发明领域

本发明属于医药化学的领域。特别是，本发明涉及具有新的N端 保护基的二肽caspase抑制剂。本发明还涉这些caspase抑制剂在减 少或治疗细胞凋亡性细胞死亡和/或降低白介素1-β产生中的应用。

背景的描述

生物体通过一种称呼各异的过程消除不需要的细胞，该过程被 称作调节性细胞死亡、编程性细胞死亡或者细胞凋亡。这种细胞死 亡作为动物发育的一个正常方面存在并且存在于组织内稳态和衰老 中(Gluck-smann，A.，Biol.Rev.Cambridge Philos.Soc.26： 59-86(1951)；Glucksmann，A.，Archives de Biologie 76： 419-437(1965)；Ellis et al.，Dev.112：591-603(1991)； Vaux et al.，Cell 76：777-779(1994))。细胞凋亡调节细胞的 数量，促进形态建成，除去有害或异常细胞并且消除业已执行完其 功能的细胞。另外，细胞凋亡发生在对多种生理应激如氧不足或局 部缺血的应答中(PCT公开的专利申请WO96/20721)。

经历调节性细胞死亡的细胞共有多种形态学变化，包括血浆和 核膜水泡状生长、细胞皱缩(合质和细胞质的缩聚)、细胞器再定位 和压缩、染色质浓缩和细胞凋亡体(含有细胞内物质的包膜颗粒)的 产生(Orrenius，S.，J.Internal Medicine 237：529-536 (1995))。

细胞凋亡通过一种细胞自发失活的内源性机制完成(Wyllie，A. H.，见《生物学和病理学细胞死亡》(Cell Death in Biology and Pathology)，Bowen and Lockshin，eds.，Chapman and Hall (1981)，pp.9-34)。作为内部或外部信号的结果，细胞激活内部 编码的自发失活程序。该自发失活程序经过激活的谨慎调节性遗传 程序完成(Wylie et al.，Int.Rev.Cyt.68：251(1980)； Ellis et al.，Ann.Rev.Cell Bio.7：663(1991))。细胞凋 亡性细胞和机体在溶解之前常常被相邻细胞或巨噬细胞识别和清 除。由于这种清除机理，虽然很多数量的细胞被清除，但不会诱发 炎症(Orrenius，S.，J.Internal Medicine 237：529-536 (1995))。

哺乳动物白介素-1β(IL-1β)在许多病变过程中起重要作用，包 括慢性和急性炎症和自身免疫性疾病(Oppenheim et.al. Immunology Today，7：45-56(1986))。IL-1β是合成的细胞相关 性前体多肽(pro-IL-1β)，其无法结合IL-1受体并且在生理学上无 活性(Mosley et al.，J.Biol.Chem.262：2941-2944 (1987))。通过抑制前体IL-1β向成熟IL-1β的转化，可以抑制白介 素-1的活性。白介素-1β转化酶(ICE)是负责激活白介素-1β(IL-1β) 的蛋白酶(Thornberry et al.，Nature 356：768(1992)；Yuan et al.，Cell 75：641(1993))。ICE是裂解无活性前白介素-1产 生IL-1的底物特异性半胱氨酸蛋白酶。编码ICE和CPP32的基因是哺 乳动物ICE/Ced-3家族的成员，其目前包括至少12种：ICE、 CPP32/Yama/Apopain、mICE2、ICE4、ICH1、TX/ICH-2、MCH2、 MCH3、MCH4、FLICE/MACH/MCH5、ICE-LAP6和ICErelIII。半胱氨酸 蛋白酶的这个家族的蛋白水解活性在介导细胞死亡中表现出决定性 作用，其活化位点(半胱氨酸参见)是ICE介导性细胞凋亡所必需的 (Miura et al.，Cell 75：653-660(1993))。这个基因家族最近 被命名为caspase类(Alnernri et.al.Cell，87：171(1996)， and Thornberry et.al.，J.Biol.Chem.272：17907-17911 (1997))，并且按照其已知功能划分为三组。表1总结了已知 caspase。

               表I 酶* 组I：炎症的介质 Caspase-1(ICE) Caspase-4(ICErel-II，TX，ICH-2) Caspase-5(ICErel-III，TY) 组II：细胞凋亡的效应子 Caspase-2(ICH-1.mNEDD2) Cassasse-3(anopain.CPP- 32，YAMA) Caspase-7(Mch-3.ICE-LAPRCMH-1) 组III：细胞凋亡的激活剂 Caspase-6(Mch2) Caspase-8(MACH.FLICE.Mch5) Caspase-9(ICE-LAP6.Mch6) Caspase-10

IL-1也是参与介导多种生理反应的细胞因子，包括炎症、脓毒 性休克、创伤愈合、血细胞生成和某些白血病的生长(Dinarello， C.A.，Blood 77：1627-1652(1991)；diGiovine et al.， Immunology Today 11：13(1990))。

迄今为止已经制备出多种基于caspase的肽底物结构的有效 caspase抑制剂。然而，与其体外效价对比，在已见报导的细胞凋 亡的整细胞模型中具有良好功效(IC50＜1μM)的抑制剂并不太多 (Thornberry，N.A.Chem.Biol.5：R97-103(1998))。因此 需要提供在细胞凋亡的整细胞模型中有功效且在细胞凋亡的动物模 型中有活性的细胞死亡抑制剂。这些抑制剂可以在治疗其中IL-1的 调节性细胞死亡和细胞因子活性起作用的疾病状态中用作治疗剂。

WO93/05071公开了具有下式肽ICE抑制剂：

               Z-Q2-Asp-Q1

其中Z是N端保护基；Q2是0-4个氨基酸使序列Q2-Asp对应于序列 Ala-Tyr-Val-His-Asp(SEQ ID NO：1)的至少一部分；Q1含有负电 性离去基团。

WO96/03982公开了作为ICE抑制剂的具有下式的天冬氨酸类似 物： 其中R2是H或烷基；R3是离去基团如卤素；R1是杂芳基-CO或氨基酸 残基。

U.S.专利5,585,357公开了作为ICE抑制剂的具有下式的肽酮类 化合物： 其中n是0-2；各个AA独立地是L-缬氨酸或L-丙氨酸；R1选自N-苄氧 基羰基和其它基团；R8、R9、R10分别独立地是氢、低级烷基和其它 基团。

Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.3：2689-2692(1993)) 报告了成为ICE可逆性抑制剂的肽苯基烷基酮类化合物的制备，例 如：

Thornberry等(Biochemistry 33：3934-3940(1994))报告了 ICE被肽酰氧基甲基酮类化合物的不可逆性灭活： 其中Ar是COPh-2，6-(CF3)2、COPh-2，6-(CH3)2、Ph-F5和其它基团。

Dolle等(J.Med.Chem.37：563-564(1994))报导了作为有 效的时间依赖性ICE抑制剂的P1含天冬氨酸的肽α-((2，6-二氯苯甲 酰基)氧基)甲基酮类化合物的制备，例如：

Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.4：1965-1968，(1994)) 报导了作为有效的ICE可逆性抑制剂的活化酮类化合物的制备： 其中X是NH(CH2)2、OCO(CH2)2、S(CH2)3和其它基团。

Dolle等(J.Med.Chem.37：3863-3866(1994))报导了作为 ICE的不可逆抑制剂的α-((1-苯基-3-(三氟甲基)-吡唑-5-yl)氧基) 甲基酮类化合物，例如：

Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.5：1405-1408(1995)) 报导了N-酰基-天冬氨酸酮类化合物对ICE的抑制作用： 其中XR2是NH(CH2)2Ph、OCO(CH2)2环己基和其它基团。

Mjalli等(Bioorg.Med.Chem.Lett.5：1409-1414(1995)) 报导了ICE通过N-酰基天冬氨酰基芳氧基甲基酮类化合物的抑制， 例如：

Dolle等(J.Med.Chem.38：220-222(1995))报导了作为ICE 的不可逆抑制剂的天冬氨酰基α-((二苯基氧膦基)氧基)甲基酮类化 合物的制备，例如：

Graybill等(Bioorg.Med.Chem.Lett.7：41-46(1997))报 导了作为ICE抑制剂的α-((特窗酰基)氧基)-和α-((特窗氨酰基 (tetramoyl))氧基)甲基酮类化合物的制备，例如：

Semple等(Bioorg.Med.Chem.Lett.8：959-964(1998))报 导了作为ICE抑制剂的肽拟氨基亚甲基酮类化合物的制备，例如：

Okamoto等(Chem.Pharm.Bull.47：11-21(1999))报告了具 有可转化为酰胺的P1羧基的含肽ICE抑制剂的制备，例如：

EP618223专利申请公开了作为抗炎剂的ICE抑制剂：

                   R-A1-A2-X-A3 其中R是保护基或任选取代的苄氧基；A1是α-羟基或α-氨基酸残基 或下式的基团： 其中环A任选地被羟基或C1-4烷氧基取代和Ra是CO或CS；A2是α-羟基 或α-氨基酸残基，或A1和A2一起构成假二肽或二肽模拟残基；X是 由Asp衍生的残基；A3是-CH2-X1-CO-Y1、-CH2-O-Y2、-CH2-S-Y3，其 中X1是O或S；Y1、Y2或Y3是环脂基，并且任选地被芳基取代。

WO99/18781公开了式I的二肽： 其中R1是N端保护基；AA是任何天然或非天然α-氨基酸、β-氨基 酸、α-氨基酸或β-氨基酸的衍生物的残基；R2是H或CH2R4，其中R4 是负电性离去基团，和R3是烷基或H，条件是AA不是His、Tyr、Pro 或Phe。这些二肽在基于细胞的体系中令人惊奇地是细胞凋亡的有 效caspase抑制剂。这些化合物在体内具有全身活性，其在小鼠肝 脏细胞凋亡模型中是抗Fas诱导性致死的有效抑制剂，并且在局部 缺血性休克的大鼠模型中具有强大的神经保护作用。

WO99/47154公开了式I的二肽： 其中R1是N端保护基；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸；R2是任选 取代的烷基或H。

WO00/01666公开了作为ICE/ced-3族的半胱氨酸蛋白酶的抑制 剂的C端修饰的草氨酰基二肽： 其中A是天然或非天然氨基酸；B是氢原子、氘原子、烷基、环烷基 和其它基团；R1是烷基、环烷基和其它基团；R2是氢、低级烷基和 其它基团。

