单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞
阅读：361发布：2020-12-21
专利汇可以提供单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了通过调节O2张 力 从而单性生殖激活人卵母细胞产生人类干细胞的方法，其包括在高O2 张力 下调节Ca2+和在低O2张力下使卵母细胞与丝 氨 酸－苏氨酸激酶 抑制剂 接触 ，从激活的卵母细胞分离内细胞团(ICMs)，和在高O2张力下培养分离的ICMs的细胞。而且，描述了在缺少非人动物产品的情况下从激活的卵母细胞产生干细胞的方法，包括用人饲养细胞/产品培养ICM/干细胞。也描述了通过公开的方法所产生的干细胞。，下面是单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞专利的具体信息内容。
1.产生人干细胞的方法，其包括：
a)单性生殖激活人卵母细胞，其中所述激活包括：i)在高O2张力下使所述卵母细 胞与离子载体接触，和ii)在低O2张力下使所述卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂 接触；
b)在低O2张力下培育步骤(a)所述的激活卵母细胞，直到胚泡形成；
c)将所述胚泡转移到饲养细胞层，并在高O2张力下培养所述转移胚泡；
d)将内细胞团(ICM)从步骤(c)所述胚泡的滋养外胚层机械地分离出来；和
e)在饲养细胞层上培养步骤(d)所述的ICM的细胞， 其中所述培养步骤(e)在高O2张力下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低O2张力通过在包含大约2％ O2到大约 5％ O2的O2浓度的气体混合物环境中孵育而维持。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述气体混合物环境进一步包括大约5％ CO2 和大约90％ N2到93％ N2。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述高O2张力通过在包含大约5％ CO2和大 约20％ O2的气体混合物环境中孵育而维持。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子载体选自离子霉素和A23187。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂选自星形孢菌 素、2-氨基嘌呤、鞘氨醇、和6-二甲氨基嘌呤(DMAP)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述激活、分离和培养步骤在的确定成分培养 基条件下进行，用于治疗应用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养基包括人脐带血清。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包括大约10％的人脐带血清。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述饲养细胞层包括人成纤维细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述成纤维细胞是出生后人皮肤成纤维细 胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述饲养细胞被抗生素失活。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗生素是丝裂霉素C。
14.分离的干细胞，其由权利要求1所述的方法制备。
15.激活人中期II卵母细胞的方法，其包括：
a)在体外受精(IVF)培养基中孵育人中期II卵母细胞；
b)在包含离子载体的IVF培养基中孵育步骤(a)所述的细胞；
c)在包含丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂的IVF培养基中孵育步骤(b)所述的细胞；和
d)在新鲜的IVF培养基中孵育步骤(c)所述的细胞，直到胚泡形成，
其中所述孵育步骤(a)和(b)在高O2张力下进行，并且其中从步骤(d)所述的 胚泡得到的内细胞团(ICM)产生可培养的干细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中用于孵育步骤(c)和(d)的所述O2张力 通过在包含大约2％ O2到5％ O2的O2浓度的气体混合物环境中培育所述细胞而维持。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述气体混合物环境进一步包括大约5％ CO2和大约90％ N2到93％ N2。
18.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括用透明质酸酶孵育所述卵母细胞。
19.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(a)在大约37℃下进行大约2小 时。
20.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(b)在大约37℃下进行大约5分 钟。
21.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(c)在大约37℃下进行大约4小 时。
22.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(d)在大约37℃下进行大约24 小时。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述IVF培养基不含非人类产品。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述离子载体选自离子霉素和A23187。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述离子载体为离子霉素。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂选自星形孢 菌素、2-氨基嘌呤、鞘氨醇、和6-二甲氨基嘌呤(DMAP)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂是DMAP。
28.分离的卵母细胞，其由权利要求15所述的方法制备。
29.分离的内细胞团(ICM)，其从权利要求28所述的卵母细胞制备。
30.从冷藏卵母细胞或孤雌生殖体产生人干细胞的方法，其包括：
(a)将冷藏剂显微注射到所述卵母细胞或孤雌生殖体的细胞质中；
(b)冷冻所述卵母细胞或孤雌生殖体至低温，以便使所述卵母细胞或孤雌生殖体 进入休眠状态；
(c)在所述休眠状态下储存所述卵母细胞或孤雌生殖体；
(d)解冻所述卵母细胞或孤雌生殖体；
(e)单性生殖激活来自步骤(d)的所述卵母细胞，其包括：i)在高O2张力下使 所述卵母细胞与离子载体接触，和ii)在低O2张力下使所述卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸 激酶抑制剂接触；
(f)在低O2张力下培育步骤(d)所述的孤雌生殖体或步骤(e)所述的卵母细胞， 直到胚泡形成；
(g)将内细胞团(ICM)从所述胚泡的滋养外胚层分离出来；和
(h)在饲养细胞层或胞外基质(ECM)基底上培养步骤(g)所述的ICM的细胞，
其中所述培养步骤(g)在高O2张力下进行。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述饲养细胞来自人类来源。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂：(i)包括糖，(ii)对于哺乳动 物细胞膜是实质上非渗透的，和(iii)维持所述卵母细胞或孤雌生殖体的存活性，以便 其能够在短暂的休眠状态下被储存并且被实质上恢复到激活状态。
33.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括使所述卵母细胞或孤雌生殖体与细 胞外冷藏剂接触，所述冷藏剂对于哺乳动物细胞膜是实质上非渗透的，并且稳定所述卵 母细胞或孤雌生殖体的细胞膜。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂包括至少一种糖，所述糖选自： 蔗糖、海藻糖、果糖、葡聚糖和蜜三糖。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂包括至少一种糖，所述糖选自： 葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、乳糖、麦芽糖、和水苏四糖。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述卵母细胞或孤雌生殖体被投入冷冻。
37.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂包括低Na+/高K+培养基。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂包括有机缓冲剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述有机缓冲剂是HEPES。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述冷藏剂包括抑制凋亡蛋白质的部分。
41.根据权利要求30所述的方法，其中所述部分为胱天蛋白酶。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述卵母细胞或孤雌生殖体以每分钟大约0.3 到6℃之间的速率被冷却到至少大约-50℃的最终温度。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述卵母细胞或孤雌生殖体以每分钟大约0.3 到3℃之间的速率被冷却到大约-50℃和-10℃之间的最终温度。
44.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(b)包括干燥所述卵母细胞或孤雌 生殖体到足以允许干燥储存的水平。
45.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(b)包括冷冻干燥所述卵母细胞或 孤雌生殖体。
46.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(b)包括真空干燥或对流干燥所述 卵母细胞或孤雌生殖体。
