发明背景

许多疾病和临床病症均可通过给予药学活性肽治疗。其中一例为 前列腺癌，这是一种性激素依赖型癌症，可通过施用干扰促黄体素(LH) 生成以调节雄性激素合成的促黄体素释放激素(LHRH)类似物来治 疗。尤其是，为了减少LH的生成，业已用LHRH的肽类似物作为促黄 体素释放激素受体的超激动剂，例如亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞 林。

在许多情况中，药学活性肽的治疗有效性取决于其在体内长时间 的持续存在。为使所述肽在体内达到持续给药以避免反复给药，缓释 或持续给药制剂是理想的。缓释给药的一种方式是微囊化，其中，活 性组分被包封在聚合膜内形成微粒。例如，通常是将LHRH的超激动 剂(例如亮丙瑞林和戈舍瑞林)包封在含有聚环二酯/聚糖酯共聚物的 微粒内，成为适合缓释注射的制剂，这种制剂可以在数周至数月内持 续释放所述的超激动剂(参见美国专利4,675,189；4,677,191； 5,480,656和4,728,721)。

另外，也需要其它可在体内长时间持续释放药学活性肽的缓释制 剂。

发明概述

本发明提供含有稳定的非水溶性复合物的药物组合物，它是由肽 类化合物(例如肽、多肽、蛋白质、拟肽物(peptidomimetic)等)， 优选药学活性肽类化合物与可在复合物给药时在体内持续释放肽类 化合物的载体大分子组成。所以，本发明所述复合物可以在较长期的 时间(例如1个月)内将药学活性肽类化合物持续释放给患者。此外， 在致密且稳定的复合物中，肽类化合物与载体大分子之间的缔合作用 使该制剂能够装载高浓度的肽类化合物。

可将肽类化合物与载体大分子在一定条件下混合形成本发明所 述复合物，生成的复合物基本上不溶于水；譬如，将肽类化合物的水 溶液与载体大分子混合，直至复合物沉淀为止。所述复合物可以是固 体形式(例如糊剂、颗粒、粉末或冻干物)，或者是经过精细粉碎成为 足以形成稳定悬浮液或半固体分散体的粉末形式。

在一个优选实施方案中，肽类化合物的非水溶性复合物为LHRH 类似物，更优选是LHRH拮抗剂，所述载体大分子为阴离子聚合物， 优选羧甲基纤维素。本发明复合物适于在体内给药前进行灭菌处理， 例如γ照照和电子束照射。

本发明还提供一种利用LHRH类似物治疗患者所患病症的方法， 该方法为：给患者施用本发明所述的含有LHRH类似物的组合物。在 一个优选实施方案中，本发明所述治疗方法可有效治疗前列腺癌。

附图简述

图1表示：肌内注射PPI-149和羧甲基纤维素的复合物后，大鼠 (左图)和狗(右图)体内的血浆睾丸素水平(ng/ml；空心黑方框)和血 浆PPI-149水平(ng/ml；实心方框)对时间所作的曲线图。

图2表示：在第0天肌内注射LHRH拮抗剂PPI-149和羧甲基纤 维素的复合物并在第30天注射LHRH激动剂利普安TM之后，大鼠体内 的血浆睾丸素水平(ng/ml；空心方框)和血浆PPI-149水平(ng/ml； 实心方框)对时间所作的曲线图，它表明PPI-149的预处理可以抑制 利普安TM(LupronTM)诱发的睾丸素涌浪。

图3A-3C是一系列肌内注射PPI-149-CMC(图3A)、PPI-258- CMC(图3B)或西曲瑞利克斯TM(CetrorelixTM)-CMC(图3C)后，雄性 Sprague-Dawley大鼠的血浆睾丸素水平(ng/ml)对时间所作的曲线 图

图4是在预定剂量以28天的间隔皮下注射PPI-149-CMC后，狗 的血浆睾丸素水平(ng/ml；空心方框)和血浆PPI-149水平(ng/ml；实 心方框)随时间所作的曲线图，它证实了对血浆睾丸素水平的持续抑 制。

图5为在预定剂量以28天的间隔肌肉内注射PPI-149-CMC后狗 中血浆睾丸素水平(ng/ml；空心方框)和血浆PPI-149水平(ng/ml；实 心方框)随时间所作的曲线图，它证实了对血浆睾丸素水平的持续抑 制。

发明详述

本发明涉及含有由肽类化合物(例如肽、多肽、蛋白质、拟肽物 等)和载体大分子组成的非水溶性稳定复合物的药物组合物、所述组 合物的制备方法以及组合物的应用方法。本发明所述药物组合物的优 越性包括：可在延长的时间(例如数周，一个月或数月)内全身性或局 部释放药学活性肽类化合物的能力，以及在复合物中负载高浓度肽类 化合物的能力。

为使本发明更容易理解，首先定义某些术语。

本文所用的术语“肽类化合物”是指至少部分由通过酰胺键(肽 键)相连的氨基酸残基组成的化合物。术语“肽类化合物”包括肽类、 多肽和蛋白质类化合物。肽通常是由约100个以下的氨基酸组成，更 常见由约50个以下的氨基酸残基组成，而且极其常见的是由约25个 以下的氨基酸残基组成。术语“肽类化合物”还包括肽类似物、肽衍 生物和拟肽物，所述拟肽物可以模拟由天然氨基酸组成的肽类化合物 的化学结构。肽类似物的例子包括：含有一种或多种非天然氨基酸的 肽类化合物。肽衍生物的例子包括那些其中氨基酸侧链、肽主链或氨 基-或羧基-末端被衍生的肽类化合物(例如具有甲基化酰胺键的肽类 化合物)。拟肽物的例子包括肽主链被一个或多个苯并氮杂分子取 代的肽(如参见James，G.L等人，(1993)科学260：1937-1942)，“反 转(inverso)”肽类中所有L-氨基酸均被相应的D-氨基酸取代，“逆 向反转(“retro-inverso”)”肽类化合物(参见Sisto的美国专利 4,522,752)中的氨基酸序列发生逆转(“逆向”)并且所有L-氨基酸均 被D-氨基酸取代(“反转”)，以及其它(电子)等排物，例如肽主链(即 酰胺键)模拟物，其中包括：对酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修饰作用、 酰胺键的完全取代、延展、缺失或主链交联。人们业已了解了若干种肽 主链修饰，其中包括Ψ[CH2S]、Ψ[CH2NH]、Ψ[CSNH2]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH2] 和Ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。上述所采用的命名法中，Ψ表示不存在酰胺 键。方括号内特指取代酰胺键的结构。其它可行的修饰作用包括：N- 烷基(或芳基)取代(Ψ[CONR])，主链交联成内酰胺和其它环结构；和其 它衍生物，其中包括C-末端羟甲基衍生物、O-修饰衍生物以及N-末端 修饰衍生物，该N-末端修饰衍生物包括取代酰胺(例如烷基酰胺和酰 肼)。