                     发明概述

本发明涉及式I的化合物： 或其药学可接受盐或前药，其中： R1是任选取代的烷基或氢； R2是氢或任选取代的烷基； R3是烷基、饱和碳环、部分饱和的碳环、芳基、饱和杂环、部分饱 和的杂环和杂芳基，其中该基团被任选取代； X是O、S、NR4或(CR4R5)n，其中R4和R5在各种情况中独立地选自氢、 烷基和环烷基，和n是0、1、2或3；或 X是NR4，和R3和R4与其所连的氮原子一起构成饱和杂环、部分饱和 的杂环或杂芳基，其中该基团被任选取代；或 X是CR4R5，和R3和R4与其所连的碳原子一起构成饱和碳环，部分饱和 的碳环、芳基、饱和杂环、部分饱和的杂环或含氧杂芳基，其中该 基团被任选取代；和 Y是天然或非天然氨基酸的残基； 条件是当X是O时，R3不是未取代苄基或叔丁基；和当X是CH2时，R3 不是氢。

本发明涉及发现了式I表示的化合物是caspase的抑制剂。本发 明还涉及本发明的化合物在减轻、预防或治疗其中细胞凋亡性细胞 死亡是致病因素或是结果的疾病中的应用。本发明的应用实例包 括：保护病灶缺血和全身性缺血后的神经系统；治疗神经变性疾 病，例如阿尔茨海默氏病、杭廷顿氏舞蹈病、朊病毒疾病、帕金森 氏病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、共济失调、毛细管扩张和 脊髓延髓萎缩；治疗心脏疾病，包括心肌梗塞、充血性心衰和心肌 病；治疗视网膜疾病；治疗自身免疫失调，包括红斑狼疮、类风湿 关节炎、I型糖尿病、斯耶格伦综合征和肾小球性肾炎；治疗多囊 肾病和贫血/红细胞生成；治疗免疫系统疾病，包括AIDS和SCIDS； 治疗或改善脓毒病，减轻或预防移植过程中细胞、组织和器官的损 伤；减少或预防产业化生物技术中细胞系的死亡；减轻或预防脱发 (掉发)；和减少皮肤细胞的过早死亡。

本发明提供含有减少动物中细胞凋亡性细胞死亡有效量的式I化 合物的药物组合物。

本发明还提供哺乳动物器官或组织的防腐或保存溶液，或者哺 乳动物或酵母细胞的生长培养基，其中所述溶液或培养基中含有有 效量的目的在于减少器官、组织或细胞中细胞凋亡性细胞死亡的式 I化合物。

本发明还涉及caspase抑制剂在治疗、改善和预防化疗和放射疗 法中的非癌细胞死亡以及治疗和减轻癌症的化疗和放射疗法的副作 用中的应用。

特别是，本发明涉及一种治疗、改善和预防动物中口腔粘膜 炎、胃肠道粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细 胞死亡和癌症化疗或放射疗法所致脱发的方法，该方法包括给需要 其的动物施用有效量的caspase抑制剂。

                    发明详述

本发明的caspase和细胞凋亡性细胞死亡的抑制剂具有通式I： 或其药学可接受盐或前药，其中： R1是任选取代的烷基或氢； R2是氢或任选取代的烷基； R3是烷基、饱和碳环、部分饱和的碳环、芳基、饱和杂环、部分饱 和杂环或杂芳基，其中该基团被任选取代； X是O、S、NR4或(CR4R5)n，其中R4和R5在各种情况中独立地选自氢、 烷基和环烷基，和n是0、1、2或3；或 X是NR4，和R3和R4与其所连的氮原子一起构成饱和杂环、部分饱和 的杂环或杂芳基，其中该基团被任选取代；或 X是CR4R5，和R3和R4与其所连的碳原子一起构成饱和碳环，部分饱和 的碳环、芳基、饱和杂环、部分饱和的杂环或含氧杂芳基，其中该 基团被任选取代；和 Y是天然或非天然氨基酸的残基； 条件是当X是O时，R3不是未取代苄基或叔丁基；和当X是CH2，R3不 是氢。    

对于R1，优选的烷基是C1-6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙 基、异丁基、戊基和己基；和取代C1-6烷基，例如CH2OCH3和 CH2OCOCH3(AM或乙酰氧基甲基)。

优选的R2是被负电性基团或离去基团取代的烷基，包括氟甲 基、氯甲基、烷氧基甲基、芳氧基甲基、烷硫基甲基、芳硫基甲 基、氨基甲基、酰氧基甲基和芳基酰氧基甲基。可以存在于R2烷基 是的任选取代基的其它实例包括但不限于：在2、4和5位上被低级 烷基任选取代的3-吡唑基氧基；3-(1-苯基-3-三氟甲基)吡唑基氧 基；2，6-二(三氟甲基)苯甲酰氧基；2，6-二甲基苯甲酰氧基；五氟 苯氧基；四氟苯氧基；2，6-二氯苯甲酰氧基；2-(3-(2-咪唑基)萘 基)氧基；二苯基氧膦基氧基；特窗酰基(tetrenyloxy)；和特窗 氨酰基氧基(tetramoyloxy)。

R3基团在式I化合物中被设计为充当三肽的P3侧链。结构A是式I 的二肽抑制剂的实例。对比之下，结构B是三肽抑制剂的一个实 例。

优选的X是O、NH和CH2。对于R3，优选的烷基是甲基、乙基、异 丙基、异丁基；烷基上优选的取代基是羟基、羧基、卤素、C4-C7环 烷基、饱和和部分饱和的杂环、芳基或杂芳基；优选的环烷基是环 戊基和环己基；优选的饱和和部分饱和的杂环基是哌啶基和吗啉 基；优选的芳基是苯基和萘基；优选的杂芳基是吡啶基、吲哚基、 呋喃基和噻吩基；芳基和杂芳基中优选的取代基是甲基、乙基、 氯、氟、溴、三氟甲基、甲氧基、羟基、羧基、氰基和硝基。

对于Y，优选的天然和非天然氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸、2-氨基丁酸、环己基甘氨酸、苯基甘氨酸、环戊基 甘氨酸和叔丁基甘氨酸。尤其优选的氨基酸是缬氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基酸丁酸、环 己基甘氨酸和苯基甘氨酸。

本发明涉及发现了式I表示的化合物是caspase的抑制剂。这些 抑制剂减缓或阻断出现细胞、组织或整体器官损失的多种临床病症 和产业应用中的细胞死亡。所以，本发明还涉及治疗、预防或减轻 其中细胞凋亡起作用的病症的方法。下文中将更全面地描述这些病 症。  

该方法包括给需要这种治疗的动物施用抑制细胞凋亡性细胞死 亡有效量的本发明的抑制剂或其药学可接受盐或前药。

可以用作caspase抑制剂的另一组本发明的优选实施方式是由式 II表示的化合物：

或其药学可接受盐或前药，其中R1、R2、X和Y如上式I中的定 义；和 A是CR6或氮； B是CR7或氮； C是CR8或氮； D是CR9或氮； E是CR10或氮；条件是A、B、C、D和E中不多于三者是氮；和R6-R10独 立地是氢、卤素、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、C4-C7环烷基、C1-C6 烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C1-C6)烷基、C6-C10芳 基(C2-C6)链烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、C1-C6羟基烷基、硝基、 氨基、氰基、C1-C6酰氨基、羟基、C1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、烷 硫基或羧基；或 R6和R7，或R7和R8，或R8和R9，或R9和R10之一与其所连的碳原子一起 构成碳环或杂环。

由R6和R7，或R7和R8，或R8和R9，或Rg和R10一起构成的桥的实例 是：-OCH2O-、-OCF2O-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-OCH2CH2O-、 -CH2N(R13)CH2-、-CH2CH2N(R13)CH2-、-CH2N(R13)CH2CH2-、 -N(R13)-CH＝CH-、-CH＝CH-N(R13)-、-O-CH＝CH-、-CH＝CH-O-、-S-CH＝CH-、 -CH＝CH-S-、-N＝CH-CH＝CH-、-CH＝N-CH＝CH-、-CH＝CH-N＝CH-、 -CH＝CH-CH＝N-、-N＝CH-CH＝N-和-CH＝CH-CH＝CH-； 其中R13是氢、烷基或环烷基； 条件是当X是O，A是CR6，B是CR7，C是CR8，D是CR9和E是CR10时，R6- R10的至少一个不是氢。

优选的R1是H、Me、Et、t-Bu或AM。优选的R2是氟甲基、酰氧基 甲基、芳基酰氧基甲基、芳氧基甲基、氧膦基氧甲基或氨基甲基。

本发明的另一组优选的caspase和细胞凋亡性细胞死亡的抑制剂 是具有通式III的化合物：

或其药学可接受盐或前药，其中R1、R2、R3和Y如式I中定义。

优选的R1是H、Me、Et、t-Bu或AM。优选的R2是氟甲基、酰氧基 甲基、芳基酰氧基甲基、芳氧基甲基、氧膦基氧甲基或氨基甲基。 优选的R3是任选取代的烷基或芳基。优选的Y是缬氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基丁酸、环 己基甘氨酸或苯基甘氨酸。

具有式I的caspase抑制剂的优选实例包括但不限于：

2-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

苯乙氧基羰基-Val-Asp-fmk，

环己基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

乙氧基羰基-Val-Asp-fmk，

异丙基氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2-氯苄氧基羰基-Ile-Asp-fmk，

3-氯苄氧基羰基-Ile-Asp-fmk，

4-氯苄氧基羰基-Ile-Asp-fmk，

苯基乙酰基-Val-Asp-fmk，

4-硝基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，5-二甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3，4-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3，5-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，5-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，4-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，4-二甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-乙基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-溴苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

环戊基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-三氟甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3-苯基丙酰基-Val-Asp-fmk，

苄基氨基羰基-Val-Asp-fmk，

3-苯基丙基氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，4-二氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3，4-二氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

4-吗啉羰基-Val-Asp-fmk，

4-吡啶基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2-吡啶基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-DCB-甲基酮，

异丁氧基羰基-Val-Asp-fmk，

丙酰基-Val-Asp-fmk，

苄基-戊二酰基-Val-Asp-fmk，

戊二酰基-Val-Asp-fmk，

3-(2-苯基氧基苯基)丙酰基-Val-Asp-fmk，

3-(5-溴-2-羟基苯基)丙酰基-Val-Asp-fmk，

3-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

3-甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2-氯-4-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk，

2-萘基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk，

p-甲苯磺酰基-Val-Asp-fmk，和

p-甲苯磺酰基-Phe-Asp-fmk。 其中fmk是氟甲基酮，和DCB是2，6-二氯苯甲酰氧基。

适用的芳基是C6-14芳基，尤其是C6-10芳基。典型C6-14芳基包括苯 基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基和芴基。

