技术领域
[0001] 本
发明涉及基因工程，尤其是涉及一种转基因斑马鱼的制备方法。
背景技术
[0002] 持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs)是指通过各种环境介质(大气、
水、
生物体等)能够长距离迁移并长期存在于环境，具有长期残留性、生物蓄积性、半挥发性和高毒性，对人类健康和环境具有严重危害的天然或人工合成的有机污染物质。
[0003] 二噁英类化合物(Dioxins)是一类典型的持久性有机污染物，长期存在于自然环境中并引起高度关注。该类化合物毒性极强，在自然环境中极难降解，能在全球范围内长距离迁移,被生物体摄入后不易分解，并沿着食物链逐级浓缩放大，对生物具有致癌、致畸、内分泌干扰等作用。二噁英类化合物是多氯二苯并对二噁英(polychlorinated dibenzodioxins,PCDDs)、多氯二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)和多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)等一类多环芳
烃的总称。其中被人们广泛关注的包括四氯二苯并对二噁英(Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)、苯并芘(Benzoapyrene,BaP)、
萘、蒽、菲等。该类化合物能与细胞内多环芳香烃化合物受体(Aryl hydrocarbon Receptor,AhR)蛋白结合，发生作用，诱导下游基因表达，引发一系列生物学效应。而TCDD是这类污染物中与AhR结合能
力最强的物质，即毒性最强的二噁英。本发明用TCDD作为标准物质，探究转基因斑马鱼在TCDD刺激下绿色
荧光蛋白的表达情况。
[0004] 二噁英类化合物在生物体内作用的分子机制主要是通过激活芳香烃受体(AhR)
信号通路而引起生物学效应。AhR是一个螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族的成员，并具有Per-Arnt-Sim(PAS)结构域，属于bHLH超家族的转录因子。它的分子量存在种属差异。AhR的配基主要包括卤代芳香烃类(Polycyclic aromatic hydrocarbons,HAHs)和多环芳香烃类(Halogenated aromatic hydrocarbons,PAHs)化合物，主要是人工产生的外源性物质。近年来的研究发现，越来越多的天然化合物也能与AhR结合，说明AhR具有高度的配基多样性的特点。AhR执行功能时，需要和另一个bHLH家族成员ARNT形成异源二聚体，识别并结合靶基因。(Michael S,Alessandro P,Scott R,et al.Ligand binding and activation of the Ah receptor[J].Chemico-Biological Interactions,2002,141:3-24)(Poland,A.Knutson,J.C.2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related halogenated aromatic hydrocarbons:examination-n of the mechanism of toxicity[J].Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol,1982,22:517-542.)[0005] 多数
细胞质中的AhR未与配体结合处于静息复合物的状态，该复合物包括1个AhR、热激蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)二聚体、乙型
肝炎病毒X蛋白结合蛋白2(hepatitis B virus X protein-associated protein 2,XAP2)以及一个p23辅伴侣蛋白分子结合。HSP90的结合使AhR维持一种非活化、可与配体结合的状态，它起到了稳定AhR的构象及抑制AhR与ARNT二聚化的作用；XAP2可以改变AhR被入核蛋白importinβ识别的能力，抑制AhR的泛素化降解。
[0006] 而AhR在细胞质中的
定位与自身核
输出信号(nuclear export signal,NES)有关，AhR序列中存在两个NES，分别位于bHLH和PAS域，非结合配体的AhR利用的是PAS域的NES，而结合配体的AhR利用的是bHLH域的NES。
[0007] AhR功能的活化也会受到其结合蛋白以及其自身序列变化的调节。HSP90可以通过结合AhR的PASB和bHLH结构域而结合AhR，p23可以稳固这种结合。HSP90与AhR的结合有助于AhR形成配基高亲和力的构象。同时，HSP90可以将AhR的入核序列隐藏起来，从而使得静息态的AhR保持在细胞质内。而配基与AhR结合改变了AhR与HSP90的结合从而暴露其入核序列。XAP2可以与AhR和HSP90结合，这种结合不仅可以防止AhR的泛素化和蛋白