本文所用术语“药学活性肽类化合物”是指以其存在形式或在体内 过程中具有药理学活性的肽类化合物(即，药学活性肽类化合物包括具 有基本药理学活性的肽类化合物，以及在给药后经体内某些途径的代谢 或处理显示出药理学活性的“前药”形式的肽类化合物)。

本文所用术语“多价阳离子肽类化合物”和“多价阴离子肽类化合 物”分别指具有多个正电荷或负电荷的肽类化合物。“二价阳离子”或 “二价阴离子”肽类化合物分别是指含有两个正电荷或负电荷的肽类化 合物。“三价阳离子”或“三价阴离子”肽类化合物分别是指含有三个 正电荷或负电荷的肽类化合物。

本文所用术语“LHRH类似物”包括模拟促黄体素释放激素结构的 肽类化合物。LHRH类似物可以是LHRH激动剂或LHRH拮抗剂。

本文所用术语“LHRH激动剂”是指刺激促黄体素释放激素受体 (LHRH-R)以促进促黄体素释放的化合物；或，“LHRH拮抗剂”是指抑 制LHRH-R因而抑制促黄体素释放的化合物。LHRH激动剂的例子包括亮 丙瑞林(商品名：利普安；Abbott/TAP)、戈舍瑞林(商品名： Zoladex；Zeneca)、布舍瑞林(Hoechst)、曲普瑞林(也称作 Decapeptyl、D-Trp-6-LHRH和Debiopharm；Ipsen/Beaufour)、那法 瑞林(商品名：Synarel；Syntex)、黄体瑞林(Wyeth)、胱氨瑞林 (cystorelin)(Hoechst)、戈那瑞林(Ayerst)和组氨瑞林(Ortho)。

本文所用术语“LHRH拮抗剂”是指抑制促黄体素释放激素受体因 而抑制促黄体素释放的化合物。LHRH拮抗剂的例子包括：抗排卵肽、 西曲瑞利克斯；在Folkers等人的美国专利5,470,947、Folkers等人 的PCT专利申请WO89/01944、Haviv的美国专利5,413,990、Haviv的 美国专利5,300,492、Koerber等人的美国专利5,371,070、Hoeger等 人的美国专利5,296,468、Janaky等人的美国专利5,171,835、Coy等 人的美国专利5,003,011、Coy的美国专利4,431,635、De等人的美国 专利4,992,421、Roeske的美国专利4,851,385、Nestor,Jr.等人的 美国专利4,801,577和Roeske等人的美国专利4,689,396中公开的化 合物，以及在题目为“LHRH拮抗剂肽类化合物”的美国专利申请 08/480,494中及其相应的题目同样为“LHRH拮抗剂肽类化合物”的PCT 专利申请(PCT/US96/09852)中所公开的化合物，这两篇文献的全文在 此引入本文作为参考。特别优选的LHRH拮抗剂具有结构：Ac-D- Nal1，4-Cl-D-Phe2-，D-Pal3-，N-Me-Tyr5，D-Asn6，Lys(iPr)8，D-Ala10- LHRH，本文称作PPI-149。

本文所用的术语“载体大分子”是指可以与肽类化合物复合形成非 水溶性复合物的大分子。在与肽类化合物复合之前，所述载体大分子通 常可溶于水。所述大分子的分子量优选至少为5kDa，更优选10kDa。术 语“阴离子载体大分子”是指含有负电荷的高分子量分子，例如阴离子 聚合物。术语“阳离子载体大分子”是指含有正电荷的高分子量分子， 例如阳离子聚合物。

本文所用术语“非水溶性复合物”是指在物理上和化学上稳定的复 合物，它是肽类化合物与载体大分子按照本文所述方法经适当混合制成 的。此类复合物通常是混合肽类化合物水溶液与载体大分子时所生成的 沉淀形式。虽然不受到机理的约束，但我们认为，在肽类化合物为阳离 子物质而载体大分子为阴离子物质或相反情况下，本发明优选非水溶性 复合物的形成中包括(即，至少部分的介导是通过)了离子相互作用。此 外，本发明非水溶性复合物的形成可以包括(即，至少部分介导是通过) 疏水性相互作用。而且，本发明水不溶性复合物可包括(即，至少部分 介导是通过)共价相互作用。对复合物的“非水溶性”描述是指基本上 不溶于或不易溶解在水中的复合物，如从水溶液中析出的沉淀物。然 而，应懂得，本发明的“非水溶性”复合物可以在体内或体内含水生理 环境的水中具有有限的溶解度(即，部分溶解度)。

本文所用术语“缓释”是指在给药后能够在体内长时间(优选至少 数天、一周或数周)持续释放药物试剂。可以通过例如药物长时间持续 的治疗作用来证实该药物是否持续释药(例如，对于LHRH类似物，可以 通过对睾丸素合成长时间的持续抑制来确定该类似物是否缓释)。此 外，也可以通过检测体内随时间而变的药物含量来证实药物的持续释 药。

本文所用的术语“患者”包括温血动物，优选哺乳动物，更优选 灵长目动物并且最优选人类。

本文所用术语“向患者给药”是指通过适当的组合物给药途径将 组合物(例如药物制剂)分配、释放或涂敷在患者的预定部位，其中包 括非胃肠道或口服给药、肌内注射、皮下/皮内注射、静脉注射、颊 部给药、透皮给药以及通过直肠、结肠、阴道、鼻内或呼吸道途径给 药。

本文所用术语“可用LHRH类似物治疗的病症”包括：那些经LHRH 激动剂或LHRH拮抗挤给药后可以达到预期疗效(例如治疗效果)的疾 病、机能紊乱或其它病症。可用LHRH类似物治疗的病症的例子包括： 激素依赖型癌症(包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和睾丸癌)、 良性前列腺肥大、青春期早熟、子宫内膜异位、子宫肌瘤、不育症(通 过体外受精)以及生育力(即避孕用)。

一方面，本发明涉及含有药学活性肽类化合物和载体大分子的非 水溶性复合物的药物组合物。在一个优选实施方案中，药学活性肽类 化合物和载体大分子之间的离子性相互作用至少部分上介导了非水 溶性复合物的形成。在这些实施方案中，药学活性肽类化合物为阳离 子物质而载体大分子为阴离子物质，或者是药学活性肽类化合物为阴 离子物质而载体大分子为阳离子物质。在另一实施方案中，非水溶性 复合物的形式至少部分是由药学活性肽类化合物和载体大分子之间 的疏水性相互作用介导的。在一个优选实施方案中，复合物所用的肽 类化合物是多价阳离子肽类化合物，例如二价或三价阳离子肽类化合 物，同时载体大分子为阴离子大分子。

