本发明涉及一种可被用于体外受精的固体产物。

本发明的背景

已经发现了几种减数分裂激活物质(下文称作MAS)。

当MAS被保持在含有卵母细胞的培养基中时，卵母细胞变得更加容易 受精。然而，使用MAS的主要问题在于它们通常具有非常低的溶解度。

本发明的概述

本发明的一个目的是研制一种含有MAS或其一种能溶于水介质中的 衍生物的组合物。

本发明的另一个目的是研制一种含有MAS或其一种不需要任何物理 干预如加热、搅拌或超声波处理就能溶于水介质中的衍生物的组合物。 本发明的详述

优选的MAS，即FF-MAS，在水中的溶解度很小，即大约为20皮克/ml (相当于2×10-5μg/ml)，而在乙醇中的溶解度相当大，即大约为4mg/ml。 根据我们的初步研究，FF-MAS在乙醇和水(1∶2.5)中的最大溶解度大约 为0.4mg/ml。几种其它的MAS在水中也具有类似低的溶解度。

令人惊奇地是，目前已经发现含有MAS和一种添加剂的固体组合物在 水中具有良好的溶解性。所述添加剂是这样一种组分，当添加到MAS中 时，可以提供一种能被用来制备一种含有MAS的水溶液的组合物。  

所述添加剂的实例是水溶性蛋白质如血清白蛋白，例如人血清白蛋白 (本文被称作HSA)，选择性地以重组的形式存在，酶和磷酸甘油酯如磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇。

优选地，本发明的组合物的含量低于10％，优选地低于5％，更优选地 低于1％(重量/重量)。

优选地，本发明的组合物中的有机溶剂含量低于10％，优选地低于5％， 更优选地低于1％(重量/重量)。

优选地，本发明的组合物的MAS含量低于1％，优选地低于0.1％，更 优选地低于0.05％(重量/重量)。

优选地，本发明的组合物的添加剂含量高于99％，更优选地高于 99.9％。  

本发明的优选组合物是这样一种组合物，其可以用不含有或只含有低 浓度有机溶剂的水介质进行处理产生一种含有MAS的溶液。优选地，这 些水介质含有少于1％，优选地少于0.5％，更优选地少于0.1％的有机溶剂 (重量/重量)。

早期，为了满足这一要求所进行的数次尝试都失败了。

本文中，术语MAS是指介导卵母细胞进行减数分裂的化合物。更具体 地，MAS是在下述实施例1中的试验中具有明显高于对照的生发泡裂解 (下文被称作GVB)百分率的化合物。优选的MAS具有至少50％的GVB百 分率，优选地至少80％。优选的MAS的实例是4，4-二甲基-5α-胆甾-8， 14，24-三烯-3β-醇(下文称作FF-MAS)；4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14， 24-三烯-3β-醇半琥珀酸酯；5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇；5α-胆甾-8， 14-二烯-3β-醇半琥珀酸酯；(20S)-胆甾-5-烯-3β，20-二醇；3β-羟基 -4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14-二烯-24-酸-N-(甲硫氨酸)酰胺；和胆甾 -5-烯-16β-醇。其它的MAS实例是在WO 96/00235，96/27658，97/00884， 98/28323，98/54965和98/55498中提到的MAS，更具体地是在其权利要 求1中提到的MAS。

制备本发明的组合物的一种方法是将MAS在有机溶剂如乙醇中的溶 液与添加剂的水溶液混合，然后直到所述溶剂蒸发尽。通过利用该产物 上方持续流动的空气、真空或任何其它用于除去溶剂的可行方法来加快 蒸发进程。被销售的该产物可以是一种具有一个或多个凹或穴的递送系 统。下文中，这些凹和穴被相互称作穴。这些穴中的至少一个含有一种 本发明的组合物。放置该固体MAS的合理可行的方法是首先将含有MAS 和所述添加剂的溶液放置在穴中，然后使该溶液进行蒸发。以这种方式 获得的蒸发残留物，即本发明的组合物被直接置于所述装置(递送系统) 的穴中。

