人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
阅读：176发布：2020-12-30
专利汇可以提供人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化LAG-3基因动物模型的构建方法及其在 生物 医药领域的应用。，下面是人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，选自NCBI登录号为NC_000072.6的第
124910116-124908702位核苷酸。
3.根据权利要求1-2任一所述的靶向载体，其特征在于，所述插入或替换的供体DNA序列来自人。优选的，所述插入或替换的供体DNA为人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人LAG-3基因的核苷酸序列包括人LAG-3基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子、第7号外显子和/或第8号外显子中的一个或多个。
4.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。
优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。
优选的，所述sgRNA在小鼠Lag-3基因的靶位点分别位于小鼠Lag-3基因的第2外显子和第3外显子上。
更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的
3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：5所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：12所示。
5.根据权利要求4所述的一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，其识别5’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；其识别3’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22。
6.一种包含权利要求4-5任一所述的sgRNA序列的构建体。
7.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
8.根据权利要求7所述的制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22所示，其中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
9.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求6所述的构建体和/或一种或多种权利要求6所述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体和一种或多种权利要求6所述构建体的体外转录产物。
10.权利要求1-3任一所述的靶向载体、权利要求4-5任一所述的sgRNA序列、权利要求6所述的构建体或权利要求9所述的细胞、权利要求7-8任一所述方法产生的sgRNA载体在构建包含LAG-3基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
11.一种构建LAG-3基因人源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述方法包括导入人LAG-3基因、使得该人LAG-3基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的LAG-3蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Lag-3基因的表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)构建含有人LAG-3基因的载体，通过基因工程方法将所述人LAG-3基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Lag-3基因缺失或使得内源/动物来源的Lag-3蛋白不表达或不具有功能；并且
(b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化LAG-3蛋白。
13.根据权利要求11-12任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的区域包含人LAG-3基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Lag-3启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化LAG-3基因的区域为动物来源。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述人源化LAG-3基因包括将动物来源的Lag-3的第2号外显子和第3号外显子全部或部分序列替换为人LAG-3的第2号外显子和第
3号外显子的全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向动物的Lag-3基因，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
15.根据权利要求11-14任一所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿类动物。优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
16.根据权利要求11-15任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型。优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
17.根据权利要求11-16任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)提供一种如权利要求9所述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行LAG-3基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行LAG-3基因人源化动物模型的建立。
19.根据权利要求11-18任一所述的方法，其特征在于，所述人源化LAG-3蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：
31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
20.根据权利要求11-18任一所述的方法，其特征在于，所述人源化的LAG-3基因选自下列组中的一种：
a)所述基因编码权利要求19中所述人源化LAG-3蛋白序列；
b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
21.一种由权利要求11-20任一所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
22.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，
(a)利用权利要求21所述的非人动物或其子代；
(b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。优选的，所述其他人源化动物为PD-1人源化小鼠或CTLA-4人源化小鼠。
24.根据权利要求22或23所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
25.一种嵌合LAG-3蛋白，其特征在于，选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：
31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
26.编码嵌合LAG-3蛋白的基因，其特征在于，其中所述基因序列选自：
a)所述基因编码权利要求25中所述人源化LAG-3蛋白序列；
b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
27.一种表达权利要求25所述人源化小鼠LAG-3蛋白的构建体。
28.一种包含权利要求27所述构建体的细胞。
29.一种包含权利要28所述细胞的组织。
30.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求21或权利要求24所述的非人动物或其子代。
31.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求21或权利要求24所述的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
32.一种权利要求21或24所述的动物及子代、权利要求25所述的嵌合LAG-3蛋白、权利要求26所述的编码嵌合LAG-3蛋白的基因、权利要求27所述的构建体、权利要求28所述的细胞、权利要求29所述的组织、权利要求30所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求
31所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
33.一种权利要求21或24所述的动物及子代、权利要求25所述的嵌合LAG-3蛋白、权利要求26所述的编码嵌合LAG-3蛋白的基因、权利要求27所述的构建体、权利要求28所述的细胞、权利要求29所述的组织、权利要求30所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求
31所述的组织或器官在与LAG-3基因或者蛋白相关的领域中的应用。
34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人LAG-3信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究LAG-3基因功能研究、人LAG-3抗体、针对人LAG-3靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。