本发明所述药物组合物可以在组合物给药后向患者体内缓释肽 类化合物，其中缓释所持续的时间决定于形成复合物的肽类化合物和 载体大分子的浓度。例如，在一个实施方案中，单剂量的非水溶性复 合物在药物组合物给药后可以为患者持续释放至少为期1周的肽类 化合物。在另一实施方案中，单剂量的非水溶性复合物在药物组合物 给药后向患者持续释放至少两周的肽类化合物。在又一个实施方案 中，单剂量的非水溶性复合物在药物组合物给药后向患者持续释放至 少三周的肽类化合物。再一个实施方案中，单剂量的非水溶性复合物 在药物组合物给药后向患者持续释放至少四周的肽类化合物。可以较 长或较短时间缓释药物的制剂也属于本发明，例如持续给药1天、1 至7天、1个月、2个月、三个月等的制剂。可以通过例如每月重复 给药1次使持续释放约1个月的肽类化合物的剂型实现长达数月的肽 类化合物的持续释放(参见实施例14)。

只要肽类化合物能够与载体大分子经二者的混合形成非水溶性 非共价复合物，那么任意大小的肽类化合物均适用于所述复合物。但 是，在某些优选实施方案中，肽类化合物是约5至约20个氨基酸、 约8至约15个氨基酸或约8至约12个氨基酸长的肽。所述制剂可以 使用多种药学活性肽类化合物，其非限定例包括：LHRH类似物(下文 讨论的)、缓激肽类似物、甲状旁腺素、腺促皮质激素(ACTH)、降钙 素、加压素类似物(例如1-脱氨基-8-D-精氨酸加压素(DDAVP))。

尽管许多载体大分子适合形成本发明的非水溶性复合物，但优选 的大分子是聚合物，更优选水溶性聚合物。在优选实施例中，载体大 分子是阴离子聚合物，例如阴离子多元醇衍生物或其碎片及其盐(例 如钠盐)。可使多元醇衍生的阴离子部分包括，例如羧酸盐、磷酸盐 或硫酸盐。特别优选的阴离子聚合物是阴离子多糖衍生物或其碎片及 其盐(例如钠盐)。载体大分子可以含有单一类型的分子(例如，一种 类型的聚合物)，或者含有两种或多种不同类型的分子(例如两种聚合 物的混合物)。具体阴离子聚合物的例子包括：羧甲基纤维素、褐藻 酸、藻酸盐、阴离子醋酸酯聚合物、阴离子丙烯酸聚合物、呫吨胶， 淀粉羟乙酸钠及其片段、衍生物和可药用盐，阴离子角叉菜胶衍生物、 阴离子聚半乳糖醛酸衍生物，以及硫酸化和磺酸化的聚苯乙烯衍生物。 优选的阴离子聚合物是羧甲基纤维素钠盐。阳离子聚合物的例子包括聚 -L-赖氨酸以及碱性氨基酸的其它聚合物。

在本发明一个特别优选的实施例中，非水溶性复合物中的肽类化合 物是LHRH类似物，例如LHRH激动剂，或更优选LHRH拮抗剂。此类LHRH 类似物一般具有10个氨基酸。优选的LHRH拮抗剂包括：含有肽类化合 物并且其中在与天然哺乳动物LHRH第6位氨基酸相对应的肽类化合物 残基上带有D-天门冬酰胺(D-Asn)结构的LHRH拮抗剂。本文所用术语 “D-天门冬酰胺结构”包括D-Asn及其类似物、其衍生物以及保持D- Asn功能活性的模拟物。其它优选的LHRH拮抗剂包括：含有结构为A- B-C-D-E-F-G-H-I-J的肽类化合物的LHRH拮抗剂。 其中：

A为Pyro-Glu、Ac-D-Nal、Ac-D-Qal、Ac-Sar或Ac-D-Pal

B为His或4-Cl-D-Phe

C为Trp、D-Pal、D-Nal、L-Nal、D-Pal(N-O)或D-Trp

D为Ser

E为N-Me-Ala、Tyr、N-Me-Tyr、Ser、Lys(iPr)、4-Cl-Phe、His、 Asn、Met、Ala、Arg或Ile；

F为 其中R和X独立地表示H或烷基；和

L含有小的极性基团；

G是Leu或Trp；

H是Lys(iPr)、Gln、Met或Arg

I是Pro；和

J是Gly-NH2或D-Ala-NH2； 或其可药用盐。

术语“小的极性基团”是指空间体积小和相对极性较小的基团。 极性是通过P等级所表示的亲水性测定的。在1-辛醇和水之间的分 配系数P被用作测定化合物亲水性的参数。亲水性也可以表示为log P，即分配系数的对数(Hansch等人，Nature 194：178(1962)；Fujita 等人，美国化学学会会志86：5175(1964))。记载许多分子的亲水性 以及多种官能团的亲脂性(疏水性)取代常数(π表示)的标准表格业已 编辑(参见Hansch & Leo，“化学和生物学中相关分析的取代常数”， Wiley，New York，New York，(1979))。借助于这些表格可以较精确地 预测出许多被测物亲水基团的亲水性。例如，萘的实测log P(辛醇/ 水)为3.45。-OH的取代常数为-0.67。因此，β-萘酚的预测log P 等于3.45+(-0.67)＝2.78。该值与β-萘酚的实测log P，即2.84很 好地吻合。本文所用术语“小的极性基团’是指log P在-1至+2之 间并且空间体积小于Trp体积的基团。

在某些实施例中，L含有小的极性基团，但条件是F不代表D- Cit、D-Hci或D-Cit或D-Hci的低级烷基衍生物。优选F选自D- Asn，D-Gln和D-Thr。更优选F是D-Asn。优选E是酪氨酸(Tyr)或 N-甲基-酪氨酸(N-Me-Tyr)。在特别优选的实施例中，LHRH拮抗剂具 有下列结构：Ac-D-Nal1，4-Cl-D-Phe2，D-Pal3，N-Me-Tyr5，D- Asn6，Lys(iPr)8，D-Ala10-LHRH(也称作PPI-149)。本发明特别优选的 复合物中含有PPI-149和羧甲基纤维素。

除了非水溶性复合物以外，本发明药物制剂可含有其它可药用载体 和/或赋形剂。本文所用术语“可药用载体”包括任意的和所有的溶剂、 分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等生 物相容性物质。优选载体适合于静脉内、肌肉内、皮下或非肠道给药(例 如，通过注射)。赋形剂包括可药用稳定剂和崩解剂。

除与载体大分子相复合的LHRH类似物的药物制剂外，本发明还包 括包装制剂，所述包装制剂包含此类复合物以及含有此类复合物的注射 器。例如，本发明提供一种利用LHRH类似物治疗患者所患病症的包装 制剂，该制剂含有LHRH类似物(优选PPI-149)和载体大分子(优选羧甲 基纤维素)的非水溶性复合物，它包装有指导患者利用LHRH类似物的非 水溶性复合物治疗所患疾病的说明书。在另一个实施例中，本发明提供 一种有腔注射器，该腔体内装有LHRH类似物(PPI-149)和载体大分子 (优选羧甲基纤维素)的非水溶性复合物。