47.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(d)包括再水合所述卵母细胞或孤 雌生殖体。
48.自体干细胞，其中所述干细胞从来自人类供体的单性生殖激活的卵母细胞得到。
49.如权利要求48所述的干细胞，其中所述干细胞拥有与所述供体卵母细胞实质上 相同的单元型。
50.如权利要求48所述的干细胞，其中所述细胞：(i)会在体外培养中增殖达一年 以上，(ii)在整个所述培养中保持分化成内胚层、中胚层、和外胚层组织产物的潜能， 和(iii)当在成纤维细胞饲养层上被培养时，其分化被抑制。
51.如权利要求50所述的干细胞，其中所述细胞保持这样的核型，其中染色体是整 倍体并且在延长的培养期间不改变。
52.如权利要求48所述的干细胞，其中所述干细胞与所述供体卵母细胞在遗传上实 质上相同。
53.如权利要求52所述的干细胞，其中所述干细胞具有46，XX核型。
54.如权利要求52所述的干细胞，其中根据单核苷酸多态性(SNP)标记，所述干 细胞被鉴定为所述供体的全同胞。
55.如权利要求52所述的干细胞，其中所述干细胞与所述供体是组织相容的。
56.如权利要求48所述的干细胞，其中所述干细胞根据所述供体的来源被基因组印 记化。
57.如权利要求56所述的干细胞，其中所述干细胞表达一种或多种基因，所述基因 选自：SNRPN、Peg1_2、Peg1_A、XIST、和H19。
58.如权利要求48所述的干细胞，其中所述干细胞表达一种或多种标志物，所述标 志物选自：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、和OCT-4。
59.如权利要求48所述的干细胞，其中所述干细胞包括同型线粒体DNA(mtDNA)。
60.分化细胞，其得自从来自人类供体的单性生殖激活卵母细胞得到的干细胞。
61.如权利要求60所述的分化细胞，其中所述分化细胞与所述卵母细胞供体是组织 相容的。
62.如权利要求60所述的分化细胞，其中所述分化细胞选自：神经元细胞、心脏细 胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪 细胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体 细胞、肥大细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞。
63.如权利要求62所述的分化细胞，其中所述细胞表达神经丝蛋白68、NCAM、βIII- 微管蛋白、GFAP、或它们的组合。
64.如权利要求62所述的分化细胞，其中所述细胞表达α-肌动蛋白、结蛋白、或它 们的组合。
65.如权利要求62所述的分化细胞，其中所述细胞表达PECAM-1、VE-钙粘蛋白、 或它们的组合。
66.如权利要求62所述的分化细胞，其中所述细胞表达α-甲胎蛋白。
67.如权利要求62所述的分化细胞，其中所述细胞包括同型线粒体DNA(mtDNA)。
68.细胞系，其包括自体干细胞，其中所述干细胞从来自人类供体的单性生殖激活卵 母细胞得到。
69.如权利要求68所述的细胞系，其中每一细胞具有46，XX核型。
70.如权利要求68所述的细胞系，其中每一细胞与所述供体卵母细胞在遗传上实质 上相同。
71.如权利要求68所述的细胞系，其中每一细胞根据所述供体来源被遗传印记化。
72.如权利要求68所述的细胞系，其中所述细胞不表达SSEA-1。
73.如权利要求68所述的细胞系，其中所述细胞产生外胚层、中胚层、和内胚层胚 系。
74.如权利要求68所述的细胞系，其中每一单独细胞系的细胞包括同型线粒体DNA (mtDNA)。
75.干细胞库，其包括自体干细胞，其中所述干细胞从来自一个或多个人类供体的单 性生殖激活卵母细胞得到。
76.如权利要求75所述的库，其中根据单核苷酸多态性(SNP)标记，每一库成员 被鉴定为全同胞、半同胞、或不相关。
77.如权利要求75所述的库，其中所述卵母细胞供体与所述库的成员是组织相容的。
78.如权利要求75所述的库，其中所述库的成员根据所述卵母细胞供体来源被基因 组印记化。
79.如权利要求75所述的库，其中每一成员对于人群中存在的至少一个MHC等位 基因是纯合的。
80.如权利要求75所述的库，其中相比于所述库中的其它成员，每一成员对于MHC 等位基因的不同组合是纯合的。
81.如权利要求75所述的库，其中每一成员对于一种或多种HLAI类基因和HLAII 类基因是至少纯合的。
82.如权利要求81所述的库，其中所述HLAI类基因选自：HLAA*，HLAB*，HLA 和Cw*单元型组合。
83.如权利要求81所述的库，其中所述HLAII类基因选自：HLADRB1*，DRB3*， DRB4*，DRB5*，DQA1*和DQB1*单元型组合。
84.如权利要求75所述的库，其中每一成员：(i)会在体外培养中增殖一年以上，(ii) 在整个培养中保持分化成内胚层、中胚层和外胚层组织中的一种产物或全部产物的潜 能，和(iii)当在成纤维细胞饲养层上培养时，其分化被抑制。
85.如权利要求84所述的库，其中每一成员保持这样的核型，其中染色体是整倍体 并且在延长的培养期间不改变。
86.如权利要求75所述的库，其中每一成员可以分化成外胚层、中胚层和内胚层胚 系细胞。
87.细胞库，其包括冷藏的孤雌生殖体，其中所述孤雌生殖体从来自一个或多个人类 供体的单性生殖激活卵母细胞得到。
88.如权利要求87所述的细胞库，其中所述孤雌生殖体在低O2张力下被培育，直到 胚泡形成。
89.细胞库，其包括冷藏的自体干细胞，其中所述干细胞从来自一个或多个人类供体 的单性生殖激活卵母细胞得到。
90.治疗需要所述治疗的对象的方法，其包括施用包含分化细胞的细胞组分，其中所 述分化细胞得自从来自人供体的单性生殖激活卵母细胞得到的干细胞。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述分化细胞选自：神经元细胞、心脏细胞、 平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、 基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体细胞、 肥大细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述对象表现的疾病选自：帕金森病、亨廷 顿病、阿尔茨海默病、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉萎缩症、囊性纤 维化、肝病、糖尿病、心脏病、黄斑变性、软骨缺陷或损伤、烧伤、足部溃疡、脉管 疾病、尿路疾病、AIDS、和癌症。
93.产生克隆人胚胎干细胞系的方法，其包括：
a)从以前受精的人卵母细胞中去除第一前核；
b)将第二前核转移到步骤(a)所述的去核卵母细胞中，其中所述第二前核来自：
i)供体卵母细胞或来自供体母亲的卵母细胞，或
ii)单性生殖激活的卵母细胞，其中所述卵母细胞的前核在激活之前已经被供 体体细胞的细胞核所取代；
和
c)培育步骤(b)得到的卵母细胞直到胚泡形成，
其中所述胚泡的内细胞团包含所述胚胎干细胞。
技术领域
【0001】本发明一般性地涉及胚胎干细胞，更具体地，涉及使用单性生殖活化的卵母 细胞(parthenogenically activated oocytes)获得人类胚胎干细胞的方法。
背景技术
【0002】人类胚胎干细胞(ES)是能够分化成大量细胞类型的多能细胞。当胚胎干 细胞被注入免疫缺陷小鼠中时，胚胎干细胞形成分化瘤(畸胎瘤)。但是，在体外被 诱导形成胚胎体(EBs)的胚胎干细胞提供了胚胎干细胞系来源，在一定的生长条件 下，该胚胎干细胞系可以分化成多种细胞类型，所述细胞类型是几种组织的特征。例 如，在神经生长因子和视黄酸存在的情况下，ES细胞分化成神经元。
【0003】对于治疗移植以及对于药物试验和开发而言，人类ES细胞和它们的分化后 代是正常人类细胞的重要来源。这两个目标所需要的都是提供足够的细胞，该细胞被 分化成适合患者需求或适当的药理学试验的组织类型。与此相关的是，需要从胚胎干 细胞产生分化细胞的有效和可靠的方法。
【0004】目前，人类胚胎干细胞(hES)来自三个来源：在不育治疗后剩余的和捐赠 用于研究的胚泡，从捐赠配子(卵母细胞和精子)产生的胚泡，和核移植(nuclear transfer(NT))的产物。尸体胎儿组织是人类胚胎生殖干细胞(hEG)的唯一来源。 hES和hEG细胞提供值得注意的科学可能性和治疗可能性，包括产生更加特化的细胞 或组织的潜能。然而，对于hES和hEG细胞来源的伦理关注，和使用NT进行研究会导 致使用NT产生人类的担心，已经引起大量的公众讨论和争辩。
【0005】哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化(单性生殖激活，parthenogenic activation) 可以被用作通过精子/NT受精的替代方案，以制备卵母细胞用于胚胎干细胞产生。单 性生殖活化是在不存在来自雄性配子的任何贡献的情况下，从雌性配子产生胚细胞， 最终发育为成体或不发育为成体。
【0006】哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化可以以多种方式被诱发。使用电刺激诱导 活化特别有意义，因为电融合是目前核移植程序的一部分。已经报道，应用用于胚细 胞-卵母细胞膜融合的电融合仪器，通过电刺激进行体外单性生殖活化。
【0007】小鼠卵母细胞通过暴露于无Ca+2-Mg+2培养基、包括透明质酸酶的培养基、 暴露于乙醇、Ca+2离子载体或螯合剂、蛋白质合成抑制剂，以及电刺激被活化。这些 过程引起小鼠卵母细胞的高速率的单性生殖活化和发育，但不活化小牛卵母细胞和/ 或引起小牛卵母细胞的较低发育速率。而且，小鼠卵母细胞的受精和单性生殖活化还 取决于排卵后老化。
【0008】已经报道，牛卵母细胞通过乙醇、电刺激、暴露于室温、以及电刺激和用放 线酮进行蛋白质抑制的组合而活化。虽然这些过程被认为提高了细胞内Ca+2，但当卵 母细胞老化达28小时以上时，它们是最成功的。
发明概述
【0010】本发明基于创造性地发现：某些条件对于单性生殖活化人类卵母细胞而言是 最佳的。
【0011】在一个实施方式中，提供了产生人类干细胞的方法，其包括单性生殖地激活 卵母细胞，其中激活包括：在高氧(O2)张力下使卵母细胞与离子载体接触，和在低 氧张力(氧气张力，O2tension)下使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触；在 低氧张力下培养激活的卵母细胞，直到胚泡形成；转移胚泡到饲养细胞层；和在高氧 张力下培养转移的胚泡；从胚泡的滋养外胚层机械分离内细胞团(inner cell mass (ICM))；以及在饲养细胞层上培养ICM的细胞，其中培养ICM细胞在高氧张力下 进行。优选地，卵母细胞是人卵母细胞。