[0003] 淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞上，通过与其配体组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ)结合，负调控T细胞功能。
[0004] 已有证据表明，LAG-3在多种免疫应答类型中发挥了重要调控作用，特别是在肿瘤免疫中。LAG-3在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中异常表达，且与多项病理参数和预后密切相关。LAG-3抑制剂或阻碍其信号通路能增强特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用。此外，联合阻断LAG-3和PD-1可能是通过增加效应T细胞的比例起到减缓肿瘤生长的协同作用。可见抗LAG-3治疗联合其它多个信号分子，在临床上对改善肿瘤免疫治疗疗效具有应用价值，可能是今后研究的重要方向之一。
[0005] 实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前与LAG-3相关的实验动物很少。Toru Miyazaki(1996)等人利用同源重组技术，将小鼠Lag-3基因上1-3号外显子用新霉素抗性基因替换，制备出Lag-3基因敲除小鼠。该小鼠NK细胞功能受损，对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。进一步的研究证实该小鼠抗原特异性CD8+T细胞增殖增加；CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较野生型增加，但两者比值未观察到明显变化。此外，该小鼠制备过程中使用的胚胎干细胞(ES细胞)来源于129遗传背景的小鼠，得到嵌合鼠后需与C57BL/6进行多次回交。该方法缺陷在于：一般需要超过10代的回交才能获得纯合子，回交往往需要2年的时间，耗费时间、资金和科研精力；另一方面，回交次数不同也会造成试验结果重复性差。
[0006] 由于目前的模型小鼠存在上述缺陷，且LAG-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化LAG-3基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例LAG-3基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达LAG-3蛋白，且表达的LAG-3蛋白能识别并结合人LAG-3抗体/抗原。此外，使用本方法制备的LAG-3基因人源化动物还可与其它基因改造人源化动物交配，得到双人源化或多人源化动物模型。本方法在肿瘤药物筛选等方面有着广阔的应用前景。
发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本发明惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物LAG-3基因的特定片段被人LAG-3基因特定片段替换，本发明成果得到世界首例LAG-3基因人源化小鼠。成功制备LAG-3基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达LAG-3嵌合蛋白，可用于LAG-3基因功能研究、靶向LAG-3人源抗体的筛选和评价。
[0008] 利用本发明制备的动物模型可用于针对人LAG-3靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究LAG-3蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。
[0009] 同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1动物模型)交配得到双基因人源化动物模型或多基因人源化动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
[0010] 本发明的第一方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
[0011] 优选的，所述的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与带改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，选自NCBI登录号为NC_000072.6的第
124910116-124908702位核苷酸。
124910116-124908702位核苷酸。
[0012] 优选的，所述的靶向载体，a)中选择的基因组核苷酸的长度为869bp，c)中选择的基因组核苷酸的长度为1415bp。
[0013] 优选的，所述的靶向载体，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因第2外显子和第3外显子。更优选的，所述的待改变的转换区为第2外显子部分或全部和/或第3外显子部分或全部。
[0014] 优选的，所述的靶向载体，其中5’臂序列如SEQ ID NO：32所示。
[0015] 优选的，所述的靶向载体，其中3’臂序列如SEQ ID NO：38所示。
[0016] 优选的，所述的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。
[0017] 优选的，所述的靶向载体，所述插入或替换的供体DNA序列来自人。进一步优选的，所述插入或替换的供体DNA为人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。更优选的，所述人LAG-3基因的核苷酸序列包括人LAG-3基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子、第7号外显子和/或第8号外显子中的一个或多个。最优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列为SEQ ID NO：26所示的人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。
[0018] 优选的，所述的靶向载体，其中所述人LAG-3的核苷酸序列编码如SEQ ID NO：27所示的NCBI登录号NP_002277.4所示人LAG-3蛋白的部分或全部序列。
[0019] 人源DNA片段选自NCBI登录号为NC_000012.12的第6773206-6773988位核苷酸。
[0020] 优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：35所示。
[0021] 本发明的第二方面，涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。
[0022] 更优选的，所述sgRNA在小鼠Lag-3基因的靶位点分别位于小鼠Lag-3基因的第2外显子和第3外显子上。进一步优选的，所述的待改变的转换区为第2外显子部分或全部和/或第3外显子部分或全部。
[0023] 再进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
[0024] 最优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：5所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：12所示。
[0025] 优选的，所述sgRNA序列，其识别5’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18；其识别3’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22。
[0026] 第一对sgRNA序列具体为：上游序列如SEQ ID NO：15所示，下游序列如SEQ ID NO：17所示，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。
[0027] 第二对sgRNA序列具体为：其上游序列如SEQ ID NO：16所示，其由在SEQ ID NO：15的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：18所示，其由在SEQ ID NO：17的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。
[0028] 第三对sgRNA序列具体为：其上游序列如SEQ ID NO：19所示，下游序列如SEQ ID NO：21所示，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。
[0029] 第四对sgRNA序列具体为：其上游序列如SEQ ID NO：20所示，其由在SEQ ID NO：19的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：22所示，其由在SEQ ID NO：21的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。
[0030] 本发明的第三方面，涉及一种包含上述上述的sgRNA序列的构建体。
[0031] 本发明的第四方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
[0032] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0033] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0034] (3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0035] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0036] 优选的，所述制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
[0037] (1)将序列如SEQ ID NO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0038] 优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22所示，其中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22为B组；
