人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
阅读：658发布：2021-01-05
专利汇可以提供人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化BTLA基因动物模型的构建方法、由此产生的动物及其在 生物 医药领域的应用。，下面是人源化基因改造动物模型的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)选自与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_
000082.6的第45237539-45239051位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_
000082.6的第45239358-45240854位核苷酸。
3.根据权利要求1-2任一所述的靶向载体，其特征在于，所述期望的供体DNA序列来自人。优选的，所述期望的供体DNA序列为人BTLA基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人BTLA基因的核苷酸序列包括人BTLA基因DNA序列的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子和/或第五外显子中的一个或多个。
4.一种用于构建人源化非人动物的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。
优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。
优选的，所述sgRNA在小鼠Btla基因的靶位点位于小鼠Btla基因的第2外显子上。
更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，sgRNA靶向的
3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。
进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：14所示。
5.一种包含权利要求4所述的sgRNA序列的构建体。
6.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
(1)将序列如SEQ ID NO：1-8所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：9-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：14，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22所示，其中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
8.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求5所述的构建体和/或一种或多种权利要求5所述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体和一种或多种权利要求5所述构建体的体外转录产物。
9.权利要求1-3任一所述的靶向载体、权利要求4所述的sgRNA序列、权利要求5所述的构建体或权利要求8所述的细胞在构建包含BTLA基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
10.一种构建BTLA基因人源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述方法包括导入人BTLA基因、使得该人BTLA基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的BTLA蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Btla基因的表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)构建含有人BTLA基因的载体，通过基因工程方法将所述人BTLA基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Btla基因缺失或使得内源/动物来源的Btla蛋白不表达或不具有功能；并且
(b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化BTLA蛋白。
12.根据权利要求10-11任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括人源化BTLA基因，所述人源化BTLA基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化BTLA基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化BTLA基因的区域包含人BTLA基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Btla启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化BTLA基因的区域为动物来源。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述人源化BTLA基因包括将动物来源的Btla的第2号外显子全部或部分序列替换为人源BTLA的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向动物的Btla基因，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。
14.根据权利要求10-13任一所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿类动物。优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
15.根据权利要求10-14任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型。优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。
16.根据权利要求10-15任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)提供一种如权利要求8所述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行BTLA基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行BTLA基因人源化动物模型的建立。
18.根据权利要求10-17任一所述的方法，其特征在于，所述人源化BTLA蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：
31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
19.根据权利要求10-17任一所述的方法，其特征在于，所述人源化的BTLA基因选自下列组中的一种：
a)所述基因编码权利要求18中所述人源化BTLA蛋白序列；
b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
20.一种由权利要求10-19任一所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
21.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，
(a)利用权利要求20所述的非人动物或其子代；
(b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。优选的，所述其他人源化动物为PD-1人源化小鼠。
23.根据权利要求21或22所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
24.一种嵌合BTLA蛋白，其特征在于，选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：
31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
25.编码嵌合BTLA蛋白的基因，其特征在于，其中所述基因序列选自：
a)所述基因编码权利要求24中所述人源化BTLA蛋白序列；
b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
26.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求20或权利要求23所述的的非人动物或其子代。
27.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求20或权利要求23所述的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
28.一种权利要求20或23所述的动物及子代、权利要求24所述的嵌合BTLA蛋白、权利要求25所述的编码嵌合BTLA蛋白的基因、权利要求26所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求27所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
29.一种权利要求20或23所述的动物及子代、权利要求24所述的嵌合BTLA蛋白、权利要求25所述的编码嵌合BTLA蛋白的基因、权利要求26所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求27所述的组织或器官在与BTLA基因或者蛋白相关的领域中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人BTLA信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究BTLA基因功能研究、人源BTLA抗体、针对人BTLA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。
[0003] B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)表达于B细胞、T细胞、巨噬细胞等细胞表面，其蛋白结构包括胞外区域、跨膜区和一个胞质区，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。BTLA与其配体疱疹病毒侵入介质(herpesvirus entry mediator,HVEM)是迄今发现的唯一一对联系Ig超家族和TNFR家族的分子。BTLA/HVEM的作用方式比较独特，因为BTLA主要行使负反馈调节功能，结合HVEM后可传递抑制信号下调T细胞的免疫应答；而HVEM除作为配体与BTLA作用结合外，还可作为受体与LIGHT作用发挥共刺激活性，促进T细胞、B细胞增殖及Ig的产生等，具有双相调节功能。此外，HVEM有可能同时结合BTLA和LIGHT或LTα形成三聚体。已有研究表明，BTLA信号可以防止自身免疫性疾病的发生，终止炎症反应，维持外周免疫耐受，抑制移植免疫应答。BTLA抑制剂可以增强TCR信号通路，并恢复T细胞功能。因此，有必要深入研究T细胞抑制性受体的种类、结构及调控机制等。
[0004] 实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前已有少数与BTLA相关的实验动物。Watanabe et al.(2003)等人构建了BTLA-/-小鼠(129SvEv背景)，发现其T细胞增殖能力增强，且更容易感染慢性复发型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，表明BTLA参与了机体早期抗感染的过程。Goularte OD和Han P(2004)等人发现BTLA-/-小鼠(129strain)的B细胞和T细胞均能正常发育存活且外周淋巴器官细胞亚群未检测异常，确定BTLA是T细胞的抑制性受体，且有可能在T细胞分化过程中发挥重要作用。Yoshihiro Oya(2008)等人进一步发现该小鼠随着年龄增长逐步产生超-γ-球蛋白、抗核抗体、抗SS-A抗体和抗双链DNA抗体，且外周T细胞活性增强；另外，还表现出淋巴细胞浸润多个器官，且7个月后小鼠存活率明显降低。Yoshihiro Oya(2011)等人还进一步制备了MRL-lpr背景的BTLA-/-小鼠。MRL-lpr小鼠作为系统性红斑狼疮模型鼠，缺失BTLA后表现出更严重的淋巴细胞浸润，与129背景的BTLA-/-小鼠相比，该小鼠因BTLA的缺失加速自身免疫性疾病并诱发Fas-独立肝损伤。