【0012】在一个相关方面，低氧张力通过在包含大约2％ O2到大约5％ O2的O2浓度的 气体混合物环境中培育而保持，其中气体混合物环境进一步包括大约5％ CO2和大约 90％氮气(N2)至93％ N2。
【0013】在另一个实施方式中，提供了激活人分裂中期II卵母细胞的方法，其包括： 在高氧气张力下在体外受精(IVF)培养基中培育人类分裂中期II卵母细胞；在高氧 气张力下通过在包含离子载体的IVF培养基中培育细胞而激活；和随后在低氧气张力 下，在包含丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂(STKI)的IVF培养基中培育细胞；和在低氧 气张力下，培育STKI处理细胞直到胚泡形成，其中从胚泡得到的内细胞团(ICM)产 生可培养的干细胞。高氧气张力可以通过在含有大约5％CO2、大约20％O2和大约75％ N2的气体混合物环境中培育细胞而保持。
【0014】在一个相关的方面，用于激活后的培育步骤的氧张力通过在气体混合物环境 中培育细胞来保持，所述气体混合物环境包括大约2％ O2到5％ O2的O2浓度，其中气 体混合物环境进一步包括大约5％ CO2和大约90％ N2到大约93％ N2。
【0015】在另一个相关方面，IVF培养基基本上不含非人类产品。
【0016】在又一相关方面，提供了通过本发明方法制备的分离卵母细胞，包括从这种 卵母细胞制备的分离内细胞团(ICM)和从其中分离的相应的干细胞。
【0017】在另一个实施方式中，提供了产生胚胎发生干细胞(embryogenic stem cells) 和它们的分化后代的哺乳动物卵母细胞的人类单性生殖激活。这种细胞和后代与卵母 细胞供体实质上同基因，因此允许相对于卵母细胞供体的细胞自体移植，以及典型地 避免了卵母细胞供体的免疫系统的排斥。
【0018】在一个相关方面，提供了来自单性生殖激活卵母细胞的hES细胞系的细胞库。
【0019】在一个实施方式中，提供了从冷藏卵母细胞或孤雌生殖体(parthenote)产 生人类干细胞的方法，其包括：将冷藏剂显微注射到卵母细胞或孤雌生殖体的细胞质 中；冷冻卵母细胞或孤雌生殖体到使其进入休眠状态的低温温度；在休眠状态中存储 卵母细胞或孤雌生殖体；解冻卵母细胞或孤雌生殖体；单性生殖地激活卵母细胞，其 中激活包括在高氧气张力下使卵母细胞与离子载体接触和在低氧气张力下使卵母细 胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触；在低氧气张力下培养孤雌生殖体和激活的卵母 细胞直到胚泡形成；从胚泡的滋养外胚层分离内细胞团(ICM)；以及在饲养细胞层 上培养ICM细胞，其中培养在高氧气张力下进行。
【0020】在另一个实施方式中，提供了来自人类供体的单性生殖激活卵母细胞的自体 干细胞。在一方面，干细胞具有与供体细胞实质上相同的单元型(haplotype)。在一 个相关方面，干细胞与供体细胞在遗传上实质上相同。
【0021】一方面，根据单核苷酸多态性(SNP)标记，干细胞被确定为供体的全同胞 (full sibling)。在另一方面，根据供体来源，干细胞被基因组印记化(genomically imprinted)。
【0022】在一个实施方式中，公开了来自从人类供体的单性生殖激活卵母细胞取得的 干细胞的分化细胞。在一个相关方面，分化细胞包括但不限于：神经细胞、心脏细胞、 平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细 胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体 细胞、肥大细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞。在另一相关方面，分化细胞表达一个 或多个标志物，包括但不限于：神经丝68(neurofiliment 68)、NCAM(神经细胞黏 附分子)、βIII-微管蛋白、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)、α-肌动蛋白、结蛋白、 PECAM-1(血小板内皮细胞黏附分子-1)、VE-钙粘蛋白、α-甲胎蛋白、或它们的组合。
【0023】在另一实施方式中，公开了包括自体干细胞的细胞系，其中干细胞来自人类 供体的单性生殖激活的卵母细胞。在一方面，细胞不表达SSEA-1。在另一方面，细 胞系中的细胞产生外胚层、中胚层、和内胚层胚系(germ line)。
【0024】在一个实施方式中，公开了细胞库，其包括冷藏的孤雌生殖体，其中孤雌生 殖体从来自一个或多个人类供体的单性生殖激活的卵母细胞得到。在一个相关方面， 孤雌生殖体在低O2张力下被培养直到胚泡形成。
【0025】在一个实施方式中，公开了细胞库，其包括冷藏的自体干细胞，其中干细胞 是从来自一个或多个人类供体的单性生殖激活的卵母细胞得到的。
【0026】在另一个实施方式中，提供了治疗需要所述方法的对象的方法，包括施用包 含分化细胞的细胞组分，其中分化细胞从得自人类供体单性生殖激活卵母细胞的干细 胞得到。在一方面，分化细胞选自：神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细胞、横纹肌细 胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细 胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体细胞、肥大细胞、中胚 层细胞、和内胚层细胞。
【0027】在一个相关方面，对象表现出的疾病选自：帕金森病，亨廷顿病，阿尔茨海 默病，ALS(肌萎缩侧索硬化症)，脊髓缺陷或损伤，多发性硬化，肌肉萎缩症，囊 性纤维化，肝病，糖尿病，心脏病，视网膜疾病(例如黄斑变性和色素性视网膜炎)， 软骨缺陷或损伤，烧伤，足部溃疡，脉管疾病，尿路疾病，AIDS(获得性免疫缺陷 综合症)，和癌症。
【0028】在一个实施方式中，公开了产生克隆人类胚胎干细胞的方法，包括：从前面 受精的人类卵母细胞中去除第一前核；将第二前核转移到去核卵母细胞中，其中第二 前核来自供体卵母细胞或供体母亲的卵母细胞、或单性生殖激活的卵母细胞，其中卵 母细胞的前核在激活之前已经被供体体细胞的细胞核所取代；和培养得到的卵母细胞 直到胚泡形成，其中来自胚泡的内细胞团包含胚胎干细胞。
【0029】在下面更加详细地描述根据本发明的示范性方法和组分。
附图简述
【0030】图1A显示单性生殖来源的hES细胞的碱性磷酸酶表面标志物(surface marker) 表达的显微图。
【0031】图1B表示表面标志物Oct4的表达显微图。
【0032】图1C表示表面标志物SSEA-1的表达显微图。
【0033】图1D表示表面标志物SSEA-3的表达显微图。
【0034】图1E表示表面标志物SSEA-4的表达显微图。
【0035】图1F表示表面标志物TRA-1-60的表达显微图。
【0036】图1G表示表面标志物TRA-1-81的表达显微图。
【0037】图2A表示单性生殖来源的hES细胞的端粒酶活性的分析。应用500、1000 和10000(单位)提取物进行分析。ΔH-热处理测试提取物(阴性对照)；阳性对照 -端粒酶阳性细胞；CHAPS-裂解缓冲液；TSR8-对照模板。
【0038】图2B显示来自培育9天的单性生殖来源的hES细胞的拟胚体(embryoid body)形成的显微图。
【0039】图2C显示来自培育10天的单性生殖来源的hES细胞的拟胚体形成的显微 图。
【0040】图2D示例单性生殖来源的hES细胞的核型。
【0041】图2E显示单性生殖来源的hES细胞的DNA指纹分析的结果。1-来自卵母 细胞供体的血液的DNA；2-来自从同一供体得到的单性生殖hES细胞的DNA；3-来 自人饲养成纤维细胞的DNA。
【0042】图3显示表征与基因组印记相关的基因表达的RNA印迹。DNA探针： SNRPN，Peg1_2，Peg1_A，H19，和GAPDH(作为内部对照)。NSF，新生儿皮肤 成纤维细胞；Hes，来自受精的卵母细胞的人类胚胎干细胞系；1，phESC-1；2，phESC-3， 3，phESC-4，4，phESC-5；5，phESC-6；6，phESC-7。NSF RT-、hES RT-、1RT- 是阴性对照。
【0043】图4显示phESC分化为全部三个胚层的产生物。外胚层分化通过对神经元 特异标志物68(A)，NCAM(B)，βIII-微管蛋白(C)和神经胶质细胞标志物GFAP (D、M)的阳性免疫细胞化学染色表示。对于中胚层标志物：肌肉特异性α肌动蛋 白(G)和结蛋白(J)，内皮标志物PECAM-1(E)和VE-钙粘蛋白(F)，分化细胞 是阳性的。内胚层分化通过对α-甲胎蛋白(H，L)的阳性染色表示。PhESC产生有 色的上皮样细胞(I，K)。放大倍数(I)×100；(A-H，J-M)，×400。
【0044】图5显示phESC系针对特定标志物的特征。在人类饲养层细胞上phESC的 未分化集落(A-F)，对SSEA-1的阴性染色(G-L)，细胞表面标志物SSEA-3(M-R)、 SSEA-4(S-X)的表达。放大倍数(A)到(E)×100；(F)×200；(G)到(X)×400。 在饲养细胞(A-F)，OCT-4(G-L)，TRA-1-60(K-R)和TRA-1-81(S-X)上phESC 集落的碱性磷酸酶阳性染色。放大倍数(A，B，O，R)×100；(C-F，M，S，X) ×200；(G-L，N，P，Q，T-W)×400。
【0045】图6证实通过与阳性对照细胞比较，phESC细胞具有高水平的端粒酶活性： “+”-来自500个细胞的提取物；“-”热处理的细胞提取物，具有未活化的端粒酶； “对照+”端粒酶阳性细胞提取物(用TRAPEZE试剂盒)；“B”-CHAPS裂解缓冲 液，引物二聚体/PCR污染物对照；TSR8-端粒酶定量对照模板(0.1和0.2摩尔(amole) /μl)；“M”-标记物，DNA梯(DNA分子量标准，DNA ladder)。
【0046】图7显示phESC系的G-带核型分型。phESC-1(A)、phESC-3(B)、phESC-4(C)、 phESC-5(D)和phESC-6(E)系具有正常的46，xx核型。PhESC-7系具有47，XXX核 型(F)。
发明详述
【0047】在描述本组分、方法和培养方法学之前，应该理解，本发明不限于所述的具 体组分、方法、和试验条件，因为这样的组分、方法和条件可能变化。也应该理解， 本文所使用的术语仅仅为描述具体实施方式的目的，并且不意图于是限制性的，因为 本发明的范围仅仅限定在所附的权利要求书中。
【0048】如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个或一种(a)”， “一个或一种(an)”，和“该(the)”包括多数指代物，除非上下文清楚地表明。 因此，例如，“该方法”包括一种或多种方法，和/或本文所描述类型的步骤，这对 于本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将是显而易见的。