[0039] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0040] (3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0041] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0042] 本发明的第五方面，涉及一种细胞，所述细胞包含上述的靶向载体、一种或多种上述的构建体和/或一种或多种上述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含上述的靶向载体和一种或多种上述构建体的体外转录产物。
[0043] 本发明进一步涉及所述的细胞，还包括Cas9 mRNA或其体外转录产物。
[0044] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是杂合的。
[0045] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是纯合的。
[0046] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述非人动物细胞是小鼠细胞。
[0047] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞为受精卵细胞。
[0048] 优选的，所述受精卵来源于任何非人类动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；最优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。
[0049] 本发明的第六方面，涉及上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的构建体或上述的细胞在构建包含LAG-3基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
[0050] 本发明的第七方面，涉及一种构建LAG-3基因人源化的非人动物或其子代的方法，所述方法包括导入人LAG-3基因、使得该人LAG-3基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的LAG-3蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Lag-3基因的表达。
[0051] 优选的，所述方法包括：
[0052] (a)构建含有人LAG-3基因的载体，通过基因工程方法将所述人LAG-3基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Lag-3基因缺失或使得内源/动物来源的Lag-3蛋白不表达或不具有功能；并且
[0053] (b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化LAG-3蛋白。
[0054] 优选的，所述动物基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的区域包含人LAG-3基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Lag-3启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化LAG-3基因的区域为动物来源。
[0055] 优选的，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的Lag-3基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含内源/动物来源的Lag-3基因座，用人LAG-3胞外域编码序列取代内源/动物来源的Lag-3胞外域编码序列的部分或全部。
[0056] 优选的，所述人源化LAG-3基因包括将动物来源的Lag-3的第2号外显子和第3号外显子全部或部分序列替换为人LAG-3的第2号外显子和第3号外显子的全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向动物的Lag-3基因，优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。所述小鼠Lag-3的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：24中的全部或部分片段所示，所述小鼠Lag-3的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示。
[0057] 进一步优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
[0058] 优选的，所述的人LAG-3基因的全部或部分片段的人LAG-3mRNA序列如SEQ ID NO：26中的全部或部分片段所示，所述人LAG-3蛋白全部或部分片段的序列如SEQ ID NO：27中的全部或部分片段所示。
[0060] 优选的，所述方法包括如下步骤：
[0061] (a)提供一种如本发明上述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；
[0062] (b)将所述细胞在培养液中进行培养；
[0063] (c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
[0064] (d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
[0065] 优选的，本发明所述的使用基因编辑技术进行LAG-3基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。更优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行LAG-3基因人源化动物模型的建立。
[0066] 本发明进一步涉及所述的方法，非人动物是啮齿类动物。
[0067] 本发明进一步涉及所述的方法，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
[0068] 本发明进一步涉及所述的方法，所述步骤(c)中的非人类哺乳动物为假孕雌性。
[0069] 本发明还涉及一种Lag-3基因敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Lag-3的第2号外显子和第3号外显子全部或部分敲除，使得内源Lag-3蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向动物的Lag-3基因，所述sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。
[0070] 优选的，所述动物用作动物模型。优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
[0071] 本发明所述的Lag-3基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：
[0072] 第一步：按照上述的步骤(1)-(4)，获得sgRNA载体；
[0073] 第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
[0074] 第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Lag-3基因被敲除，获得Lag-3基因敲除阳性小鼠；
[0075] 第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Lag-3-/-小鼠；
[0076] 优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：41-44所示。
[0077] 本发明的第八方面，涉及上述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0078] 本发明的第九方面，涉及一种嵌合LAG-3蛋白，选自下列组中的一种：
[0079] a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
[0080] b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
[0081] c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0082] d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0083] e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[0084] 或
[0085] f)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：26所示的序列的部分或全部所示；
[0086] g)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0087] h)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列杂交；
[0088] i)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0089] j)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：26所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0090] 或
[0091] k)嵌合LAG-3蛋白序列中人LAG-3的蛋白序列如SEQ ID NO：27部分或全部序列所示；
[0092] l)嵌合LAG-3蛋白序列中人LAG-3的蛋白序列与SEQ ID NO：27所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0093] m)嵌合LAG-3蛋白序列中编码人LAG-3的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：27所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
[0094] n)嵌合LAG-3蛋白序列中人LAG-3的蛋白序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0095] o)嵌合LAG-3蛋白序列中人LAG-3的蛋白序列具有SEQ ID NO：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