[0006] 随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化还可改进和提升细胞人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。
[0007] 鉴于BTLA基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化BTLA基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例BTLA基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达BTLA蛋白，且表达的BTLA蛋白能识别并结合人BTLA抗体/抗原，该方法在肿瘤药物筛选和方面有着广阔的应用前景。
发明内容
[0008] 为了解决上述问题，本发明利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物BTLA基因的特定片段被人BTLA基因特定片段替换，本发明成果得到世界首例BTLA基因人源化小鼠。成功制备BTLA基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达BTLA嵌合蛋白，可用于BTLA基因功能研究、靶向BTLA人源抗体的筛选和评价。
[0009] 利用本发明制备的动物模型可用于针对人BTLA靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究BTLA蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。
[0010] 同时还得到基因敲除动物模型，以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1动物模型)交配得到双基因人源化动物模型或多基因人源化动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
[0011] 本发明的第一方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
[0012] 优选的，所述的靶向载体，其中a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)选自与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_000082.6的第45237539-45239051位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂/受体)选自NCBI登录号为NC_000082.6的第
45239358-45240854位核苷酸。
45239358-45240854位核苷酸。
[0013] 优选的，所述的靶向载体，其中，a)与c)中选择的基因组核苷酸的长度分别为500-1500bp。优选的，长度大约为1.5kb。更优选的，分别为1513bp和1497bp。
[0014] 优选的，所述的靶向载体，所述的待改变的转换区分别位于BTLA基因第2外显子。
[0015] 优选的，所述的靶向载体，其中5’臂序列如SEQ ID NO：32所示。
[0016] 优选的，所述的靶向载体，其中3’臂序列如SEQ ID NO：38所示。
[0017] 优选的，所述的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。
[0018] 优选的，所述期望的供体DNA序列来自人。优选的，所述期望的供体DNA序列为人BTLA基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人BTLA基因的核苷酸序列包括人BTLA基因DNA序列的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子和/或第五外显子中的一个或多个。
[0019] 优选的，所述的靶向载体，其中所述人源BTLA的核苷酸序列编码NCBI登录号NM_181780.3和NM_001085357.1所示人源BTLA蛋白的部分或全部序列；人源DNA片段选自NCBI登录号为NC_000003.12的第112479758-112479462位核苷酸。
[0020] 优选的，所述的靶向载体，其中期望的转换区序列如SEQ ID NO：35所示。
[0021] 本发明的第二方面，涉及一种用于构建人源化非人动物的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。
[0022] 优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。
[0023] 优选的，所述sgRNA在小鼠Btla基因的靶位点位于小鼠Btla基因的第2外显子上。
[0024] 更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。
[0025] 进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：14所示。
[0026] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：15所示，下游序列如SEQ ID NO：17所示，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。
[0027] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：16所示，其由在SEQ ID NO：15的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：18所示，其由在SEQ ID NO：17的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别5’端靶位点。
[0028] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：19所示，下游序列如SEQ ID NO：21所示，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。
[0029] 本发明进一步涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其上游序列如SEQ ID NO：20所示，其由在SEQ ID NO：19的5’端加上TAGG得到，下游序列如SEQ ID NO：22所示，其由在SEQ ID NO：21的5’端加上AAAC得到，所述sgRNA序列识别3’端靶位点。
[0030] 本发明第三方面提供一种包含上述所述的sgRNA序列的构建体。
[0031] 本发明第四方面提供一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
[0032] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
[0033] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0034] (3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0035] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0036] 优选的，所述制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
[0037] (1)将序列如SEQ ID NO：1-8所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：9-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0038] 优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：14，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22所示，其中SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18为A组，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22为B组；
[0039] (2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
[0040] (3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
[0041] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
[0042] 本发明第五方面提供一种细胞，所述细胞包含上述任一所述的靶向载体、一种或多种上述任一的构建体和/或一种或多种上述构建体的体外转录产物。
[0043] 优选的，所述细胞包含上述任一所述的靶向载体和一种或多种上述任一构建体的体外转录产物。
[0044] 本发明进一步涉及所述的细胞，该细胞包括Cas9mRNA或其体外转录产物。
[0045] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是杂合的。
[0046] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞中的基因是纯合的。
[0047] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述非人动物细胞是啮齿类动物，进一步优选为小鼠。
[0048] 本发明进一步涉及所述的细胞，其中，所述细胞为受精卵细胞；优选的，所述受精卵来源于任何非人类动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；最优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。
[0049] 本发明第六方面提供一种上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的构建体或上述的细胞在构建包含BTLA基因人源化的非人动物或其子代中的应用。
[0050] 本发明的第七方面，提供一种构建BTLA基因人源化的非人动物或其子代的方法，所述方法包括导入人BTLA基因、使得该人BTLA基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的BTLA蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Btla基因的表达。
[0051] 优选的，所述方法包括：
[0052] (a)构建含有人BTLA基因的载体，通过基因工程方法将所述人BTLA基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Btla基因缺失或使得内源/动物来源的Btla蛋白不表达或不具有功能；并且
[0053] (b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化BTLA蛋白。
[0054] 优选的，所述动物基因组中包括人源化BTLA基因，所述人源化BTLA基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化BTLA基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化BTLA基因的区域包含人BTLA基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Btla启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化BTLA基因的区域为动物来源。