适用的环烷基是C3-8环烷基。典型环烷基包括环丙基、环丁基、 环戊基、环己基和环庚基。

适用的饱和或部分饱和的碳环基团包括如上定义的环烷基，以 及环烯基，例如环戊烯基、环庚烯基和环辛烯基。

适用的卤代或卤素基团包括氟、氯、溴和碘。

适用的烷基包括直链和支链C1-10烷基，更优选C1-6烷基。典型C1-10 烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3- 戊基、己基和辛基。也可以考虑位于本发明化合物的苯环上的两个 相邻位点的三亚甲基。

适用的芳基烷基包括被任何上述C6-14芳基取代的任何的上述C1-10 烷基。适用的基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。

适用的卤代烷基包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的 C1-10烷基，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1，1-二 氟乙基、氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。

适用的烷氧基包括被一个上述C1-10烷基取代的氧。

适用的烷硫基包括被一个上述C6-10烷基取代的硫，还包括这些烷 硫基的亚砜和砜类化合物。

适用的酰氨基是任何与氨基氮相连的C1-6酰基(烷酰基)，例如乙 酰氨基、丙酰氨基、丁酰氨基、戊酰氨基、己酰氨基，以及芳基取 代的C2-6取代酰基。

适用的酰氧基是任何与氧基(-O-)相连的C1-6酰基(烷酰基)，例 如甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧 基等。

适用的芳基酰氧基包括取代在上述任何酰氧基上的任何上述芳 基，例如2，6-二氯苯甲酰氧基、2，6-二氟苯甲酰氧基和2，6-二(三 氟甲基)苯甲酰氧基。

适用的氨基包括-NH2、-NHR11和-NR11R12，其中R11和R12是定义如 上的C1-10烷基或环烷基。

适用的饱和或部分饱和的杂环基团包括四氢呋喃基、吡喃基、 哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、 异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、异色满基、色满基、吡唑烷基 和吡唑烷基、特窗酰基和特窗氨酰基。

适用的杂芳基包括下列的任一基团：噻吩基、苯并[b]噻吩基、 萘并[2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、 色烯基、香豆素基、占吨基、phenoxanthiinyl、2H-吡咯基、吡 咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪 基、异吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉 基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基(quinozalinyl)、噌啉基、喋啶 基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、acrindinyl、啶基、菲咯啉 基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基、吩噁嗪 基、1，4-二氢喹喔啉基-2，3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并 [1，2-a]嘧啶-4-酮、1，2-苯并异噁唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟吲 哚基和2-氧代苯并咪唑基。当杂芳基含有环内氮原子时，该氮原子 可以是N-氧化物的形式，例如吡啶基N-氧化物、吡嗪基N-氧化物、 嘧啶基N-氧化物等。

任选的取代基包括一个或多个烷基；卤素；卤代烷基；环烷 基；羟基；羧基；氧膦基氧基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨 基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基或杂 芳基任选取代的芳基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基 氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取 代的芳氧基；被一个或多个丁基烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二 烷基氨基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的杂芳 基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨 基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的杂芳氧基； 烷氧基；烷硫基；芳硫基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；酰氧 基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨 基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选地取代的芳基酰氧 基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨 基、烷氧基、羟基、羧基或卤代烷基任选取代的二苯基氧膦基氧 基；被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨 基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的杂环；被一 个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧 基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的杂环烷基氧基；被一 个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧 基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的部分饱和的杂环烷 基；或被一个或多个低级烷基、卤素、氨基、烷基氨基、二烷基氨 基、烷氧基、羟基、羧基、卤代烷基和芳基任选取代的部分饱和的 杂环烷基氧基。

本发明的某些化合物可以作为立体异构体存在，包括旋光异构 体。本发明包含所有立体异构体和这些立体异构体的消旋混合物以 及按照所属领域普通技术人员已知的方法分离的各个对映体。

药学可接受盐的实例包括无机和有机酸加成盐，例如盐酸盐、 氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来 酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；和，与碱如氢氧化钠和三 (羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的无机和有机碱加成盐。

前药的实例包括式I的化合物，其中R1是烷基或取代烷基，如 CH2OCH3和CH2OCOCH3(AM酯)。

本发明还涉及一种治疗患病动物中对caspase的抑制具有应答的 疾病的方法。特别适用于本发明方法中的化合物的优选实施方式是 上述式I定义的化合物。

本发明的化合物可以利用所属领域普通技术人员已知的方法致 病。特别是，具有式I的化合物可以通过合成路线1中的示例反应制 备。中间体1按照Revesz等(Tetrahedron Lett.35：9693- 9696(1994))所述方法制备。1与N保护的氨基酸，如由氯甲酸2-氯 苄酯和缬氨酸制备的(2-氯苄氧基羰基)-Val的偶联，得到酰胺2。 利用Dess-Martin试剂按照Revesz等(Tetrahedron Lett.35： 9693-9696(1994))氧化2得到3，其为非对映体的混合物。该氧化 液可以采用其它试剂，例如氯铬酸吡啶盐(PCC)或重铬酸吡啶盐 (PDC)。酯的酸催化裂解得到游离酸4。

                   合成路线1

其它N保护的氨基酸可以按照合成路线2-4中示例反应制得。

                 合成路线2

                 合成路线3

                 合成路线4

具有取代磺酰基作为N保护基的式III的混合物可以按照类似于 合成路线1制备。可用于制备式III的新caspase抑制剂的磺酰基保 护氨基酸的示例如合成路线5所示。

                 合成路线5

也可以使用其它具有特殊官能的N-保护基。例如可以引入抗氧 剂如Trolox作为保护基。混合物可以按照合成路线6所示制备。另 外，混合物可以按照合成路线7所示制备。所述混合物将兼具 caspase抑制剂和抗氧剂的特性，其作为神经保护剂将在休克的治 疗中更加有效(Pierre Etienne Chabrier et al.，PNAS 96： 10824-10829(1999))。

                 合成路线6

荧光染料可以引入作为保护基，例如合成路线8中所示的化合 物。

                   合成路线8

这些化合物能够抑制caspase并且使荧光染料附着于caspase。 所以，这些分子应该可以有效标记caspase和检测caspase在细胞 中的活性。这些化合物可以通过合成路线9中示例反应制备。

                   合成路线9 优选的式R3-X-C(O)的荧光保护基包括，例如：

本发明的一个重要方面是发现具有式I的化合物是caspase的抑 制剂。所以，期望这些抑制剂能够在多种出现细胞、组织或整体器 官损失的临床病症中减缓或阻断细胞死亡。

本发明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防神经系统中在局 部缺血和兴奋毒性的不同情况下的细胞死亡(脑、脊髓和外周神经 系统)，包括但不限于：休克所致病灶缺血和心搏停止引起的全身 性缺血，以及脊髓损伤(Emery et al.，J.Neurosurgery 89： 911-920(1998))。一个特别的用途是治疗可能在高危分娩的婴儿 出生中和淹溺中出现的氧缺乏的效应。细胞死亡抑制剂也可以用于 减少或防止神经系统中因创伤性损伤(如脑外伤)引起的细胞死亡、 病毒感染或辐射诱发的神经细胞死亡(例如，癌症放疗的副作用)， 以及急性细菌性脑膜炎(Braun等，Nat Med 5：298-302(1999))。 细胞死亡抑制剂还可以用于减轻或预防神经变性疾病范围内的细胞 死亡，包括但不限于阿尔茨海默氏病(Mattson et al.，Brain Res.807：167-176(1998))、杭廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、多发 性硬化、肌萎缩性侧索硬化和脊髓延髓萎缩。在大鼠瞬时病灶脑局 部缺血模型中可以试验本发明的细胞死亡抑制剂的体内神经保护特 性(Xue et al.，Stroke 21：166(1990))。所说的细胞死亡抑 制剂还可以用于治疗或改善急性细菌性脑膜炎中的细胞死亡(Braun et al.，Nat Med 5：298-302(1999))。

本发明的细胞死亡抑制剂可以有效减轻或防止任何可能导致心 肌死亡的病症中的细胞死亡(Black et al.，J.Mol.Cel.Card. 30：733-742(1998)和Maulik et al.，Free Radic.Biol.Med. 24：869-875(1998))。这包括心肌缺血和再灌注引起的心肌梗 塞、充血性心衰和心肌病。一个特别的应用是减少或防止某些心脏 病毒感染中出现的心肌细胞死亡。

利用Rodriguez等(J.Exp.Med.184：2067-2072(1996))所 说的“小鼠肝脏细胞凋亡”模型可以试验本发明的细胞死亡抑制剂 的体内活性。在这个模型中，用抗Fas抗体静脉内(IV)处理小鼠， 该抗体可以在肝脏和其它器官中诱发大面积细胞凋亡，导致扩散性 器官衰竭和死亡。该模型可以有效地间接测试出本发明的细胞死亡 抑制剂的全身性生物利用度，及其体内抗细胞凋亡特性。因此本发 明的细胞死亡抑制剂可以用于减少或预防肝细胞的细胞凋亡(Jones et al.，Hepatology 27：1632-42(1998))，例如在脓毒病 (Jaeschke et al.，J.Immunol.160：3480-3486(1998))和遗 传性酪氨酸血症I型(HT1)(Kubo et al.，Prov.Natl.Acad. Sci.USA 95：9552-9557(1998))。本发明的细胞死亡抑制剂还可 以用来治疗肝炎(Suzuki，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.217： 450-454(1998))。

可以利用本发明的细胞死亡抑制剂减少或预防视网膜神经元的 细胞死亡(Kermer et al.，J.Neurosci.18：4656-4662(1998) 和Miller et al.，Am.J.Vet.Res.59：149-152(1998))，其 可能出现在眼内压增高(如青光眼)的疾病或与衰老过程有关的视网 膜疾病(如衰老相关性斑变性)中。所说的抑制剂也可以用于治疗视 网膜的遗传性变性疾病，例如色素性视网膜炎。

本发明的细胞死亡抑制剂还可以用来减少或预防肾脏中的细胞 死亡。这包括肾淀粉样变性(Hiraoka et al.，Nippon Jinzo Gakkai Shi.40：276-83(1998))、急性肾衰(Lieberthal et al.，Semin Nephrol.18：505-518(1998))、环孢菌素A引起的 鼠管状上皮细胞死亡(Ortiz et al.，Kidney International Supp.68：S25-S29(1998))和HIV诱发的肾病(Conaldi et al.， J.Clin.Invest.102：2041-2049(1998))。