[0096] 或
[0097] p)嵌合LAG-3蛋白的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：29所示的序列的部分或全部；
[0098] q)嵌合LAG-3蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0099] r)嵌合LAG-3蛋白的核苷酸编码序列在严格条件下，与SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列杂交；
[0100] s)嵌合LAG-3蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0101] t)嵌合LAG-3蛋白的核苷酸编码序列具有SEQ ID NO：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0102] 或
[0103] u)嵌合LAG-3的mRNA序列为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；
[0104] v)嵌合LAG-3的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0105] w)嵌合LAG-3的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列杂交；
[0106] x)嵌合LAG-3的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0107] y)嵌合LAG-3的mRNA序列具有与SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0108] 或
[0109] A1)嵌合LAG-3蛋白中编码嵌合LAG-3蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：28所示的序列的部分或全部；
[0110] B1)嵌合LAG-3蛋白中编码嵌合LAG-3蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0111] C1)嵌合LAG-3蛋白中编码嵌合LAG-3蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列杂交；
[0112] D1)嵌合LAG-3蛋白中编码嵌合LAG-3蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：28所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0113] E1)嵌合LAG-3蛋白中编码嵌合LAG-3蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
[0114] 本发明的第十方面，涉及编码嵌合LAG-3蛋白的基因，其中，所述基因序列选自：
[0115] a)所述基因编码本发明上述的嵌合LAG-3蛋白序列；
[0116] b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
[0117] c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
[0118] d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0119] e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
[0120] 优选的，SEQ ID NO：30所示序列为人源化小鼠LAG-3DNA的非模板链，又被称为编码链或有义链。
[0121] 本发明进一步涉及一段人源化小鼠LAG-3的基因组DNA序列，其转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，前述DNA序列一致或互补。
[0122] 鉴于人LAG-3或小鼠Lag-3具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
[0123] 本发明的第十一方面，涉及一种表达上述人源化小鼠LAG-3蛋白的构建体。
[0124] 本发明本发明的第十二方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
[0125] 本发明本发明的第十三方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
[0126] 本发明的第十四方面，涉及一种制备多基因人源化非人动物的方法，
[0127] (a)利用上述的非人动物或其子代；
[0128] (b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
[0129] 优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
[0130] 本发明进一步涉及一种建立双人源化小鼠基因改造非人动物的方法，包括如下步骤：
[0131] (a)利用前述的一种建立LAG-3基因人源化非人动物的方法获得LAG-3基因基因改造人源化小鼠；
[0132] (b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配，并进行筛选，得到双人源化小鼠。
[0133] 优选的，所述步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与PD-1人源化小鼠交配得到LAG-3和PD-1双人源化小鼠。
[0134] 优选的，所述步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与CTLA-4人源化小鼠交配得到LAG-3和CTLA-4双人源化小鼠。
[0135] 本发明的第十五方面，涉及本发明上述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0136] 本发明进一步涉及非人类哺乳动物，其基因组中含有人源基因。
[0137] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是啮齿动物。
[0138] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是小鼠。
[0139] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物表达人源化LAG-3基因编码的蛋白质。
[0140] 所述的非人动物含有SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所述的基因；或者，与上述基因的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，与上述序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个碱基；或者，与上述基因在严格条件下杂交。
[0141] 本发明进一步涉及一种通过上述的任一方法制备获得的一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途。
[0142] 本发明进一步涉及一种荷瘤非人类哺乳动物模型，通过包括前述任一所述的方法制备获得。优选的，所述非人类哺乳动物是啮齿动物。进一步优选的，所述非人类哺乳动物是小鼠。
[0143] 本发明的第十六方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的的非人动物或其子代。
[0144] 本发明的第十七方面，涉及一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
[0145] 本发明进一步涉及一种来源于前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。
[0146] 本发明的第十八方面，涉及一种来源于上述动物及子代、上述嵌合LAG-3蛋白、上述编码嵌合LAG-3蛋白的基因、上述构建体、细胞和组织、上述细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述组织或器官在制备动物模型中的用途。
[0147] 本发明的第十九方面，涉及一种来源于上述动物及子代、上述嵌合LAG-3蛋白、上述编码嵌合LAG-3蛋白的基因、上述构建体、细胞和组织、上述细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述组织或器官在与LAG-3基因或者蛋白相关的领域中的应用。
[0148] 优选的，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人LAG-3信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究LAG-3基因功能研究、人LAG-3抗体、针对人LAG-3靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0149] 优选的，所述LAG-3抗体可以是人源或鼠源或嵌合。
[0150] 优选的，所述动物为非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物、动物模型。
[0151] 优选的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
[0152] 受精卵可以来源于任何非人类动物。优选受精卵细胞来源于啮齿类。可以通过DNA的显微注射来向受精卵引入遗传构建体。例如，可以通过显微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类哺乳动物来产生上文所述方法的非人类哺乳动物。
[0153] 这里使用的术语“基因改造”描述人工引入并整合进生物的DNA产生的特定基因的蛋白质。
[0154] 这里使用的术语“基因改造动物”描述基因组中含有外源DNA的动物。此基因改造DNA可能整合在基因组的某处。
[0155] 本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，提供非人类哺乳动物，所述基因改造动物基因组中含有编码人源LAG-3的DNA。