【0049】“分化”指代发生在细胞中的变化，这种变化使那些细胞呈现某些特化的功 能以及失去变化成某些其它特化的功能单元的能力。能够分化的细胞可以是全能的、 多能的(pluripotent)、或多能(multipotent)细胞中的任意。分化相对于成熟的成体 细胞可能是部分的或完全的。
【0050】单雌生殖(gynogenesis)指，在细胞活化后导致产生包含可辨别的滋养外胚 层和内细胞团的胚胎，所述细胞例如卵母细胞或其它胚胎细胞类型，包括全部雌性来 源的哺乳动物DNA，优选人类雌性来源，例如人类或非人类灵长动物卵母细胞DNA。 这种雌性哺乳动物DNA可以通过例如，至少一个DNA序列的插入、缺失或取代被 遗传修饰，或可以未被修饰。例如，DNA可以通过插入或缺失期望的编码序列，或 促进或抑制胚胎发生的序列被修饰。一般地，这样的胚胎将通过体外激活包含全部雌 性来源DNA的卵母细胞而获得。单雌生殖包含在下面所定义的单性生殖中。它还包 括其中精子的DNA没有贡献于被激活卵母细胞中的DNA的激活方法。
【0051】在一个相关的方面，卵母细胞从制备用于IVF的超排卵(superovulating)对 象获得。用于IVF中的“超排卵”技术，如用激素处理雌性对象，被设计成促进卵巢 产生几个卵(卵母细胞)，而不是如在自然周期中通常的一个卵。
【0052】促进卵产生所需要的药物治疗，包括但不限于下列：醋酸亮丙瑞林(Lupron) (促性腺素释放激素激动剂)、Orgalutran、Antagon或西曲肽(Cetrotide)(促性腺素 释放激素激动剂)、Follistim、Bravelle或果纳芬(Gonal-F)(FSH，促卵泡激素)、 Repronex(FSH和LH的组合，促黄体激素)、和波热尼乐(Pregnyl)或Novarel(hCG， 人绒毛膜促性腺素)。
【0053】在一个相关方面，在经阴道超声指引下可以进行卵的收集。为完成这一过程， 应用超声将针通过阴道壁插入(例如，在IV镇静下)到卵巢中以查找每一个卵泡。 卵泡液被抽到试管中以取得卵。
【0054】通过“单性生殖(孤雌生殖，Parthenogenesis)”(“单性生殖激活 (parthenogenically activated)”和“孤雌生殖激活(parthenogenetically activated)” 被交换使用)过程，卵母细胞的激活在缺少精子穿入下发生，并且其指代包含滋养外 胚层和内细胞团的早期阶段胚胎的发育，所述胚胎通过激活包含全部雌性来源DNA 的卵母细胞或胚胎细胞例如卵裂球而获得。在一个相关方面，“孤雌生殖体”指代通 过这种激活得到的最终细胞。在另一相关方面，“胚泡”指代分裂阶段的受精或激活 的卵母细胞，其包含由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的中空细胞球。在又一 相关方面，“胚泡形成”指代在卵母细胞受精或激活之后的过程，其中随后卵母细胞 在培养基中被培养一段时间，所述时间能够使其发育成由外滋养层细胞和ICM组成 的中空细胞球(例如，5到6天)。
【0055】在一个实施方式中，公开了通过单性生殖激活的卵母细胞产生克隆人类胚胎 干细胞系的方法。虽然单性生殖在自然界中不是罕见的繁殖形式，但不知道哺乳动物 能够进行这种繁殖形式。然而，从雌性近交系小鼠LT/Sv的卵母细胞中，可以发现比 例为10％的自发单性生殖(Ozil和Huneau，Development(2001)128：917-928；Vrana等， Proc Natl Acad Sci USA(2003)100(Suppl 1)：11911-11916；Berkowitz and Goldstein， New Eng J Med(1990)335(23)；1740-1748)。有胎盘哺乳动物的卵母细胞能够被诱导 进行体外单性生殖；但是，胚胎发育是不成功的。
【0056】单性生殖激活哺乳动物卵母细胞和将激活的卵母细胞转移进入代理母亲之 后，具有有限的胚胎存活：小鼠为十天；羊为21天；猪为29天；兔为11.5天 (Kure-bayashi等，Theriogenology(2000)53：1105-1119；Hagemann等，Mol Repord dev (1998)50：154-162；Surani and Barton，Science(1983)222：1034-1036)。这种发育停滞的 原因可能是由于遗传印记(genetic imprinting)。已经显示，母亲与父亲的基因组是 表观遗传上不同的(epigentically different)并且这两组对于成功的胚胎发育都是必需 的(Surani，Cell(1998)93：309-312；Sasaki et al.，(1992)6：1843-1856)。在孤雌生殖体中， 所有的遗传物质应该是母亲来源，因此应当缺少父亲印记。父亲印记被认为负责胚外 (extra-embryo)组织发育，因此，在去核卵母细胞受精之后滋养组织发育(Stevens， Nature(1978)276：266-276)。因此，在动物中，去核的受精卵对于核转移和随后的单 性生殖激活可能是有用的。
【0057】哺乳动物的孤雌生殖体仅仅经历有限的发育，胚胎最终死亡。在食蟹猴 (Macac fascicularis)中，体外单性生殖激活之后的中期II阶段卵母细胞中的仅仅14％ 在培养8天之后发育到胚泡阶段(Monk，Genes Dev(1988)2：921-925)。相似地，核 转移之后被体外单性生殖激活的人卵母细胞中的12％发育成胚泡状态(Monk，1998)。 在这二种情况中，都产生一个干细胞系。
【0058】在LT/Sv近交系小鼠的未交配雌性中，以自发激活孤雌生殖体形成的胚胎在 几天内死亡。当从包含这些胚胎的内细胞团(ICM)的细胞进行核转移到受精的去核 的C57BL/6j小鼠卵母细胞中时，得到了具有LT/Sv基因组的克隆小鼠(Kaufman et al.， Nature(1977)265：53-55)。因此，受精卵母细胞的使用允许孤雌生殖体的足月发育。 在一方面，受精的去核人卵母细胞能够被用于支持包含供体细胞核的单性生殖胚胎的 发育，直到胚泡阶段。
【0059】在一个实施方式中，在单性生殖激活之后，供体卵母细胞或供体母亲的卵母 细胞的前核可以被转移到受精的人卵母细胞中，雌性和雄性前核已经从所述受精的人 卵母细胞取出。
【0060】在另一个实施方式中，公开了用于产生人类干细胞的二阶段过程，其包括： 将供体体细胞的细胞核转移到供体卵母细胞中，其中卵母细胞随后通过单性生殖激 活；和将激活卵母细胞的前核转移到受精卵母细胞中，其中雄性和雌性前核已经被取 出。
【0061】在另一个实施方式中，来自供体体细胞的细胞核可以被转移到受精的去核人 卵母细胞中，随后进行单性生殖激活。上述的三个实施方式通过下面的流程图被说明。
情况1
雌性患者→取出卵母细胞→单性生殖激活→取出前核→将前核加入到去核的受精卵 母细胞中
雄性患者→从患者母亲得到卵母细胞→单性生殖激活→取出前核→将前核加入到去 核的受精卵母细胞中
情况2
取得供体卵母细胞→取出前核→使用核转移，加入来自患者的体细胞的细胞核→单性 生殖激活→取出前核→将前核加入到去核的受精卵母细胞中
情况3
取得供体卵母细胞→受精→去除细胞核→加入患者的体细胞细胞核→单性生殖激活
【0062】“多能细胞”指代来自通过激活包含全部雌性或雄性来源DNA的细胞而产 生的胚胎的细胞，其可以在未分化状态下在体外保持长期、理论上为无限的时期，其 可以产生不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层、和内胚层。细胞的多能状态优选 地通过在合适条件下培养内细胞团或来自胚胎的内细胞团的细胞而保持，所述胚胎由 雄核发育或雌核发育方法产生，所述条件例如，通过在成纤维细胞饲养层或其它饲养 层或包含白血病抑制因子(LIF)的培养物上培养。这种培养细胞的多能状态可以通 过多种方法确认，例如，(i)确认表征多能细胞的标志物的表达；(ii)包含表达多 能细胞基因型的细胞的嵌合动物的产生；(iii)将细胞注入到动物例如SCID小鼠中， 在体内产生不同的分化细胞类型；以及(iv)在体外，观察到细胞分化(例如，当在 缺少饲养层或LIF时培养)为拟胚体和其它分化细胞类型。
【0063】“二倍体细胞”指代细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有全部雄性或雌性 来源的二倍DNA内容物。
【0064】“单倍体细胞”指代细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有单倍DNA内 容物，其中单倍DNA是全部雄性或雌性来源。
【0065】激活指代一种过程，其中例如——但不限于此，在减数分裂中期II中，受 精或未受精卵母细胞进行这样的过程：所述过程一般包括染色单体对的分离，第二极 体挤出，产生具有单倍数目染色体的卵母细胞，每一染色体具有一个染色单体。激活 包括这样的方法，通过该方法，包含全部雄性或雌性来源DNA的细胞被诱导发育成 具有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎，这对于产生多能细胞是有用的，但其本 身可能不能发育成存活的后代。例如，激活可以在下面的一种条件下进行：(i)不 引起第二极体挤出的条件；(ii)引起极体挤出但其中极体挤出被抑制的条件；或(iii) 抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。
【0066】“中期II’指代细胞发育的一个阶段，其中细胞的DNA内容物由单倍数目染 色体组成，每一染色体由二条染色单体表示。
【0067】在一个实施方式中，中期II卵母细胞在不同的O2张力气体环境下通过孵育 卵母细胞被激活。在一个相关方面，低O2张力气体环境由包含大约2％、3％、4％、 或5％的O2浓度的气体混合物产生。在另一相关方面，气体混合物包含大约5％ CO2。 进一步地，气体混合物包含大约90％ N2、91％ N2、或93％ N2。这种气体混合物区别 于含有5％ CO2的空气，其大约有约5％ CO2、20％O2、和75％ N2。
【0068】“O2张力”指代在流体中(例如，液体或气体)的氧气的分压(气体混合 物的单一成分施加的压力)。低张力是当氧分压(pO2)低时的情况，高张力是当氧 分压高时的情况。
【0069】“确定成分培养基条件”指代培养细胞的环境，其中详细描述了最佳成长所 需要的其成分的浓度。例如，取决于细胞的用途(例如，治疗应用)，从包含异种蛋 白质的条件中取出细胞是重要的；例如，培养条件是无动物条件或无非人动物蛋白质。 在一个相关方面。“体外受精(IVF)培养基”指代包含受精卵母细胞能够在其中或 其上成长的化学限定物质的营养系统。