本发明的细胞死亡抑制剂也可以用来减少或预防因慢性酒精摄 取导致的颊粘膜的细胞死亡(Slomianyetal.，Biochem.Mol. Biol.Int.45：1199-1209(1998))。

利用本发明的细胞死亡抑制剂可以减少或防止植物中的细胞死 亡(Richberg et al.，Curr.Opin.Plant Biol.1：480- 485(1998))，例如因病原体导致的植物细胞死亡(Pozo et al.， Curr.Biol.8：1129-1132(1998)和Greenberg et al.，Cell 77：551-563(1994))。

利用本发明的细胞死亡抑制剂还可以减少或防止因放射和紫外 线导致的细胞死亡(Sheikh et al.，Oncogene 17：2555- 2563(1998))。

本发明的细胞死亡抑制剂也可以用于减少或预防脊髓发育不良 综合征(MDS)中的骨髓细胞的凋亡性死亡(Mundle et al.，Am.J. Hematol.60：36-47(1999))。

本发明的细胞死亡抑制剂也可以用来减少或预防免疫系统细胞 的过早死亡，并且特别有效地治疗免疫缺损性疾病，例如获得性免 疫缺损综合征(AIDS)、重度联合免疫缺损综合征(SCIDS)和相关疾 病。所说的细胞死亡抑制剂也可以用于治疗放射引起的免疫抑制。

人体器官和组织的移植是器官衰竭的常规疗法。然而，在移植 过程中，供体器官或组织存在细胞死亡的危险，因为丧失了被移植 之前在宿主内的正常血液供应。利用所述细胞死亡抑制剂通过灌注 在供体器官或组织内，或通过向器官/组织保藏液中直接加入细胞 死亡抑制剂，可以处理这种情况。例如据报导，用Ac-YVAD- cmk(SEQ ID NO：2)，一种caspase-1抑制剂处理胚胎黑质细胞混 悬液可以减轻DNA断裂并减少移植物中的细胞凋亡。其还可以提高 嫁接在偏侧震颤麻痹大鼠上的多巴胺能神经元的存活，由此基本上 改善了机能恢复I(Schierle et al.，Nat.Med.5：97- 100(1999))。细胞死亡抑制剂还可以用来减少或预防移植后供体器 官/组织中的细胞死亡，保护其免受再灌注损伤和/或由细胞凋亡引 发的宿主免疫细胞杀死其靶向的效应。细胞死亡抑制剂的细胞保护 效应还可以用于防止人体或动物的精子和卵子在体外受精过程中的 死亡。这些抑制剂可在收获过程中使用并且使它们可以存在于保藏 介质内。

哺乳动物细胞系、昆虫细胞和酵母细胞常常用来制备大量工业 或医药用的重组蛋白质(如抗体、酶或激素)。一些上述细胞系的生 活期限受到生长条件、被表达重组分子的特性(有些有毒)和其他未 知因素的限制。通过在生长培养基中含有1-100μM浓度范围的细胞 死亡抑制剂可以延长产业化细胞系的生活期限。

支配毛发生长和脱落的因素多数未知。然而某些迹象是，毛囊 退化(称作毛发生长中期)至少部分归因于细胞凋亡。因此，可以考 虑利用本发明的细胞死亡抑制剂治疗多种情况导致的脱发，包括但 不限于男人型秃发、辐射或化疗引起的脱发和因情绪应激引起的脱 发。有迹象表明，细胞凋亡在毛发脱色中起作用。因此，还可以利 用本发明的细胞死亡抑制剂治疗或预防头发过早变灰的情况。

皮肤上皮细胞的死亡可以在与高水平的辐射、热量或化学物质 接触后出现。可考虑利用本发明的细胞死亡抑制剂可以治疗、减少 或预防此类皮肤损伤。在一种特定应用中，所述的细胞死亡抑制剂 可以作为局部制剂如软膏的一部分使用，用来治疗急性的过度日晒 并且预防皮肤起疱和脱皮。

Goldberg等(Nature Genetics 13：442-449(1996))最近报导 杭廷顿素(huntingtin)，一种杭廷顿氏舞蹈病(HD)基因的蛋白产 物，可以被CPP32而不是ICE裂解。经突变HD是位于HD基因的5’末端 的三核苷酸CAG的扩展。这种超过36个重复的三核苷酸扩展与HD的 临床表现有关。CAG扩展促使杭廷顿素被CPP32裂解，由此与CPP32 在HD的凋亡性细胞死亡中的作用有关。本发明的具有CPP32抑制活 性的混合物可以有效阻断CPP32诱发的细胞凋亡性细胞死亡，由此 预防和治疗HD和其他以三核苷酸重复扩展为特征的疾病，例如萎缩 性肌强直、脆弱X精神发育迟缓、脊髓延髓性肌肉萎缩、I型脊髓小 脑atoxia和Dentato-Rubro pallidoluysian萎缩。

本发明涉及一种治疗、改善或预防动物中的口腔粘膜炎、胃肠 道粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死亡和 癌症化疗或放疗导致的脱发，该方法包括给需要其的动物施用有效 量的本发明细胞死亡抑制剂。

当动物用化疗剂和/或辐射治疗以杀死癌症细胞时，不期望的副 作用是使快速分裂的非癌性细胞凋亡性死亡。这种非癌性细胞包括 胃肠道细胞、皮肤、毛发和骨髓细胞。按照本发明，给所述非癌性 细胞施用caspase抑制剂以防止此类细胞的细胞凋亡。在有关优选 实施方式中，caspase抑制剂经局部施用至例如胃肠道、口腔、皮 肤或头皮用于预防胃肠道、口腔、皮肤或毛发细胞的细胞凋亡，但 允许癌细胞死亡。所以，在一个实施例中，通过局部施用caspase 抑制剂可以与化疗和放疗治疗脑癌并且保护外层皮肤、毛发细胞、 胃肠道和骨髓。在口腔粘膜炎的情况中，caspase抑制剂可以以例 如漱口剂或口腔洗涤剂、凝胶的形式应用，或以口腔缓释锭剂使 用，用于有化疗或有辐射引起的caspase激活和凋亡性细胞死亡。 在胃肠道粘膜炎的情况中，caspase抑制剂可以以不全身性吸收的 形式或以覆盖胃肠道表面的形式或以栓剂的形式应用治疗胃肠道粘 膜炎。在直肠炎的情况中，capsase抑制剂可以作为灌肠剂或栓剂 的组成部分使用。在膀胱粘膜炎的情况中，caspase抑制剂可以通 过导尿管使用。为了预防辐射或化疗引起的脱发，caspase抑制剂 可以以例如护发素、发用凝胶、香波或发用调理剂的形式涂敷在头 皮上。重要的是，caspase抑制剂可以化疗剂或辐射施用之前应 用，由此防止化疗剂或辐射对正常细胞启动损伤效应。

本发明范围内的组合物包括其中含有实现上述目的有效量的本 发明化合物的所有组合物。当各别需要改变时，所属领域技术人员 了解测定各成分的最佳有效量范围。通常，所述的化合物在对哺乳 动物如人体给药时口服剂量可以是例如每天0.0025-50mg/kg被治 疗哺乳动物体重，或等效量的其药学可接受盐，用于治疗该哺乳动 物的细胞凋亡介导的疾病如神经元细胞死亡、心脏病、视网膜疾 病、多囊肾病、免疫系统失调和脓毒症。有利地，经口服给予约 0.01-约10mg/kg可以治疗或预防此类疾病。对于肌肉内注射，剂量 通常约为口服剂量的半数。譬如，为了治疗或预防神经元细胞死 亡，适当的肌肉内剂量应是约0.0025-约25mg/kg，更优选约0.01- 约5mg/kg。

单位口服剂量可以含有约0.01-约50mg，优选约0.1-约10mg的 化合物。单位剂量可以以一个或多个片剂每天给药1次或数次，各 片剂中含有约0.1-约10，常为0.25-50mg的化合物或其溶剂化物。

在局部制剂中，所述化合物可以以约0.01-100mg/g载体的浓度 存在。在一个优选实施方式中，化合物以约0.07-1.0mg/ml，更优 选约0.1-0.5mg/ml，首选约0.4mg/ml的浓度存在。

除了施用作为原料化学品的化合物以外，本发明的化合物可以 作为药物制剂的组成部分给药，该组合物含有适宜的药学可接受载 体，其包括辅助化合物加工成为可药用制剂的赋形剂和辅剂。优选 地，所述制剂特别是经口服或经局部给药和可用于优选给药剂型的 那些制剂如片剂、糖衣丸、缓释锭剂和胶囊、口腔洗涤剂和漱口 剂、凝胶、液体混悬液、护发素、发用凝胶、香波，和可以直肠给 药的制剂如栓剂，以及通过注射、局部或口服给药的适用溶液，含 有约0.01-99％，优选约0.25-75％活性化合物以及赋形剂。

另外属于本发明范围内的是本发明的化合物的无毒药学可接受 盐。通过将本发明的特定细胞死亡抑制剂的溶液与药学可接受无毒 酸的溶液混合可以制备酸加成盐，所述酸例如盐酸、富马酸、马来 酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等。通过 将本发明的特定细胞死亡抑制剂的溶液与药学可接受无毒碱的溶液 混合可以制备碱性盐，所述碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆 碱、碳酸钠、Tris等。

本发明的药物组合物可以施用给任何获得本发明化合物有益效 应的动物。虽然本发明不受此限制，上述动物为哺乳动物，例如人 体。

caspase抑制剂及其药物组合物可以通过实现上述目的的任何方 式给药。例如，给药可以经非肠道、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜 内、经皮、经颊、鞘内、颅内或局部途径给药。而且或常常是经口 服途径给药。施用的剂量取决于接受者的年龄、健康和体重、如果 存在的联合疗法的种类、治疗的频率和预期作用的特性。通常， caspase抑制剂经局部给药至组织保护其不发生细胞凋亡并与化疗 剂分开。例如，顺铂可以通过i.v.注射给药用于治疗癌症如脑、 肺、乳腺、肝脏、肾脏、胰、卵巢、前列腺癌，同时局部施用 caspase抑制剂以治疗、缓解或预防口腔或胃肠道中的凋亡性细胞 死亡，例如作为口腔洗涤剂治疗口腔粘膜炎；和用于治疗骨髓细胞 死亡的可IV注射水溶液；和生活覆盖胃肠道表面的口服制剂，或用 于治疗胃肠道粘膜炎(包括直肠炎)的灌肠剂或栓剂。caspase抑制 剂也可以经导尿管应用以治疗、缓解或预防膀胱粘膜炎。另外或常 常地caspase抑制剂可以局部涂敷在皮肤和/或头皮上以治疗、改善 或预防毛发和皮肤细胞的凋亡性细胞死亡。在进一步的实施方式 中，局部施用化疗剂或辐射可以治疗局部癌症如脑、肺、乳腺、肝 脏、肾脏、胰、卵巢、前列腺癌；并且caspase抑制剂全身性给药 如i.v.注射，可以治疗、缓解或预防胃肠道细胞、口服上皮细胞、 骨髓细胞、皮肤细胞和毛发细胞的凋亡性细胞死亡。譬如，在脑癌 治疗中的口腔粘膜炎情况中，无法透过血脑屏障的caspase抑制剂 可以例如通过i.v.注射全身性给药，随后辐射脑肿瘤。这将保护口 腔粘膜免疫辐射的有害作用，但caspase抑制剂将不保护脑肿瘤受 到辐射的肿瘤作用。重要的是，caspase抑制剂可以在辐射之前给 药，由此预防辐射对正常粘膜细胞启动损伤效应。