将肽类化合物和载体大分子在足以形成肽类化合物与载体大分子 的非水溶性复合物的条件下混合可以制得本发明所述复合物。所以，本 发明的另一方面涉及了药物制剂的制备方法。在一个实施例中，该方法 包括：

提供肽类化合物和载体大分子；

将肽类化合物和载体大分子在足以形成肽类化合物与载体大分子 的非水溶性复合物的条件下混合；和

制备含有该非水溶性复合物的药物制剂。 例如，将肽类化合物的溶液和载体大分子的溶液混合，直至肽类化合物 和载体大分子的非水溶性复合物自溶液中沉淀出来为止。在某些实施例 中，肽类化合物和载体大分子的溶液是水溶液。此外，如果肽类化合物 或载体分子(或两者)在二者混合前是基本上不溶于水的，那么可以在将 复合物的两种组成混合之前先将肽类化合物和/或载体大分子溶解在水 混溶性溶剂内，例如醇(如乙醇)。在非水溶性复合物制备方法的另一个 实施例中，肽类化合物的溶液和载体大分子的溶液被混合并被加热，直 至肽类化合物和载体大分子的非水溶性复合物自溶液中沉淀出来。制备 非水溶性复合物所需的肽类化合物和载体大分子的量随所用的具体肽 类化合物和载体大分子、所用的特定溶剂和/或制备复合物的方法而 定。但是，通常肽类化合物相对于载体大分子来说是过量的，这基于摩 尔数。肽类化合物在重量/重量基础上也常常是过量的，如实施例所证。 在某些实施例中，载体大分子(优选羧甲基纤维素钠)和肽类化合物(优 选PPI-149)是以载体大分子：肽类化合物之比为0.2∶1(w/w)混合。在 其它多个实施例中，载体大分子：肽类化合物(w/w)的比例可以是，例 如，0.5∶1、0.4∶1、0.3∶1、0.25∶1、0.15∶1或0.1∶1。制备本发明非 水溶性复合物的条件和方法的非限定性实例将在实施例1-5和8-9中描 述。

一旦肽类化合物/大分子复合物自溶液中沉淀出来，采用本领域普 通技术人员已知的方法，例如过滤(即通过0.45微米的尼龙膜)、离心 等可以分离出溶液中的沉淀物。随后，将回收的糊状物干燥(例如在真 空下或在70℃烘箱内)，并且采用已知方法(例如锤磨或剪磨，或用研 钵和捣棒研磨)将固体碾磨或粉碎成粉末。在碾磨和粉碎后，将粉末过 筛(优选90微米筛)，获得分布均匀的颗粒。另外，可以将回收的糊状 物冻结并冷冻干燥。可以将粉末形式的复合物分散在载体溶液内，形成 适于注射的悬浮液或半固体分散体。因此，在不同的实施例中，本发明 药物制剂是干燥的固体、悬浮液或半固体分散体。适用于悬浮液的液态 载体的例子包括盐水溶液、甘油溶液和卵磷脂溶液。

在另一个实施例中，本发明所述药物制剂为灭菌制剂。例如，在形 成非水溶性复合物后，将该复合物灭菌，最好是通过γ照射或电子束灭 菌。所以，上述本发明药物制剂的制备方法还可以包括将非水溶性复合 物经γ照射或电子束照射来灭菌。优选该制剂用至少15KGy的γ照射剂量 进行γ照射灭菌。在其它实施例中，该制剂用至少19KGy或至少24KGy 的γ照射剂量进行γ照射灭菌。如实施例11证实，本发明制剂在γ照射中 保持可接受的稳定性。

而且，为了制备灭菌药物制剂，可以利用常规灭菌技术(例如，采 用灭菌的起始材料并在灭菌条件下完成制备过程)分离非水溶性复合 物。所以，在上述药物制剂制备方法的另一实施例中，用灭菌方法生成 非水溶性复合物。

本发明制备非水溶性复合物的方法在实施例1-5和8-9中进一步描 述。按照本发明所述方法制备的药物制剂，包括粉剂、悬浮液、半固体 分散体、干燥固体(例如冻干固体)及其灭菌形式(例如γ照射灭菌)也 属于本发明。

另一方面，本发明涉及利用本发明所述药物制剂通过存在于非水溶 性复合物内的药学活性肽类化合物来治疗患者所患病症的方法。所以， 在一个优选实施例中，本发明提供了一种用LHRH类似物治疗患者病症 的方法，其中包括给患者施用含有LHRH类似物和载体大分子的非水溶 性复合物的药物制剂。

可以通过任何适合获得预期治疗效果的途径给予患者药物制剂，但 优选的给药途径是非肠道方式，特别优选肌内注射(i.m.)和皮下/皮内 (s.c./i.d.)注射。而且，患者可以口服所述制剂。其它适当的非胃肠 道给药途径包括：静脉内注射、颊部给药、经皮给药和直肠、阴道、鼻 内或呼吸道途径的给药。应注意，当制剂通过i.m.或s.c./i.d.途径 可以持续释放数周或数月时，其它途径的给药将无法缓释同样长的时 间，这归因于药物经过其它生理机制被清除(即，剂型被从给药部位清 除，从而无法观察到与i.m.或s.c./i.d.注射给药时同样长时间的延 迟治疗作用)。

所述药物组合物含有治疗有效量的LHRH类似物。“治疗有效量” 是指在剂量和必要的时间阶段内获得预期效果所需的有效量。LHRH类 似物的治疗有效量取决于多种因素，例如疾病状况、患者个体的年龄和 体重、LHRH类似物(单用或与一种或多种其它药物结合)在患者个体内 产生所需反应的能力。调整剂量方案以便获得最佳的治疗反应。治疗有 效量也是一种拮抗剂的治疗有益作用超过毒性或有害作用的量。LHRH 类似物治疗有效量的非限定范围是0.01至10mg/kg。将血浆睾丸素水 平持续降低28天所用的LHRH类似物PPI-149的优选剂量是：在约1mL 或更少体积的悬浮液中约为0.1-10mg/kg，更优选0.3-1.2mg/kg(表示 游离肽)。应注意，剂量值应随待缓解病症的严重程度而变化。还应懂 得，对于任何特定的患者来说，特定的剂量方案应随时间根据个体需要 以及药物组合物给药者或给药监察者的职业化判断来调整，并且上述剂 量范围仅仅是举例而不是限定本发明的范围和实践。

本发明所述治疗方法适合治疗多种病症、疾病和功能紊乱，其中是 以具有所需临床作用的LHRH类似物进行给药。疾病和功能紊乱的例子 包括：激素依赖型癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和睾 丸癌；良性前列腺肥大、青春期早熟、子宫内膜异位和子宫肌瘤。所以， 本发明提供通过给予本发明所述药物制剂来治疗上述疾病和功能紊乱 的方法。此外，也可以用LHRH类似物改变生育力。因此，本发明所述 方法也适用于体外受精或避孕目的。