【0070】“胞外基质(ECM)基底(Extracellular matrix substrate)”指代支撑最佳生 长的细胞下的表面。例如，这种ECM基底包括但不限于，Matrigel、层粘连蛋白、明 胶、和纤连蛋白基底。在一个相关方面，这样的基底可以包括胶原蛋白IV、巢蛋白， 肝素硫酸盐蛋白聚糖，包括不同的生长因子(例如，bFGF、表皮生长因子、胰岛素 样生长因子-1、血小板衍生生长因子、神经生长因子、和TGF-β-1)。
【0071】“胚胎(Embryo)”指代细胞激活产生的胚胎，所述细胞例如，卵母细胞 或包含所有雄性或雌性来源DNA的其它胚胎细胞，其可以任选地被修饰，其包括可 辨别的滋养外胚层和内细胞团，其不能产生存活的后代并且其中DNA为全部雄性或 雌性来源。内细胞团或其中包含的细胞，对于如前面所定义的多能细胞的产生是有用 的。
【0072】“内细胞团(ICM)”指代产生胎儿组织的胚胎内部部分。在本文中，这些 细胞被用于在体外提供多能细胞的持续来源。而且，ICM包括从雄核发育或雌核发 育得到的胚胎的内部部分，例如，包含所有雄性或雌性来源DNA的细胞激活后得到 的胚胎。这种DNA，例如，将是人DNA，例如，人类卵母细胞或精子的DNA，其 可以被遗传修饰或可以不被遗传修饰。
【0073】“滋养外胚层”指代产生胎盘组织的早期胚胎的另一部分，包括从雄核发育 或雌核发育得到的胚胎的组织，例如，包含所有雄性或雌性来源例如人类卵巢或精子 的DNA的细胞激活得到的胚胎。
【0074】“分化细胞”指代具有特定分化状态，例如，非胚胎状态的非胚胎细胞。三 种最早分化的细胞类型是内胚层、中胚层、和外胚层。
【0075】“实质上相同的”指针对特定特征的值相同，其如此相近以至于在测量差异 (例如，通过HLA分型、SNP分析、和类似方法)能力内基本上相同。
【0076】“组织相容的”指代生物体耐受外来组织移植的程度。
【0077】“基因组印记”指代这样的机制，通过该机制，基因组中的许多基因根据它 们的双亲来源被单等位基因地表达。
【0078】“同型异源性”，包括其语法上的变化，指代在细胞或个体中存在相同类型 的线粒体DNA(mtDNA)。
【0079】“异质性”，包括其语法的变化，指代在细胞或个体中存在一种以上类型的 线粒体DNA(mtDNA)的混合物。
【0080】“单亲的”指代一个或多个细胞或个体，另一细胞或个体从其中产生并且对 其保持次生性(subsidiary)。
【0081】“机械地分离”指代通过物理力量分离细胞集合体的过程。例如，这种过程 将排除可能含有非人物质的酶(或其它细胞分裂产物)的应用。
【0082】在天然的环境中，卵巢的未成熟卵母细胞(卵)经历成熟过程，其导致通过 减数分裂进展到减数分裂中期II。随后卵母细胞停滞在中期II。在中期II中，细胞的 DNA内容物由单倍数目的染色体组成，每个染色体由二个染色单体表示。
【0083】这样的卵母细胞可以通过冷藏被无限保存，例如通过用糖显微注射，但不限 于此。
【0084】在一个实施方式中，提供了从冷藏的卵母细胞或孤雌生殖体产生人类干细胞 的方法，包括：向卵母细胞或孤雌生殖体的细胞质中显微注射冷藏试剂，冷冻卵母细 胞或孤雌生殖体到低温温度使它进入休眠状态，在休眠状态下保存卵母细胞或孤雌生 殖体，解冻卵母细胞或孤雌生殖体，在高O2张力下在离子载体存在下单性生殖激活 卵母细胞，随后在低O2张力下使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触，培养激 活的卵母细胞或孤雌生殖体直到胚泡形成，从胚泡分离内细胞团(ICM)，和在人饲养 细胞层上培养ICM细胞，其中培养ICM细胞在高O2张力下进行。
【0085】在一方面，如所述取得的卵母细胞被转移到改良型、等张的IVF——其被胚 胎测试矿物油(Sigma)覆盖，或任何其它适合的培养基。如果期望，卵母细胞可以 用与计划进行显微注射的量浓度相同的细胞外糖孵育。例如，为注入0.1M糖，卵母 细胞可以在DMEM/F-12中用0.1M糖平衡。在一方面，冷藏剂包含比标准DMEM低 的Na+浓度(例如，低Na+培养基(media))。在一相关方面，冷藏剂包含比标准 DMEM更高的K+浓度(例如，高K+)。在另一相关方面，冷藏剂包含比标准DMEM 更低的Na+和更高的K+浓度(例如，低Na+低/高K+培养基)。在一方面，冷藏剂包 括有机缓冲剂，包括但不限于HEPES。在另一方面，冷藏剂包括抑制凋亡蛋白(例 如，胱天蛋白酶)的部分。
【0086】可选地，卵母细胞可以任选地与任何其它实质上不可渗透的溶质例如NaCl 平衡，以在显微注射之前降低它们的细胞体积。相对于在显微注射之前没有在高渗培 养基中孵育的卵母细胞，细胞体积的这种最初的降低可以导致较小最终体积的显微注 射卵母细胞。这种较小最终体积可以最小化卵母细胞膨胀引起的任何可能的负面影 响。用于制备显微注射的细胞的这种一般程序也可以用于其它细胞类型(例如，激活 的卵母细胞、hES细胞、和类似细胞)。
【0087】随后卵母细胞用冷藏剂显微注射。显微注射设备和程序在本领域被充分表征， 并且已知用于注射小分子到细胞中的显微注射设备可以在本发明中使用。在示范性显 微注射步骤中，卵母细胞可以在10psi压力下被显微注射30毫秒。另一个标准显微 注射技术的实例为由Nakayama和Yanagimachi(Nature Biotech.16：639-642，1998)描 述的方法。
【0088】在这个过程中有用的冷藏剂包括具有低温防护性质和一般不可渗透的任何化 学物质。具体地，冷藏剂可以包括单独的糖或糖与其它传统的冷藏剂混合在一起。碳 水化合物糖例如海藻糖、蔗糖、果糖、和蜜三糖，可以被显微注射到浓度少于或等于 大约1.0M，更优选地，少于或等于约0.4M。在一方面，浓度为0.05到0.20M之间， 包括0.05和0.20M。此外，细胞外糖或传统冷藏剂可以在存储之前被加入。如果细 胞在显微注射之前在高渗溶液中被孵育，在显微注射之后实质上不可渗透的溶质可以 允许保持在培养基中，或可以通过用含有更低浓度的这种溶质或不含这种溶质的培养 基洗涤细胞而从培养基中去除。
【0089】一些糖或多糖一般不透过细胞膜，因为它们太大以至于不能穿过细胞膜，它 们对用于冷藏目的具有优良的物理化学和生物学性质。虽然这些糖一般自身不渗透细 胞膜，但利用所描述的方法，这些一般非渗透性的糖可以被细胞内显微注射，产生有 利效果。
【0090】非渗透性糖——其对细胞具有稳定或保存作用，在本方法中特别用作冷藏剂 ——包括：蔗糖、海藻糖、果糖、葡聚糖和蜜三糖。在这些糖中，海藻糖——葡萄糖 的非还原二糖——已经显示了在低浓度下在稳定细胞结构方面的优异效应。细胞外糖 脂或糖蛋白的加入也可以稳定细胞膜。
【0091】在冷藏剂显微注射之后，细胞被制备用于存储。多种冷冻和/或干燥方法可 以被用于制备储存用细胞。具体地，本文描述三种方法：真空或风干、冷冻干燥、和 冷冻-解冻(冻-融)方案。干燥过程具有稳定的生物材料可以在环境温度下被运输和 储存的优点。
【0092】典型地，在投入储存用液氮之前，加载有1到2M DMSO的卵母细胞以非常 慢的冷却速率(0.3到0.5℃/分钟)被冷却到中间温度(-60℃到-80℃)。然后样品可 以在此温度下被保存。
【0093】随后悬浮材料可以在冷藏温度下被保存所希望的时间，例如，通过使小瓶留 在液氮中(LN2)。
【0094】真空或风干或冷冻干燥蛋白质的方案在本领域中被充分表征(Frank等 “Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals”BioPharm，October 1991，p.39；Shalaev等”Changes in the Physical State of Model Mixture during Freezing and Drying：Impact on Product Quality，”Cryobiol.33，14-26(1996))，并且这些方案 可以被用于制备使用描述的方法存储的细胞悬浮液。除风干之外，可以用来从细胞悬 浮液中去除水的其它对流干燥方法包括氮气或其它气体的对流。
【0095】对本发明方法有用的示范性蒸发真空干燥方案可以包括在12孔板上的孔中 各放置20μl并且在环境温度下真空干燥2小时。当然，可以使用其它的干燥方法， 包括干燥小瓶中的细胞。以这种方式制备的细胞可以被干燥保存，并且通过在DMEM 中或任何其它适合培养基中稀释而再水合。
【0096】使用冷冻干燥制备用于储存的细胞的本发明的方法由冷冻细胞悬浮液开始。 虽然本领域已知的冷冻方法可以被使用，但本文针对冷冻-解冻方法所描述的简单投 入冷冻(plunge freezing)方法也可以被用于冷冻干燥方案中的冷冻步骤。
【0097】冷冻之后，可以应用二阶段干燥过程。在第一阶段，升华作用能被加入以便 蒸发冷冻水。在样品中的纯晶体冰已经被升华之后，进行第二干燥。冷冻干燥的细胞 能够被保存并且以如上面针对真空干燥所述的相同方式被水合。随后存活细胞可以被 恢复。
【0098】细胞从冷冻或干燥状态恢复之后，任何外部的冷藏剂可以任选地从培养基中 去除。例如，可以通过加入具有较低浓度冷藏剂的相应培养基来稀释培养基。例如， 恢复细胞可以在含有比用于细胞储存的糖浓度低的糖的培养基中孵育大约五分钟。对 于这一孵育，培养基可以包含与用作冷藏剂的糖相同的糖；不同冷藏剂，例如半乳糖； 或任何其它实质上不可渗透的溶质。为了最小化由培养基渗透性降低而诱发的任何渗 透震扰，细胞外冷藏剂的浓度可以通过进行多次这种稀释步骤而缓慢地降低，每次稀 释使用更低浓度的冷藏剂。这些稀释步骤可以重复直到不存在细胞外冷藏剂或直到冷 藏剂的浓度或培养基的渗透性降低到所期望的水平。
【0099】单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和自体干细胞，可以以允许细胞应 将来需要而复苏的方式被存储或“库存(banked)”。单性生殖激活的卵母细胞和自 体干细胞的等分试样可以在任何时间被移出，成长为许多未分化细胞的培养物和随后 分化成特定的细胞类型或组织类型，并且随后可以被用于治疗疾病或替代对象中的功 能异常组织。因为细胞从供体单性生殖得到，所以细胞能够被保存，使得个体或近亲 能够长时期地得到细胞。
【0100】在一个实施方式中，提供了用于储存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、 和/或自体干细胞样品的细胞库。在另一个实施方式中，提供了用于施用这种细胞库 的方法。美国专利申请公开号20030215942在此引入全文作为参考，其提供了干细胞 库系统的实例。
【0101】使用如上面所描述的方法，单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或 自体干细胞样品的分离和体外繁殖以及它们的冷藏帮助建立可移植人干细胞“库”。 因为有可能储存更小的细胞等分试样，建库过程可以占据相对小得空间。因此，许多 个体的细胞可以以短期或长期基础、以相对少的费用被储存或“库存”。