本发明的药物制剂是以其本身已知的方式制备，例如通过常规 混合、制粒、糖衣掩蔽、溶解或冷冻干燥过程的方式。因此，通过 混合活性化合物和固体赋形剂可以获得口服用药物制剂，任选地将 所得混合物研磨并且加工为颗粒的混合物，如果希望或需要的话， 加入适当辅剂后，得到片剂或糖衣片芯。

适用的赋形剂特别是：填充剂，例如糖，如乳糖或蔗糖、甘露 糖醇或山梨糖醇、纤维素制剂和/或磷酸钙，如磷酸三钙或磷酸一 氢钙；和粘合剂，例如淀粉糊，如采用玉米淀粉、小麦淀粉、稻米 淀粉、土豆淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维 素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果希望，可以加入 崩解剂，例如上述淀粉和羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂 或藻酸及其盐，如藻酸钠。首先，辅剂是流动调节剂和润滑剂，如 二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或 聚乙二醇。提供的糖衣片芯具有适当的包衣，如果需要，该包衣可 以耐受胃液。出于此目的，可以采用浓缩的糖溶液，其任选地含有 阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫 胶溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备萘胃液包衣，利 用适当纤维素制剂如；邻苯二甲酸乙酰基纤维素或邻苯二甲酸羟苯 基甲基纤维素的溶液。片剂或糖衣中可以加入染料或颜料，譬如用 于识别或为了使活性化合物剂量的组合具有特征。

其他可以用于口服的药物制剂包括有由明胶组成的推嵌式胶囊 以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇组成的软的密封胶囊。推嵌 式胶囊可以含有颗粒形式的活性化合物，其可以与填充剂如乳糖、 粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混 合。在软胶囊中，活性化合物适宜溶于或悬浮在适当液体中，如脂 肪油或液体石蜡。此外，可以加入稳定剂。

可用于直肠的可能的药物制剂包括，例如灌肠剂或栓剂，其有 一种或多种活性化合物与栓剂基质的联合形式组成。适用的栓剂基 质例如是天然或合成甘油三酯，或链烷烃。此外，也可以采用明胶 直肠胶囊，其有活性化合物与基质的联合形式组成。可行的基质原 料包括，例如液态甘油三酯、聚乙二醇或链烷烃。

适合非肠道给药的制剂包括水可溶形式的活性化合物的水溶 液，例如水溶性盐和碱性溶液。此外，可以施用活性化合物的混悬 液如适宜的油性注射混悬液。适用的亲脂性溶剂或赋形剂包括：脂 肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯或 聚乙二醇-400(这些化合物可溶于PEG-400)。含水注射混悬液可以 含有提高混悬液粘度的物质，包括如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和 /或葡聚糖。任选地，混悬液可以含有稳定剂。

按照本发明的一个方面，本发明的化合物可以应用在局部和非 肠道制剂中并且用于治疗皮肤损伤，例如由于接触高水平的辐射 (包括紫外线、热或化学品)所引起的皮肤损伤。

一种或多种对皮肤具有治疗作用的附加物质也可以掺混在所述 组合物中。所以，组合物还可以含有一种或多种能够提高皮肤中环 AMP水平的化合物。适用的化合物包括以该组合物重量计约0.1- 1％(重量)的腺苷或核酸水解产物和约0.5-5％(重量)的罂粟碱。适用 的还有约0.1-2％(重量)的β-肾上腺素能激动剂如异丙肾上腺素或 约0.1-1％(重量)的环AMP，均基于组合物的重量计。其他可以混合 在本发明组合物中的适当种类的附加活性成分包括任何具有皮肤有 益效果的化合物。此类化合物包括用量为约0.003-0.3％(重量)的视 黄醛类化合物如维生素A，和用量为约0.1-10％(重量)的色原烷醇如 维生素E或其衍生物，基于该组合物的重量计。另外，抗炎剂和角 膜成形剂也可以混合在化妆品组合物中。典型的抗炎剂是用量约 0.25-5％(重量)的皮质类固醇如氢化可的松或其乙酸酯，或用量约 0.025-0.5％(重量)的皮质类固醇如地塞米松，基于组合物的重量 计。典型的角膜成形剂是约0.1-20％(重量)的煤焦油或约0.05- 2％(重量)的地蒽酚，基于该组合物的重量计。

本发明的局部组合物通过选择适当的载体适当地配制为油、霜 剂、洗剂、软膏等。适用的载体包括植物或矿物油、白凡士林(白 色软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(大于Cl2)。优 选的载体是活性成分可溶于其中的那些载体。组合物中还可以含有 乳化剂、稳定剂、保湿剂和抗氧剂，如果希望也可以含有着色剂或 香料。此外，经皮制剂促进剂可以是用在上述局部制剂中。此类促 进剂的实例可以参见U.S.专利号3,989,816和4,444,762。

霜剂适宜由矿物油、自乳化蜂蜡和水的混合物配制，其中溶于 少量油如杏仁油中的活性成分混合在该混合物中。此类霜剂的典型 实例是一种含有约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1份杏 仁油的霜剂。

通过混合活性成分在植物油如杏仁油中的溶液与热的软石蜡并 使该组合物冷却可以配制得到软膏。此类软膏的典型实例是一种含 有约30％(重量)杏仁油和约70％(重量)白色软石蜡的软膏。

洗剂一般通过将活性成分溶解在适当的高分子量醇如丙二醇或 聚乙二醇中制成。

此外，这些组合物可以含有其他药剂、生长因子、创伤愈合 剂、载体等，这是所属领域普通技术人员熟知的。本发明的组合物 可以施用给业已患有皮肤损伤如灼伤的温血动物如人体，其给药量 足以令愈合过程快于未治疗宿主。这种应用的有效量将取决于皮肤 损伤的严重程度和被治疗患者的全身状况。根据需要可以调节长时 间内的维持剂量。对于兽用，根据需要可以给予较高水平的剂量。

在动物患有毛发生长减少的情况中，本发明的组合物以足以提 高毛发生长速率的量给药。这种用途的有效量将取决于毛发生长减 少的程度和被治疗患者的全身状况。根据需要可以调节长时间内的 维持剂量。对于兽用，根据需要可以给予较高水平的剂量。

当将所述的化合物给予植物时，可以将它们涂敷在植物的叶子 和/或茎和/或花上，例如通过喷雾。所述的化合物可以以颗粒形式 或溶于或混悬在适当载体中的形式喷雾，例如采取水或油-水乳 液。所述的化合物可以与植物的土壤混合。在这种实施方式中，所 述的化合物被植物的根部摄取。

在一个优选实施方式中，该caspase抑制剂配制为口腔洗涤剂的 组成部分用于治疗、缓解或预防口腔粘膜炎。此类口腔洗涤剂是该 caspase抑制剂的水溶液，其中也可以含有醇、甘油、合成甜味剂 和表面活性剂、矫味剂和着色剂。它们也可以含有抗感染剂，如海 克替啶和西吡氯铵。所述的口腔洗涤剂还可以含有局部麻醉剂(例 如苯佐卡因、可卡因、达克罗宁盐酸盐、利多卡因、丙对卡因盐酸 盐或teracaine盐酸盐)，例如用于缓解辐射或化疗引起的创伤疼 痛。口腔洗涤剂可以具有酸性或碱性pH。参见Remington’s Phannaceutical Sciences，A.R.Gennaro(ed.)，Mack Publishing Company，pp.1045，1046，1526和1965(1990)。

在另一优选实施方式中，caspase抑制剂配制为能够覆盖胃肠道 表面的口服制剂，用于治疗、改善或预防胃肠道粘膜炎。胃肠道粘 膜炎的实例包括食管粘膜炎、胃粘膜炎和肠粘膜炎。此类制剂可以 含有抗胃酸剂如碳酸铝、氢氧化铝凝胶、次硝酸铋、次水杨酸铋、 碳酸钙、碳酸二羟基铝钠、氢氧化镁铝、碳酸镁、氢氧化镁、氧化 镁、碳酸氢钠、铋乳、氨基乙酸二羟基铝、磷酸镁、三硅酸镁及其 混合物。其他添加剂包括但不限于H2受体拮抗剂、助消化剂、止吐 剂、吸附剂和各种药剂。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，A.R.Gennaro(ed.)，Mack Publishing Company， pp.774-778(1990)。

化疗剂如顺铂和放射疗法包括常常在患者中引起早期或晚期发 作的呕吐。所以，在一个实施方式中，止吐剂与caspase抑制剂联 合给药以避免呕吐并且保留caspase抑制剂与胃肠道接触。此类止 吐剂的实例包括但不限于多巴胺能呕吐受体的阻断剂如甲氧氯普胺 和曲美苄胺，和大麻素类化合物。甲氧氯普胺可以在化疗/放疗 /caspase抑制剂疗法之前或过程中口服给药，用于预防早期呕吐反 应，并且随后后者可以通过鼻内给药，按照U.S.专利号5,760,086 和4,536,386所述以预防延长发作的呕吐。在化疗/放疗后的期间 内，caspase抑制剂和正投影可以合并给药用于治疗、改善或预防 胃肠道粘膜炎。