在一个特别优选的实施例中，所述方法用于治疗前列腺癌，制剂中 采用的LHRH类似物是LHRH拮抗剂，最优选PPI-149，并且所述方法能 够在肌肉内或皮下给药之后在体内至少持续释放4周的LHRH类似物。 前列腺癌的患者通过接受LHRH类似物，可以利用本发明配制的LHRH 类似物，优选PPI-149抑制前列腺癌细胞的生长。此外，本发明所配制 的LHRH拮抗剂(优选PPI-149)在与LHRH激动剂结合使用时，也就是患 者在开始用LHRH激动剂治疗前先经LHRH拮抗剂(优选PPI-149)预给药 时可以抑制睾丸素涌浪。利用本发明所述制剂来抑制LHRH诱发性睾丸 素涌浪的方法以及其它用LHRH拮抗剂治疗前列腺癌的方法在题目为 “用LHRH拮抗剂治疗前列腺的方法”的美国专利申请08/573，109(提 交于1995年12月15日)及其题目相同的部分延续专利申请 08/755，593(提交于1996年11月25日)中有详细描述，两篇文献的内 容被引入PCT专利申请公开97/22357中。上述美国专利申请和PCT专 利申请公开的全文均引入本文供参考。

将药学活性肽类化合物与载体大分子复合的具体方法在下列实施 例1-5和8-9中进行描述。同时也描述了用于证实含LHRH拮抗剂的复 合物能在体内持续释放药学活性肽的试验结果(实施例6)以及可以抑 制LHRH-激动剂诱发的睾丸素涌浪的试验结果(实施例7)。用于进一步 说明本发明的下列实施例不对本发明构成制约。所有在本申请全文中引 用的参考文献、专利和专利申请公开的内容均在此引入本文作为参考。 实施例1：

将PPI-149溶解在水中制得100ml 6.25mg/ml LHRH拮抗剂PPI- 145的溶液。将USP羧甲基纤维素钠(CMC)(低粘度级，Hercules化学 公司产品)混合至溶解得到0.125％w/v的等量样品(最少100ml)。将等 量的PPI-149和CMC溶液混合(CMC：肽的比例为0.2∶1(w/w))而得到固 体材料。将固体材料搅拌过夜，随后通过在0.45微米尼龙滤纸过滤收 集该固体。HPLC对滤液的测定表明，证实95％PPI-149化合物转化为 固体复合物。将固体复合物自溶液中分离出来。将回收的白色糊状物用 水漂洗两次，随后转移到瓶中并在真空下干燥。干燥72小时后，得到 633g白色粉末。该固体材料用研钵和捣棒粉碎。元素分析表明：57％ 肽存在于复合物内。 实施例2：

将25mg PPI-149溶解在1ml水中。向其中加入1ml 0.5％羧甲基 纤维素溶液。混合后该混合物成为一种柔滑的白色固体。将混合物加热 回流5分钟，生成荧光白的沉淀物。通过离心/倾析分离出该固体材料。 将固体重新悬浮在水中，反复离心后收集该固体。HPLC对滤液的测定 表明，至少90％的PPI-149化合物转化为固体复合物。将该白色沉淀 物在真空内干燥，并用研钵和捣棒粉碎该固体材料。元素分析表明77 ％的肽存在于复合物内。 实施例3：

将50mg PPI-149溶解在2ml 5％甘露糖醇中，并且与2ml 0.5％ 羧甲基纤维素(低粘度级，USP，Spectrum Quality Chemicals)混合。 搅拌该混合物，立刻生成白色沉淀。将悬浮液冻结并冷冻干燥，得到 PPI-149缓释复合物。 实施例4：

将25mg PPI-149溶解在1ml水中，在其中加入1ml 0.5％藻酸钠， USP，(Spectrum)。混合物在混合时立刻生成白色沉淀。通过离心/倾 析分离出此材料。将该固体重新悬浮在水中并通过反复离心收集，将白 色沉淀物在真空内干燥。元素分析表明肽含量为66％。 实施例5：

将25mg PPI-149溶解在1ml水中。加入氨以将pH调至11.0。向 其中加入1ml 0.5％藻酸，USP，(Spectrum)。混合物在混合时立刻生 成白色沉淀。通过离心/倾析分离出此材料。将该固体悬浮在水中并通 过重复离心收集，将白色沉淀物在真空内干燥。元素分析表明肽含量为 79％。 实施例6：

按照上述实施例制备LHRH拮抗剂PPI-149和羧甲基纤维素的非水 溶性复合物。配制PPI-149/CMC复合物的悬浮液，并且以单剂量肌肉 内注射到大鼠和狗的体内。大鼠所用的剂量为50μg/kg/天×60天，用 于狗的剂量是40μg/kg/天×28天。在不同的时间点测定血浆睾丸素水 平(ng/ml)作为对LHRH拮抗剂在动物体内的活性的衡量。图1曲线所 示的典型结果证明，肌肉内注射PPI-149复合物可以在大鼠体内持续抑 制至少42天的血浆睾丸素水平，在狗体内持续抑制至少28天的血浆睾 丸素水平(图1中由空心方框表示)，也就证实了LHRH拮抗剂的缓释给 药。动物体内的血浆PPI-149水平(ng/ml)也得到检测(图1中由实 心方框表示)。在第一个8天内可以观察到PPI-149的一个起始峰形， 此后在血浆内基本上无法测出PPI-149。虽然在约8天以后不能检测出 血浆内的PPI-149，但睾丸素水平的结果证明体内的PPI-149仍在试验 过程中产生治疗作用。 实施例7：

按照上述实施例制备LHRH拮抗剂PPI-149和羧甲基纤维素的非水 溶性复合物。配制PPI-149/CMC复合物的悬浮液，并且在第0天以单 剂量肌肉内注射到大鼠体内。在第30天时，将LHRH激动剂利普安TM(亮 丙瑞林)注射到大鼠体内。在不同的时间点测定血浆睾丸素水平(ng/ml； 图2中由空心方框表示)作为对LHRH拮抗剂在动物体内的活性的衡量。 动物体内的血浆PPI-149水平(ng/ml)也得到检测(图2中由实心方 框表示)。图2曲线所示的典型结果证明，用PPI-149/CMC复合物进行 的预处理可以迅速将血浆睾丸素降低到阉割水平，此外还同时阻断 LHRH激动剂诱发的睾丸素涌浪。虽然在约8天以后不能检测出血浆内 的PPI-149，但睾丸素水平的结果证明体内的PPI-149仍在试验过程中 产生治疗作用。 实施例8：