【0102】在一个实施方式中，在加工和储存之前或之后，使一部分样品用于测试。
【0103】本发明还提供了纪录或指示(索引，indexing)单性生殖激活的卵母细胞、 胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品的方法，以便当需要查找样品时，它可以容易地 被找回。任何指示和检索系统(indexing and retrieval system)可以被用于实施此目的。 任何合适的存储系统类型可以被应用，以便能够贮存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、 ICM、和/或自体干细胞。样品可以被设计以储存单独的样品，或可以被设计以储存 数百、数千、甚至数百万的不同细胞样品。
【0104】单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品可以被指示， 以便可靠和准确地找回。例如，每一样品可以以字母数字编码、条形码、或任何其它 方法或它们的组合来标记。还可以有可得到的和可读的信息列表，其能够识别每一单 性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品和它们在库中的位置以 及能够识别库外的细胞样品的来源和/或类型。这种指示系统可以以本领域任何熟知 的方式操作，例如，手工地或非手工地操作，例如，可以应用计算机和常规软件。
【0105】在一个实施方式中，使用指示系统组织(organized)细胞样品，以便对于供 体的使用，无论什么时间需要，样品都将是可得到的。在其它实施方式中，细胞样品 可以被与起初供体相关的个体使用。一旦在被记录到指示系统中，细胞样品可以用于 匹配目的，例如，匹配程序将确定具有匹配类型信息的个体以及个体将具有被提供匹 配样品的选择。
【0106】储存库系统(storage banking system)可以包括用于储存多个记录的系统， 所述记录与多个个体和多个细胞样品有关。每条记录可包含类型信息，与细胞样品或 具体个体相关的基因型信息或表型信息。在一个实施方式中，系统将包括交叉-匹配 表(cross-match table)，其将样品类型与想接受样品的个体的类型相匹配。
【0107】在一个实施方式中，数据库系统储存了在库中的每一单性生殖激活的卵母细 胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品的信息。某些信息与每一样品关联储存。信 息可以与具体供体，例如，供体的身份和供体的医疗史相关。例如，每一样品可以是 HLA分型的并且HLA类型信息可以与每一样品关联储存。储存的信息还可以是可利 用信息。每一样品储存的信息是可搜索的，并且以样品可以被查找(定位)和立即提 供给客户这样的方式鉴定样品。
【0108】因此，本发明的实施方式使用基于计算机的系统，所述系统包含信息例如供 体、提交日期、提交细胞的类型、存在的细胞表面标志物类型、关于供体的遗传信息、 或其它相关的信息、以及例如保藏记录和储存样品的位置的储存细节、和其它有用的 信息。
【0109】术语“基于计算机的系统”指代硬件，软件，和任何用于储存、搜索和检索 关于储存细胞的信息的数据库。基于计算机的系统优选地包括上面所描述的储存介 质，和用于存取和操作数据的处理器。这种实施方式的基于计算机系统的硬件包括中 央处理单元(CPU)和数据库。技术人员可以容易地知道，目前可用的任何一种基于 计算机系统都是适合的。
【0110】在一个实施方式中，计算机系统包括与母线(总线，bus)相连的处理器， 母线与主存储器(优选地执行为RAM)和许多辅助存储设备例如硬盘驱动器和可移 动介质存储设备相连。可移动介质存储设备可以表现为，例如，软盘驱动器、DVD 驱动器、光盘驱动器、只读光盘驱动器(compact disk drive)、磁带驱动器等。可移 动存储介质例如软盘、只读光盘、磁带等可以被插入到可移动储存设备中，所述可移 动存储介质包含记录在其中的控制逻辑和/或数据。计算机系统包括合适的软件，用 于在插入可移动介质存储设备中时阅读来自可移动介质存储设备的控制逻辑和/或数 据。关于单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞的信息可以以众 所周知的方式存储在主存储器、任何辅助存储设备、和/或可移动存储介质中。在运 行期间，用于存取和处理这些数据的软件(例如搜索工具、比较工具等)保留在主存 储器中。
【0111】如本文所用，“数据库”指代存储器，其能够存储与单性生殖激活的卵母细 胞和/或自体干细胞集合和供体相关的任何有用的信息。
【0112】与存储的单性生殖激活的卵母细胞，胚泡，ICM，和/或自体干细胞相关的 数据可以在多种格式的多种数据处理程序中被存储和操作。例如，数据可以作为文本 存储在文字处理文件中，如Microsoft WORD或WORDPERFECT，ASCII文件，html 文件，或以本领域技术人员熟悉的多种数据库程序如DB2、SYBASE、或ORACLE 存储在pdf文件中。
【0113】“搜索程序(search program)”指代一个或多个程序，其在基于计算机的 系统上执行，以便搜索与数据库中的冷藏样品有关的细节或比较与数据库中的冷藏样 品有关的信息。“检索程序(retrieval program)”指代一个或多个程序，其在基于计 算机的系统上执行，以便识别数据库中的感兴趣的参数。例如，检索程序可以用于发 现适合具体特征的样品，具有特定标志物或DNA序列的样品，或用于发现对应于具 体个体的样品位置。
【0114】能够被储存于一个细胞库中的细胞样品的数目没有上限。在一个实施方式中， 来自不同个体的数百个产品被储存在一个库或储存设备(storage facility)中。在另一 个实施方式中，多达数百万的产品被储存在一个储存设备中。单个储存设备可以被用 于储存单性生殖激活的卵母细胞和/或自体干细胞样品，或多个储存设备可以被应用。
【0115】在本发明的一些实施方式中，储存设备可以具有用于组织和指示储存的细胞 样品的任何方法的手段，例如，自动机器人检索装置和细胞样品操作装置。设备可以 包括用于处理细胞样品的微操作装置。已知的常规技术可以被用于有效储存和找回细 胞样品。示范性技术包括但不限于机器视觉(Machine Vision)、机器人、自动引导 车系统(Automated Guided Vehicle System)、自动储存和检索系统、计算机集成制造、 计算机辅助工艺设计、统计过程控制等。
【0116】与需要样品的个体有关的类型信息或其它信息可以被记录在系统中，其可以 被用于鉴定合适的匹配产品，如，例如，数据库系统，指示系统等。一旦在系统中被 记录，则个体与供体细胞样品的类型之间可以进行匹配。在优选的实施方式中，供体 样品来自与需要样品的个体相同的个体。然而，也可以使用相似但不相同的供体/接 受体匹配。对于具有匹配类型标识符的个体，匹配样品是可得的。在本发明的一个实 施方式中，个体的识别信息与细胞样品关联储存。在一些实施方式中，匹配过程发生 在大约收获样品的时间，或可以发生在处理、存储期间的任何时间，或在出现需求时。 因此，在本发明的一些实施方式中，匹配过程发生在个体实际需要细胞样品之前。
【0117】当个体需要单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞时， 如果需要，可以在几分钟内找到它并且使其可用于研究、移植或其它目的。也可以进 一步处理样品以便制备样品用于移植或其它需求。
【0118】通常地，在这个阶段卵母细胞排卵和经过精子受精。精子在所谓的激活过程 中开始完成减数分裂。在激活过程中，染色单体对分离，第二极体被挤出，以及卵母 细胞保留单倍数目的染色体，每一个染色体具有一个染色单体。精子贡献染色体的另 一单倍体互补物，以便形成具有单个染色单体的完整的二倍体细胞。随后染色体在第 一次细胞周期期间经过DNA合成而发展。这些细胞随后发育成为胚胎。
【0119】相反地，本文所描述的胚胎通过细胞的人工激活而发育，所述细胞一般为哺 乳动物卵母细胞或包含所有雄性或雌性来源DNA的卵裂球。如本发明背景中讨论的， 在文献中已经报道了未受精卵母细胞的人工激活方法。这样的方法包括物理方法，例 如，机械方法例如刺破、操作培养中的卵母细胞；热方法例如冷却和加热；反复电脉 冲；酶处理例如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶；渗透处理；离子处理例如利用 二价阳离子和钙离子载体，例如离子霉素和A23187；麻醉剂的使用例如醚、乙醇、 丁卡因、利诺卡因、普鲁卡因、吩噻嗪；镇定剂例如甲硫哒嗪、三氟啦嗪、氟奋乃静、 氯丙嗪；蛋白质合成抑制剂的使用例如环己酰亚胺(放线菌酮)、嘌呤霉素；磷酸化 作用抑制剂的使用，例如蛋白质激酶抑制剂例如星形孢菌素(staurosporine)、2-氨 基嘌呤、鞘氨醇、和DMAP；它们的组合；以及其它方法。
【0120】在本领域这些方法是已知的，并且在美国专利第5,945,577中讨论，在此引 用以作参考。
【0121】在一个实施方式中，在中期II中的人细胞，一般是包括所有雄性或雌性来 源的DNA的卵母细胞或卵裂球，被人工激活用于引起卵母细胞的人工激活。
【0122】在一个相关的方面，激活的细胞，例如，卵母细胞——其为二倍体，可以发 育成为包含滋养外胚层和内细胞团的胚胎。这可以使用已知的方法和帮助胚泡发育的 培养基来实现。
【0123】在单雌生殖胚胎已经被培养产生可辨别的滋养外胚层和内细胞团之后，内细 胞团的细胞随后被用于产生希望的多能细胞系。这可以通过将来自内细胞团的细胞或 整个内细胞团转移到抑制分化的培养物上而完成。这可以通过将内细胞团细胞转移到 抑制分化的饲养层上而完成，例如成纤维细胞或上皮细胞，例如从出生后人类组织得 到的成纤维细胞等，或产生LIF的其它细胞。为将细胞保持在未分化状态，可以使用 其它的因子/成分以提供合适的培养条件，包括但不限于，加入条件培养基(Amit等， Developmental Biol(2000)227：271-278)、bFGF和TGF-β1(含有或不含有LIF)(Amit 等，Biol Reprod(2004)70：837-845)、激活gp130/STAT3途径的因子(Hoffman和 Carpenter，Nature Biotech(2005)23(6)：699-708)、激活PI3K/Akt，PKB途径的因子(Kim 等，FEBS Lett(2005)579：534-540)、为骨形成蛋白(BMP)超家族成员的因子(Hoffman 和Carpenter(2005)，出处同上)、以及激活规范/β-联蛋白(canonical/β-catenin)Wnt 信号途径的因子(例如，GSK-3-特异性抑制剂；Sato等，Nat Med(2004)10：55-63)。 在一相关的地方面，这些因子可以包含含有饲养细胞和/或ECM基底的培养条件 (Hoffman和Carpenter(2005)，出处同上)。
