技术领域
[0001] 本
发明属于人工
辅助生殖技术领域，涉及一种体外受精卵前期培养液，为一种体外受精液及其制备方法。
背景技术
[0002] 目前人类不孕率提高促使试管婴儿技术的发展。在试管婴儿技术中需采集良好的精子和母体的卵细胞进行受精和先期培养，该培养过程与受精液密切相关，受精液的
质量优劣决定试管婴儿的成败。体外受精液的目的主要是提供精子、卵子存活的营养和受精卵发育的营养，以及为精子、卵子及受精卵创建合理的成活和生长发育的环境。体外受精液对受精卵前期的分裂培养已广泛应用于试管婴儿技术中；如在试验室或临床中，在二
氧化
碳环境下由体外受精液对体外精子、卵子的提供存活的环境及对受精卵提供早期发育的营养。
[0003] 目前使用的受精液调配的营养不全，或其物理或化学指标过余宽，在培养过程中容易使精子或卵细胞死亡、或精子获能不足活
力较低、或卵细胞生存受到影响，如在精子活力试验中，精子保持活力的比率较低(同样的试验过程、同批次精液，下同)，或其比率接近或低于合格标准(保持活力率≥75％)。有些受精液的稠度较高，其含有有害成份和炎细胞去除不干净，严重影响受精卵的发育成长。
[0004] 另外，一般受精液在使用前不能直观地判断有效性的好坏，如果在其变质后仍继续使用将对试验或临床操作造成不可逆转的结果。
发明内容
[0005] 本发明主要是解决现有受精液不适宜精子、卵细胞生存，或影响受精卵发育成长等技术问题，进而提供一种完全适宜于精子、卵细胞或受精卵生存或生长的受精液；该受精液能保证精子获能且维持其活力、能使受精卵正常发育成长，使用安全且易于直观判断其是否变质，为辅助生殖技术提供有力保证，避免
风险发生。
[0006] 本发明的体外受精液是通过多种溶质溶于超纯净
水中进行调配而成的培养液，该多种溶质包括
基础液溶质、
杀菌剂和原液溶质；该基础液溶质包括有
氯化钠，氯化
钾，
硫酸镁，氯化
钙，
碳酸氢钠，丙
酮酸钠，乳酸钠，
牛磺酸，
柠檬酸钠；该杀菌剂为庆大霉素，该原液溶质为人血清
白蛋白；该调配的培养液在超净
工作台下再利用0.2μm的滤
膜过滤进行除菌处理。
[0007] 进一步，该基础液溶质在培养液中的含量如下：氯化钠96.4～106.6mmol/L、
氯化钾4.46～4.92mmol/L、
硫酸镁0.19～0.21mmol/L、
氯化钙1.94～2.14mmol/L、碳酸氢钠23.75～26.25mmol/L、
丙酮酸钠0.31～0.35mmol/L、乳酸钠12.18～13.47mmol/L、牛磺酸0.048～0.053mmol/L、柠檬酸钠0.000475～0.000525mmol/L；所述的人血清白蛋白在培养液中的含量为9.5～10.5g/L。
[0008] 再进一步，该庆大霉素在培养液中的含量为9.5～10.5mg/L。
[0009] 再进一步，该培养液中还具有用以判断该培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，在培养液中的含量为4.75～5.25mg/L。
[0010] 更进一步，该培养液的pH值为7.20～7.40；该培养液的渗透压为260～290mOsm/Kg。
[0011] 一种如上述所述的体外受精液的制备方法，它包括以下步骤：
[0012] (1)培养液的配制
[0013] a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中，待用；
[0014] b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中；
[0015] c、向上述步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO3溶质，同时根据需要添加指示剂，得基础液；
[0016] d、向上述步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得原液；
[0017] e、检测上述步骤d所得原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40，并记录最终渗透压和pH值。
[0018] (2)培养液的处理：
[0019] a、除菌，将上述步骤所得培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；
[0020] b、分装及冷存，在无菌环境下对过滤后的培养液进行分装、封口，并放置于
冰箱或冷库内，在2～8℃条件下保存，得体外受精液；
[0021] c、取分装好的体外受精液进行检测，检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、细菌内毒素检测、以及体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该体外受精液是否合格。
[0022] 本发明通过该体外受精液中各成份的合理配比，保证将其溶液的渗透压控制在260～290mOsm/Kg的范围内，为精子、卵细胞正常生成，受精卵的正常生长、发育创建了适宜的环境。
[0023] 该体外受精液中根据情况添加指示剂，如酚红。由于酚红在pH变化时
颜色变化明显，如，pH在7.0～7.5范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6.8时为黄色，当pH值大于8.4时为红色。通过该体外受精液的的颜色观察就可直观地判断其是否变质在用于试验或临床时，从而避免了使用变质体外受精液而产生的风险。当体外受精液中不含酚红指示剂时，则溶液呈透明、清澈，在有效期内能保证无菌且正常使用。通过加入抗生素等杀菌剂以抑制细菌的生长；如庆大霉素是一种
光谱、热
稳定性好的抗生素，在体外受精液中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。本发明在制备过程中其
溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳(TOC)超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。
[0024] 本发明包含有多种适合精子、卵细胞生存和受精卵生长发育的有机或无机成份，能创建适宜于精子的生存环境，维持了精子原有活力，同时能有效地去杀死有害细菌等，为体外受精卵培育提供了保证。
[0025] 本发明配制工艺操作简单合理，检测严密，能够快速地提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。
[0026] 以下结合
实施例对本发明作进一步的说明。
[0027] 实施例一
[0028] 本发明的体外受精液，它是通过多种溶质溶于超纯净水中进行调配而成的培养液。该超纯净水的物理标准为：①流速为0.05Lpm-2.0Lpm、②在25℃时
电阻率为18.2MΩ.cm、③在25℃时电导率为0.055цS/cm；化学标准为：热原质＜0.001Eu/ml，微粒≤1/ml，TOC＜5ppb。该超纯净水也可用注射用水替代。该多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。通过基础液溶质调配创建适宜于精子、卵细胞、受精卵生存的环境以及提供受精卵生长所需营养。该基础液溶质包括有氯化钠，氯化钾，硫酸镁，氯化钙，碳酸氢钠，丙酮酸钠，乳酸钠，牛磺酸，柠檬酸钠。该原液溶质为人血清白蛋白，用于提供受精卵生存的必要的营养物质。该杀菌剂为庆大霉素；用于杀灭体外受精液中的细菌等有害物质。
[0029] 经上述调配而成的培养液在超净工作台下再利用0.2μm的滤膜过滤进行除菌处理。
[0030] 该基础液溶质在培养液中的含量如下：氯化钠96.4mmol/L、氯化钾4.46mmol/L、硫酸镁0.19mmol/L、氯化钙1.94mmol/L、碳酸氢钠23.75mmol/L、丙酮酸钠0.31mmol/L、乳酸钠12.18mmol/L、牛磺酸0.048mmol/L、柠檬酸钠0.000475mmol/L；该人血清白蛋白在培养液中的含量为9.5g/L。本实施例中的杀菌剂为庆大霉素，其在培养液中的含量为9.5g/L。具体参见表1中的“配方1”。
[0031] 表1 体外受精液的配方
[0032]组分名称 配方1 配方2 配方3
氯化钠mmol/L 96.4 101.5 106.6
氯化钾mmol/L 4.46 4.69 4.92
硫酸镁mmol/L 0.19 0.2 0.21
氯化钙mmol/L 1.94 2.04 2.14
碳酸氢钠mmol/L 23.75 25 26.25
丙酮酸钠mmol/L 0.31 0.33 0.35
乳酸钠mmol/L 12.18 12.82 13.47
牛磺酸mmol/L 0.048 0.05 0.053
柠檬酸钠mmol/L 0.000475 0.0005 0.000525
人血清白蛋白g/L 9.5 10 10.5
酚红mg/L 4.75 0 5.25
庆大霉素mg/L 9.5 10 10.5
[0033] 该培养液的pH值为7.40，以适合于细胞生长。该培养液的渗透压为280mOsm/Kg，以适合于细胞的生存和受精卵的生长和发育。
[0034] 该培养液中还具有用以判断该培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，其在培养液中的含量为4.75mg/L。
[0035] 本发明体外受精液的制备方法(以配制10L体外受精液为基准)包括以下步骤：
[0036] (1)培养液的配制
[0037] a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中。根据上述表1中“配方1”的各溶质含量按配制10L体外受精液分别称取氯化钠(NaCl)56.394g(即
964mmol)、氯 化 钾(KCl)3.323g(即44.6mmol)、硫 酸镁(MgSO4)0.228g(即 1.9mmol)(注：实际操作时可选用MgSO4·7H2O)、氯化钙(CaCl2)2.154g(即19.4mmol)、碳酸氢钠(NaHCO3)19.95g(即237.5mmol)、丙酮酸钠(C3H3O3Na)0.341g(即3.1mmol)、乳酸钠(C3H5O3Na)13.64g(即121.8mmol)(注：实际操作时采用60％的乳酸钠溶液)、牛磺酸(NH2CH2CH2SO3H)0.06g(即0.48mmol)、柠檬酸钠(C6H5Na3O7)0.00123g(即0.00475mmol)，以及人血清白蛋白95g和庆大霉素95mg，分开放置，待用。同时准备带刻度调制容器(10L以上)和超纯净水10L以上；然后将称量好超纯净水(一般采用先加入少于10L的超纯水，如
9L左右)加入配制用带刻度的调制容器中，待用。
[0038] b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中；本实施例采用以下顺序先后将各称取的基础液溶质加入已加入超纯净水的调制容器中：氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、丙酮酸钠、柠檬酸钠、牛磺酸、乳酸钠。
[0039] c、向步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO3基础液溶质，同时根据需要添加指示剂；得基础液；本实施例中杀菌剂选用庆大霉素。将95mg(即9.5mg/L标准)的庆大霉素加入步骤b所得溶液中后，再加入所称取的NaHCO3基础液溶质。同时加入指示剂酚红47.5mg(即4.75mg/L标准)，得基础液。
[0040] d、向上述步骤c所得的基础液中加入上述所称取的人血清白蛋白95g，震荡或搅拌混合均匀后，得原液.