在本实施例中，不溶性复合物是在LHRH类似物PPI-258和羧甲基 纤维素(CMC)之间形成的。PPI-258的结构是：乙酰基-D-萘基丙氨酰基 -D-4-Cl-苯基丙氨酰基-D-吡啶基丙氨酰基-L-丝氨酰基-L-酪氨酰基- D-门冬酰基-L-亮氨酰基-L-Ne-异丙基-赖氨酰基-L-丙基-D-丙氨酰基- 酰胺。为了制备PPI-258/CMC缓释制剂，将174.8mg(净重148.6mg) PPI-258加入到29.72ml水中，并且搅拌原料以使肽悬浮并溶解。向 该搅拌溶液中加入1.85ml 2％CMC钠溶液(Hercules)。立刻出现固体 沉淀。在加热回流后，悬浮液变澄清，随后出现白色沉淀物。回流5 分钟后，将反应冷却，通过离心分离出固体。将该固体用水漂洗，在真 空内干燥过夜。将干燥的粉末用研钵和捣棒粉碎并且经90微米的不锈 钢筛筛分。收集过筛的粉末(90微米筛)并定性分析。干燥固体的总产 量为198.4mg，研磨后得到110.8mg大小一定的粉末。定性分析表明 复合物具有下列组成：肽PPI-158-80％，CMC-18.8％，水-6.6％。 实施例9：

在本实施例中，不溶性复合物是在LHRH类似物CetrorelixTM(也 称作SB-75)和羧甲基纤维素(CMC)之间形成。CetrorelixTM的结构是： 乙酰基-D-萘基丙氨酰基-D-4-Cl-苯基丙氨酰基-D-吡啶基丙氨酰基- L-丝氨酰基-L-酪氨酰基-D-瓜氨酰基(citrulyl)-L-亮氨酰基-L-胍基 戊氨酰-L-脯氨酰基-D-丙氨酰基-酰胺。为了制备CetrorelixTM/CMC 缓释制剂，将102.8mg(净重87mg)CetrorelixTM加入到17.4ml水中， 并且搅拌原料以使肽悬浮并溶解。向该搅拌溶液中加入1.1ml 2％CMC 钠溶液(Hercules)。立刻出现成块的白色沉淀。将悬浮液加热回流5 分钟并冷却，生成白色沉淀固体。通过离心分离出固体，将固体用水漂 洗，真空干燥过夜。将干燥的粉末用研钵和捣棒粉碎并且经90微米的 不锈钢筛筛分。收集粉末并定性分析。干燥固体的总产量为95mg，经 研磨后得到60mg大小一定的粉末。定性分析表明复合物具有下列组 成：肽CetrorelixTM-75％，CMC-20.7％，水-6.5％。 实施例10：

在本实施例中，测定三种不同LHRH类似物(PPI-149、PPI-258和 CetrorelixTM)从上述三个实施例所制得的CMC缓释制剂中向体内的持 续释放。并且对三种不同的制剂载体，即盐水、甘油(15％甘油/4％葡 萄糖)和卵磷脂进行试验。采用Spragur-Dawley大鼠(25只雄性，体重 300-325g)，LHRH类似物的有效性是基于血浆睾丸素水平降低作用来判 断的。

给药的剂量和途径如下所示： 组别 化合物 剂量 (mg/kg) 剂量 (μg/kg/天) 剂量 (mg/只鼠) 载体 给药途径 A PPI-149 9 300 2.7 盐水 IM B PPI-149 9 300 2.7 甘油 IM C PPI-149 9 300 2.7 甘油 SC D PPI-149 9 300 2.7 卵磷脂 IM E PPI-258 9 300 2.7 盐水 IM F Cetrorelix TM 9 300 2.7 盐水 IM

肽的精确剂量是300μg/kg/天×30天，给药是以200μl的单剂量 肌肉内(IM)或皮下(SC)注射2.7mg/只鼠。活性肽浓度为13.5mg/ml 时，注射5只鼠/组所需的总体积是1.3m1。注射体积保持不变，调整 粉末的重量以达到总肽量，如下所示： 组别 所需体积 ml 粉末的需要量 mg 粉末的用量 mg 所用体积 ml A 1.3 22.5 29.5 1.7ml盐水 B，C 2.6 45 71.1 4.1ml甘油/葡萄糖 D 1.3 22.5 35.2 2.03ml 0.5％卵磷脂/甘露糖醇 E 1.3 22.5 31 1.79ml盐水 F 1.3 22.5 20.9 1.21ml盐水

在第0天麻醉条件下，将200μl单剂量的试验物分别肌肉内或皮 下注射到左后肢的上胁腹或肩胛之间的皮肤下。

为了测定血浆睾丸素水平，在给药后第1天和第3、7、14、21、 28和35天自后眶窦(retro-orbital sinus)取约0.4m1血样。将血液 处理成血浆，在干冰上冷冻，通过标准方法测定睾丸素血浆水平。

图3A-3C所示的典型结果证明，LHRH类似物PPI-149、PPI-258 和CetrorelixTM作为CMC缓释制剂可以相应地将雄性Sprague-Dawley 大鼠体内的血浆睾丸素水平降低，并可以在低水平维持至少28天，甚 至长达50天(分别如图3A、3B和3C所示)。这些结果表明，三种制剂 均有效降低体内血浆睾丸素水平，并且可以长时间维持较低的血浆睾丸 素水平。 实施例11：

在本实施例中，将PPI-149-CMC制剂暴露在γ照射下灭菌，随后对 照射制剂的物理和化学性质进行评价。下列数据表明，γ-照射是适用于 PPI-149-CMC缓释制剂的灭菌方式。 肽的稳定性

将每个约40mg的两个独立PPI-149-CMC批次分别装(在液上气体 下)在1型玻璃瓶内，用橡皮塞封口并用铝箔密封。随后，在不同标称 剂量的γ照射下处理这些玻璃瓶。从每个批次暴露在各个水平γ照射下的 样品中各取两瓶用于分析肽的纯度(表示为％)。结果表明，当γ照射剂 量不超过并包括24KGy时，PPI-149-CMC在肽纯度中的降低始终在2％ 以下(如HPLC测定的杂质曲线所示)。在第二个试验中对另一试验批次 的PPI-149-CMC采用了较高剂量的γ照射。PPI-149-CMC被证实能够在 高剂量γ照射下暴露时具有很好的化学稳定性。

随后的处方前研究是将PPI-149-CMC经γ-照射后的降解曲线与 PPI-149注射溶液(1mg/ml)经高压灭菌后获得的降解曲线进行比较。两 种样品制备如下：a)将PPI-149-CMC暴露在19KGy γ-照射下；b)将 PPI-149溶液(1mg/ml)进行高压灭菌(121℃/20分钟)。两种样品的 HPLC色谱图显示，两种样品的降解曲线定性相似(出现相似的主峰相对 保留时间)。 γ-照射后储存的应力稳定性

在γ-照射后对各瓶进行应力储存(stress-storage)的处方前研 究。将PPI-149-CMC两个试验批次的密封玻璃瓶暴露在19KGy的γ-照 射下，并且在25℃、37℃和50℃下储存长达1个月。这些处方前研 究中的化学稳定性数据表明，经过19KGy剂量的γ-照射以及随后的应 力储存后，甚至在较高应力储存条件(例如50℃下1周)下储存以后， 也没有造成重大的化学不稳定性。这些数据显示，在经过不超过 19KGy剂量的γ-照射以及在50℃以下储存28天后，PPI-149-CMC在 肽纯度中的降低保持在2％以下(如HPLC测定的杂质曲线所示)。尽管 两个批次试验中的起始水分含量明显不同，但从起始的处方前稳定样品 或储存1个月后的样品中测出的肽纯度并无明显差异。 PPI-149-CMC粒度分析