[0156] 在一个优选的实施方案中，本发明还涉及非人类哺乳动物的基因改造动物，所述动物基因组中含有外源DNA，所述DNA为所述的DNA或基因组DNA。其中所述基因改造可以是人工引入并整合进所述DNA表达特定基因的蛋白质。所述基因改造动物基因组中含有编码人源LAG-3的DNA。所述DNA还包括特异的诱导物或阻遏物物质。
[0157] 在另一个优选的实施方案中，本发明还涉及一种可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物能够表达人LAG-3蛋白的细胞，所述蛋白为前述人源化小鼠LAG-3蛋白。在另一个优选的实施方案中，非人类哺乳动物含有如上述所描述的遗传构建体。在另一实施方案中，提供表达基因改造人源LAG-3的非人类哺乳动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性表达人源LAG-3蛋白。
[0158] 在另一实施方案中，基因改造动物中的人源LAG-3的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。
[0159] 非人类哺乳动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类哺乳动物是哺乳动物，更优选的非人类哺乳动物是啮齿动物。本发明最优选的动物是小鼠。
[0160] 可以对上文描述的非人类哺乳动物进行临床表型分析和分子遗传学研究。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。
[0161] 本发明还提供来源于本发明提供的非人类哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。可以通过多种方法检测含有编码人源LAG-3蛋白的DNA序列的遗传构建体的整合。对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测外源DNA表达的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色、细胞流式检测和Western印迹分析来评估是否存在人源LAG-3蛋白质。
[0162] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning ALaboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；
Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；
Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
[0163] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
[0164] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
附图说明
[0165] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0166] 图1：sgRNA的活性检测结果，其中Con为阴性对照，PC为阳性对照，blank为空白对照；(A)为sgRNA1-sgRNA7活性检测结果；(B)为sgRNA8-sgRNA14活性检测结果；
[0167] 图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
[0168] 图3：人LAG-3基因与鼠Lag-3基因对比示意图；
[0169] 图4：人源化小鼠LAG-3基因示意图；
[0170] 图5：打靶策略示意图；
[0171] 图6：pClon-4G-LAG质粒酶切结果图，其中，CK为未经酶切的质粒对照；
[0172] 图7：鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中，M为Marker，WT为野生型，图A为5’端引物PCR扩增结果图，图B为3’端引物PCR扩增结果图；
[0173] 图8：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，WT为野生型，+为阳性对照，图A为5’端引物PCR扩增结果图，图B为3’端引物PCR扩增结果图；
[0174] 图9：F1代小鼠Southern blot结果，其中WT为野生型；
[0175] 图10：流式分析结果，其中，图A、D、G为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E、H为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F、I为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3人源化鼠，分别使用mLAG3 PE(图A、B、C)、hLAG3 APC(图G、H、I)和hLAG3 Alexa Fluor647(图D、E、F)进行细胞标记；
[0176] 图11：流式分析结果，其中，图A、D、G为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E、H为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F、I为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3人源化鼠，分别使用mLAG3 PE(图A、B、C)、hLAG3 APC(图D、E、F)和hLAG3 Alexa Fluor 647(图G、H、I)进行细胞标记；
[0177] 图12：鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型；
[0178] 图13：小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hLAG-3小鼠体内，并利用人LAG-3抗体进行抗肿瘤药效试验结果；
[0179] 图14：小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hLAG-3小鼠体内，并利用人LAG-3抗体进行抗肿瘤药效试验结果；
[0180] 图15：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为LAG-3纯合子对照，-为野生型对照(图A、B)，WT为野生型，-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为PD-1基因人源化小鼠杂合子(图C、D)；
[0181] 图16：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3/PD-1人源化鼠，分别使用mLAG3 PE(图A、B、C)和hLAG3 APC(图D、E、F)进行细胞标记；
[0182] 图17：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3/PD-1人源化鼠，分别使用mPD-1PE(图A、B、C)和hPD-1FITC(图D、E、F)进行细胞标记；
[0183] 图18：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为CTLA-4人源化基因纯合子对照，-为野生型对照(图A、B)，+为LAG-3杂合子对照，-为野生型对照(图C、D)；
[0184] 图19：小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化LAG-3/PD-1小鼠纯合子体内，并利用人PD-1抗体Keytruda和LAG-3抗体Ab-C中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验结果；
[0185] 图20：小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化LAG-3/PD-1小鼠纯合子体内，并利用人PD-1抗体Keytruda和LAG-3抗体Ab-C中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验结果；
[0186] 图21：小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化LAG-3/PD-1小鼠纯合子体内，并利用人PD-1抗体Keytruda和LAG-3抗体Ab-C中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验结果；
[0187] 图22：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。
具体实施方式
[0188] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0189] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
[0191] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
[0192] EcoRI，ScaI，HindIII，BamHI，XhoI，EcoRV，SalI，BbsI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3122M，R3104M，R3136M；R0146M，R3195M，R3138M，R0539L；
[0193] 卡那霉素购自Amresco，货号为0408；
[0194] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
[0195] AIO试剂盒来源北京百奥赛图公司，货号BCG-DX-004；
[0196] UCA试剂盒来源北京百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；
[0198] B-hPD-1小鼠、B-hCTLA-4小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；
[0199] 小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
[0200] 鼠CD3抗体来源BD，货号563123；
[0201] PE anti-mouse CD223(LAG-3)Antibody(mLAG3 PE)来源Biolegend，货号为125208；
[0202] Alexa 647anti-human CD223(LAG-3)Antibody(hLAG3 AlexaFluor647)来源Biolegend，货号为369304；