在另一实施方式中，所述的caspase抑制剂可以配制为可IV注射 溶液用于治疗、缓解或预防骨髓细胞死亡。

本发明的组合物可以对业已患有化疗或放疗诱发的非癌性细胞 死亡的温血动物如人体，或者更优选在化疗或放射之前或期间治 疗。

下列实施例举例说明但不限定本发明的方法和组合物。其他适 宜的改进和在临床疗法中常见的且对于所属领域技术人员显而易见 的多种情况和参数的适应属于本发明的范围。

                      实施例1

              2-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

步骤A.氯甲酸2-氯苄酯。0℃下，向存在于乙醚(15ml)中的2- 氯苄醇(1.0g，7.0mmol)溶液中加入N，N-二异丙基乙基胺(2.4ml， 14.0mmol)和存在于甲苯中的光气溶液(7.5ml，14.0mmol)。令该 混合物在2小时内升至室温同时搅拌，随后过滤。通过旋转蒸发除 去乙醚，制备氯甲酸2-氯苄酯在甲苯中的溶液用于下步反应。

步骤B.2-氯苄氧基羰基-Val。室温下向存在于2N NaOH水溶液 (10ml)中的L-缬氨酸(0.5g，4.3mmol)溶液内加入氯甲酸2-氯苄酯 (14.0mmol)。室温下搅拌所得溶液12小时，随后用20ml的乙酸乙 酯稀释，用2N NaOH、2N HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥和真空浓 缩。得到标题化合物，其为白色固体(0.94g，3.29mmol，77％)。 1H NMR(DMSO-d6)：12.24(bs，1H)，7.61(d，J＝8.4，1H)， 7.50(m，2H)，7.37(m，2H)，5.12(s，2H)，3.87(dd，J＝8.7， 6.0，1H)，2.06(m，1H)，0.89(m，6H)。

步骤C.5-氟-3-(2-氯苄氧基羰基-缬氨酰氨基)-4-羟基戊酸叔 丁酯。向2-氯苄基-氧基羰基-Val(216mg，0.76mmol)在THF(10ml) 中的溶液内加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDCI)(159mg，0.83mmol)、1-羟基苯并三唑水合物 (HOBT)(116mg，0.77mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(46mg， 0.38mmol)。所得混合物室温下搅拌5分钟，随后向其中加入3-氨基 -5-氟-4-羟基戊酸叔丁酯(157mg，0.75mmol)在THF(5ml)中的溶 液。所得混合物在室温下搅拌12小时，用乙酸乙酯(20ml)稀释，用 1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤和用Na2SO4干燥。蒸发溶剂，随后 通过闪式色谱(EtOAc/己烷2/3)得到标题化合物，其为无色油 (80mg，0.17mmol，22％)。1H NMR(CDCl3)：7.38(m，2H)，7.27(m， 2H)，7.06-6.84(m，1H)，5.56(m，1H)，5.22(s，2H)，4.51- 4.21(m，3H)，4.01(m，3H)，2.63(m，2H)，2.12(m，1H)， 1.43(m，9H)，0.96(m，6H)。

步骤D.2-氯苄氧基羰基-Val-Asp(OBu-t)-fmk。向Dess- Martin高碘烷(periodinane)(0.35g，0.835mmol)在二氯甲烷 (15ml)中的混悬液内加入5-氟-3-(2-氯苄氧基羰基-缬氨酰氨基)- 4-羟基戊酸叔丁酯(80mg，0.17mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。 该混合物回流12小时，冷却至室温，随后用25ml乙酸乙酯稀释，用 饱和Na2SO3水溶液、盐水洗涤，再用Na2SO4干燥。蒸发溶剂，此后 通过闪式色谱(EtOAc/己烷1/2)得到标题化合物，其为浅白色固体 (56mg，0.12mmol，72％).1H NMR(CDCl3)：7.39(m，2H)，7.28(m， 2H)，5.43(m，1H)，5.25-4.84(m，5H)，4.05(m，1H)，2.96(m， 1H)，2.77(m，1H)，2.14(m，1H)，1.42(s，9H)，0.96(m， 6H)。

步骤E.2-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk。室温下向2-氯苄氧基 羰基-Val-Asp(OBu-t)-fmk(56mg，0.12mmol)在3ml CH2Cl2中的溶 液内加入1ml的TFA。所得溶液搅拌3小时，随后用20ml的乙酸乙酯 稀释，用饱和Na2HPO4、盐水洗涤，并且用Na2SO4干燥。真空蒸发溶 剂得到标题化合物，其为白色固体(39mg，0.09mmol，77％)。1H NMR(CDCl3)：8.61(m，1H)，8.15(m，1H)，7.49(m，2H)， 7.37(m，2H)，5.21(m，1H)，5.11(s，2H)，4.59(m，2H)， 3.84(m，1H)，2.65(m，2H)，1.98(m，1H)，0.86(m，6H)。

                 实施例2

        3-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1所述的5个步骤由3-氯苄醇制成。 1H NMR(CDCl3)：7.55(bs，1H)，5.48(m，1H)，4.90(m，4H)， 4.02(m，2H)，3.85(m，1H)，3.08(m，1H)，2.76(m， 1H)，1.93(m，1H)，1.71(m，7H)，1.23(m，4H)，0.95(m，6H)。

                    实施例3

             苯乙氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1所述的5个步骤由苯乙醇制成。1H NMR(CDCl3)：7.87(m，2H)，7.23(m，5H)，5.74(d，J＝8.4，1H)， 4.87(m，2H)，4.26(m，3H)，3.99(m，1H)，2.89(m，4H)， 2.09(m，1H)，0.91(m，6H)。

                    实施例4

            4-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-氯苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.51(m，1H)，7.42(m，5H)，5.21(m，1H)， 5.03(s，2H)，4.60(m，1H)，3.83(m，1H)，2.65，(m，2H)， 1.93(m，1H)，0.85(m，6H)。

                    实施例5

         环己基甲氧基羰基-Valp-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由环己基甲醇制成。1H NMR(CDCl3)：7.55(bs，1H)，5.48(m，1H)，4.90(m，4H)， 4.02(m，2H)，3.85(m，1H)，3.08(m，1H)，2.76(m，1H)， 1.93(m，1H)，1.71(m，7H)，1.23(m，4-H)，0.95(m，6H)。

                   实施例6

            乙氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由L-缬氨酸和氯甲酸乙 基酯。1H NMR(DMSO-d6)：8.43(s，1H)，7.19(m，1H)，5.14(bs， 2H)，4.66-4.53(m，1H)，4.01(q，J＝6.9，2H)，3.83-3.76(m， 1H)，2.73-2.67(m，2H)，1.96-1.88(m，1H)，1.16(t， J＝6.9，3H)，0.86-0.82(m，6H)。

                       实施例7

                 苄基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由苯基乙酰氯制成1H NMR(DMSO-d6)：8.55(m，1H)，8.21(m，1H)，7.21(m，5H)， 5.14(m，2H)，4.62(m，2H)，4.14(m，1H)，2.66(m，2H)， 1.93(m，1H)，0.83(m，6H)。

                      实施例8

            4-硝基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由氯甲酸4-硝基苄酯制 成。1H NMR(DMSO-d6)：12.5(s，1H)，8.66-8.54(m，1H)， 8.23(m，2H)，7.64(m，2H)，5.19(m，4H)，4.66-4.54(m，2H)， 3.82(m，1H)，2.76(m，2H)，1.95(m，1H)，0.87(m，6H)。

                     实施例9

        2，5-二甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，5-二甲基苄醇制 成。1H NMR(DMSO-d6)：8.50(m，1H)，7.42(m，1H)，7.06(m， 2H)，4.99(s，2H)，4.64-4.56(m，1H)，3.83(m，1H)，2.97(m， 1H)，2.67(m，2H)，1.89(m，1H)，0.86(m，6H)。

                    实施例10

       3，4-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3，4-二氯苄醇制成。 1H NMR(DMSO-d6)：8.50(m，1H)，7.65-7.35(m，4H)，5.03(m， 3H)，4.59(m，1H)，3.84(m，1H)，2.67(m，2H)，1.94(m，1H)， 0.86(m，6H)。

                     实施例11

         3，5-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3，5-二氯苄醇制成。 1H NMR(DMSO-d6)：8.54(m，1H)，7.56-7.34(m，3H)，5.05(m， 3H)，4.63-4.55(m，1H)，3.86(m，1H)，2.73(m，2H)，1.95(m， 1H)，0.86(m，6H)。

                    实施例12

          2，5-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，5-二氯苄醇制成。 1H NMR(DMSO-d6)：8.54(m，1H)，7.51(m，3H)，5.26-5.08(m， 3H)，4.65-4.55(m，1H)，3.87(m，1H)，2.73-2.60(m，2H)， 1.98(m，1H)，0.86(m，6H)。

                     实施例13

           2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，6-二氯苄醇制成。 1H NMR(DMSO-d6)：8.50(m，1H)，7.55-7.41(m，3H)，5.25(m， 3H)，4.64-4.51(m，1H)，3.78(m，1H)，2.71(m，2H)，1.92(m， 1H)，0.84(m，6H)。

                     实施例14

          2，4-二甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，4-二甲基苄醇制 成。1H NMR(DMSO-d6)：8.53(m，1H)，7.39(m，1H)，7.28- 7.18(m，3H)，5.26(m，1H)，4.99(m，2H)，4.66-4.53(m，1H)， 3.80(m，1H)，2.78-2.72(m，1H)，2.59(m，3H)，1.92(m，1H)， 1.16(m，3H)，0.85(m，6H)。

                     实施例15

           4-乙基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-乙基苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.50(m，1H)，7.23(m，4H)，4.98(m，3H)， 4.63(m，1H)，3.84(m，1H)，2.68(m，2H)，1.91(m，1H)， 0.85(m，6H)。

                      实施例16

             4-氯苄氧基羰基-Ile-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-氯苄醇制成。1H NMR(CDCl3)：8.61(m，1H)，8.52(m，1H)，7.48(m，1H)，7.39(m， 4H)，5.19(m，2H)，5.02(s，2H)，4.54(m，1H)，3.87(m，1H)， 2.73(m，2H)，1.68(m，1H)，1.39(m，1H)，1.17(m，1H)， 0.81(m，6H)。

                    实施例17

          4-溴苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-溴苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：7.56(d，J＝8.1 Hz，1H)，7.42(m，1H)，7.32(d， J＝8.1 Hz，1H)，5.21(m，1H)，5.00(s，2H)，4.62(m，2H)， 3.83(m，1H)，3.60(m，1H)，2.71(m，2H)，1.76(m，1H)， 0.84(m，6H)。

                    实施例18

          4-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-氟苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.63(m，1H)，7.92(m，1H)，7.55(m，4H)， 5.03(m，3H)，4.61(m，2H)，3.83(m，1H)，2.73(m，2H)， 1.95(m，1H)，0.95(m，6H).