[0055] 优选的，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的BTLA基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含内源/动物来源的Btla基因座，用人BTLA胞外域编码序列取代内源/动物来源的Btla胞外域编码序列的部分或全部。
[0056] 本发明所述的方法中，动物来源的BTLA包括动物来源Btla基因的第1号外显子的全部序列、第2号外显子的部分序列、第3号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或人BTLA基因部分为编码人类BTLA多肽的氨基酸的第2号外显子的部分或全部序列；
[0057] 优选的，所述的动物来源的BTLA基因为啮齿类动物来源的Btla基因；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠；最优选的，所述小鼠Btla的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：24中的全部或部分片段所示，所述小鼠Btla的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示。
[0058] 优选的，所述的人BTLA基因的全部或部分片段的人BTLA mRNA序列如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67中的全部或部分片段所示，所述人BTLA蛋白全部或部分片段的序列如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68中的全部或部分片段所示。
[0059] 优选的，所述人源化BTLA基因包括将动物来源的Btla的第2号外显子全部或部分序列替换为人源BTLA的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向动物的的Btla基因，所述用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。
[0060] 优选的，所述动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0061] 本发明还涉及一种Btla敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Btla的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源Btla蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向动物的Btla基因，所述sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-8任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。
[0063] 本发明所述的Btla基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：
[0064] 第一步：按照上述所述的步骤(1)-(4)，获得sgRNA载体；
[0065] 第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
[0066] 第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Btla基因被敲除，获得Btla基因敲除阳性小鼠；
[0067] 第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Btla-/-小鼠；
[0068] 优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：41-44所示。
[0069] 优选的，本发明所述人源化动物的构建方法包括如下步骤：
[0070] (a)提供一种上述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；
[0071] (b)将所述细胞在培养液中进行培养；
[0072] (c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；优选的，所述步骤(c)中的非人类哺乳动物为假孕雌性。
[0073] (d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
[0074] 优选的，所述非人类哺乳动物是啮齿类动物；所述非人类哺乳动物细胞是啮齿类动物细胞。进一步优选的，所述啮齿类动物细胞是小鼠细胞；更优选的，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
[0075] 优选的，使用基因编辑技术进行BTLA基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括但不限于基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。进一步优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行BTLA基因人源化动物模型的建立。
[0076] 本发明第八方面提供一种人源化BTLA蛋白，所述选自下列组中的一种：
[0077] a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
[0078] b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：31所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
[0079] c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0080] d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0081] e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[0082] 本发明所述的嵌合BTLA蛋白，选自下列组中的一种：
[0083] a)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67所示的序列的部分或全部所示；
[0084] b)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0085] c)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67所示的核苷酸序列杂交；
[0086] d)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0087] e)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：67所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0088] 或
[0089] f)嵌合BTLA蛋白序列中人BTLA的蛋白序列如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68部分或全部序列所示；
[0090] g)嵌合BTLA蛋白序列中人BTLA的蛋白序列与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0091] h)嵌合BTLA蛋白序列中编码人BTLA的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
[0092] i)嵌合BTLA蛋白序列中人BTLA的蛋白序列与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0093] g)嵌合BTLA蛋白序列中人BTLA的蛋白序列具有SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：68所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
[0094] 或
[0095] k)嵌合BTLA蛋白的核苷酸编码序列为SEQ ID NO：29所示的序列的部分或全部；
[0096] l)嵌合BTLA蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0097] m)嵌合BTLA蛋白的核苷酸编码序列在严格条件下，与SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列杂交；
[0098] n)嵌合BTLA蛋白的核苷酸编码序列与SEQ ID NO：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0099] p)嵌合BTLA蛋白的核苷酸编码序列具有SEQ ID NO：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0100] 或
[0101] q)嵌合BTLA的mRNA序列为SEQ ID NO：30所示的序列的部分或全部；
[0102] r)嵌合BTLA的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0103] s)嵌合BTLA的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列杂交；
[0104] t)嵌合BTLA的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0105] u)嵌合BTLA的mRNA序列具有与SEQ ID NO：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
[0106] 或
[0107] v)嵌合BTLA的蛋白序列为SEQ ID NO：31的部分或全部；
[0108] w)嵌合BTLA的蛋白序列与SEQ ID NO：31所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0109] x)编码嵌合BTLA蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：31所示的蛋白的核苷酸序列杂交；
[0110] y)嵌合BTLA的蛋白序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0111] z)嵌合BTLA的蛋白序列具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
[0112] 或
[0113] A1)嵌合BTLA蛋白中编码嵌合BTLA蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO：28所示的序列的部分或全部；
[0114] B1)嵌合BTLA蛋白中编码嵌合BTLA蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0115] C1)嵌合BTLA蛋白中编码嵌合BTLA蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列杂交；
[0116] D1)嵌合BTLA蛋白中编码嵌合BTLA蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO：28所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
[0117] E1)嵌合BTLA蛋白中编码嵌合BTLA蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
[0118] 本发明进一步涉及一种表达所述蛋白序列的构建体。
[0119] 本发明进一步涉及一种包含所述构建体的细胞。
[0120] 本发明进一步涉及一种包含所述细胞的组织。
[0121] 本发明第九方面提供一种人源化的BTLA基因，所述基因选自下列组中的一种：
[0122] a)所述基因编码上述所述嵌合小鼠BTLA的蛋白序列；
[0123] b)嵌合BTLA的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