[0203] CD223(LAG-3)Monoclonal Antibody(3DS223H)(hLAG3 APC)购自eBioscience，货号为17-2239-42；
[0204] PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
[0205] PE anti-mouse CD279(PD-1)Antibody(mPD-1PE)来源Biolegend，货号109104；
[0206] FITC anti-human CD279(PD-1)Antibody(hPD-1 FITC)来源Biolegend，货号329904；
[0207] 流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
[0208] 实施例1pT7-LAG-5、pT7-LAG-12的构建
[0209] 靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
[0210] 设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA14)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于LAG-3基因第2号外显子和第3号外显子上，各sgRNA在LAG-3上的靶位点序列如下：
[0211] sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-GTTCCACTAGTTGTGTCTTCAGG-3’[0212] sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-GGCCCTGAAGACACAACTAGTGG-3’[0213] sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-ACCACGGGGAGCTCTTTCCCAGG-3’[0214] sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-CTAGTTGTGTCTTCAGGGCCTGG-3’[0215] sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-GCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGG-3’[0216] sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-CCTCCTGGGCCCACACCACGGGG-3’[0217] sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-GGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGG-3’[0218] sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-TCGAGGCCTGGCCGACGCGCAGG-3’[0219] sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-TCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGG-3’[0220] sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-AGGCCTGGCCGACGCGCAGGCGG-3’[0221] sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-TGCAGTCTCCGCCTGCGCGTCGG-3’[0222] sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-AGGAGAGGGCGCGGTTCGGGAGG-3’[0223] sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-GCGGTTCGGGAGGCGCACGGTGG-3’[0224] sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-TGCAGGAGAGGGCGCGGTTCGGG-3’[0225] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1(其中sgRNA9由于合成的序列不正确，未进行检测)。从中优先选择2个(分别是sgRNA-5和sgRNA-12)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-LAG-5和pT7-LAG-12。
[0226] 表1 sgRNA-5和sgRNA-12序列列表
[0227]
[0228]
[0229] 表2连接反应体系
[0230]sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4 DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4 DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL
[0231] 反应条件：
[0232] 室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
[0233] 随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-LAG-5和pT7-LAG-12进行后续实验。
[0234] pT7-sgRNA质粒来源：
[0235] pT7-sgRNA载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0236] 含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：23)：
[0237]gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc
[0238] 实施例2载体pClon-4G-LAG的构建
[0239] 将小鼠Lag-3基因(Gene ID：16768)第2号外显子至第3号外显子的部分编码序列(基于NCBI登录号为NM_008479.2→NP_032505.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：24所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：25所示)用人LAG-3基因(Gene ID：3902)相应编码序列替换(基于NCBI登录号为NM_002286.5→NP_002277.4的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：26所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：27所示)，鼠Lag-3与人LAG-3基因结构对比示意图见图3，最终得到的改造后的人源化小鼠LAG-3基因示意图见图4。人源化小鼠LAG-3基因DNA序列(嵌合LAG-3基因DNA)如SEQ ID NO：28所示：
[0240]ttgtgtcttcagggccaggggctgaggtcccggtggtgtgggcccaggagggggctcctgcccagctcccctgcagccccacaatccccctccaggatctcagccttctgcgaagagcaggggtcacttggcagcatcagccagacaggtatgcaccccaaacttgggcaacaggacctccgaatccagcactcaaccccacacccgtgccggtcctctgtcccctgccctgaggtgtcactccctctgaagccagtgacccagtctccctgccctcgcttgcaccgttcctgcccttgctctgcaatcagcgaccctcacgccagcatcccttctctccagaagtggatgcggccagtccaacagaggggtcgggcgtgaggggacggttggtggtcaagagaactcttggggcgggctttctcatcctcaacgggtggctgcctgcatcctcccgggcttcctacccctggagcttctcaactccattctctttcccgcccagtggcccgcccgctgccgcccccggccatcccctggcccccggccctcacccggcggcgccctcctcctgggggcccaggccccgccgctacacggtgctgagcgtgggtcccggaggcctgcgcagcgggaggctgcccctgcagccccgcgtccagctggatgagcgcggccggcagcgcggggacttctcgctatggctgcgcccagcccggcgcgcggacgccggcgagtaccgcgccgcggtgcacctcagggaccgcgccctctcctgccgcctccgtctgcgcctgggccaggcctcga
[0241] SEQ ID NO：28仅仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人源LAG-3基因序列片段。
[0242] 改造后的人源化小鼠LAG-3的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示。
[0243] 鉴于人LAG-3或小鼠Lag-3具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
[0244] 发明人进一步设计了图5所示的打靶策略和包含5’同源臂、人LAG-3基因片段、3’同源臂的载体。载体的构建过程如下：
[0245] 1、设计3段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：
[0246] 5’端同源臂序列如SEQ ID NO：32所示，为NCBI登录号为NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸，
[0247] 上游引物(SEQ ID NO：33)：
[0248] F：5’-tttaagaaggagatatacatggaattcgaatcagccccctcacactttccac-3’
[0249] 下游引物(SEQ ID NO：34)：
[0250] R：5’-cctcagcccctggccctgaagacacaactagtggaaca-3’