用激光散射粒度测定法对PPI-149-CMC进行粒度分析。为了说明 该方法的可行性，可进行一个处方前试验，该试验研究γ-照射对PPI- 149-CMC粒度的影响。该试验首先认为无定形固体材料在储存中会有颗 粒变实的倾向。将PPI-149-CMC试验批次的两个样品储存在I型瓶内， 用灰色橡皮塞封口并用铝箔密封。在暴露于15.5KGy剂量的γ-照射之前 和之后对颗粒进行分析。颗粒分析采用激光散射法(使用装有反向傅里 叶透镜的Malvern Mastersizer STM)。在剧烈的振摇下，将用于激光 散射粒度分析的20mg样品分散在约0.5ml去离子水中，随后在室温下 和浴槽内声处理5分钟。在本底计数以后，进行定性分析试验。将样品 分散体滴加到连续进样池(约60ml标称体积)内直至昏暗度达到约20 ％。试验(和本底检测)中，混合器的旋转速率被设定在2700rpm。在这 种速率条件下，不产生旋涡引起的气泡，并足以保持分散体的稳定性。 进行8次扫描，分析数据表明，所有数据点端值的标准偏差＜0.03％。 当样品分散体在池中保持15分钟并取出后，没有产生显著的变化，这 表明在试验过程中没有出现颗粒溶出。

用上述试验参数对样品进行分析。进行8次扫描，测出平均粒径的 数据。可以发现存在两种不同的粒度分布，并且在高粒度端区都具有明 确的截止值，这表明颗粒没有发生聚集。1批次的PPI-149-CMC在γ-照 射前的平均体积直径明显低于照射后的样品。该处方前试验似乎表明， 在灭菌过程中一些颗粒变实。 实施例12：

在本实施例中，进行多种处方前试验来研究γ-照射和温度/湿度作 用对固态形式的PPI-149-CMC的影响。

X-射线粉末衍射法

在试验开始时，将两种60mg的PPI-149-CMC样品装在(在液上空 气下)I型玻璃瓶内、用灰色丁基橡皮塞封口并用铝箔密封。将一个样 品暴露在19.0KGy剂量的γ-照射下。随后通过X-射线粉末衍射研究两 种60mg固态形式的样品。比较19.0KGy剂量γ-照射之前和之后的衍射 图。

在下一试验中，将60mg的PPI-149-CMC样品(经γ-照射后)装在I 型玻璃瓶内，并且在预平衡的恒湿恒温箱内和50℃/75％相对湿度条件 下放置5天。将恒温箱内的样品取出后迅速用灰色丁基橡皮塞将样品容 器封口并用铝箔密封。将该压封样品的X-射线粉末衍射图与在室温下 密封在容器内的相同批次的另一样品进行比较。用装有石墨单色仪和 Cu(λ＝1.54)X-射线源的Siemens D500自动粉末衍射仪在50kV和40mA 下对样品进行分析。采用分步扫描窗的双-θ(two-theta)扫描范围是 4-40°，该分步扫描窗的第二步是0.05°/1.2。将光隙设定在(1)1°、 (2)1°、(3)1°、(4)0.15°和(5)0.15°。用NBS云母标准物(SRM 675)进 行双-θ校准。用零本底样品板分析样品。

数据表明，在γ照射前，PPI-149-CMC没有明显的结晶或拟结晶结 构。事实上，其X-射线衍射图具有无定形固态的特性(在2-20°20之间 存在宽鸵峰，在衍射图中没有明显的峰)。照射后的PPI-149-CMC样品 也产生一个与未照射样品极其相似的衍射图，这表明γ-照射的处理(不 超过19KGy的剂量)未在材料中引起显著的固态多晶形变换。在类似的 方法中，PPI-149-CMC的温度/湿度试验样品具有与未照射样品和照射 样品极其相似的衍射图谱，这强有力地表明，PPI-149-CMC不存在在材 料中引起固态多晶型变换的倾向。 吸湿性

对PPI-149-CMC(照射后)的处方前研究，可在恒温(25℃)和各 种相对湿度条件下测定平衡吸湿度(通过重量增益测定)。对作为相对湿 度(％RH)函数的平衡湿度(％水分)的分析表明，含水量在高达约80％ 相对温度下逐渐增加。在较高的相对湿度(95％RH)下，PPI-149-CMC吸 湿显著。当相对温度等于或低于80％时，对防潮的严重关注是不必要 的；因此，某些制备步骤可以在日常的湿度条件下进行(条件是避免湿 度端值)。 实施例13：

在本实施例中，对PPI-149-CMC进行溶出性试验。试验采用沉降 和非沉降条件。PPI-149-CMC在25℃下、在0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH 7.3) 中的溶解度约为100μg/ml(以游离肽来测量和表示)。在沉降条件下(在 指定温度的体系中的饱和溶解度＜10％)，甚至不用搅拌，PPI-149-CMC 迅速溶解(测定并表示为游离的肽)。在类似的试验中，测定PPI-149- CMC在25℃的0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH 7.3)中的平衡溶解度(测定并 表示为游离肽)；试验中采用三种样品：单独的PPI-149-CMC、另外存 在10％(重量)PPI-149(表示为游离肽，但以PPI-149的醋酸盐形式引 入)的PPI-149-CMC以及另外含有50％(重量)羧甲基纤维素钠USP的 PPI-149-CMC。三种样品表面上均具有相似的肽平衡溶解度。由于所选 择的缓冲体系接近于生理条件，存在于PPI-149-CMC中的附加游离羧 甲基纤维素或肽种类可能不对溶解度产生影响。 实施例14：

在本实施例中，对PPI-149-CMC在狗体内反复使用的皮下(SC)和 肌肉内(IM)剂量的药代动力学、药效学和安全性进行定性分析。

在第一个试验中，将对40只雄性长耳短腿小猎犬进行为期三个月 的评价，试验中每月1次IM或SC注射PPI-149-CMC，其剂量分别为 1.2mg/kg(第1天)、0.3或0.6mg/kg(第29天)，1.2mg/kg(第57天)， 注射液采用多种重新组合的赋形剂。试验采用8组，每组5只的狗进行 试验： 组别 动物数     重新组合的赋形剂a，b            剂量c           (mg/kg) 给药 途径 第1天 第29天 第57天 第1天 第29天 第57天 Ad 5 盐水 甘油 卵磷脂 0 0 0 IM B 5 甘油 甘油 卵磷脂 1.2 0.3 1.2 IM C 5 甘油 甘油 卵磷脂 1.2 0.6 1.2 IM D 5 PEG 甘油 卵磷脂 1.2 0.3 1.2 IM E 5 PEG 甘油 卵磷脂 1.2 0.3 1.2 SC Fd 5 卵磷脂 甘油 卵磷脂 1.2 0.6 1.2 IM Gd 5 卵磷脂 甘油 卵磷脂 1.2 0.6 1.2 SC H 5 甘油 甘油 卵磷脂 1.2 0.3 1.2 SC a.用于将PPI-149-CMC再溶为特定悬浮液的重新组合的赋形剂，