水解，也有助于AhR驻留在细胞质内，当脂溶性很强的二噁英类化合物通过扩散作用穿过细胞膜进入细胞质时，与静息态的AhR蛋白
复合体结合，AhR与其配基结合后构象发生变化，暴露了其位于N端的入核序列(Nuclear localization sequence,NLS)，入核序列引导该复合物进入细胞核。入核后，AhR从复合物中解离出来，与细胞核内的ARNT形成异源二聚体，结合到靶基因的DNA生物异源物质效应元件(xenobiotic-responsive element,XRE，也称为DRE)上，启动下游基因(如：CYP1A)的转录。在AhR和ARNT形成二聚体识别并结合靶基因的XRE，并招募一系列激活因子。绝大多数AhR依赖基因的启动子上游都动发现了DRE序列，所以DRE可以作为判断一个基因是否受AhR调控的依据。
[0008] 细胞色素
氧化酶P450(Cytochrome 450,CYP450s)酶系是自然界中最具有催化活性的生物催化酶之一，它在生物体中具有重要的生理功能。CYP450s能对各种内源性物质(如类固醇、
脂肪酸等)以及外源性物质(如TCDD、苯并(a)芘等)进行生物转化的第I相反应，促进这些酶在芳香烃类化合物代谢时的作用。目前，由于CYP450酶系同工酶活性对外源性物质的高敏感性，TCDD可以诱导CYP1A基因mRNA的表达，AhR激活CYP1A基因是通过与其启动子上的5’-TNGCGTG-3’，其中N为任意的核苷酸。(M.S.Denison,J.M.Fisher,and J.P.Whitlock,Jr.,The DNA Recognition Site for the Dioxin-Ah Receptor Complex.Nucleotide Sequence and Functional Analysis,J Biol Chem,1988,263:17221-4.)CYP1A表达量与二噁英暴露呈现正相关性，可以使其作为早期评估和检测水生生态环境系统污染的重要指标。近年来，CYP450在环境毒理学方面受到了越来越多的关注。因此，人们确定CYP1A为二噁英暴露的生物标志物，该基因上游因物种的不同而具有不同数目和
位置的DRE序列，而CYP1A基因在RNA水平或蛋白水平表达量的高低也是二噁英暴露水平的标志之一。
[0009] 斑马鱼(Danio rerio)是一种典型的模式动物，优势非常突出，体长4～6cm，体呈纺锤形，背部橄榄色，体侧从鳃盖后直伸到尾有数条
银蓝色纵纹，臀鳍部也有与体色相似的纵纹。斑马鱼属卵生鱼类，
体外受精，胚胎发育同步且速度快，胚体透明，其卵无粘性，受精卵经2～3天孵出仔鱼。饲养条件要求不高，繁殖周期短，能大规模繁育。养殖用水pH要求7.2～7.5，水温26～29℃。利用斑马鱼，可以研究生命科学的
基础问题，建立毒理学和水产育种学模型，研究和解决环境科学和农业科学的重大问题。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于提供一种转基因斑马鱼的制备方法。
[0011] 所述转基因斑马鱼的制备方法的具体步骤如下：
[0012] 1)CYP1A启动子序列的改造，具体方法如下：
[0013] (1)含6个DRE的CYP1A启动子的改造(可参考中国
专利CN201610167440.5“一种二噁英类持久性有机污染物的检测方法”)；
[0014] 根据已知的斑马鱼基因组序列设计引物，在序列两端添加XhoI、HindⅢ两个酶切位点。采用常规分子克隆的方法和overlap PCR技术，克隆并改造得到含6个DRE的CYP1A启动子。
[0015] 改造后PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE序列如下：
[0016]
[0017]
[0018] (2)含12个DRE的CYP1A启动子的改造，具体方法如下：
[0019] 1、选取斑马鱼CYP1A基因启动子中两个含有多DRE的区域，设计以下引物：
[0020] 12×DRE-1F：5’-CGCGGATCCAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(BamHI)
[0021] 12×DRE-1R：5’-AAAGATATCATTGCCTGCATGTTTGAG-3’(EcoRV)
[0022] 12×DRE-2F：5’-AAAGATATCCCTTTAATCAGGGGTCGCC-3’(EcoRV)
[0023] 12×DRE-2R：5’-CTAGTCTAGACCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(XbaI)
[0024] 以斑马鱼基因组DNA为