[0041] e、检测步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20～7.40，并记录最终渗透压和pH值，得卵裂液的原液即培养液；本实施例中，经检测，该溶液渗透压为280mOsm/Kg，符合要求；溶液为淡红，其pH值为7.10低于标准值。用滴管滴加氢氧化钠溶液至pH值在7.20～7.40，再经检测pH值为7.40；
[0042] (2)培养液的处理：
[0043] a、除菌，将上述步骤所得培养液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；
[0044] b、分装及冷存，在无菌环境下对过滤后的培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内，在2～8℃条件下保存，得本发明的体外受精液即成品；将上述除菌后的培养液10L装入保存瓶中，
装瓶时可采用30ml/瓶或50ml/瓶或100ml/瓶的标准进行装瓶；本实例中采用100ml/瓶标准进行装瓶，上述10L培养液装入100保存瓶中，装瓶后用封口机旋盖后套上
封口膜，再用塑封机封紧，放置于冰箱或冷库内，在
温度为2～8℃条件下进行保存。
[0045] c、取分装好的体外受精液进行检测，检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、细菌内毒素检测、以及体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该体外受精液是否合格。
[0046] 本发明的体外受精液的各检测结果参见表2(表2中的“配方1”对应于表1中“配方1”)
[0047] 表2：精子洗涤液检测结果
[0048]
[0049] 本发明的体外受精液的具体检测方法、过程及结果如下：
[0050] (一)、pH值检测
[0051] 随机
抽取上述成品体外受精液一定量(一般为50ml)用pH计进行检测，经三次随机抽取检测，分别得pH值为7.40、7.30、7.30记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，得pH值为7.35，处于7.20～7.40之间，合格。
[0052] (二)、渗透压检测
[0053] 随机取上述成品体外受精液10μL滴入渗透压仪(
露点渗透压仪)的
探头的
滤纸片上，将探头推入仪器等待检测值，并记录检测数值。同样方法检测三遍，分别得渗透压280mOsm/Kg、275mOsm/Kg、282mOsm/Kg取平均值得该体外受精液的渗透压为279mOsm/Kg，处于260～290mOsm/Kg范围内，合格。
[0054] (三)、细胞毒性检测
[0055] 按GB/T16886.5的规定进行细胞毒性检测，经检测该成品体外受精液的细胞毒性，计分为0.3分，小于1分，合格。
[0056] (四)、皮内刺激反应检测
[0057] 按GB/T16886.10的规定，经向20只成年鼠注射该体外受精液，20分钟后均无皮内刺激反应，合格。
[0058] (五)、致敏性检测
[0059] 按GB/T16886.10的规定，经向20只成年鼠注射该体外受精液，20分钟后均末见异常，无致敏性反应，合格。
[0060] (六)、无菌检测
[0061] 采用中国药典的无菌检测的
薄膜过滤法进行检测。将上述的体外受精液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜分别在温度为23～28℃的改良
马丁细菌培养基内和温度为30～35℃的硫
乙醇酸盐
真菌培养基内培养14天后，均无菌孢生长，合格。
[0062] (七)、热原检测
[0063] 按照中华人民共和国药典2010年版二部附录XI D规定方法进行检测。根据上述规定使用家兔进行试验，其试验结果如下：在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，该供试品的热原检查符合规定。
[0064] (八)、细菌内毒素检测
[0065] 采用中国药典细菌内毒素的检测方法中的鲎
试剂凝胶法进行检测，检测值小于1.0EU/mL判定为合格。阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品体外受精液的阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品体外受精液符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品体外受精液不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。按上述过程和要求对本发明成品进行检测，其检测置为0.75EU/mL，低于标准值，合格。
[0066] (九)、体外鼠胚试验
[0067] 1.超数排卵
[0068] 选择6～8周龄雌鼠多个，经