[0124] c)嵌合BTLA的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：30所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0125] d)嵌合BTLA的mRNA序列与SEQ ID NO：30所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
[0126] 和/或
[0127] e)编码嵌合BTLA的蛋白的基因序列，所述蛋白与SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0128] f)编码嵌合BTLA的蛋白的基因序列，所述蛋白的序列与SEQ ID NO：31的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；
[0129] g)编码嵌合BTLA的蛋白的基因序列，所述蛋白具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
[0130] 和/或
[0131] h)嵌合BTLA的基因序列如SEQ ID NO：28所示；
[0132] i)嵌合BTLA的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：28所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0133] j)嵌合BTLA的基因序列与SEQ ID NO：28所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
[0134] 和/或
[0135] k)嵌合BTLA的基因序列如SEQ ID NO：29所示；
[0136] l)嵌合BTLA的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0137] m)嵌合BTLA的基因序列与SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
[0138] 本发明所述基因选自下列组中的一种：
[0139] a)所述基因编码上述所述人源化BTLA蛋白序列；
[0140] b)所述基因序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：30所示；
[0141] c)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
[0142] d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0143] e)所述基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
[0144] 更优选的，所述的编码嵌合BTLA蛋白的基因，其中嵌合小鼠BTLA DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：35。
[0145] 优选的，所述基因序列选自：
[0146] a)所述DNA编码前述人源化小鼠BTLA氨基酸序列；
[0147] b)所述DNA序列如SEQ ID NO：30所示；
[0148] c)所述DNA的CDS编码序列如SEQ ID NO：29所示；
[0149] d)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸杂交的DNA序列；
[0150] e)与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：29所示的核苷酸具有至少90％同一性程度的DNA序列；
[0151] f)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸与SEQ ID NO：31所示的氨基酸具有至少90％的同一性程度；
[0152] g)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的SEQ ID NO：31所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0153] h)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的序列与SEQ ID NO：31的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸；
[0154] 和/或
[0155] i)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
[0156] 更优选的，SEQ ID NO：35所示序列为人源化小鼠BTLA DNA的非模板链，又被称为编码链或有义链。
[0157] 上述人源化小鼠BTLA的基因组DNA序列，其转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与前述基因序列一致或互补。
[0158] 上述人源化的BTLA蛋白或基因亦可是构建方法中的人源化蛋白或基因DNA。
[0159] 本发明第十方面提供一种由上述所述方法产生的非人哺乳动物或其子代。
[0160] 本发明的第十一方面，提供一种制备多基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
[0161] (a)利用上述所述构建BTLA基因人源化的非人动物或其子代的方法获得非人动物或其子代；
[0162] (b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
[0163] 优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。更优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物。
[0164] 优选的，所述其他人源化动物可以为PD-1、PD-L1、OX-40人源化小鼠。
[0165] 在本发明的一个实施例中，所述多基因人源化动物是双基因人源化动物，所述双人源化小鼠基因改造动物模型建立的方法，包括如下步骤：
[0166] (a)利用前述的一种建立BTLA基因人源化动物模型的方法获得BTLA基因基因改造人源化小鼠；
[0167] (b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
[0168] 优选的，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与PD-1人源化小鼠交配得到BTLA和PD-1双人源化小鼠模型。
[0169] 本发明第十二方面提供上述方法产生的多基因人源化非人类哺乳动物或其后代。
[0170] 本发明进一步涉及非人类哺乳动物，其基因组中含有人源基因。
[0171] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是啮齿动物。
[0172] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，其中非人类哺乳动物是小鼠。
[0173] 本发明进一步涉及一种非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物表达人源化BTLA基因编码的蛋白质。
[0174] 本发明还涉及根据上述所述的方法产生的非人类哺乳动物或其子代。
[0175] 本发明第十三方面提供一种通过上述所述的任一方法制备获得的一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途。
[0176] 本发明进一步涉及一种荷瘤非人类哺乳动物模型，通过包括前述任一所述的方法制备获得。优选的，所述非人类哺乳动物是啮齿动物。进一步优选的，所述非人类哺乳动物是小鼠。
[0177] 本发明的第十四方面，提供一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述所述的方法制备得到的非人动物或其子代。
[0178] 本发明的第十五方面，提供一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述所述的方法制备得到的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
[0179] 本发明进一步涉及一种来源于前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。
[0180] 本发明的第十六方面，提供一种来源于上述所述的嵌合BTLA蛋白、上述所述的编码嵌合BTLA蛋白的基因、上述所述的方法产生的动物及子代、上述所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
[0181] 本发明的第十七方面，涉及一种来源于上述所述的嵌合BTLA蛋白、上述所述的编码嵌合BTLA蛋白的基因、上述所述的方法产生的动物及子代、上述所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述所述的组织或器官在与BTLA基因或者蛋白相关的领域中的应用。
[0182] 优选的，所述应用包括但不仅限于在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人BTLA信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究BTLA基因功能研究、人源BTLA抗体、针对人BTLA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0183] 本发明进一步涉及一种前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物、前述方法产生的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
[0184] 本发明进一步涉及一种前述的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物、前述任一项中的方法产生的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
[0185] 本发明进一步涉及一种前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物、前述任一项中的方法产生的动物模型在筛选、验证、评价或研究BTLA基因功能研究、BTLA抗体、针对BTLA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0186] 本发明还涉及使用上述方法产生的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
[0187] 优选的，涉及使用上述方法产生的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
[0188] 更优选的，涉及使用上述方法产生的动物模型在筛选、验证、评价或研究BTLA基因功能研究、BTLA抗体、针对人BTLA靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0189] 优选的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
[0190] 受精卵可以来源于任何非人类动物。优选受精卵细胞来源于啮齿类。可以通过DNA的显微注射来向受精卵引入遗传构建体。例如，可以通过显微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类哺乳动物来产生上文所述方法的非人类哺乳动物。
[0191] 这里使用的术语“基因改造”描述人工引入并整合进生物的DNA产生的特定基因的蛋白质。这里使用的术语“基因改造动物”描述基因组中含有外源DNA的动物。此基因改造DNA可能整合在基因组的某处。
[0192] 本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，提供非人类哺乳动物，所述基因改造动物基因组中含有编码人源BTLA的DNA。
[0193] 在一个优选的实施方案中，本发明还涉及非人类哺乳动物的基因改造动物，所述动物基因组中含有外源DNA，所述DNA为上述所述的DNA或基因组DNA。其中所述基因改造可以是人工引入并整合进所述DNA表达特定基因的蛋白质。所述基因改造动物基因组中含有编码人源BTLA的DNA。所述DNA还包括特异的诱导物或阻遏物物质。