模版分别进行普通PCR后，切胶回收得到序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列如下：
[0025] 序列12×DRE-1：
[0026]
[0027]
[0028] 序列12×DRE-2：
[0029]
[0030] 2、把序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列分别用 限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)37℃酶切过夜后，切胶回收
片段；同时用 限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)对pCMV-C-EGFP质粒酶切并回收片段，最后用T4 DNA连接酶将序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列与质粒连接，得到pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP重组质粒；
[0031] 3、以重组质粒pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP为模版，设计引物12×DRE-F和12×DRE-R，进行PCR添加酶切位点，引物序列如下：
[0032] 12×DRE-F：5’-CGCCTCGAGAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(XhoI)
[0033] 12×DRE-R：5’-CTAGAAGCTTCCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(HindIII)
[0034] 切胶回收后得到含有12个DRE的启动子pCYP1A-12×DRE序列如下：
[0035]
[0036]
[0037] 2)Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备，具体方法如下：
[0038] (1)Tol2转座子敲入系统供体质粒的构建：
[0039] 用限制性核酸内切酶XhoI和HindIII对步骤1)中的PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE重组质粒、pCYP1A-12×DRE片段进行酶切，再次
电泳切胶回收；同时用XhoI和HindIII对Tol2转座子pT2AL200R150G质粒双酶切，大片段切胶回收，回收的Tol2转座子载体分别和pCYP1A-6×DRE、pCYP1A-12×DRE启动子片段混合，同T4 DNA连接酶25℃连接1h；
[0040] 转化感受态细胞，在含有
氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜，挑取单菌落于5mL LB液体培养基(含Amp)，摇菌16h，用 质粒小量提取
试剂盒提取质粒，用EGFP-R引物测序鉴定。鉴定序列正确后中提质粒备用，得到pTol2-CYP1A-6×DRE-EGFP、pTol2-CYP1A-12×DRE–EGFP两个质粒，分别含有6个DRE、12个DRE的CYP1A启动子分别连接带有EGFP基因的Tol2转座子载体；
[0041] (2)线性化改造后的Tol2转座子供体质粒和Tol2转座酶质粒：
[0042] 1.Tol2转座子供体质粒的线性化，具体方法如下：
[0043] 取10μg带有改造后CYP1A启动子序列的Tol2转座子供体质粒，用SpeI单酶切使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，确定线性
化成功后进行DNA酚氯仿抽提纯化，得到线性DNA片段pTol2-CYP1A-6×DRE-EGFP、pTol2-CYP1A-12×DRE-EGFP；
[0044] 2.Tol2转座酶质粒的线性化，具体方法如下：
[0045] 取10μg带有Tol2转座酶编码序列的pCS2-zT2TP质粒，用NotI单酶切使其线性化。琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，确定线性化成功后进行DNA酚氯仿抽提纯化。
[0046] (3)Tol2转座酶mRNA的体外转录合成和纯化，具体方法如下：
[0047] 以线性Tol2转座酶DNA片段为模版进行体外转录，然后纯化。
[0048] (4)显微注射样品的配制，具体方法如下：
[0049] 根据以下体系准备样品：
[0050]
[0051] 混匀后冻存备用；
[0052] 3)斑马鱼胚胎的显微注射和继代培养，具体方法如下：
[0053] (1)显微注射操作和转基因斑马鱼的筛选、继代培养，具体方法如下：
[0054] 与注射装置连接完毕后，在