由于本发明的组合物被用于卵母细胞的处理，所以对于本发明的组合 物来说，不含对卵母细胞产生负面影响的组分是相当重要的。

使用本发明组合物的一种方法是在水介质如水中溶解该组合物，然 后，如果需要，添加其它的对卵母细胞的成熟可能具有有益影响的组分。

使用本发明组合物的另一种方法是在一种通常用于体外成熟的介质 中溶解该组合物。

本发明通过下列实施例得到进一步说明，然而，这些实施例并不能被 解释为对本发明保护范围的限制。以上说明书和以下实施例中记载的特 征可以以任何结合的方式成为以不同形式实现本发明的物质。 实施例1  用于测定一种化合物是否为MAS的方法

从体重为13-16克的未成熟雌性小鼠(C57BL/6J x DBA/2J F1， Bomholtgaard，丹麦)中获得卵母细胞，然后将该卵母细胞保存在控制温 度(20-22℃)，光线(以6.00-18.00照射)和相对湿度(50-70％)下。给 所述小鼠腹膜内注射0.2ml含20 IU FSH的促性腺激素(Gonal-F， Serono)，并且48小时后采用颈转位处死所述小鼠。剥离出小鼠的卵巢 并且通过在立体显微镜下和Hx-介质(如下所示)中使用一对27号的针 手工刺破卵泡来分离卵母细胞。显示完整生发泡(下文称作GV)的球形 卵母细胞被分成丘封闭卵母细胞(下文称作CEO)和裸露卵母细胞(下文 称作NO)并被放置在添加了3mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat.No. A-7030)，5mg/ml人血清白蛋白(HSA，国家血清研究所(State Serum Institute)，丹麦)，0.23mM丙酮酸酯(Sigma，Cat.No S-8636)，2mM 谷氨酰胺(Flow Cat.No.16-801)，100 IU/ml青霉素和100μg/ml链 霉素(Flow，Cat No.16-700)的α-极限必需培养基(不含核糖核苷的α -MEM，Gibco BRL，Cat.No.22561)中。该培养基添加了3mM次黄嘌呤 (Sigma Cat.No.H-9377)并被命名为Hx-培养基。

所述卵母细胞用Hx-培养基冲洗三次并且将大小一致的卵母细胞分 成CEO和NO两组。将CEO和NO培养在4-孔多孔平皿(multidishes) (Nunclon，丹麦)中，每孔中含有0.4ml Hx-培养基和浓度为10μM的 待检测化合物。1个对照孔(即，在不加待检测化合物的相同培养基中培 养的35-45个卵母细胞)总是与3个测试孔(每个添加了待检测化合物的 孔中35-45个卵母细胞)同时进行培养。

所述卵母细胞在含5％CO2的潮湿环境中于37℃下培养24小时。培养 结束时，采用立体显微镜(Wildt，Leica MZ 12)分别对具有GV，GVB和极 性体(下文称作PB)的卵母细胞数目进行计数。GVB的百分率，被定义 为该孔中经历GVB的卵母细胞相对卵母细胞总数的百分率，如下进行计 算：％GVB＝((GVB的数目+PB的数目)/卵母细胞的总数)×100。 实施例2  用于测定一种化合物是否能被用作本发明组合物中的添加

     剂的方法

用于FF-MAS组合物的添加剂的特征在于：

改善FF-MAS在乙醇/水(1∶2.5v/v)中的溶解度；

在MEMα培养基中重新配制组合物后确保得到FF-MAS的清澄溶液；

当对从未成熟雌性小鼠中获得的卵母细胞进行测试时，确保GVB百分 率至少为50％。

制备饱和的FF-MAS乙醇溶液。以1∶2.5的比例与添加剂的水溶液混 合。通过目测控制过剩的FF-MAS可以在所述溶液中获得。在室温下使所 述溶液旋转24小时。通过0.22μm的过滤器过滤所述溶液，通过HPLC测 定FF-MAS的含量并且计算溶解度。将350μl转移到4-孔平皿中并在室温 下蒸发至干。加入500μl MEMα培养基(Gibcobal)。如果在半小时内获 得清澄溶液，用由未成熟雌性小鼠得到的卵母细胞测试所述组合物。获 得的％GVB至少为50％，优选地80％，参见实施例1。 实施例3  含有人血清白蛋白(HSA)的组合物