【0124】在一方面，内细胞团细胞在人出生后包皮或皮肤成纤维细胞或产生白细胞抑 制因子的其它细胞上，或在白细胞抑制因子存在的情况下被培养。在一相关的方面， 在ICM种植(seeding)之前，饲养细胞被失活。例如，饲养细胞可以使用抗生素被 有丝分裂失活。在一相关方面，抗生素可以是丝裂霉素C，但不限于此。
【0125】培养将在这样的条件下进行，所述条件将细胞维持在未分化的多能状态下达 延长的时期，理论上无限期。在一个实施方式中，卵母细胞在高O2张力下用钙离子 载体被单性生殖激活，随后使卵母细胞在低O2张力下与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接 触。从单性生殖激活的卵母细胞得到的ICM在高O2张力下被培育，其中例如使用含 有20％ O2的气体混合物维持细胞。在另一方面，可培养是指能够或适于被培养。在 一相关的方面，在胚泡培养四天之后，机械地进行ICM分离，其中培养在饲养细胞 上进行。这样的培养，例如，排除了使用来自动物来源的材料的需求——如免疫切除 法的情况。
【0126】在一相关的方面，用于ICM的培养基补充有非动物血清，包括但不限于， 人脐带血清，其中血清在确定成分培养基中存在(例如，IVF，可从MediCultA/S， Denmark；Vitrolife，Sweden；或Zander IVF，Inc，Vero Beach，FL获得)。另一方面， 所提供的培养基和过程不含动物产品。在一相关方面，动物产品是那些来自非人来源 的产品，包括血清、干扰素、趋化因子、细胞因子、激素、以及生长因子。
【0127】本发明产生的多能状态的细胞可以通过多种方法确认。例如，可以测试细胞 中特征性ES细胞标志物的存在或不存在。在人类ES细胞的情况下，这种标志物的 实例如上述被鉴定，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT4， 它们在本领域中是已知的。
【0128】而且，可以通过将细胞注射到合适的动物例如SCID小鼠中和观察分化细胞 和组织的产生来确认多能性。确认多能性的又一方法是，使用对象多能细胞产生嵌合 动物以及观察引入细胞对不同细胞类型的贡献。生产嵌合动物的方法在本领域中是公 知的，并且在美国专利第6,642,433号中描述，其在此引用作为参考。
【0129】确认多能性的又一方法是，在有利于分化的条件下(例如，成纤维细胞饲养 层的移除)培养时，观察到ES细胞分化为拟胚体和其它分化细胞类型。这一方法已 经被使用，并且已经确认，对象多能细胞在组织培养中产生拟胚体和不同的分化细胞 类型。
【0130】得到的多能细胞和细胞系，优选人多能细胞和细胞系——其来自全部雌性来 源的DNA，具有多种治疗和诊断应用。在多种疾病状态的治疗中，这种多能细胞可 以被用于细胞移植治疗或基因治疗(如果被遗传修饰)。
【0131】就此而言，已知小鼠胚胎干(ES)细胞能分化成几乎任何细胞类型。因此， 根据本发明产生的人多能(ES)细胞应当具有类似的分化能力。根据本发明的多能 细胞将根据已知方法被诱导分化，得到期望的细胞类型。例如，根据本发明产生的人 ES细胞可以被诱导分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、视 网膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞等，这是通过在分化培养基中和在提供进 行细胞分化的条件下培养这些细胞来实施的。引起ES细胞分化的培养基和方法与合 适的培养条件一样，是本领域已知的。
【0132】例如，Palacios等，Proc，Natl.Acad，USA，92；7530-7537(1995)教导了造 血干细胞从胚细胞系的产生，通过使干细胞接受诱导过程实施，所述诱导过程包括： 最初，在缺乏视黄酸的悬浮培养基中，培养这种细胞的聚集体，随后，在包含视黄酸 的相同培养基中进行培养，随后，将细胞聚集体转移到提供用于细胞粘附的基底上。
【0133】而且，Pedersen，J，.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-552(1994)是综述性论文，其引 用了公开体外分化胚胎干细胞产生多种分化细胞类型的方法的许多论文，所述细胞类 型包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。
【0134】并且，Bain等，Dev.Biol.，168：342-357(1995)教导了体外分化胚胎干细 胞产生具有神经元性质的神经细胞。这些参考文献示范了用于从胚细胞或干细胞获得 分化细胞的已报道方法。这些参考文献、特别是其中与分化胚胎干细胞的方法相关的 公开内容，在此整体引入以作参考。因此，使用已知的方法和培养基，本领域技术人 员可以培养对象ES细胞，包括基因工程化的或转基因的ES细胞，以取得希望的分 化细胞类型，例如，神经细胞、肌细胞、造血细胞等。通过本文所描述的方法产生的 多能细胞可被用于获得任何希望的分化细胞类型。分化的人类细胞的治疗用途是空前 的。例如，人造血干细胞可以被用于需要骨髓移植的医学治疗中。这种过程被用于治 疗许多疾病，例如，晚期癌症如卵巢癌和白血病，和损害免疫系统的疾病如AIDS。 造血干细胞可以如下取得，例如，通过将来自雄性或雌性癌症或AIDS患者的雄性或 雌性DNA与去核卵母细胞整合，得到如上述的多能细胞，和在有利于分化的条件下 培养这样的细胞，直到得到造血干细胞。这样的造血细胞可以被用在包括癌症和AIDS 的疾病的治疗中。
【0135】可选地，通过在产生神经细胞系的分化条件下培养对象多能细胞(the subject pluripotent cells)，所述多能细胞可以被用于治疗患有神经疾病的患者。能够通过移 植这样的人神经细胞治疗的具体疾病示范性地包括，帕金森病、阿尔茨海默病、ALS 和大脑性麻痹等。在帕金森病的具体情况下，已经证实，移植的胎儿脑神经细胞与周 围细胞正确连接并且产生多巴胺。这可以使得帕金森病症状长期逆转。在一个相关的 方面，神经前体可以用于恢复(reanneal)切断的/受伤的神经纤维，以便在手、腿、 和脊髓损伤后恢复运动。
【0136】本发明的一个目标提供基本上无限的多能人细胞供应，所述细胞可以被用于 产生适合于对卵母细胞供体进行自体移植的分化细胞。人胚胎干细胞和来自胚泡的它 们的分化后代——其在不育治疗后残留，或使用NT产生，当用在异基因细胞移植治 疗中时，可能会被受体的免疫系统排斥。单性生殖产生的干细胞会产生分化细胞，其 能减轻与目前移植方法相关的重要问题，例如，可能因为相对于卵母细胞供体的宿主 -抗-移植物或移植物-抗-宿主排斥而发生的移植组织排斥。常规地，通过施用抗排斥 药物例如环孢菌素来预防或减轻排斥。但是，这样的药物具有显著的副作用，例如抑 制免疫、致癌性质、和非常昂贵。所公开的方法产生的细胞会消除或至少大大降低相 对于卵母细胞供体的抗排斥药物的需求。
【0137】本发明的另一个目标是提供基本上无限的多能人细胞供应，所述细胞可以被 用于产生适合于卵母细胞供体家族成员(例如，同胞)的异基因移植的分化细胞。这 种细胞对于卵母细胞供体的直系家族成员的细胞在免疫和遗传方面将是相似的，因此 被供体的家族成员排斥的可能性低。
【0138】本方法的另一个目标是，与SCNT比较时，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激 活是相对简单的方法，并且使得用更少的细胞操作产生干细胞。
【0139】已经显示，在干细胞产生方面，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激活比需要用 机械操作卵母细胞的方法(例如，SCNT)更有效。
【0140】SCNT的一个缺点是，线粒体呼吸链活性不足的对象表现出与通常在SCNT 胎儿和子代中遇到的表现型异常惊人相似的表现型(Hiendleder等，Repro Fertil Dev (2005)17(1-2)：69-83)。细胞通常仅仅含有一种类型的线粒体DNA(mtDNA)，其 被称为同型异源性，但是，异质性确实存在，通常作为突变和野生型mtDNA分子的 组合或形成野生型变体的组合(Spikings等，Hum Repro Update(2006)12(4)：401-415)。 因为异质性可以导致线粒体疾病，因此存在多种机制以确保仅仅母系的传送 (maternal-only transmission)。但是，随着绕过用于维持同型异源性的正常机制的方 案(例如，胞浆运输(CT)和SCNT)越来越多的应用，扰乱的线粒体功能对于来自 这些来源的干细胞可以是内在的。
【0141】在一方面，因为孤雌生殖体是单亲的，异质性的可能性被最小化。
【0142】可以由细胞疗法治疗的其它疾病和病示范性地包括，脊髓损伤、多发性硬化 症，肌肉萎缩症，糖尿病，肝病包括急性疾病(病毒性肝炎、药物过量(对乙酰氨基 酚)和其它)、慢性疾病(慢性肝炎和其它(通常导致硬化))、遗传性肝脏疾病(血 友病B、因子IX缺乏、胆红素代谢缺陷、尿素循环缺陷、溶酶体贮积病、a1-抗胰蛋 白酶缺陷和其它)，心脏疾病，软骨替代(cartilage replacement)，烧伤，足部溃疡， 胃肠疾病，脉管疾病，肾病，视网膜疾病，尿路疾病，和衰老相关性疾病和病。
【0143】这种方法可以被用于替代缺陷的基因，例如，缺陷的免疫系统基因、囊性纤 维化基因，或被用于引入引起治疗有利的蛋白质表达的基因，所述蛋白质例如生长因 子、淋巴因子、细胞因子、酶等。
【0144】例如，编码脑衍生生长因子的基因可以被引入根据本发明产生的人多能细胞 中，该细胞分化成神经细胞并且该细胞被移植进入帕金森患者体内以延缓这种病期间 神经细胞的丢失。
【0145】并且，本多能人ES细胞可以被用作体外分化模型，尤其用于参与早期发育 调节的基因的研究。而且，使用本ES细胞而产生的分化细胞组织和器官可以在药物 研究中被使用。
【0146】进一步地，本ES细胞或由其得到的分化细胞可以被用作产生其它ES细胞 和细胞集落的核供体。
【0147】更进一步地，根据本公开内容得到的多能细胞可以用于鉴定参与胚胎发生的 蛋白质和基因。这可以通过例如差异表达实施，即，通过比较根据本发明提供的多能 细胞中表达的mRNAs和当这些细胞分化成不同的细胞类型例如神经细胞、心肌细胞、 其它肌细胞、皮肤细胞等时所表达的mRNAs。因此，有可能确定哪种基因参与了特 定细胞类型的分化。
【0148】进一步地，具有特定遗传缺陷如导致杜兴肌营养不良(Duchene’s Muscular Dystrophy)的遗传缺陷的ES细胞和/或它们的分化后代，可以被用作研究与该遗传 缺陷相关的特定疾病的模型。
【0149】并且，本公开内容的另一个目标是，以不同浓度以及在不同细胞培养条件下， 例如，在不同细胞基质中或在不同的气体分压下培养，使根据所述方法产生的多能细 胞系暴露于不同生长因子的混合物，以便确定诱导期望的分化细胞类型产生和繁殖的 条件。