显微镜下旋转胚胎，找到动物极一端的细胞质，将液体注入细胞质；受精约5天后，在荧光显微镜下观察成活的斑马鱼幼鱼，可见弱绿色荧光的表达，筛选带有绿色荧光的斑马鱼幼鱼继续培养；3个月后，含有绿色荧光的首代(F0)斑马鱼性成熟，用野生型斑马鱼与该斑马鱼交配得到子一代(F1)，加入50ng/L TCDD斑马鱼培养液刺激24h，筛选出绿色荧光明显增强的转基因斑马鱼F1代。继续培养斑马鱼子一代，待子一代性成熟后，用转基因雌鱼和雄鱼交配得到子二代(F2)；
[0055] (2)转基因斑马鱼的TCDD暴露观察和荧光强度测定，具体方法如下：
[0056] 1.对比转基因斑马鱼Tg(pCYP1A-6×DRE-EGFP)、Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)在50ng/L TCDD斑马鱼培养液培养48h前后绿色荧光强度的变化，TCDD诱导后，转基因斑马鱼的内脏部分(肝脏、肠道等)绿色荧光较其它部位强，相同浓度TCDD诱导Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)的绿色荧光强度高于Tg(pCYP1A-6×DRE-EGFP)，说明含有12个DRE的启动子相比于含6个DRE的启动子对TCDD刺激更加敏感。每个浓度取5条鱼(n＝5)，用Image-Pro Plus
6.0
软件测定荧光强度，选取内脏肠道部位，每条鱼选取一致区域，读值用于数据统计分析；
[0057] 2.收集转基因斑马鱼F2代胚胎，立即用含有不同浓度TCDD的斑马鱼培养液分别培养不同时间后，继续用洁净的斑马鱼培养液培养至96h；不同浓度TCDD培养24-96h的转基因斑马鱼Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)；10ng/L TCDD诱导96h可见内脏部位绿色荧光增强，绿色荧光强度随着TCDD浓度和培养时间的增加而增强。
[0058] 本发明的技术效果及优点如下：
[0059] 本发明提供了一种带有改造后的CYP1A启动子和绿色荧光蛋白基因的转基因斑马鱼的制备方法。具体是提供了一种含有12个DRE的CYP1A启动子的构建方法，以及含有该启动子连接绿色荧光蛋白基因的重组Tol2转座子敲入质粒，质粒线性化纯化的方法和显微注射样品的配方。通过显微注射技术制备得到的Tg(pCYP1A-6×DRE-EGFP)和Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)转基因斑马鱼，对比了含有6个DRE与12个DRE启动子的活性。本发明优点包括：启动子的改造方法能够切实提高启动子的活性，且线性化的质粒使转基因的效率增高，改造后含12个DRE启动子的Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)转基因斑马鱼能够响应
水体低至10ng/L TCDD诱导，表达较强的绿色荧光。相比已有能响应多环芳烃的转基因斑马鱼更加敏感。
附图说明
[0060] 图1为pTol2-CYP1A-EGFP质粒图谱。
[0061] 图2为转基因斑马鱼传代示意图。
[0062] 图3为50ng/L TCDD培养48h的转基因斑马鱼Tg(6×DRE)、Tg(12×DRE)图片。
[0063] 图4为50ng/L TCDD培养48h的转基因斑马鱼Tg(6×DRE)、Tg(12×DRE)肠道荧光强度对比图。
[0064] 图5为不同浓度TCDD培养24-96h的转基因斑马鱼Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)荧光图片。
具体实施方式
[0065] 下面结合附图对本发明的具体步骤作详细说明。
[0066] 步骤一：CYP1A启动子序列的改造
[0067] 一、含6个DRE的CYP1A启动子的改造
[0068] 1、以National Center for Biotechnology Information(NCBI)
网站上已知的斑马鱼基因组序列设计一对引物CYP1A-F、CYP1A-R，克隆CYP1A(Chromosome 18)启动子序列。引物序列如下：
[0069] CYP1A-F：5’-AAACTCGAGGAAACCCACGCCATGCAAAC-3’(添加XhoI酶切位点)[0070] CYP1A-R：5’-AAAGGATCCGCTGCACTATTCCAGCGGTA-3’(添加HindⅢ酶切位点)[0071] 2、用 Genomic DNA Kit提取斑马鱼基因组DNA，按如下体系混合PCR各组分：50μL体系
[0072]
[0073]
[0074] PCR反应条件：
[0075]
[0076] 扩增反应结束后，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，与标准分子量DNA对比，确定所扩增的单一DNA片段条带符合预期大小370bp，用胶回收试剂盒回收DNA。回收产物用XhoI和HindIII进行双酶切，并再次胶回收，同时将质粒载体PGL6-TA用XhoI和HindIII双酶切，并胶回收。然后用T4 DNA连接酶将CYP1A启动子序列与载体片段在25℃下连接1h。
