。这类口腔 洗液是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的水溶液，其中还可以含 有醇、甘油、合成甜味剂、表面活性剂、矫味剂和着色剂。它们还可以 含有抗感染剂，例如海克替啶和氯化鲸蜡基吡啶鎓。口腔洗液还可以含 有局部麻醉剂(例如苯佐卡因、可卡因、盐酸达克罗宁、利多卡因、盐 酸丙美卡因或盐酸丁卡因)，例如减轻放射或化学疗法诱发的疮痛。口 腔洗液可以具有酸性或碱性的pH。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington氏药物科学)，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company(1990)，pp.1045，1046，1526和1965。
在另一种优选的实施方式中，将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂配制成能够覆盖胃肠表面的口服制剂，用于治疗、改善或预防胃肠 黏膜炎。胃肠黏膜炎的实例包括食管黏膜炎、胃黏膜炎和肠黏膜炎。这 类制剂可以包含抗胃酸剂，例如碳酸铝、氢氧化铝凝胶、碱式硝酸铋、 碱式水杨酸铋、碳酸钙、碳酸二羟铝钠、镁加铝、碳酸镁、氢氧化镁、 氧化镁、碳酸氢钠、铋乳、氨基乙酸二羟铝、磷酸镁、三硅酸镁和它们 的混合物。其他添加剂非限制性地包括H2-受体拮抗剂、助消化剂、止吐 剂、吸附剂和杂剂(miscellaneous agent)。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington氏药物科学)，A.R.Gennaro，ed.， Mack Publishing Company(1990)，pp.774-778。
诸如顺铂等化学治疗剂和放射疗法经常诱发患者发生早期与晚期呕 吐。因而，在一种实施方式中，将止吐剂与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶抑制剂一起给药，以避免呕吐，保持天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶抑制剂与胃肠道的接触。这类止吐剂的实例非限制性地包括阻滞多巴 胺能呕吐受体的化合物，例如甲氧氯普胺和曲美苄胺，和大麻素类。甲 氧氯普胺可以在化学疗法/放射疗法/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂疗法之前和/或期间口服给药，以预防早期呕吐反应，然后按照美国 专利No.5,760,086和4,536,386进行鼻内给药，以预防迟发的呕吐。 在化学疗法/放射疗法后的期间，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂 和止吐剂可以共同给药，以治疗、改善或预防胃肠黏膜炎。
在进一步的实施方式中，可以将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑 制剂配制成可IV注射的溶液，用于治疗、改善或预防骨髓细胞死亡。
本发明的组合物可以对已经患有化学疗法或放射疗法诱导非癌细胞 死亡的温血动物、例如人给药，或者更优选地在化学疗法或放射疗法之 前或期间给药。
下列实施例是本发明方法和组合物的例证而非限制。常见于临床疗 法中的各种条件和参数的其他适合的修改和调整属于本发明的精神和 范围，它们对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
S-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.叔丁基5-氟-3-[S-2-(苯氨基)羰基氧基丙酰氨基]-4-羟基 戊酸酯
将S-(-)-2-[(苯氨基)羰基氧基]丙酸(201mg，0.96mmol)、EDCI (98mg，0.51mmol)、HOBT(74mg，0.48mmol)、DMAP(28mg，0.23mmol) 与叔丁基3-氨基-5-氟-4-羟基戊酸酯(101mg，0.49mmol)在THF(6ml)中 的混合物在室温下搅拌17小时。将其用1∶1己烷/EtOAc(80ml)稀释， 用水、2N HCl、水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，经Na2SO4干燥。蒸发溶液， 残余物经过快速色谱纯化(己烷/EtOAc 3/2)，得到标题化合物，为白色 固体(80mg，0.21mmol，43％)。1H NMR(CDCl3)：7.40-7.05(m，6H)， 5.18(q，J＝6.9，1H)，4.54-3.95(m，4H)，2.75-2.51(m，2H)，1.51(d，J＝6.9， 3H)，1.42(m，9H).