[0194] 在另一个优选的实施方案中，本发明还涉及一种可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物能够表达人BTLA蛋白的细胞，所述蛋白为前述人源化小鼠BTLA蛋白。在另一个优选的实施方案中，非人类哺乳动物含有上述所描述的遗传构建体。在另一实施方案中，提供表达基因改造人源BTLA的非人类哺乳动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性表达人源BTLA蛋白。
[0195] 在另一实施方案中，基因改造动物中的人源BTLA的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。
[0196] 非人类哺乳动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类哺乳动物是哺乳动物，更优选的非人类哺乳动物是啮齿动物。本发明最优选的动物是小鼠。
[0197] 本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
[0198] 本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，
30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，
45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，
60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，
99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，
45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，
60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，
93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，
99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
[0199] 本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
[0200] 在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
[0201] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
[0202] 本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
可以对上文描述的非人类哺乳动物进行临床表型分析和分子遗传学研究。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。
可以对上文描述的非人类哺乳动物进行临床表型分析和分子遗传学研究。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。
[0203] 本发明还提供来源于本发明提供的非人类哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。可以通过多种方法检测含有编码人源BTLA蛋白的DNA序列的遗传构建体的整合。对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测外源DNA表达的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色、细胞流式检测和Western印迹分析来评估是否存在人源BTLA蛋白质。
[0204] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：1989)；DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；
Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；
ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986) ；B .Perbal，
APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker ，eds .，AcademicPress，London ，1987) ；
HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，
1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；
ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986) ；B .Perbal，
APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker ，eds .，AcademicPress，London ，1987) ；
HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，
1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
[0205] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
[0206] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
附图说明
[0207] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
[0208] 图1：sgRNA活性检测结果，其中A为5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA1-sgRNA8)，B为3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA9-sgRNA14)，Con为阴性对照，PC为阳性对照；
[0209] 图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
[0210] 图3：鼠Btla基因与人BTLA基因对比示意图；
[0211] 图4：人源化小鼠BTLA基因示意图；
[0212] 图5：打靶策略示意图；
[0213] 图6：(A)pClon-4G-BTLA质粒酶切结果图，其中M为Marker，ck为未经酶切的质粒对照；(B)Marker分子量说明；
[0214] 图7：鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中，M为Marker，WT为野生型，编号为1、2的小鼠为阳性小鼠；
[0215] 图8：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，编号为F1-1至F1-6的小鼠均为阳性小鼠；
[0216] 图9：F1代小鼠Southern blot结果，编号F1-1至F1-6的小鼠P1探针检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠；
[0217] 图10：F1代小鼠Southern blot结果，编号F1-4的小鼠P2探针检测结果，结果表明，编号F1-4的BTLA阳性小鼠无随机插入；
[0218] 图11：流式分析结果，其中，取C57BL/6小鼠和BTLA人源化小鼠，分别用CD3抗体刺激脾脏内T细胞，再用抗鼠BTLA荧光抗体和anti-mTCRβ(图B、C)或抗人BTLA荧光抗体和anti-mTCRβ(图E、F)进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与野生型对照组(图A，D)相比，可在BTLA人源化F1杂合鼠脾脏内，检测到表达人BTLA蛋白的细胞；而在C57BL/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人BTLA蛋白的细胞；
[0219] 图12：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为BTLA人源化F1代杂合子小鼠；
[0220] 图13：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠和B-hBTLA纯合小鼠，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞，再用抗鼠Btla抗体mBTLA PE(图A、B、C)和鼠源CD19抗体mCD19FITC，或抗人BTLA抗体hBTLA APC(图D、E、F)和鼠源CD19抗体mCD19FITC对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，在C57BL/6对照鼠的脾脏内可检测到表达鼠BTLA蛋白的细胞(图A、B)，未检测到表达人BTLA蛋白的细胞(图D、E)；在B-hBTLA纯合小鼠脾脏内可检测到表达人BTLA蛋白的细胞(图F)，而未检测到表达鼠BTLA蛋白的细胞(图C)；
[0221] 图14：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为B-hBTLA纯合子小鼠，GAPDH为内参对照；
[0222] 图15：鼠尾PCR鉴定结果(Btla基因敲除小鼠)，其中，WT为野生型，+为阳性对照，编号为1至6的小鼠为阳性小鼠；
[0223] 图16：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hBTLA小鼠体内，并利用6种抗人BTLA抗体(AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，G1-G7各组实验动物平均体重增长无显著差异；
[0224] 图17：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hBTLA小鼠体内，并利用6种抗人BTLA抗体(AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，G1-G7各组实验动物平均体重变化无显著差异；
[0225] 图18：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hBTLA小鼠体内，并利用6种抗人BTLA抗体(AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，其中，G2-G7治疗组实验动物肿瘤平均体积呈现明显差异，且G3-G7治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组；
[0226] 图19：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为BTLA基因纯合子对照，-为野生型对照(图A、B)，WT为野生型，-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为PD-1基因人源化小鼠杂合子(图C、D)；图A、B的结果表明编号为3017-3032的小鼠为BTLA基因纯合子、图C、D的结果表明编号为3017-3032的小鼠为PD-1纯合子，综合两组结果表明，16只小鼠均为双基因纯合子；
[0227] 图20：流式分析结果，其中，取C57BL/6小鼠和双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用鼠源BTLA抗体mBTLA PE(图A、B、C)和鼠源CD19抗体mCD19FITC，或人源BTLA抗体hBTLA APC(图D、E、F)和鼠源CD19抗体mCD19FITC对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化BTLA/PD-1纯合子的鼠脾脏内检测到表达人BTLA蛋白的细胞，而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人BTLA蛋白的细胞；