[0077] 3、转化感受态细胞：将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞(CaCl2法制备)中，
冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置5min。加入500μL LB培养基，37℃220rpm恒温摇床摇菌1h，取200μL涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基(Amp 100μg/ml)中，37℃培养过夜。挑取单菌落于5mL LB液体培养基(含Amp)，摇菌16h，用 质粒小量提取试剂盒提取质粒，用RVprimer3通用引物测序鉴定。测得正确序列如下：
[0078]
[0079]
[0080] 4、用得到重组质粒PGL6-TA-CYP1A作为模版，利用overlap PCR在片段中插入1个DRE、2个DRE、3个DRE，得到含有4个DRE、5个DRE、6个DRE改造后的CYP1A启动子。设计引物序列如下：
[0081] 4×DRE-1F：5’-TGTTACATACATCAATCTCC-3’
[0082] 4×DRE-2F：5’-ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAATCT
[0083] CC-3’
[0084] 4×DRE-1R：5’-CACGCACACATACATGGTAC-3’
[0085] 4×DRE-2R：5’-CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATG
[0086] GTAC-3’
[0087] 以CYP1A-F和4×DRE-1R为引物，以PGL6-TA-CYP1A为模版，PCR扩增出序列1。4×DRE-1F和CYP1A-R为引物，PGL6-TA-CYP1A为模版，PCR扩增出序列2。pCYP1A-F和4×DRE-2R为引物，序列1为模版，PCR扩增出序列3。4×DRE-2F和CYP1A-R为引物，序列2为模版，PCR扩增出序列4。以CYP1A-F和CYP1A-R为引物，模版同时加入序列3和序列4，扩增出目的序列CYP1A-4×DRE。得到的目的片段经XhoI和HindIII双酶切后回收，并与经XhoI和HindIII双酶切的质粒载体PGL6-TA连接，连接产物转化E.coli DH5α，氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-4×DRE。用Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性。改造后PGL6-TA-pCYP1A-4×DRE序列示意：
[0088]
[0089]
[0090] 5、用得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-4×DRE为模版，设计引物5×DRE-F，5×DRE-R，进行overlap PCR，对启动子序列进一步改造。引物序列如下：
[0091] 5×DRE-F：5’-CTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCG
[0092] TGTGTTACATACATCAAT-3’
[0093] 5×DRE-R：5’-CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCA
[0094] GTCACGCACACATACATGGTAC-3’
[0095] 改造后PGL6-TA-pCYP1A-5×DRE序列示意：
[0096]
[0097] 6、用得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-5×DRE为模版，设计引物6×DRE-F，6×DRE-R，进行overlap PCR，对启动子序列进一步改造。引物序列如下：
[0098] 6×DRE-F：5’-ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGC
[0099] GTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTG-3’
[0100] 6×DRE-R：5’-CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCG
[0101] CAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGT-3’