步骤B.1-(羰基-Asp(O-Bu-t)-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
将periodinane(0.49g，1.16mmol)与叔丁基5-氟-3-[S-2-(苯氨基) 羰基氧基丙酰氨基]-4-羟基戊酸酯(80mg，0.21mmol)在二氯甲烷(6ml)中 的混合物回流20小时。冷却至室温后，加入含有0.5g Na2S2O3的饱和碳 酸氢钠水溶液(10ml)。将所得混合物搅拌1小时，用1∶1己烷/EtOAc(80ml) 萃取。有机相用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，在真空中浓缩，得到标 题化合物，为吸湿性白色固体(69mg，0.18mmol，85％)。
1H NMR(CDCl3)：7.40-7.25(m，5H)，7.13-7.00(m，2H)，5.30- 4.87(m，4H)，3.05-2.71(m，2H)，1.56-1.53(m，3H)，1.42(s，9H).
步骤C.1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯
向1-(羰基-Asp(O-Bu-t)-CH2F)乙基N-苯基氨基甲酸酯(69mg， 0.18mmol)的3ml CH2Cl2溶液中加入1ml TFA。将所得溶液在室温下搅拌 1小时，用EtOAc(80ml)稀释，用饱和Na2HPO4中和至pH~5，用水和盐水 洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩，得到标题化合物，为白色固体(26mg， 0.078mmol，44％)。 1H NMR(DMSO-d6)：9.86(br s， 1H)，8.67(br s，1H)，7.45-7.27(m，4H)，6.99(br s，1H)，5.30-4.80(m，4H)， 4.59(br s，1H)，2.72(br s，2H)，1.37(br s，3H).
实施例2
2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.2-苯氨基羰基氧基-3-甲基丁酸
向2-羟基-3-甲基丁酸(0.20g，1.7mmol)的吡啶(8ml)溶液中加入异 氰酸苯基酯(0.184ml)。将所得溶液在室温下搅拌4小时，用2N HCl酸 化至pH~2，用EtOAc(30ml)稀释。分离有机相，用水和盐水洗涤，经Na2SO4 干燥，在真空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶2己烷/EtOAc，然后是 EtOAc)，得到标题化合物，为无色的油(200mg，0.85mmol，50％)。
1H NMR(DMSO- d6)：9.80(s，1H)，7.47(d，J＝7.8，2H)，7.28(t，J＝7.8，2H)，7.00(t，J＝7.8， 1H)，4.71(d，J＝4.2，1H)，2.17(m，1H)，1.02-0.97(m，6H).
如实施例1所述，从2-苯氨基羰基氧基-3-甲基丁酸和叔丁基3-氨 基-5-氟-4-羟基戊酸酯分三步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.79(s，1H)， 8.62(s，1H)，7.47(d，J＝7.8，2H)，7.28(t，J＝7.8，2H)，7.00(t，J＝7.8，1H)， 5.14-4.60(m，4H)，2.80-2.60(m，2H)，2.10(m，1H)，0.97-0.93(m，6H).
实施例3
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苯基酯 分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.79(s，1H)，8.60(s，1H)，7.47(d，J＝7.5， 2H)，7.28(t，J＝8.2，2H)，7.00(t，J＝7.2，1H)，5.14-4.58(m，4H)，2.80-2.71 (m，2H)，2.10(m，1H)，0.98-0.93(m，6H).
实施例4
S-1-(羰基-Asp-CH2F)乙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从L-(+)-乳酸和异氰酸苄基酯分四步制备标 题化合物。 1H NMR (丙酮-d6)：7.81-7.00(m，7H)，5.37-4.33(m，6H)，2.89-2.67(m，2H)，1.40 (d，J＝6.9，3H).
实施例5
2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苄基酯分四步 制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：12.48(s，1H)，8.59-8.51(m，1H)，7.90-7.80 (m，1H)，7.33-7.24(m，5H)，5.34-4.99(m，2H)，4.70-4.29(m，3H)，4.18(d，J＝ 6.0，2H)，2.85-2.53(m，2H)，2.01(m，1H)，0.92-0.87(m，6H).
实施例6
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苄基氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和异氰酸苄基酯 分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：8.46(s，1H)，7.86(t，J＝6.3，1H)，7.34-7.21 (m，5H)，4.97-4.56(m，4H)，4.18(d，J＝6.0，2H)，2.68(m，2H)，2.02(m，1H)， 0.91-0.86(m，6H).