[0228] 图21：流式分析结果，其中，取C57BL/6小鼠和双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用鼠源PD-1抗体mPD-1PE(图A、B、C)和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ，或人源PD-1抗体hPD-1FITC(图D、E、F)和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化BTLA/PD-1纯合子的鼠脾脏内检测到表达人PD-1蛋白的细胞，而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人PD-1蛋白的细胞；
[0229] 图22：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠；GAPDH为内参对照。结果可见，在C57BL/6小鼠活化的T细胞里，可检测到鼠Btla的mRNA表达；在双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠活化的T细胞里，可以检测到人BTLA的mRNA表达；
[0230] 图23：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠；GAPDH为内参对照。结果可见，在C57BL/6小鼠活化的T细胞里，可检测到鼠Pd-1的mRNA表达；在双重人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠活化的T细胞里，可以检测到人PD-1的mRNA表达；
[0231] 图24：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。
具体实施方式
[0232] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0233] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
[0235] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
[0236] EcoRI，ScaI，BamHI，BbsI，SacI，StuI，NcoI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3122M，R3136M，R0539L，R3156M，R0187M，R3193M；
[0237] 卡那霉素购自Amresco，货号为0408；
[0238] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
[0239] AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；
[0240] UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；
[0241] 逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；
[0243] B-hPD-1小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；
[0244] 小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
[0245] 鼠CD3抗体来源BD，货号563123；
[0246] mPD-1Ab来源BIO X CELL，货号BE0146；
[0247] mTcRβPerCP来源Biolegend，货号109228；
[0248] mPD-1PE来源Biolegend，货号109104；
[0249] mBTLA PE来源Biolegend，货号134804；
[0250] hBTLA APC来源Biolegend，货号344510
[0251] mCD19FITC来源Biolegend，货号115505；
[0252] hPD-1FITC来源Biolegend，货号329904；
[0253] 流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
[0254] 实施例1pT7-BTLA-1、pT7-BTLA-14的构建
[0255] 靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
[0256] 设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA8)、3’端靶位点(sgRNA9-sgRNA14)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点均位于BTLA基因第二外显子上，各sgRNA在BTLA上的靶位点序列如下：
[0257] sgRNA-1靶位点序列：5’-CAGTGCAACTTACTATTACG-3’(SEQ ID NO：1)
[0258] sgRNA-2靶位点序列：5’-CTCGTAATAGTAAGTTGCAC-3’(SEQ ID NO：2)
[0259] sgRNA-3靶位点序列：5’-GTGACTTGGTGTAAGCACAA-3’(SEQ ID NO：3)
[0260] sgRNA-4靶位点序列：5’-TCCAAACAGTCTGCCAGGAC-3’(SEQ ID NO：4)
[0261] sgRNA-5靶位点序列：5’-TTCATAGACCTAATGTGACT-3’(SEQ ID NO：5)
[0262] sgRNA-6靶位点序列：5’-GGAATTCCAAACAGTCTGCC-3’(SEQ ID NO：6)
[0263] sgRNA-7靶位点序列：5’-TCCTGTCCTGGCAGACTGTT-3’(SEQ ID NO：7)
[0264] sgRNA-8靶位点序列：5’-TTTAAATAACTCTCCTGTCC-3’(SEQ ID NO：8)
[0265] sgRNA-9靶位点序列：5’-TCAGTAACCATCCATGTGAC-3’(SEQ ID NO：9)
[0266] sgRNA-10靶位点序列：5’-TCACATGGATGGTTACTGAA-3’(SEQ ID NO：10)
[0267] sgRNA-11靶位点序列：5’-CCATTATCACTGAGATGTAT-3’(SEQ ID NO：11)
[0268] sgRNA-12靶位点序列：5’-CAATACATCTCAGTGATAAT-3’(SEQ ID NO：12)
[0269] sgRNA-13靶位点序列：5’-CCAATACATCTCAGTGATAA-3’(SEQ ID NO：13)
[0270] sgRNA-14靶位点序列：5’-TGAGATGTATTGGTTTAAAG-3’(SEQ ID NO：14)
[0271] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图1。从中优先选择2个(分别是sgRNA1和sgRNA14)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸，退火后以酶切连接(BbsI)的方式，将其分别连接至pT7-sgRNA质粒，获得表达载体pT7-BTLA-1和pT7-BTLA-14。
[0272] 表1 sgRNA1和sgRNA14序列列表
[0273]
[0274]
[0275] 表2连接反应体系(10μL)
[0276]双链片段 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL
[0277] 反应条件：
[0278] 室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
[0279] 随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-B2-6和pT7-B2-10进行后续实验。
[0280] pT7-sgRNA质粒来源：
[0281] pT7-sgRNA载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0282] 实施例2载体pClon-4G-BTLA的构建
[0283] 将小鼠Btla基因(Gene ID：208154)第2号外显子的部分编码序列(基于NCBI登录号为NM_001037719.2→NP_001032808.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：24所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：25所示)用人源BTLA基因(Gene ID：151888)相应编码序列替换(基于NCBI登录号为NM_181780.3→NP_861445.3的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：26所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：27所示)，鼠Btla与人BTLA基因结构对比示意图见图3，最终得到的改造后的人源化小鼠BTLA基因示意图见图4。人源化小鼠BTLA基因DNA序列(嵌合BTLA基因DNA)如SEQ ID NO：28所示：
[0284] GATGAAGAGTGTGATGTACAGCTTTATATAAAGAGACAATCTGAACACTCCATCTTAGCAGGAGATCCCTTTGAACTAGAATGCCCTGTGAAATACTGTGCTAACAGGCCTCATGTGACTTGGTGCAAGCTCAATGGAACAACATGTGTAAAACTTGAAGATAGACAAACAAGTTGGAAGGAAGAGAAGAACATTTCATTTTTCATTCTACATTTTGAACCAGTGCTTCCTAATGACAATGGGTCATACCGCTGTTCTGCAAATTTTCAGTCTAATCTCATTGAAAGCCACTCAACAACTCTTTATGTGACAGGTAA
[0285] SEQ ID NO：28仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人源BTLA基因序列片段。
[0286] 改造后的人源化小鼠BTLA的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示。
[0287] 鉴于人BTLA和鼠Btla基因存在多个转录本，本实施例中的人源化序列设计的方法同样适用于其它转录本的人源化改造。例如，可将上述人BTLA基因的转录本替换为其他转录本，如NCBI登录号为NM_001085357.1→NP_001078826.1(其mRNA序列及蛋白序列如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68所示)。
[0288] 发明人进一步设计了图5所示的打靶策略和包含5’同源臂、人BTLA基因片段、3’同源臂的载体。载体的构建过程如下：
[0289] 1、设计同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：
[0290] 5’端同源臂，序列如SEQ ID NO：32所示，为NC_000082.6的第45237539-45239051位核苷酸；
[0291] 上游引物：
[0292] F:5’-tttaagaaggagatatacatggatatcatacagcaacgacctcgttaagact-3’(SEQ ID NO：33)
[0293] 下游引物：
[0294] R:5’-taaagctgtacatcacactcttcatctaaaacaaaaacaaaactgg-3’(SEQ ID NO：34)[0295] 2、设计期望的转换区的引物及相关序列，具体为：
[0296] 人DNA片段，序列如SEQ ID NO：35所示，为NC_000003.12的第112479758-112479462位核苷酸；
[0297] 上游引物：F:5’-gttttagatgaagagtgtgatgtacagctttatataaagagacaa-3’(SEQ ID NO：36)
[0298] 下游引物：R:5’-atcacttacctgtcacataaagagttgttgagtggctttcaatg-3’(SEQ ID NO：37)
[0299] 3、设计同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：
[0300] 3’同源臂，序列如SEQ ID NO：38所示，为NC_000082.6的第45239358-45240854位核苷酸
[0301] 上游引物：F:5’-cactcaacaactctttatgtgacaggtaagtgatctaccccag-3’(SEQ ID NO：39)
[0302] 下游引物：R:5’-ttgttagcagccggatctcaggtcgacgctagactatcaattctaccatgttgat-3’(SEQ ID NO：40)