[0102] 改造后PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE序列示意：
[0103]
[0104] 二、含12个DRE的CYP1A启动子的改造
[0105] 1、选取斑马鱼CYP1A基因启动子中两个含有DRE的区域，设计以下引物：
[0106] 12×DRE-1F：5’-CGCGGATCCAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(BamHI)
[0107] 12×DRE-1R：5’-AAAGATATCATTGCCTGCATGTTTGAG-3’(EcoRV)
[0108] 12×DRE-2F：5’-AAAGATATCCCTTTAATCAGGGGTCGCC-3’(EcoRV)
[0109] 12×DRE-2R：5’-CTAGTCTAGACCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(XbaI)
[0110] 以斑马鱼基因组DNA为模版分别进行普通PCR后，切胶回收得到两段序列如下：
[0111] 序列12×DRE-1：
[0112]
[0113]
[0114] 序列12×DRE-2：
[0115]
[0116]
[0117] 2、把上述两个序列分别用 限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)37℃酶切过夜后，切胶回收片段，同时也用上述酶对pCMV-C-EGFP质粒酶切并回收片段，最后用T4 DNA连接酶将上述两个序列和质粒连接，得到pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP质粒。
[0118] 3、以重组质粒pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP为模版，设计引物12×DRE-F，12×DRE-R，进行PCR添加酶切位点。引物序列如下：
[0119] 12×DRE-F：5’-CGCCTCGAGAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(XhoI)
[0120] 12×DRE-R：5’-CTAGAAGCTTCCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(HindIII)
[0121] 切胶回收后pCYP1A-12×DRE序列示意：
[0122]
[0123]
[0124] 步骤二：Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备
[0125] 1、Tol2转座子敲入系统供体质粒的构建
[0126] 用 限制性核酸内切酶XhoI和HindIII对步骤一中的PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE重组质粒、pCYP1A-12×DRE片段进行酶切，再次电泳切胶回收。同时用XhoI和HindIII对Tol2转座子pT2AL200R150G质粒双酶切，大片段切胶回收。回收的Tol2转座子载体分别和pCYP1A-6×DRE、pCYP1A-12×DRE启动子片段混合，同T4 DNA连接酶25℃连接1h。
[0127] 转化感受态细胞：将10μL连接产物加入100μL的感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置5min。加入500μL LB培养基，37℃220rpm恒温摇床摇菌1h，取200μL涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基(Amp 100μg/ml)中，37℃培养过夜。挑取单菌落于5mL LB液体培养基(含Amp)，摇菌16h，用 质粒小量提取试剂盒提取质粒，用EGFP-R引物测序鉴定。鉴定序列正确后中提质粒备用。质粒图谱见(图1)。
[0128] 2、线性化改造后的Tol2转座子供体质粒和Tol2转座酶质粒
[0129] (1)Tol2转座子供体质粒的线性化
[0130] 取10μg带有改造后CYP1A启动子序列的Tol2转座子供体质粒pTol2-CYP1A-6×DRE-EGFP、pTol2-CYP1A-12×DRE-EGFP，用SpeI进行单酶切使其线性化，酶切体系如下：
[0131]
[0132] 琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，确定线性化成功后进行DNA纯化。100μL酶切体系用ddH2O补齐至200μL，加等体积
苯酚200μL涡旋震荡。室温12000rpm离心5min，去上清于新的EP管中。加等体积氯仿，涡旋震荡。室温12000rpm离心5min，取上清于新的EP管中，加2.5倍体积无水
乙醇，-20℃存放30min。4℃离心12000rpm，去上清。加1ml 70％乙醇洗一次。