它们含有下列成分(在水中)：

1.甘油＝15％甘油/5％葡萄糖

2.PEG＝4％聚乙二醇-3350/4％甘露糖醇

3.卵磷脂＝0.5％卵磷脂/5％甘露糖醇 b.注意，用于临床试验的重新组合的赋形剂为0.9％氯化钠USP c.所有剂量均以肽(PPI-149)的含量表示 d.在第85天宰杀三只动物用于解剖和显微组织学研究

该试验是评价在不同赋形剂中的起始剂量PPI-149-CMC在第一个 月的处理期间的有效性。在试验的第二个月中，试验的狗接受较低剂量 的PPI-149-CMC，以便测出有效的“维持”剂量。第3个月内，对 PPI-149-CMC的长期安全性和作用特性进行评价。

在各个给药日期中，将在一种重新组合的赋形剂中配制的PPI- 149-CMC以IM或SC剂量，或将IM剂量的空白对照物投药在右后肢的 上胁腹(IM)和肩胛中区(SC)。将上述材料吸入带有23g斜角短针的1cc 结核菌素注射器内。注射部位在给药前用酒精棉签即时擦涂。注射体积 是基于特定的肽剂量/kg体重。应注意，所有剂量均是指PPI-149肽的 给药量。

在整个试验期间每天至少观察2次每只试验动物表现出的毒性或 药理学作用的明显指征以及全身行为和外观的变化。记录下全部异常的 临床表现。

在给予第一个剂量前以及给药后的不同时间采集血样，用于全血计 数(CBC)，血清化学分析，并用放射免疫测定法每周测定2次PPI-149 和睾丸素的浓度。

在试验3个月后，处死9只试验动物，收集它们的组织，用于全面  的病理学和病理组织学分析。处死的动物选自：赋形剂对照组、一个 IM给药组和一个SC给药组。在第3个月处死后收集的用于病理学和病 理组织学分析的组织是：给药部位(SC或IM)、肾上腺、主动脉、骨、 骨髓、脑、隔膜、附睾、食管、带有视神经的眼、心脏、肾、大肠(盲 肠，结肠)、带有胆囊的肝脏、带有气管的肺、淋巴结、胰腺、脑垂体 腺、带有尿道的前列腺、唾液腺、坐骨神经、骨骼肌、皮肤、小肠(十 二指肠、空肠、回肠)、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、带有甲状旁腺的 甲状腺、舌、气管、膀胱和肉眼损害。

在对处理动物和对照动物的试验期间，血液学或血液化学中的基线 没有明显变化。除了睾丸和前列腺发生了意料内的改变之外，PPI- 149-CMC处理的狗与对照动物(经赋形剂处理)在三个月后处死的总体 和组织学评价中未显示出明显的差异，也就是这种LHRH拮抗剂产生了 预期的作用。

对于PPI-149-CMC的药代动力学，用1.2mg/kg再悬浮于各种重新 组合的赋形剂中的PPI-149-CMC处理所有的狗，IM或SC给药均显示出 相似的血浆PPI-149药代动力学曲线，曲线中在第一个2天内出现血浆 浓度峰，并且在随后的一个月内以指数方式缓慢降低。当被悬浮在试验 所用的三种重新组合赋形剂的任意一种中时，PPI-149-CMC具有与 PPI-149相似的血浆分布。

考虑到PPI-149-CMC的内分泌作用，PPI-149-CMC初次给药后的 24小时内所有试验狗均表现出阉割水平的睾丸素(＜0.6ng/ml)，并且这 种睾丸素水平在给药后的第一个月内普遍保持在阉割水平的范围内，而 与给药途径和所选的再溶赋形剂无关。在35只狗中，有26只(75％) 狗在第29天PPI-149-CMC第二次给药前抽取的血样中含有阉割水平的 睾丸素。这些结果表明，1.2mg/kg的起始剂量在狗的体内成功地引起 快速并长效的血浆睾丸素抑制作用(＞28天)。在第二个月的给药中，在 测试“维持”剂量(低于起始剂量的剂量)的功效时，其结果表明，在 35只狗中，0.3或0.6mg/kg PPI-149-CMC的给药可以使30只狗体内 的睾丸素在阉割水平维持20天以上。在第二个月的治疗结束(第57天) 时，在35只狗中，有21只(60％)保持在阉割水平，而另外14只动物 的睾丸素水平恢复正常(＞0.6％ng/ml)。在第3个月初以1.2mg/kg的剂 量给药。PPI-149的血药浓度在随后的28天内保持不变，而血浆睾丸 素水平重新达到“阉割”水平。在第三个月结束时(第85天)，血浆睾 丸素水平在35只PPI-149-CMC处理狗中的30只中保持在阉割水平。

总之，采用IM或SC给药方式以及不同的重新组合赋形剂，35只 狗在第1天接受1.2mg/kgPPI-149-CMC，在第29天接受0.3或0.6mg/kg PPI-149-CMC，并且在第57天接受1.2mg/kg PPI-149-CMC。在这35 只狗中，19只狗(54％)的血浆睾丸素水平在整个治疗过程中保持在阉 割水平范围内。因此，以28天的时间间隔进行PPI-149-CMC给药可以 对血浆睾丸素产生快速(所有动物在24小时内达到阉割水平)和长效 (在整个给药过程中保持)的完全抑制作用。

按照与上述试验类似的方法进行为期6个月的试验，以进一步评价 PPI-149-CMC在狗体内的长期安全性和功效特性。动物通过IM或SC方 式接受1.2mg/kg起始剂量的PPI-149-CMC，随后以28天为间隔接受5 次给药(浓度为0.3mg/kg、0.6mg/kg或1.2mg/kg)。在一定的时间间隔 利用放射免疫学分析法对血浆睾丸素和PPI-149的水平进行评价。图 4(SC处理)和图5(IM处理)中的典型结果显示了血浆睾丸素水平(空心 方框)和PPI-149水平(实心方框)。每次PPI-149-CMC给药时所用的具 体剂量在曲线中标出。图4和图5的结果进一步证明，以28天为间隔 的PPI-149-CMC给药可以对血浆睾丸素产生快速和长效的完全抑制作 用，该作用能够将降低的血浆睾丸素水平维持6个月之久。

等同物

所属领域技术人员无需更多的常规试验就会意识到或能够确信许 多本发明具体实施例所描述的等同物。这些等同物也包含在下列权利要 求书的范围之内。