                    实施例19

        2，4-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，4-二氯苄醇制成。 1H NMR(CDCl3)：8.51(m，1H)，7.52(m，3H)，5.08(m，3H)， 4.59(m，2H)，3.85(m，1H)，2.69(m，2H)，1.94(m，1H)， 0.95(m，6H)。

                    实施例20

          环戊基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由环戊基甲醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：7.22(bs，1H)，5.21(m，1H)，5.09(m，1H)， 4.61(m，2H)，3.84(m，3H)，2.73(m，2H)，2.10(m， 1H)，1.92(m，1H)，1.49(m，6H)，1.23(m，2H)，0.84(m，6H)。

                    实施例21

        4-三氟甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由4-三氟甲基苄醇制 成。1H NMR(DMSO-d6)：8.63(m，1H)，8.18(m，1H)，7.74(d， J＝7.2Hz，2H)，7.57(d，J＝8.1，2H)，5.14(m，4H)，4.64(m， 1H)，3.81(m，1H)，2.72(m，2H)，1.94(m，1H)，0.86(m，6H).

                    实施例22

            3-苯基丙酰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例2的4个步骤由3-苯基丙酰氯制成。 1H NMR(DMSO-d6)：12.29(bs，1H)，8.39(m，1H)，7.82(m，1H)， 7.2 1(m，5H)，5.25(m，2H)，4.39(m，1H)，4.03(m，1H)， 2.80(m，3H)，2.54(m，3H)，1.89(m，1H)，0.80(m，6H)。

                        实施例23

                苄基氨基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由苄胺制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.55(m，1H)，7.25(m，5H)，6.57(m，1H)， 6.20(m，1H)，5.16(m，1H)，4.22(m，5H)，2.61(m，2H)， 1.89(m，1H)，0.87(m，6H)。

                    实施例24

           3-苯基丙氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3-苯基-1-丙醇制成。 1H NMR(DMSO-d6)：8.61(m，1H)，8.18(m，1H)，7.21(m，5H)， 5.17(m，1H)，4.53(m，1H)，3.83(m，4H)，2.71(m， 4H)，1.85(m，3H)，0.85(m，6H)。

                    实施例25

          2，4-二氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2，4-二氟苄醇制成。 1H NMR(CDCl3)：7.33(m，1H)，6.83(m，2H)，5.60(m，1H)， 5.11(m，3H)，4.88(m，2H)，4.03(m，1H)，3.05(m，1H)， 2.79(m，1H)，2.05(m，1H)，0.94(m，6H)。

                    实施例26

          3，4-二氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3，4-二氟苄醇制成。 1H NMR(CDCl3)：8.63(m，1H)，8.18(m，1H)，7.52(m，1H)， 7.27(m，2H)，5.07(m，3H)，4.51(m，2H)，3.99(m，1H)， 2.70(m，2H)，1.95(m，1H)，0.85(m，6H)。

                    实施例27

             4-吗啉羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由4-吗啉羰基氯制成。 1H NMR(CDCl3)：10.61(bs，1H)，7.58(m，1H)，5.19(d，J＝8.1 Hz，1H)，4.95(m，3H)，4.42(m，1H)，3.71(m，4H)，3.42(m， 4H)，2.94(m，2H)，2.19(m，1H)，0.98(m，6H)。

                    实施例28

          4-吡啶基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由4-吡啶基甲醇。1H NMR(CDCl3)：8.56(m，2H)，8.15(m，2H)，7.23(m，1H)， 6.47(m，1H)，5.10(s，2H)，4.35(m，3H)，4.08(m，1H)， 2.61(m，2H)，1.46(m，1H)，0.94(m，6H)。

                    实施例29

         2-吡啶基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2-吡啶基甲醇制成。 1H NMR(CDCl3)：8.59(m，1H)，7.28(m，3H)，7.03(m，1H)， 5.58(m，1H)，5.11(m，5H)，4.06(m，1H)，2.83(m，2H)， 2.17(m，1H)，0.93(m，6H)。

                    实施例30

      2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-DCB-甲基酮

步骤A.Z-Asp(OBu-t)-DCB-甲基酮。向Z-Asp(OBu-t)-溴甲基酮 (500mg，1.24mmol)在DMF(10ml)中的溶液内加入氟化钾(320mg， 5.50mmol)和2，6-二氯苯甲酸(348mg，1.82mmol)。该混合物在室 温下搅拌12小时，随后用25ml的乙酸乙酯稀释，用NH4Cl水溶液和 盐水洗涤，用Na2SO4干燥和真空浓缩。得到标题化合物，其为白色 固体(0.78g，2.62mmol，69％).1H NMR(CDCl3)：7.34(m，8H)， 5.96(d，J＝8.7，1H)，5.21(d，J＝6.6，2H)，5.16(s，2H)， 4.70(m，1H)，2.88(m，2H)，1.27(s，9H)。

步骤B.Asp(OBu-t)-DCB-甲基酮-N-盐酸盐。向Z-Asp(OBu- t)-DCB-甲基酮(572mg，1.14mmol)在乙醇(15ml)中的溶液内加入 Pd/C(50mg)和6N HCl(0.2ml)。该混合物在室温和H2氛(1atm)下 搅拌12小时，随后过滤和浓缩。得到标题化合物，其为浅白色固体 (416mg，1.04mmol，90％).1H NMR(CDCl3)：7.27(m，3H)， 5.28(m，2H)，4.94(m，1H)，3.27(m，2H)，1.42(s，9H)。

步骤C.2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp(OBu-t)-DCB甲基酮。向 2，6-二氯苄氧基羰基-Val(200mg，0.60mmol)在THF(10ml)中的溶 液内加入Asp(OBu-t)-DCB-甲基酮-N-盐酸盐(250mg， 0.60mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI， 126mg，0.66mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT，92mg， 0.60mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，29mg，0.28mmol)。所 得混合物在室温下搅拌12小时，用乙酸乙酯(20ml)稀释，用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤并且用Na2SO4干燥。蒸发溶剂，随后通 过闪式色谱(EtOAc/己烷2/3)得到标题化合物，其为无色油(85mg， 0.18mmol，21％)。1H NMR(CDCl3)：7.35(m，6H)，7.27(m，1H)， 5.41(m，3H)，5.15(m，2H)，4.41(m，1H)，2.96(m，2H)， 2.28(m，1H)，1.44(m，9H)，0.94(m，6H)。

步骤D.2，6-二氯苄氧基羰基-Val-Asp-DCB-甲基酮。向2，6-二 氯苄氧基羰基-Val-Asp(OBu-t)-DCB甲基酮(85mg，0.18mmol)在 CH2Cl2(3ml)中的溶液内室温下加入TFA(1ml)。将所得溶液搅拌3小 时，随后用20ml的乙酸乙酯稀释，用饱和Na2HPO4、盐水洗涤，并且 用Na2SO4干燥。真空蒸发溶剂得到标题化合物，其为白色固体(27mg， 0.04mmol，25％)。1H NMR(CDCl3)：9.28(bs，1H)，8.11(m，1H)， 7.49(m，1H)，7.30(m，6H)，5.37(m，4H)，4.32(m，2H)， 3.73(m，2H)，2.19(m，1H)，1.25(m，3H)，0.98(m，3H)。

                    实施例31

             异丁氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由L-缬氨酸和氯甲酸异 丁酯制成。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.47(m，1H)，7.23(m，1H)， 5.24-4.52(m，3H)，3.81-3.72(m，3H)，2.73-2.55(m，2H)， 1.94-1.79(m，2H)，0.89-0.83(m，12H)。

                    实施例32

            甲氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由L-缬氨酸和氯甲酸甲 酯制成。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.49(s，1H)，7.28(m，1H)， 5.16-4.54(m，3H)，3.81(m，1H)，3.53(s，3H)，2.72-2.56(m， 2H)，1.93(m，1H)，0.85(m，6H)。

                    实施例33

         异丙氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由L-缬氨酸和氯甲酸异 丙酯制成。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.43(s，1H)，7.11(m，1H)， 5.18-4.54(m，4H)，3.76(m，1H)，2.69-2.67(m，2H)，1.91(m， 1H)，1.17(d，J＝6，6H)，0.83(m，6H)。

                    实施例34

             丙酰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的4个步骤由L-缬氨酸和丙酰氯制 备.1H NMR(DMSO-d6)：δ8.63-7.82(m，2H)，5.37-5.02(m，1H)， 4.70-3.95(m，3H)，2.89-2.56(m，2H)，2.21-2.10(m，2H)， 1.91(m，1H)，0.98(t，J＝7.2，3H)，0.86-0.82(m，6H)。

                    实施例35

           苄基-戊二酰基-Val-Asp-fmk

步骤A.单戊二酸苄酯。将戊二酸酐(460mg，4.03mmol)在苄醇 (1ml)中的溶液在70℃下加热过夜。该混合物通过色谱(3∶1己烷 /EtOAc)纯化得到油状产物(0.4g，1.8mmol，45％).1H NMR(CDCl3)： δ7.36(br s，5H)，5.12(s，2H)，2.48-2.41(m，4H)，2.00- 1.96(m，2H)。

步骤B.苄基-戊二酰基-Val-OBu-t。戊二酸一苄酯(0.4g， 1.8mmol)、Val-OBu-t(382mg，1.82mmol)、EDC(335mg， 1.75mmol)、HOBT(265mg，1.73mmol)和DMAP(372mg，3.04mmol) 在THF(15ml)中的混合物在室温下搅拌17小时。处理并且通过色谱 纯化得到标题化合物，其为无色油(370mg，0.98mmol，54％)。1H NMR(CDCl3)：δ7.39-7.30(m，5H)，5.96(d，J＝8.4，1H)， 5.12(s，2H)，4.45(m，1H)，2.47-1.94(m，7H)，1.46(s，9H)， 0.95-0.87(m，6H)。

步骤C.苄基-戊二酰基-Val-OH。向苄基-戊二酰基Val-OBu- t(370mg，0.98mmol)在二氯甲烷(3ml)中的溶液内加热 TFA(1ml)。该混合物在室温下搅拌8小时。处理得到标题化合物， 其为无色油(200mg，0.62mmol，63％).1H NMR(CDCl3)：δ7.36(br s，5H)，6.43(d，J＝8.7，1H)，5.13(s，2H)，4.55(m，1H)， 2.49-2.21(m，5H)，2.00(m，2H)，0.99-0.94(m，6H)。

步骤D.苄基-戊二酰基-Val-Asp-fmk。标题化合物由苄基-戊二 酰基-Val-OH在类似于实施例1所述方法的3个步骤中制得，其为白 色固体。1H NMR(CDCl3)：δ7.35(br s，5H)，6.72(s，1H)， 5.56(s，1H)，5.11(s，2H)，4.92-4.22(m，4H)，3.13-2.68(m， 2H)，2.43-1.93(m，6H)，0.92(d，J＝5.1，6H)。