实施例7
S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨 基甲酸酯
步骤A.S，S-1-羧基-2-甲基丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基 甲酸酯
向S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸(0.2g，1.69mmol)的吡啶(10ml)溶液中 加入甲基(S)-(-)-2-异氰基-3-甲基丁酸酯(0.243ml，1.69mmol)。然后 将所得溶液在室温下搅拌24小时，用2N HCl酸化至pH~2，用EtOAc(30ml) 稀释。分离有机相，用水和盐水洗涤，在真空中浓缩。将残余物溶于饱 和NaHCO3，用4∶1己烷∶EtOAc洗涤。将含水相用2N HCl酸化至pH~2， 用乙酸乙酯萃取(2×30ml)。合并有机层，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干 燥，在真空中浓缩，得到标题化合物，为无色的油(92mg，0.334mmol， 20％)。 1H NMR(DMSO- d6)：6.42(d，J＝8.7，1H)，4.08-3.99(m，2H)，3.62(d，J＝0.9，3H)，2.04-1.93( m，2H)，0.94-0.83(m，12H).
步骤B.S，S-2-甲基-1-(氨基甲酰基-N-(叔丁基5-氟-4-羟基戊酸酯 -3-基)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯
将S，S-1-羧基-2-甲基丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯 (92mg，0.335mmol)、EDCI(66mg，0.335mmol)、HOBt(45mg，0.335mmol)、 DMAP(20mg，0.17mmol)与叔丁基3-氨基-5-氟-4-羟基戊酸酯(69mg， 0.335mmol)在THF(10ml)中的混合物在室温下搅拌20小时，过滤，在真 空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶2己烷/EtOAc)，得到标题化合物，为 无色的油(20mg，0.043mmol，13％)。
1H NMR(CDCl3)：6.98-6.86(m，1H)，5.50(d，J＝9.3，1H)， 5.10-5.05(m，1H)，4.90(d，J＝4.2，1H)，4.50-4.00(m，5H)，3.76(s，3H)，2.74- 2.48(m，2H)，2.33-2.13(m，2H)，1.44(s，9H)，0.99-0.93(m，12H).
步骤C.S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2F)丙基N-(2-甲基-1- 甲氧羰基丙基)氨基甲酸酯
将Dess-Martin试剂(0.2g，0.47mmol)与S，S-2-甲基-1-(氨基甲酰 基-N-(叔丁基5-氟-4-羟基戊酸酯-3-基)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基丙 基)氨基甲酸酯(20mg，0.043mmol)在二氯甲烷(10ml)中的混合物回流20 小时，冷却至室温，加入含有0.2g Na2S2O3的25ml饱和碳酸氢钠水溶液。 将所得混合物搅拌2天，用EtOAc(50ml)稀释，用水和盐水洗涤，经Na2SO4 干燥，在真空中浓缩。残余物经过色谱纯化(3∶1己烷/EtOAc)，得到标题 化合物，为无色的油(12mg，0.026mmol，60％)。1H NMR(CDCl3)：
7.25-7.10(m，1H)，5.52-5.44(m，1H)，5.31-4.84(m，4H)，4.34-4.25(m，1H)，
3.77(d，J＝1.2，3H)，3.09-2.66(m，2H)，2.34-2.12(m，2H)，1.42(d，J＝1.8，
9H)，1.00-0.88(m，12H).
步骤D.S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧羰基 丙基)氨基甲酸酯
向S，S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2F)丙基N-(2-甲基-1-甲氧 羰基丙基)氨基甲酸酯(12mg，0.026mmol)的1.5ml CH2Cl2溶液中加入 0.5ml TFA。将所得溶液在室温下搅拌4小时，用CHCl3稀释(3×15ml)， 在真空中浓缩，得到标题化合物，为浅黄色固体(10.25mg，0.025mmol， 96％)。1HNMR(丙酮-d6)：
7.75-7.40(m，1H)，6.85-6.82(m，1H)，5.34-5.12(m，1H)，4.84-
4.80(m，2H)，4.58-4.43(m，1H)，4.18-4.11(m，1H)，3.71(s，3H)，2.88-2.60
(m，2H)，2.16-2.05(m，2H)，0.98-0.86(m，12H).