在该实施例中，制备了三种产物。参照以下表格，用于产物1，2和3 的FF-MAS原液分别含有50，500和3330μg/ml的FF-MAS。对于每种产 物，HAS原液含20％的HAS。所述原液的使用量如表中所述。例如，对于 产物1，将400μl的FF-MAS原液与1000μl的HAS原液进行混合。将这 些原液混合后，所得到的溶液清澄，其中没有观察到沉淀。混合后，将 表中所示的量转移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麦)中。例如，对于产物 1,350μl的所述混合物最终被转移到多孔平皿中，所述溶液在室温下蒸发 至于。蒸发后，一些产物在平皿中呈乳白色、透明薄膜状，其它一些产 物肉眼看不到。在该实施例中，FF-MAS的最高溶解浓度为0.95mg/ml。

使用前，加入500μl的MEMα培养基(Gibcobal)，室温下半小时内获 得FF-MAS和HAS的清澄溶液。   4-孔-多孔平皿     No.1     4-孔-多孔平皿     No.2     4-孔-多孔平皿     No.3  FF-MAS的乙醇溶液     50μg/ml     400μl     -     -  FF-MAS的乙醇溶液     500μg/ml     -     400μl     -  FF-MAS的乙醇溶液     3.33μg/ml     -     -     450μl  HSA的水溶液     20％     1000μl     1000μl     1125μl  转移到多孔平皿中的量     350μl     350μl     525μl  FF-MAS与HAS之间的比例     1∶10,000     1∶1,000     1∶150  蒸发前溶液的外观     清澄，无色溶液，没有沉淀 实施例4  含有人血清白蛋白(HAS)的组合物

与前面实施例所述类似，通过在室温下混合样品以下述浓度制备含有 HSA的FF-MAS的水/乙醇溶液。蒸发后，溶液清澄，没有观察到沉淀的产 生。所述溶液被转移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麦)中。最后，所述溶 液在室温下蒸发至干。

使用前，加入500μl的MEMα培养基(Gibcobal)，在室温下半小时内 获得FF-MAS和HAS的清澄溶液。

用由未成熟雌性小鼠获得的卵母细胞对配方进行了测试。各配方的％ GVB如下表所示。     4-孔-多孔平皿     No.1     4-孔-多孔平皿     No.2     4-孔-多孔平皿     No.3  FF-MAS的乙醇溶液     5.22μg/ml     100μl     -     -  FF-MAS的乙醇溶液     26.1μg/ml     -     100μl     -  FF-MAS的乙醇溶液     261μg/ml     -     -     100μl  HSA的水溶液     20％     250μl     250μl     250μl  FF-MAS与HAS之间的比  例     1∶10,000     1∶2,000     1∶200  每孔中的FF-MAS的理  论量     0.5μg     2.5μg     25μg  ％GVB     72     93     91 实施例5  含有人血清白蛋白(HAS)的组合物

与前面实施例所述类似，通过在室温下混合样品以下述浓度制备含有 HSA的FF-MAS的水/乙醇溶液。蒸发后，溶液清澄，没有观察到沉淀的产 生。所述溶液被转移到4-孔多孔平皿(Nuclon，丹麦)中。最后，所述溶 液在室温下蒸发至干。

使用前，加入500μl的MEMα培养基(Gibcobal)，在室温下半小时内 获得FF-MAS和HAS的清澄溶液。

利用HPLC测定重新配制后FF-MAS的浓度，其结果如下所述。用由未 成熟雌性小鼠获得的卵母细胞对配方进行了测试。各配方的％GVB如下表 所示。 4-孔-多孔平皿     No.1   4-孔-多孔平皿     No.2  4-孔-多孔平皿     No.3  4-孔-多孔平皿     No.4  4-孔-多孔平皿     No.5  FF-MAS的乙醇  溶液   26.1μg/ml     100μl     -     -     -     -  FF-MAS的乙醇  溶液  7.83μg/ml     -     100μl     -     -     -  FF-MAS的乙醇  溶液  5.22mg/ml     -     -     100μl     -     -  FF-MAS的乙醇  溶液  2.5μg/ml     -     -     -     100μl     -  FF-MAS的乙醇  溶液  0.5μg/ml     -     -     -     -     100μl  HAS的水溶液  20％     250μl     250μl     250μl     250μl     250μl  FF-MAS与HAS  之间的比例     1∶100,000     1∶20,000     1∶10,000     1∶6667     1∶2000  每孔中的  FF-MAS的理论  量     0.05μg     0.25μg     0.5μg     0.75μg     2.5μg  ％GVB     13     52     78     82     90