[0251] 人DNA片段(783bp)序列如SEQ ID NO：35所示，为NCBI登录号为NC_000012.12的第6773206-6773988位核苷酸；
[0252] 上游引物(SEQ ID NO：36)：
[0253] F：5’-gtgtcttcagggccaggggctgaggtcccggtggtg-3’
[0254] 下游引物(SEQ ID NO：37)：
[0255] R：5’-tcgaggcctggcccaggcgcagacggaggcggcag-3’
[0256] 3’同源臂序列如SEQ ID NO：38所示，为NCBI登录号为NC_000072.6的第124910116-124908702位核苷酸
[0257] 上游引物(SEQ ID NO：39)：
[0258] F：5’-cgtctgcgcctgggccaggcctcgagtaggtggg-3’
[0259] 下游引物(SEQ ID NO：40)：
[0260] R：5’-ttgttagcagccggatctcagggatccccagagggtggagacatcaaggaag-3’
[0261] 以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段，以人基因组DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段，通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-LAG。
[0262] 实施例3载体pClon-4G-LAG的验证
[0263] 随机挑选5个pClon-4G-LAG克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中，EcoRI+XhoI应出现1666bp+4137bp，EcoRV+HindIII应出现1097bp+4706bp，ScaI+SalI应出现1784bp+4019bp。酶切结果均符合预期，参见图6，表明所有质粒酶切验证正确结果。编号1和2的质粒经测序公司测序验证正确。
[0264] 实施例4显微注射及胚胎移植
[0265] 取C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-LAG-5、pT7-LAG-12质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-LAG质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将该免疫检查点人源化小鼠命名为B-hLAG-3小鼠。
[0266] 实施例5基因改造人源化小鼠的鉴定
[0267] 1、F0代基因型鉴定
[0268] 分别使用两对引物对得到的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，其中，PCR反应体系(20μL)见表3，PCR扩增反应条件见表4，引物位置PCR-1位于5’同源臂左侧，PCR-4位于3’同源臂右侧，PCR-2和PCR-3均位于人源化片段上，引物序列如下：
[0269] 5’端引物：
[0270] 上游引物：PCR-1(SEQ ID NO：41)：5’-agcattcacacagggtggggaattt-3’；
[0271] 下游引物：PCR-2(SEQ ID NO：42)：5’-ggcgtgagggtcgctgattg-3’
[0272] 3’端引物：
[0273] 上游引物：PCR-3(SEQ ID NO：43)：5’-gacctccgaatccagcactcaacc-3’；
[0274] 下游引物：PCR-4(SEQ ID NO：44)：5’-aggagtccacttggcaatgagcaaa-3’[0275] 如果重组载体插入正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为2049bp，3’端引物产物长度应为2206bp，3只阳性F0小鼠的PCR鉴定结果见图7，结果表明：编号为1、2、3的小鼠为阳性小鼠。
[0276] 表3 PCR反应体系(20μL)
[0277]10×缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
[0278] 表4 PCR扩增反应条件
[0279]
[0280] (*a每个循环降0.7℃)
[0281] 2、F1代基因型鉴定
[0282] 将F0鉴定为阳性的B-hLAG-3小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。PCR实验结果与预期相符，显示5只F1代小鼠均为阳性小鼠，编号分别为：F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5。
[0283] 应用Southern blot对上述5只F1代阳性小鼠进行检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BamHI酶消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂外侧及3’同源臂片段上。探针合成引物如下：
[0284] P1-F(SEQ ID NO：45)：5’-ggccacttatcatcacttgccc-3’
[0285] P1-R(SEQ ID NO：46)：5’-ggtggtaaaggggcctaggag-3’
[0286] P2-F(SEQ ID NO：47)：5’-cagggagagcaatggctaggg-3’
[0287] P2-R(SEQ ID NO：48)：5’-gctgaaaaactcatagaaatggggc-3’
[0288] 野生型的C57BL/6小鼠基因组经P1、P2探针杂交分别产生6.3kb和10.2kb的条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠则产生16.6kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生6.3kb+16.6kb或10.2kb+16.6kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。
[0289] Southern blot检测结果见图9。综合P1、P2探针的结果表明，5只小鼠中有3只小鼠无随机插入，编号分别为F1-2、F1-3、F1-4(图9)，证实这3只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。
[0290] 这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hLAG-3人源化基因工程小鼠。
[0291] 3、人源化小鼠的表达情况分析
[0292] 选取1只阳性F1代B-hLAG-3杂合子小鼠，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，分别用鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次。再用鼠(mLAG3 PE，图10B、C)和人LAG-3抗体(hLAG3 AlexaFluor647，图10E、F)或人LAG-3抗体(hLAG3 APC，图10H、I)进行细胞标记，即用鼠LAG-3抗体(mLAG3 APC)和anti-mTCRβ及人LAG-3抗体(hLAG3 APC或hLAG3 AlexaFluor647)和anti-mTCRβ对胞外蛋白同时进行染色，PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(见图10)显示，与未经刺激对照组(图A、D、G)和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比(图B、E、H)，人LAG-3抗体检测到B-hLAG-3人源化小鼠脾脏内表达人源化LAG-3蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化LAG-3蛋白的细胞。
[0293] 进一步的，将鉴定为阳性的F1代小鼠互相交配，可得到B-hLAG-3人源化基因工程小鼠纯合子。选取1只纯合的B-hLAG-3小鼠(6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，进行FACS检测，方法与F1代一致。流式分析结果(见图11)显示，可在B-hLAG-3纯合鼠体内，用人LAG-3抗体检测到表达人源化LAG-3蛋白的细胞(图11F、I)，而在未经刺激的(图11D、G)或经鼠CD3刺激的C57BL/6小鼠(图11E、H)体内未检测到人或人源化LAG-3蛋白的细胞。
[0294] 实施例6基因敲除小鼠的鉴定
[0295] 由于Cas9的切割造成基因组DNA的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，可能得到LAG-3蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：
[0296] SEQ ID NO：49：5’-GCTTTGGGAAGCTCCAGGTAAG-3’
[0297] SEQ ID NO：50：5’-CAAGGGATGGCACTCCCGCAGTAG-3’
[0298] 野生型小鼠应只有1条PCR条带，产物长度应为1494bp，杂合子应还有1条PCR条带，产物长度应为约750bp；纯合子应只有这1条PCR条带。PCR反应体系及条件同实施例5中人源化小鼠基因型鉴定，结果参见图12。经鉴定编号为1、2、3的小鼠为基因敲除小鼠。
[0299] 实施例7B-hLAG-3基因人源化动物模型体内药效验证
[0300] 取B-hLAG-3纯合小鼠(4-6周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择3种人LAG-3单克隆抗体(Ab-A、Ab-B、Ab-C)中的1种，给药剂量均为10mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每3天给药1次，共给药3次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到
3000mm3时执行安乐死。
3000mm3时执行安乐死。
[0301] 表5中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(试验开始后第11天)和分组后10天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)。