实施例8
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯
步骤A.苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB
向苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2Br(300mg，0.75mmol)、2，6-二氯苯甲 酸(215mg，1.12mmol)与KF(217mg，3.75mmol)的混合物中加入无水DMF (5ml)。将混合物在室温Ar下搅拌12小时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。 将溶液用饱和氯化铵水溶液、盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥。除去溶剂， 残余物用快速柱色谱纯化(己烷∶EtOAc，2∶1)。得到标题化合物，为无色 的油(296mg，0.67mmol，89％)。1H NMR(CDCl3)：7.34(m，8H)，5.97(d，J＝8.7，1H)，5.21(d，J＝6.6，2H)，5.16 (s，2H)，4.70(m，1H)，2.90(m，2H)，1.28(s，9H).
步骤B.S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲 酸酯
向苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB(150mg，0.34mmol)的乙醇(20ml) 溶液中加入Pd/C(30mg)和含水HCl(0.2ml，6N)。将混合物在H2下搅拌 3小时，然后过滤除去Pd/C。浓缩乙醇溶液，残余物用于下面的反应。 将S-2-苯氨基-1-羰氧基-3-甲基丁酸(81mg，0.34mmol)、EDCI(65mg， 0.34mmol)、HOBt(52mg，0.34mmol)、DMAP(24mg，0.20mmol)与 NH2-Asp(OBu-t)-CH2DCB-HCl在THF(10ml)中的混合物在室温下搅拌16 小时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。将溶液用含水NaOH(1N)、含水HCl(1N)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥。浓缩溶液，残余物经过快速柱色谱纯 化，得到标题化合物，为淡黄色固体(41mg，0.07mmol，22％)。
1H NMR(CDCl3)：7.28(m，8H)，5.05(m，3H)，4.67(m，1H)，2.88 (m，2H)，2.31(m，1H)，1.42(s，9H)，0.91(m，6H).
步骤C.S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯
向S-2-甲基-1-(羰基-Asp(OBu-t)-CH2DCB)丙基N-苯基氨基甲酸酯 的CH2Cl2(2ml)溶液中加入TFA(1ml)。将混合物在25℃Ar下搅拌12小 时，然后用乙酸乙酯(30ml)稀释。将溶液用饱和含水Na2HPO4洗涤，经Na2SO4 干燥。蒸发之，在真空下干燥残余物。得到标题化合物，为黄色固体(18mg， 0.03mmol，47％)。
1H NMR(CDCl3)：7.29(m，8H)，5.00(m，3H)，4.21(m， 1H)，2.91(m，2H)，2.35(m，1H)，0.97(m，6H).
实施例9
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3-氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和3-氟苯基异 氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：10.09(bs，1H)，8.73(m，1H)，8.29(m，1H)， 7.35(m，3H)，6.83(s，1H)，5.18(m，1H)，4.69(m，3H)，2.60(m，2H)，2.11(m， 1H)，0.96(m，6H).
实施例10
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和4-氟苯基异 氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.73(bs，1H)，8.56(bs，1H)， 7.33(s，2H)，7.00(s，2H)，5.05(m，1H)，4.55(m，3H)，2.52(m，2H)，1.97(m， 1H)，0.81(m，6H).
实施例11
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(3，4-二氟苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和3，4-二氟苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：10.09(bs，1H)，8.65(bs， 1H)，7.56(m，1H)，7.37(m，1H)，7.24(m，1H)，5.05(m，1H)，4.65(m，3H)， 2.73(m，2H)，2.11(m，1H)，0.95(m，6H).
实施例12
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(4-苯氧基苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和4-苯氧基苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：12.45(bs，1H)，9.84(bs，
1H)，8.65(m，1H)，7.48(d，J＝8.7Hz，2H)，7.35(dd，J＝7.5，8.4Hz，2H)，7.08
(dd，J＝7.2，7.5Hz，2H)，6.95(m，3H)，5.22(m，1H)，4.69(m，3H)，2.62(m，
2H)，2.09(m，1H)，0.93(m，6H).
实施例13
S-1-环己基-1-(羰基-Asp-CH2F)甲基N-苯基氨基甲酸酯
通过实施例1和2所述方法，从S-(+)-六氢扁桃酸和异氰酸苯基酯 制备标题化合物，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)：9.76(bs，1H)，8.68
(bs，1H)，7.44-7.27(m，4H)，6.99(bs，1H)，5.30-4.80(m，4H)，1.80-1.45(m，
6H)，1.14(bs，5H).