[0303] 以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段，以人基因组DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段，通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-BTLA。
[0304] 实施例3载体pClon-4G-BTLA的验证
[0305] 随机挑选3个pClon-4G-BTLA克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中，EcoRI应出现5779bp+1043bp，SacI应出现4130bp+2692bp，ScaI应出现5579bp+1243bp。酶切结果均符合预期，参见图6，结果表明所有质粒酶切验证正确。编号1、2、3的质粒经测序公司测序验证正确，选择质粒2进行后续实验。
[0306] 实施例4显微注射及胚胎移植
[0307] 取小鼠的受精卵，例如，C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的Cas9mRNA、pClon-4G-BTLA质粒和pT7-BTLA-1、pT7-BTLA-14质粒的体外转录产物，使用体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录，注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的F0代小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将该免疫节点人源化小鼠命名为B-hBTLA小鼠。
[0308] 实施例5基因改造人源化小鼠的鉴定
[0309] 1、F0代基因型鉴定
[0310] 对得到的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物针对BTLA基因的第2外显子，引物位置PCR-1位于5’同源臂左侧，PCR-4位于3’同源臂右侧，PCR-2和PCR-3均位于人源化片段上，序列如下：
[0311] 5’端引物：
[0312] PCR-1(SEQ ID NO:41)：5’-acttagtggactgtaggagtgctgg-3’
[0313] PCR-2(SEQ ID NO:42)：5’-cagcggtatgacccattgtcattagga-3’
[0314] 3’端引物：
[0315] PCR-3(SEQ ID NO:43)：5’-ccatcttagcaggagatccctttga-3’
[0316] PCR-4(SEQ ID NO:44)：5’-tagacatgagacaaggttgggcctg-3’
[0317] 如果重组载体插入正确，则应在5’和3’端分别有一条PCR条带，5’端引物产物长度应为1842bp，3’端引物产物长度应为2428bp。PCR反应体系和条件见表3、表4。
[0318] 表3 PCR反应体系(20μL)
[0319]10×缓冲液 2μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
dNTP(2mM) 2μL
MgSO4(25mM) 0.8μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
[0320] 表4 PCR扩增反应条件
[0321]
[0322] (*每个循环降0.7℃)
[0323] 2只阳性F0代小鼠的PCR鉴定结果见图7。
[0324] 2、F1代基因型鉴定
[0325] 将F0代小鼠鉴定为阳性的小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。PCR实验结果(图8)与预期相符，显示6只小鼠均为阳性小鼠。
[0326] 应用Southern blot对上述6只F1代阳性小鼠进行检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用StuI、PstI酶分别消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂外侧及人源化片段上。探针合成引物如下：
[0327] P1-F(SEQ ID NO：45)：5’-TGATTTGCTTGCTGTTTAAGGTCAT-3’
[0328] P1-R(SEQ ID NO：46)：5’-CTCAGAAAGAGATTTCAAGGGGGTA-3’
[0329] P2-F(SEQ ID NO：47)：5’-GGATGCTCTGATGGGCACACACTTT-3’
[0330] P2-R(SEQ ID NO：48)：5’-TTAGGGAACCAGTTTCTCAGCAGGG-3’
[0331] 野生型的C56BL/6小鼠基因组经P1、P2探针杂交分别产生11.6kb和5.8kb的条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠则分别产生9.4kb和5.8kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生11.6kb+9.4kb和5.8kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。
[0332] Southern blot检测结果见图9-图10。探针P1的实验结果(图9)显示6只小鼠中，只有编号为F1-4的小鼠无随机插入，探针P2的实验结果(图10)显示该小鼠人源化片段插入正确，证实该小鼠(F1-4)为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。
[0333] 这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hBTLA人源化基因工程小鼠。
[0334] 3、人源化小鼠的表达情况分析
[0335] 选取1只阳性F1代杂合子小鼠，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg CD3(来源：BD，Clone 145 2C-11)，24h后取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
[0336] FACS检测：用鼠源BTLA抗体mBTLA PE和anti-mTCRβ及人源BTLA抗体hBTLAAPC和anti-mTCRβ(TCRβPerCP)对胞外蛋白同时进行染色，PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(见图11)显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，抗人BTLA抗体检测到人源化小鼠脾脏内表达人BTLA蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人BTLA蛋白的细胞。
[0337] RT-PCR检测：提取小鼠脾脏细胞RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，利用引物[0338] mBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：49)：ACCCCTTGAGGTTAGCCCT
[0339] mBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：50)：TTGTAGAACAGCTATACGACCCA
[0340] 扩增大小为122bp的鼠Btla片段；
[0341] 利用引物
[0342] hBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：51)：ATACTGTGCTAACAGGCCTCA
[0343] hBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：52)：ACCCATTGTCATTAGGAAGCACT
[0344] 扩增大小为152bp的人BTLA片段。
[0345] PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。GAPDH作为内参。实验结果显示(图12)，野生型C57BL/6小鼠和F1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠Btla的mRNA表达，F1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人BTLA的mRNA表达。
[0346] 进一步的，将鉴定为阳性的F1代小鼠互相交配，可得到B-hBTLA人源化基因工程小鼠纯合子。选取1只纯合的B-hBTLA小鼠，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
[0347] FACS检测：用鼠源BTLA抗体mBTLA PE和鼠源CD19抗体mCD19FITC或人源BTLA抗体hBTLA APC和鼠源CD19抗体mCD19FITC对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测。流式分析结果(见图13)显示，用荧光标记的抗鼠BTLA抗体可检测到未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激的小鼠C57BL/6脾脏内表达鼠源BTLA蛋白的细胞(见图13A、B)，纯合人源化小鼠脾脏内未检测到表达鼠BTLA蛋白的细胞(见图13C)；用荧光标记的抗人BTLA抗体检测到纯合人源化小鼠脾脏内表达人BTLA蛋白的细胞(见图13F)；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人BTLA蛋白的细胞(见图13D、E)。表明本方法制备得到的BTLA基因改造人源化小鼠可以表达人BTLA蛋白，并被抗人抗体识别。
[0348] RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和B-hBTLA纯合子小鼠脾脏细胞的总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA后进行PCR分析；利用引物mBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：49)和mBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：50)扩增大小为122bp的鼠Btla片段；利用引物hBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：51)和hBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：52)扩增大小为152bp的人BTLA片段。
[0349] PCR反应体系和反应条件见F1代杂合子小鼠检测条件，使用GAPDH作为内参。实验结果显示，见图14，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Btla的mRNA表达，B-hBTLA纯合子小鼠活化细胞中可检测到人BTLA的mRNA表达。
[0350] 以上检测表明本方法制备得到的BTLA基因改造人源化小鼠及子代可以表达人BTLA蛋白，并被抗人抗体识别。该模型小鼠可用于抗人BTLA抗体的筛选和检测。
[0351] 实施例6基因敲除小鼠的鉴定
[0352] 由于Cas9的切割造成双链断裂，同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，得到BTLA蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：
[0353] F：5’-TGAAGAGTGTCCAGTGCAACTTACT-3’(SEQ ID NO：53)
[0354] R：5’-TGTGGTGGACTGTGGATGTGACAAA-3’(SEQ ID NO：54)
[0355] 野生型小鼠应只有1条PCR条带，产物长度应为452bp，杂合子应还有1条PCR条带，产物长度应为约260bp。PCR反应体系及条件同实施例5，PCR结果参见图15。
[0356] 实施例7B-hBTLA基因人源化动物模型体内药效验证