4℃12000rpm离心10min，去上清，加入10μL RNase-free H2O溶解，测定DNA浓度和纯度，-80℃冻存备用。
[0133] (2)Tol2转座酶质粒的线性化
[0134] 取10μg带有Tol2转座酶编码序列的pCS2-zT2TP质粒，用NotI单酶切使其线性化。酶切体系如下：
[0135]
[0136] 琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，确定线性化成功后进行DNA纯化，方法同上。
[0137] 3、Tol2转座酶mRNA的体外转录合成和纯化
[0138] (1)转座酶mRNA的体外转录
[0139] 用 mMESSAGE mMACHINE Kit试剂盒合成，合成体系如下：
[0140]
[0141] 37℃温育2h，取1μL电泳鉴定。
[0142] (2)转座酶mRNA的纯化
[0143] 使用 MEGAclear Kit试剂盒纯化Tol2转座酶mRNA。
[0144] 加入1μL DNase消化模版，37℃15min。80μL Elution Solution，将合成好的20μL样品加入混合均匀。加250μL无水乙醇，吹吸均匀，取700μL上柱，12000rpm，1min，去上清。Washing Solution 500μL，12000rpm离心20s，重复一次。将柱子放入新的EP管，加50ml Elution buffer于膜上，65℃10min，12000rpm 1min离心。微量分光光度计测定浓度和纯度，-80℃保存。
[0145] 4、显微注射样品的配制：
[0146] 根据以下体系准备样品：
[0147]
[0148] 混匀后冻存备用。
[0149] 步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射技术和继代培养
[0150] 1、显微注射操作
[0151] 在显微注射工作的前一天准备好交配缸，将雌鱼和雄鱼放于缸中，用隔板隔开。收集胚胎的当天上午，将隔板拔去，雄鱼和雌鱼交配产卵后收集。配制好的注射样品灌入玻璃毛细管拉制的显微注射针管。与注射装置连接完毕后，在显微镜下旋转胚胎，找到动物极一端的细胞质，将液体注入细胞质，此时可见胚胎出现一个不会立即散去的红点(酚红指示)，说明注射位置正确。为了使外源基因的插入
频率最大化并降低首代鱼的嵌合性，显微注射尽量在胚胎单细胞阶段进行，且注射时间控制在受精后40min内。
[0152] 2、注射后的胚胎及斑马鱼的培养
[0153] 斑马鱼培养水温：28±1℃；充气；溶解氧：5～7mg/L；pH：7.2～7.5；光照周期：14h光照，10h黑暗；光照：2000～3000lx。胚胎在含有20mg/ml亚甲基蓝的斑马鱼培养液中培养，幼鱼饲喂草履虫，成鱼投喂丰年虫。
[0154] 3、转基因斑马鱼的筛选和继代培养
[0155] 受精约5天后，在荧光显微镜下观察成活的斑马鱼幼鱼，可见弱绿色荧光的表达，筛选带有绿色荧光的斑马鱼幼鱼继续培养。3个月后，含有绿色荧光的首代(F0)斑马鱼性成熟，用野生型斑马鱼与该斑马鱼交配得到子一代(F1)，加入50ng/L TCDD斑马鱼培养液刺激24h，筛选出绿色荧光明显增强的转基因斑马鱼F1代。继续培养斑马鱼子一代，待子一代性成熟后，用转基因雌鱼和雄鱼交配得到子二代(F2)。传代示意图见(图2)。
[0156] 4、转基因斑马鱼的TCDD暴露观察和荧光强度测定
[0157] (1)对比转基因斑马鱼Tg(pCYP1A-6×DRE-EGFP)、Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)在50ng/L TCDD斑马鱼培养液培养48h前后绿色荧光强度的变化，见(图3)。可见TCDD诱导后，转基因斑马鱼的内脏部分(肝脏、肠道等)绿色荧光较其它部位强，相同浓度TCDD诱导Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)的绿色荧光强度高于Tg(pCYP1A-6×DRE-EGFP)，说明含有12个DRE的启动子相比于含6个DRE的启动子对TCDD刺激更加敏感。每个浓度取5条鱼(n＝5)，用Image-Pro Plus 6.0软件测定荧光强度，选取内脏肠道部位，每条鱼选取一致区域，读值用于数据统计分析，荧光强度对比图参见图4。
[0158] (2)收集转基因斑马鱼F2代胚胎，立即用含有不同浓度TCDD的斑马鱼培养液分别培养不同时间后，继续用洁净的斑马鱼培养液培养至96h。为便于观察，将幼鱼置于3％甲基
纤维素以减小幼鱼的活动范围。通过荧光显微镜观察，选取相同曝光条件拍照。不同浓度TCDD培养24-96h的转基因斑马鱼Tg(pCYP1A-12×DRE-EGFP)荧光图片见(参见图5)。10ng/L TCDD诱导96h可见内脏部位绿色荧光增强，绿色荧光强度随着TCDD浓度和培养时间的增加而增强。