腹腔注射PMSG10IU/只；48h后经腹腔注射hCG10IU/只，注射hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。
[0069] 2.准备培养皿
[0070] 培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50μL大小的受精液微滴即培养微滴，表面
覆盖培养用油，在CO2
培养箱内预平衡4～18小时。
[0071] 3鼠胚采集
[0072] 合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。
[0073] 1-细胞胚胎收集：注射hCG后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状受精卵团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移、在体外受精液中清洗20分钟后，挑选出正常形态的受精胚胎150个，转移到培养微滴中，用于1-细胞鼠胚检测试验。
[0074] 4体外培养
[0075] 采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，每组鼠胚数为50个，置于已平衡的培养液中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。
[0076] 5试验结果
[0077] 1-细胞胚
胎体外分别培养96小时后记录囊胚数量。
[0078] 观察指标：囊胚形态观察。
[0079] 经上述试验，其阳性对照组中具有合格囊胚形态的胚胎数为15个，其阴性对照组中具有合格囊胚形态的胚胎数为45个。
[0080] 结论：1、阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；2、阴性对照组的囊胚形成率为90％，大于合格标准80％，产品合格。
[0081] (十)、精子活力试验
[0082] 采用上游法，取一个15毫升离心管，将1毫升精液(新鲜或解冻后)加到离心管内，将1ml体外受精液添加到离心管内，将离心管内的精液和体外受精液充分混合后，在200g离心5分钟。离心机停止旋转，用9英寸巴斯德吸管吸去上清液，注意不要把离心管下面的精子吸入，用5毫升移液管在离心管内加入1毫升的受精液，用同一个加了液体的移液管上下吸入离心管下面的精子，直到精子与液体完全混匀后盖紧离心管，再放入离心机离心5分钟(200g)，离心机停止旋转，用9英寸巴斯德吸管吸去上清液，注意不要把离心管下面的精子吸入。用1毫升移液管吸取1毫升的体外受精液慢慢地添加到离心管内。加入液体时，离心管的
角度保持在45度角左右，将离心管盖紧后将离心管倾斜放入100毫升烧杯中，再将烧杯放到无二氧化碳的培养箱内上游75分钟。上游结束后，用9英寸巴斯德吸管吸去上面约0.5毫升液体，这是上游后的精子悬浮液，将精子悬浮液放到另一个试管内。将先前准备的4孔培养皿从培养箱中拿出，添加10微升精子悬浮液到两个培养孔内，再将培养皿放回无二氧化碳的培养箱培养。用剩余的精子悬浮液用上述同样的方法做精子浓度和活力的检查。经过24小时培养后，直接在200倍的
显微镜放大倍数下检查精子活力，每个孔计数至少100个精子(活动的和不运动的)，然后从两个孔所得数据获得平均数。
[0083] 经精子浓度检测得孔中的精子个数为105个，符合试验要求。在培养24小时后，经检测，保持活子的精子数为99个，没有活力的精子数为11个，保持活力的精子比率为90％，远远超过合格标准75％，产品合格。
[0084] 实施例二
[0085] 本发明的体外受精液是通过多种溶质溶于超纯净水中进行调配而成的培养液。所述各溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。该实施例中所采用基础液溶质和原液溶质与实施例一相同，其各溶质的含量参见表1的“配方2”一栏，该基础液溶质在培养液中的具体含量如下：氯化钠101.5mmol/L、氯化钾4.69mmol/L、硫酸镁0.20mmol/L、氯化钙2.04mmol/L、碳酸氢钠25.0mmol/L、丙酮酸钠0.33mmol/L、乳酸钠12.82mmol/L、牛磺酸
0.05mmol/L、柠檬酸钠0.0005mmol/L；该人血清白蛋白在培养液中的含量为10g/L。
[0086] 该培养液中的杀菌剂为庆大霉素，其在溶液中的含量为10mg/L。
[0087] 该培养液中没有添加指示剂，溶液透明、清澈。
[0088] 该培养液的pH值为7.3，渗透压为275mOsm/Kg。
[0089] 该实施例中的体外受精液的制备方法与实施例一基本相同，其区别在于在培养液的配制步骤c中没有加入指示剂，其成品溶液透明、清澈。其成品检测过程同实施例一，其检测结果参见表2的“配方2”一栏，产品合格。
[0090] 实施例三
[0091] 本发明的体外受精液是通过多种溶质溶于超纯净水中进行调配而成的培养液。