[0357] 取B-hBTLA纯合小鼠(4-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×105/100μl PBS)，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择6种抗人BTLA抗体(AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6)进行注射治疗，剂量为10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。给药频率为每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次3
并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm时应执行安乐死结束试验。
并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm时应执行安乐死结束试验。
[0358] 整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时(分组后第22天)，所有治疗组和对照组小鼠体重均出现增长，且在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图16、17)；但从肿瘤体积测量结果上看(图18)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而除G2组外的所有治疗组小鼠，与对照组相比肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明这6种抗人BTLA抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。
[0359] 表5中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后15天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第22天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
[0360] 表5小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学分析
[0361]
[0362] 从表5可见，结合图16可知在实验终点时(分组后第22天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对6种抗人BTLA抗体耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(G1)平均肿瘤体积为1542±1618mm3，治疗组平均肿瘤体积分别为1631±1093mm3(G2)、924±641mm3(G3)、461±488mm3(G4)、624±345mm3(G5)、831±881mm3(G6)、
1017±839mm3(G7)，使用BTLA抗体AB1治疗(G2)与对照组(G1)小鼠肿瘤体积大小差别不大，但G3～G7治疗组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组(G1)，TGITV分别为43.8％、76.5％、
76.5％、65.0％、50.4％、37.2％，表明BTLA抗体AB2、AB3、AB4、AB5、AB6具有不同的抑制肿瘤生长效果，在相同的给药剂量和频次下，BTLA抗体AB3(G4)、AB4(G5)对肿瘤具有明显的抑制作用(TGITV＞60％)，抑瘤效果优于AB2、AB5、AB6抗体，而AB1几乎没有抑制肿瘤生长作用。由此证明不同的抗人BTLA抗体在B-hBTLA小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，且抗体AB3、AB4抑制肿瘤的效果明显优于其它抗体，表现出不同的疗效，且均未对动物产生明显毒副作用，安全性较好。
1017±839mm3(G7)，使用BTLA抗体AB1治疗(G2)与对照组(G1)小鼠肿瘤体积大小差别不大，但G3～G7治疗组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组(G1)，TGITV分别为43.8％、76.5％、
76.5％、65.0％、50.4％、37.2％，表明BTLA抗体AB2、AB3、AB4、AB5、AB6具有不同的抑制肿瘤生长效果，在相同的给药剂量和频次下，BTLA抗体AB3(G4)、AB4(G5)对肿瘤具有明显的抑制作用(TGITV＞60％)，抑瘤效果优于AB2、AB5、AB6抗体，而AB1几乎没有抑制肿瘤生长作用。由此证明不同的抗人BTLA抗体在B-hBTLA小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，且抗体AB3、AB4抑制肿瘤的效果明显优于其它抗体，表现出不同的疗效，且均未对动物产生明显毒副作用，安全性较好。
[0363] 上述研究结果证明人源化BTLA动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于BTLA信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人BTLA抗体的有效性，以及评估靶向BTLA的治疗效果等。
[0364] 实施例8双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
[0365] 包含人源BTLA基因的小鼠(如利用本方法或制得的B-hBTLA动物模型)还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对B-hBTLA小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到BTLA人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的B-hBTLA动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到BTLA人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。
[0366] 以双重人源化BTLA/PD-1小鼠的生成为例，由于小鼠Btla与Pd-1基因不在同一条染色体上，可通过将B-hBTLA小鼠与包含人源PD-1基因的小鼠(如B-hPD-1小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化BTLA/PD-1小鼠。
[0367] 分别使用4对引物对双重人源化BTLA/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表6，反应体系和条件见表7、8。多只双重人源化BTLA/PD-1小鼠的鉴定结果见图19，其中图19A、B中编号为3017～3032的小鼠为BTLA纯合子小鼠、图19C、D中编号为3017～3032的小鼠为PD-1纯合子小鼠，综合两组结果表明，编号为3017～3032的16只小鼠均为双基因纯合子。
[0368] 表6序列及产物长度
[0369]
[0370] 表7 PCR反应体系(20μL)
[0371]2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA(100-200ng/20ml) 2μL
ddH2O 补至20μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA(100-200ng/20ml) 2μL
ddH2O 补至20μL
[0372] 表8 PCR扩增反应条件
[0373]
[0374] 进一步的，对双重人源化BTLA/PD-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化BTLA/PD-1小鼠纯合子(9周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
[0375] FACS检测：用鼠源BTLA抗体mBTLA PE和鼠源CD19抗体mCD19FITC(图20A、B、C)或人源BTLA抗体hBTLA APC和鼠源CD19抗体mCD19FITC(图20D、E、F)，或鼠源PD-1抗体mPD-1PE和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ(图21A、B、C)或人源PD-1抗体hPD-1FITC和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ(图21D、E、F)，和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图20、21显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人源BTLA抗体和人源PD-1抗体可以检测到人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠脾脏内表达人BTLA和PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人BTLA或PD-1蛋白的细胞。
[0376] RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和双人源化BTLA/PD-1纯合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA；
[0377] 利用引物mBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：49)和mBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：50)扩增大小为122bp的鼠Btla片段；
[0378] 利用引物hBTLA RT-PCR F1(SEQ ID NO：51)和hBTLA RT-PCR R1(SEQ ID NO：52)扩增大小为152bp的人BTLA片段；
[0379] 利用引物mPD-1 RT-PCR F3：5’-CCTGGCTCACAGTGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：63)，和mPD-1 RT-PCR R3：5’-CAGGGCTCTCCTCGATTTTT-3’(SEQ ID NO：64)扩增大小为297bp的鼠Pd-1片段；
[0380] 利用引物hPD-1 RT-PCR F3：5’-CCCTGCTCGTGGTGACCGAA-3’(SEQ ID NO：65)，和hPD-1 RT-PCR R3：5’-GCAGGCTCTCTTTGATCTGC-3’(SEQ ID NO：66)扩增大小为297bp的人PD-1片段。
[0381] PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
[0382] 实验结果显示(见图22、23)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Btla和Pd-1的mRNA表达，BTLA/PD-1纯合子小鼠活化细胞中可检测到人BTLA和PD-1的mRNA表达。
[0383] 实施例9基于胚胎干细胞的制备方法
[0384] 采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得BTLA基因人源化小鼠。
[0385] 根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠BTLA基因示意图(图4)，发明人设计了图24所示的打靶策略，图24中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Btla基因的2号外显子全部或部分用人BTLA基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(3812bp)、3’同源臂(4169bp)和人源化基因片段(297bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例5一致。
[0386] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0387] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0388] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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