实施例14
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，5-二氯苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和2，5-二氯苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(DMSO-d6)：9.39(s，1H)，8.69(bs，1H)，
7.75(d，J＝6.6Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(d，J＝8.7Hz，1H)，5.19
(m，1H)，4.72(m，3H)，2.75(m，2H)，2.10(m，1H)，0.93(m，6H).
实施例15
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-(2，4-二氯苯基)氨基甲酸酯
如实施例1和2所述，从S-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸和2，4-二氯苯 基异氰酸酯分四步制备标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：8.10(dd，J＝8.7，3.9Hz，1H)，7.39(m，1H)，7.26
(m，3H)，5.12(m，2H)，4.88(m，2H)，2.87(m，2H)，2.32(m，1H)，0.97(m，
6H).
实施例16
S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2PTP)丙基N-苯基氨基甲酸酯
如实施例8所述，从苄氧羰基-Asp(OBu-t)-CH2Br和5-羟基-1-苯基 -3-(三氟甲基)吡唑分3步制备标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：7.72(m，1H)，7.32(m，10H)，
7.17(m，2H)，5.08(m，3H)，4.86(m，1H)，2.81(m，2H)，2.31(m，1H)，1.03
(m，6H).
实施例17
酶活性
在荧光酶测定法中测量S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨 基甲酸酯作为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂的活性。利用连 接有荧光离去基团的合成肽底物测量酶活性。合成底物被酶裂解产生荧 光信号，在分光荧光计或荧光微量滴定板读数器中读取该信号。
在酶测定法中试验从30pM至10μM不等的12种浓度供试化合物。在 2ng(rCaspase 3)天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(购自Becton分 公司PharMingen，San Diego，CA)、各种浓度供试化合物、10μM天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3底物Ac-DEVD-AMC(SEQ ID NO：1，购自 Quality Controlled Biochemicals，Inc.Hopkinton，MA)和天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶缓冲液(20mM PIPES、100mM NaCl、10mM DTT、 1mM EDTA、0.1％ CHAPS和10％蔗糖，pH7.2)的存在下进行酶反应，总 体积为100μl。在96孔平板中进行酶反应，在37℃下培养30分钟。然 后利用355nm激发滤光器/460nm发射滤光器，用荧光平板读数器(EG&G WALLAG 1420-002)读数。利用GraphPrism软件分析数据，得到关于S-2- 甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯的IC50值为17nM。
实施例18
细胞保护活性
通过检查S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯阻滞 TNF-α诱导HeLa细胞死亡的能力，测定细胞保护活性。该测定法中，在 试验前24小时将25,000个HeLa细胞接种在96孔平板中。在测定当天， 将细胞与八种不同浓度的供试化合物预培养30分钟，然后用TNF-α (25ng/ml)和环己酰亚胺(30μg/ml)攻击细胞，进一步培养24小时。然后 通过两次PBS洗涤除去死亡的细胞，加入100μl细胞群指示溶液(钙黄 绿素AM，最终浓度8μM)。培养20分钟后，在485/510nm下测量荧光信 号，数据以对照百分比表示，对照培养物仅用环己酰亚胺处理。在这些 实验中，S-2-甲基-1-(羰基-Asp-CH2F)丙基N-苯基氨基甲酸酯关于细胞 保护作用的EC50为150nM。
在充分描述本发明的基础上，本领域技术人员将领会到，在广泛而 等价的条件、制剂和其他参数范围内可以实施相同的发明，而不影响本 发明或其任意实施方式的范围。本文引用的所有专利、专利申请和公开 出版物均全文结合在此作为参考文献。
发明背景
序列表 <110>Cytovia Inc. Wang，Yan Cai，Sui Weber，Eckard Mills，Gordon Green，Douglas Guan，Lufeng <120>取代的α-羟基酸天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其用途 <130>1735.040PC02 <140>待指定 <141>待指定 <150>60/157，077 <151>1999-08-27 <150>60/158，373 <151>1999-10-12 <160>1 <170>PatentIn 3.0版 <210>1 <211>7 <212>PRT <213>不确定 <400>1 Asp Glu Val Asp 1
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