                    实施例36

             戊二酰基-Val-Asp-fmk

存在于含30％HBr(2ml)的AcOH溶液中的苄基-戊二酰基-Val- Asp(OBu-t)-fmk(78mg，0.15mmol)溶液在室温下搅拌4小时。真空 除去溶剂。向残余物中加入丙酮(1ml)，随后加入EtOAc(10ml)和 己烷(20ml)。此后真空除去溶剂，得到标题化合物，其为褐色固体 (36mg，0.10mmol，67％)。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.60-7.87(m， 2H)，5.36-4.42(m，4H)，2.94-2.57(m，2H)，2.33-1.69(m， 7H)，0.83(s，6H)。

                      实施例37

         3-(2-苯氧基苯基)丙酰基-Val-Asp-fmk

步骤A.3-(2-苯氧基苯基)丙酸。3-(2-羟基苯基)丙酸(0.57g， 3.4mmol)、溴苯(0.4ml，3.37mmol)和K2CO3(2.5g)在丙酮(10ml) 中的混合物在室温下搅拌2天。该混合物用1∶1己烷/EtOAc(100 ml)稀释，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩。残余物通 过色谱纯化(5∶1随后4∶1己烷/EtOAc)得到3-(2-苯氧基苯基)丙酸 苯酯(0.45g，1.30mmol，77％)。

3-(2-苯氧基苯基)丙酸苯酯(0.45g，1.30mmol)、2N NaOH(20ml)和MeOH(10ml)的混合物在室温下搅拌过夜，其随后用 浓盐酸中和至pH-2并且用EtOAc(100ml)提取。有机相用盐水洗 涤，用硫酸钠干燥和真空浓缩得到3-(2-苯氧基苯基)丙酸，其为 油。这可用于下一步骤无需进一步纯化。

步骤B.3-(2-苯氧基苯基)丙酰基-Val-Asp-fmk。该标题化合物 异类似于实施例36和1的方法由如上合成的粗品3-(2-苯氧基苯基) 丙酸制成。1H NMR(DMSO-d6)：δ8.62-8.50(m，1H)，7.47- 6.85(m，9H)，5.36-5.04(m，4H)，4.63-4.02(m，2H)，5.83(br s，6H)，1.85(br s，1H)，0.80(s，6H)。

                    实施例38

      3-(S-溴-2-羟基苯基)丙酰基-Val-Asp fmk

室温下将3-(2-苯氧基苯基)丙酰基-Val-Asp-fmk(30mg，30mg， 0.06mmol)在30％HBr的乙酸溶液(2ml)中的混合物搅拌6小时。真空 除去溶剂，向残余物中加入1∶1EtOAc/己烷。蒸发溶剂得到标题化 合物，其为褐色固体(18mg，0.037mmol，62％).1H NMR(丙酮-d6)： δ7.45-6.74(m，4H)，5.03-4.35(m，4H)，3.03-2.73(m，6H)， 0.97-0.87(m，6H)。

                    实施例39

           3-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3-氟苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.64(m，1H)，7.95(m，1H)，7.45(m，2H)， 7.19(m，3H)，5.25(m，1H)，5.06(s，2H)，4.58(m，2H)， 3.85(m，1H)，2.73(m，2H)，1.99(m，1H)，0.86(m，6H)。

                    实施例40

           2-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由2-氟苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：7.36(m，2H)，7.12(m，3H)，5.68(m，1H)， 5.17(s，2H)，4.34(m，3H)，3.97(m，2H)，2.62(m， 2H)，2.06(m，1H)，0.91(m，6H)。

                    实施例41

          3-甲基苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例1的5个步骤由3-甲基苄醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：8.52(m，1H)，7.92(m，1H)，7.43(m，1H)， 7.17(m，4H)，5.25(m，1H)，4.99(s，2H)，4.56(m，2H)， 3.83(m，1H)，2.71(m，2H)，2.29(s，3H)，1.93(m，1H)， 0.85(m，6H)。

                    实施例42

        2-氯-4-氟苄氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例2的5个步骤由2-氯-4-氟苄醇制成。 1H NMR(CDCl3)：8.63(m，1H)，7.42(m，4H)，5.15(m，3H)， 4.61(m，2H)，4.02(bs，1H)，3.81(m，1H)，2.63(m，2H)， 1.90(m，1H)，0.83(m，6H)。

                    实施例43

           2-萘甲氧基羰基-Val-Asp-fmk

该标题化合物是按照实施例2的5个步骤由2-萘甲醇制成。1H NMR(DMSO-d6)：7.80(m，4H)，7.46(m，3H)，6.99(m，1H)， 5.59(m，1H)，5.25(s，2H)，4.46(m，3H)，4.03(m，2H)， 2.62(m，2H)，2.11(m，1H)，0.94(m，6H)。

                    实施例44

            p-甲苯磺酰基-Val-Asp-fmk

步骤A.p-甲苯磺酰基-Val。该标题化合物通过类似于实施例1步 骤B所述方法由缬氨酸和p-甲苯磺酰氯制得，收率为13％。1H NMR(DMSO-d6)：7.90(d，J＝9.3，1H)，7.63(d，J＝8.1，2H)， 7.32(d，J＝8.1，2H)，3.47(m，1H)，2.35(s，3H)，1.90(m，1H)， 0.82-0.76(m，6H)。

步骤B.5-氟-3-[p-甲苯磺酰基-缬氨酰氨基]-4-羟基戊酸叔丁 酯。该标题化合物按照实施例1步骤C的类似方法制得收率为37％。 1H NMR(CDCl3)：7.73(d，J＝8.4，2H)，7.30(d，J＝7.2，2H)， 6.72-6.50(m，1H)，5.28-5.08(m，1H)，4.32-3.81(m，4H)， 3.45(m，1H)，2.65-2.45(m，2H)，2.43，2.41(2s，3H)， 2.05(m，1H)，1.45，1.43(2s，9H)，0.88-0.79(m，6H)。

步骤C.p-甲苯磺酰基-Val-Asp(OBu-t)-fmk。该标题化合物是 通过类似于实施例1步骤D的方法制得，收率为92％。1H NMR(CDCl3)： 7.74-7.70(m，2H)，6.93(m，1H)，7.31-7.27(m，2H)，7.03(d， J＝7.8，1H)，6.96(d，J＝8.1，1H)，5.26-4.61(m，3H)，3.55- 3.47(m，1H)，2.98-2.48(m，2H)，2.11(m，1H)，2.43，2.41(2s， 3H)，1.45，1.42(2s，9H)，0.87-0.81(m，6H)。

步骤D.p-甲苯磺酰基-Val-Asp-fmk。该标题化合物是通过类似 于实施例1步骤E的方法制得，收率为31％。1H NMR(DMSO-d6)： 8.53-8.43(m，1H)，7.81(br s，1H)，7.63(d，J＝7.4，2H)， 7.32(d，J＝7.4，2H)，5.02-4.28(m，4H)，2.18-2.40(m，2H)， 2.34(s，3H)，1.79(m，1H)，0.77-0.74(m，6H)。

                    实施例45

           p-甲苯磺酰基-Phe-Asp-fmk

该标题化合物是通过类似于实施例1中的三个步骤的方法由p-甲 苯磺酰基-Phe和3-氨基-5-氟-4-羟基戊酸叔丁酯制成。1H NMR(CD3OD)：7.61(d，J＝6.9，2H)，7.29-7.13(m，7H)，4.56- 3.94(m，4H)，3.01-2.78(m，2H)，2.44(s，3H)，2.51-2.37(m， 2H)。

                    实施例46

                     酶活性

在荧光酶分析法中测定2-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk作为 caspase-3的抑制剂的活性。利用与荧光离去基团相连的合成肽底 物测定酶活性。合成底物在酶作用下的裂解产生荧光信号，该信号 在分光荧光计或在荧光微量滴定平板读数器中读取。

在酶分析试验中测定范围在30pM-10μM范围内的12个浓度的试 验化合物。酶反应是在2ng rCaspase 3(购自PharMingen，a Becton division company，San Diego，CA)、不同浓度的试验 化合物、10μM caspase 3底物Ac-DEVD-AMC(SEQ ID NO：3)(购自 Quality Controlled Biochemicals，Inc.Hopkinton，MA)和 caspase缓冲液(20mM PIPES，100mM NaCl，10mM DTT，1mM EDTA，0.1％CHAPS和10％蔗糖，pH 7.2)的存在下异100μl的总体 积进行。酶反应在96孔平板中进行并且在37℃下培育30分钟。随后 用荧光平板读数器(EG&GWALLAG 1420-002)读取，采用355nm激 发滤光片/460nm发射滤光片。使用GraphPrism软件分析数据。采 用相同的方法试验其它抑制剂并且结果总结在表II中。

      表II二肽作为Caspase-3的抑制剂的活性 名称 Caspase-3 IC50(nM) 2-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk     36 3-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk     36 苯乙氧基羰基-Val-Asp-fmk     110 4-氯苄氧基羰基-Val-Asp-fmk     34 环己基甲氧基羰基-Val-Asp-fmk     72 乙氧基羰基-Val-Asp-fmk     58

如表II所示，二肽是caspase-3的有力抑制剂。

完全描述本发明后，所属领域普通技术人员应理解在广泛且等 同的条件、表述和其它参数范围中同样可以实施而不影响本发明或 其任何实施方式。再次引入的所有专利、专利申请和专利公开均全 文引入作为参考。

                      发明背景

序列表 <110>Cytovia，Inc.

 Cai，Sui Xiong

 Weber，Eckard

 Wang，Yan

 Mills，Gordon B.

 Green，Douglas R. <120>Caspase抑制剂及其用途 <130>1735.035PC02 <140> <141> <150>US60/128,545 <151>1999-04-09 <150>US60/158,370 <151>1999-10-12 <160>3 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>5 <212>PRT <213>未知的生物体 <220> <223>未知的生物体的描述：肽ICE抑制剂 <400>1 Ala Tyr Val His Asp   1               5 <210>2 <211>4 <212>PRT <213>未知的生物体 <220> <223>未知的生物体的描述：Caspase-1抑制剂 <400>2 Tyr Val Ala Asp   1 <210>3 <211>4 <212>PRT <213>未知的生物体 <220> <223>未知的生物体的描述：Caspase 3底物 <400>3 Asp Glu Val Asp     1