[0302] 表5肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率
[0303]
[0304]
[0305] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述3种抗体耐受良好。所有实验治疗组(G2-G4)和对照组(G1)小鼠平均体重增长在整个实验周期内均无明显区别(图13)，但从肿瘤体积结果上看(图14)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，表明这三种抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。治疗效果上，抗体Ab-A(G2)、Ab-B(G3)治疗组与对照组(G1)相比，肿瘤体积差别不明显，抗体Ab-C治疗组(G4)的小鼠平均肿瘤体积为926±141mm3，与对照组(G1)相比(平均肿瘤体积为1344±524mm3)，肿瘤体积呈现明显的缩小，表明这3种抗人LAG-3单抗在抑制肿瘤生长方面具有不同的作用，抗体Ab-C体内治疗肿瘤效果明显优于抗体Ab-A、Ab-B。证明了B-hLAG-3小鼠可用于筛选抗人LAG-3抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于人LAG-3信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。
[0306] 实施例8双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
[0307] 利用本方法或制得的B-hLAG-3小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，可选择B-hLAG-3小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到LAG-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的B-hLAG-3小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到LAG-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
[0308] 以双重人源化LAG-3/PD-1小鼠的生成为例。由于LAG-3与PD-1基因分别均位于6号和2号染色体上，选择B-hLAG-3小鼠与PD-1人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化LAG-3/PD-1小鼠。
[0309] 分别使用4对引物对双重人源化LAG-3/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表6，反应体系和条件见表7、8。多只双重人源化LAG-3/PD-1小鼠的鉴定结果见图15，其中图A、B表明编号为3020-3023的小鼠为LAG-3纯合子小鼠、图C、D表明编号为3019-3027的小鼠为PD-1纯合子小鼠，综合两组结果可知，编号为3020-3023的4只小鼠为双基因纯合子。
[0310] 表6引物序列
[0311]
[0312] 表7 PCR反应体系(20μL)如下：
[0313]2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH2O 补至20μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH2O 补至20μL
[0314] 表8 PCR扩增反应条件如下：
[0315]
[0316] 进一步的对双重人源化LAG-3/PD-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化LAG-3/PD-1小鼠纯合子(6-7周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，进行FACS检测。用鼠Lag-3抗体mLAG-3 PE和鼠T细胞表面抗体mTcRβ或人LAG-3抗体hLAG-3APC和鼠T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测LAG-3的表达；用鼠PD-1抗体mPD-1PE和鼠T细胞表面抗体mTcRβ或人PD-1抗体hPD-1FITC和鼠T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色检测PD-1的表达。流式分析结果(见图16、17)显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人LAG-3抗体和人PD-1抗体可以检测到人源化LAG-3/PD-1纯合子小鼠脾脏内表达人源化LAG-3和PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化LAG-3或PD-1蛋白的细胞。
[0317] 再以双重人源化LAG-3/CTLA-4小鼠的生成为例。由于LAG-3与CTLA-4基因分别均位于6号和1号染色体上，选择B-hLAG-3小鼠与CTLA-4人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化LAG-3/CTLA-4小鼠。
[0318] 分别使用4对引物对双重人源化LAG-3/CTLA-4小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表9，反应体系和条件见表7、8。多只双重人源化LAG-3/CTLA-4小鼠的鉴定结果见图18，其中图A、B表明编号为1106-1117的小鼠为CTLA-4纯合子小鼠、图C、D表明编号为1106-1117的小鼠为LAG-3人源化纯合子小鼠，综合两组结果可知，编号为1106-1117的12只小鼠为双基因纯合子。
[0319] 表9引物序列
[0320]
[0321] 实施例9双重人源化LAG-3/PD-1动物模型体内药效验证
[0322] 单克隆抗体联合用药在肿瘤治疗中是临床广泛应用的方法。本实施例选择有代表性的人PD-1抗体Keytruda(pembrolizumab，人源化单克隆抗体)与实施例7中验证药效最好的LAG-3抗体Ab-C联用，以验证双重人源化LAG-3/PD-1小鼠可用于针对LAG-3和PD-1/PD-L1信号通路的联合用药方面的研究。
[0323] 取双重人源化LAG-3/PD-1小鼠纯合子(4-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择Keytruda、Ab-C中的1种或2种，给药剂量为0.1-10mg/kg，对照组注射空白溶剂。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。具体的给药或给药组合、剂量、给药方式和频率如表10所示。
[0324] 从测试结果上看，3组小鼠的体重或体重变化(图19、20)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积结果上看(图21)，对照组(G1)小鼠的肿瘤在实验周期内持续生长，2个治疗组(G2、G3)小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小，表明经过不同药物或药物联用治疗后，小鼠体内肿瘤生长受到明显抑制。
[0325] 具体对每项实验进行评估分析。表11中列出了主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组17天后的肿瘤体积、实验结束时(接种后第24天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。在实验终点时，所有小鼠均存活，对照组(G1)平均肿瘤体积为2038±423mm3，单独使用Keytruda治疗组(G2)平均肿瘤体积为1234±3 3
143mm ，Keytruda与LAG-3抗体Ab-C联用治疗组(G3)平均肿瘤体积为771±164mm ，可见Keytruda与LAG-3抗体联用治疗组(G3)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用Keytruda(G2)，TGITV值分别为42.3％，66.8％，表明上述两种单克隆抗体联用的疗效优于单独使用的疗效，且具有明显疗效(TGITV值)60％。同时使用抗人PD-1抗体药Keytruda和LAG-3，可以更高效的抑制肿瘤细胞的生长。
143mm ，Keytruda与LAG-3抗体Ab-C联用治疗组(G3)平均肿瘤体积为771±164mm ，可见Keytruda与LAG-3抗体联用治疗组(G3)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用Keytruda(G2)，TGITV值分别为42.3％，66.8％，表明上述两种单克隆抗体联用的疗效优于单独使用的疗效，且具有明显疗效(TGITV值)60％。同时使用抗人PD-1抗体药Keytruda和LAG-3，可以更高效的抑制肿瘤细胞的生长。
[0326] 表10给药组合、剂量、给药方式及频率
[0327]
[0328] 表11肿瘤体积、存活率及肿瘤抑制率
[0329]
[0330]
[0331] 实施例10基于胚胎干细胞的制备方法
[0332] 采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得LAG-3基因人源化小鼠。
[0333] 根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠LAG-3基因示意图(图4)，发明人设计了图22所示的打靶策略，图22中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Lag-3基因的2号至3号外显子全部或部分用人LAG-3基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(5068bp)、3’同源臂(783bp)和人源化基因片段(5180bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例5一致。
[0334] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0335] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0336] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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