【0150】下述的实施例意图说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
人单性生殖胚胎发生干细胞的产生
【0151】材料和方法
【0152】供体自愿地捐献卵母细胞、卵丘细胞(cumulous cell)和血液(用于DNA 分析)而没有支付金钱。供体签署全面知情同意文件并且被告知所有的捐献材料被用 于研究而不是用于生殖目的。在卵巢刺激之前，根据针对人类细胞、组织和基于细胞 和组织的产品的FDA合格测定指南(Food and Drug Administration.(Draft)Guidance for Industry：Eligibility Determination for Donors of Human Cells，Tissues，and Cellular and Tissue Based Products(HCT/Ps)，2004年5月)和俄罗斯公共卫生部第N67号 (02.26.03)，卵母细胞供体接受医学适应性检查。其包括X-射线、血液和尿液分析、 和肝功能试验。供体还被筛查梅毒、HIV、HBV、和HCV。
【0153】使用标准的激素刺激产生对象供体的过排卵，得到卵母细胞。在她们月经周 期的第3天到第13天，每一供卵经历通过FSH的卵巢刺激。给予总共1500IU的FSH。 从供体月经周期的第10天到第14天，以每日0.25毫克注射促性腺激素释放素拮抗 剂Orgalutran(Organon，Holland)。从供体的月经周期第12天到第14天，每日注射 75IU FSH+75IU LH(Menopur，Ferring GmbH，Germany)，如果超声波检查显示卵 泡直径为18mm到20mm之间，则在供体月经周期的第14天施用单剂量的8000IU hGC(Choragon，Ferring GmbH，Germany)。在大约第16天，hCG注射之后35小时， 进行经阴道穿刺。通过超声波引导的针抽吸，将来自麻醉供体囊状卵泡的卵泡液收集 到无菌试管中。
【0154】从卵泡液中选出卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在冲洗培养基(Flushing Medium)(MediCult)中冲洗，随后在20％ O2、5％ CO2，37℃潮湿气氛下，在具有液 体石蜡覆盖物的通用IVF培养基(Universal IVF medium)(Medocult，见表1)中 孵育2小时。
表1.IVF培养基
组成 氯化钙 EDTA 葡萄糖 人血清白蛋白 硫酸镁 青霉素G 氯化钾 磷酸二氢钾 碳酸氢钠 氯化纳 乳酸钠 丙酮酸钠 水
【0155】在激活之前，卵丘卵母细胞复合体(COCs)用SynVitro Hyadase(MediCult， A/S，Denmark)处理而去除卵丘细胞，随后在带有石蜡覆盖物的通用IVF培养基中孵 育30分钟。
【0156】从此时起，除离子霉素处理外，卵母细胞和胚胎的培养在37℃下使用O2减 少的气体混合物(90％N2+5％O2+5％CO2)在潮湿气氛中进行。卵母细胞通过在20％ O2、5％CO2的气体环境中，在37℃下，在CO2培养箱中，在5μM离子霉素中孵育5 分钟，随后在37℃下，在90％N2、5％ O2、5％ CO2的气体环境中，在带有石蜡覆盖 物的IVF培养基中，用1mM 6-二甲氨基嘌呤(DMAP)培养4小时而被激活。卵母 细胞随后在IVF中洗涤3次。激活和培养在4孔板(Nunclon，A/S，Denmark)中、 在覆盖有液体石蜡油(MediCult，A/S，Denmark)的500μl培养基中进行。
【0157】激活的卵母细胞在含有5％ O2、5％ CO2、90％N2的气体环境中在IVF培养 基中培育，从激活的卵母细胞产生的胚胎在相同的气体混合物中被培养。
【0158】在上述条件下(即，低O2张力)使激活的卵母细胞在IVF培养基中孵育， 直到观察到Blastocyst Scoring Modification为1AA或2AA的含有内细胞团(ICM) 的完全膨胀的胚泡(Shady Grove Fertility Center，Rockville，MD，和Georgia Reproductive Specialists，Atlanta，GA)。
【0159】用0.5％的链霉蛋白酶(Sigma，St.Louis)处理，以去除透明带。通过免疫 外科分离来自胚泡的ICM，其中胚泡用针对人脾细胞的马抗血清孵育，随后暴露于 豚鼠补体。通过轻轻地吸取处理的胚泡从ICM去除滋养外胚层细胞。
【0160】对于ICM从整个胚泡的产生，胚泡被放置在被设计用于培养phESC的培养 基(即，VitroHESTM培养基(例如，DMEM/高葡萄糖培养基，VitroLife，Sweden)， 补充有10％的人类脐带血血清、5ng/ml人重组LIF(Chemicon Int’l，Inc，Temecula，CA)、 4ng/ml重组人FGF(Chemicon Int’l，Inc，Temecula，CA)和青霉素-链霉素(100U/100μg)) 中的饲养层上。当胚泡附着和质体细胞扩展时，ICM成为可见的。经过三到四天的 额外培养，使用精细拉伸的(finely drawn)玻璃吸管，通过机械切割ICM，将ICM 从滋养外胚层生长物分离出来。进一步地，在37℃、在5％ CO2和5％ O2中的96孔 板中，在VitroHESTM培养基(如上面阐述的)中，ICM细胞在有丝分裂失活的出生 后皮肤成纤维细胞的饲养细胞层上培养。这种气体混合物被用于培养干细胞。使用非 动物材料进行人成纤维细胞培养。成纤维细胞的失活使用10μg/ml的丝裂霉素C (Sigma，St.Louis，MO)进行3小时。
【0161】在一个单独的方法中，通过用针对人脾细胞的马抗血清孵育卵泡、随后暴露 于兔补体实施免疫外科。通过轻轻地吸取处理的胚泡，从ICM去除滋养外胚层细胞。 在得自遗传上不相关个体的(双亲许可)的新生儿人皮肤成纤维细胞(HSF)的饲养 层上实施分离ICMs的进一步培养，使用包含人脐带血血清的培养基得到。HSF饲养 层使用丝裂霉素C被有丝分裂失活。
【0162】用于HSF培养的培养基由90％ DMEM(高葡萄糖，带有L-谷氨酰胺 (Invitrogen)，10％人脐带血血清和青霉素-链霉素(100U/100mg)Invitrogen)组成。
【0163】为培养ICM和phESC，使用补充有4ng/ml hrbFGF、5ng/ml hrLIF和10％人 脐带血血清的VitroHESTM(Vitrolife)。ICM被机械地铺在新鲜的饲养层上并且培养3 到4天。第一集落被机械地切割去掉并且在培养五天后被重新铺置。在培养五到六天 之后得到所有随后的传代细胞(passage)。对于早期的传代细胞，集落被机械地分成 簇并且重新铺置。phESC的进一步传代用胶原酶IV处理和机械分离进行。phESC的 繁殖在37℃下、5％CO2下、在潮湿气氛中进行。
【0164】卵母细胞激活
【0165】从最初的供体，四个卵母细胞被激活，并且激活的卵母细胞在包括5％ O2、 5％ CO2和90％N2的气体环境中在IVF培养基中被培育，并在五(5)天期间进行。
表2显示了激活卵母细胞的成熟过程。每个卵母细胞在4-孔板中被分离。
表2.培养的激活的卵母细胞*
第一天 第二天 第三天 第五天 N1 1前核(pn) 1极体(pb) 2个卵裂球(bl)，相等 分裂(fr)-0％ 4bl，相等 Fr-2％ 1个桑椹胚 fr-15％ N2 0pn， 1pb 4bl，不相等 Fr-4％ 5bl，不相等 Fr-20％ 4bl，不相等 fr-40％
N3 1pn， 1pb 2bl，不相等 Fr-0％ 6bl，相等 fr-0％ 早期胚泡 N4 1pn， 1pb 4bl，相等 fr-10％ 4bl，相等 fr-20％ 具有优良ICM 1AA的完全膨 胀的胚泡
*细胞第一天在M1TM培养基(MediCult)中孵育，在第2-5天在M2TM培养基(MediCult) 中孵育。培养基每天变化。M1TM和M2TM包含人血清白蛋白、葡萄糖和衍生的代谢 物、生理盐、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素、核苷酸、碳酸氢钠、链霉素(40mg/l)、 青霉素(40.000IU/l)和酚红。
【0166】内细胞团从N4中被分离并且被转移到如上面所述的人成纤维饲养细胞。N1 和N2在第六天退化。而且，在第六天，N3产生完全膨胀的胚泡，ICM为2AB。N3 随后在第六天被转移到人成纤维饲养细胞。来自N4的ICM未改变。N3被用于分离 干细胞。
【0167】ICM细胞在VitroHESTM培养基中、在含有5％ CO2和95％ N2的气体环境中 被培育并进行四十五(45)天。表2a显示N3ICM细胞培养的过程。
表2a.N3-ICM培育的过程*
第3天 ICM，在新鲜饲养细胞上移植。 第8天 细胞集落被机械分成6份，并在96-孔板的3个孔中培育——第一代。 第14天 从第一代细胞的5个集落，细胞被机械地分开，第二代的20个集落 在24-孔板的3个孔中被培育。 第20天 细胞被铺在35mm的皿中——第三代 第24天 对五(5)个35mm的皿种植细胞——第四代。在室温下用5％链霉 蛋白酶(Sigma)化学分开第一个皿。 第30天 对二十五(25)个35mm种植细胞——第五**代 第34天 第六**代细胞 第35天 从第六代细胞冷冻11个安瓿 第37天 第七**代细胞 第44天 从第七代细胞冷冻12个安瓿 第45天 第八代细胞
*细胞在M2TM培养基(MediaCult)中成长
**这些传代细胞用链霉蛋白酶消化得到
【0168】干细胞分离
【0169】从5个供体的卵母细胞，使用MediCult培养基随后在减少的氧气下培养， 使得在培养的第五天或第六天产生23个胚泡。胚泡中的11个具有可见的ICMs(表 3)。
表3.孤雌生殖体和单性生殖胚胎干细胞系的产生
1-二个卵母细胞没有被激活；2-一个卵母细胞在激活后退化；3-一个卵母细胞未被激活；
4-二个卵母细胞处于中期阶段I并且被弃去。
【0170】这些结果表明，从单性生殖激活的卵母细胞中形成胚泡的成功率是大约 57.5％。
【0171】免疫组织化学染色
【0172】对于免疫染色，hES细胞集落和在饲养层上的phESC细胞被种植在微盖玻 片上，用PBS洗涤二次并且用100％甲醇在-20℃固定5分钟。细胞用 PBS+0.05％Tween-20洗涤二次并且在室温下用PBS+0.1％ Triton X-100渗透10分钟。 细胞洗涤后，通过在室温(RT)下使用封闭液(PBS+0.05％Tween-20+4％羊血清加 3％人脐带血血清)温育30分钟，封闭非特异性结合。在封闭液中稀释单克隆抗体并 在室温下使用1小时：SSEA-1(MAB4301)(1：30)，SSEA-3(MAB4303)(1： 10)，SSEA-4(MAB4304)(1：50)，OCT-4(MAB4305)(1：30)，TRA-1-60 (MAB4360)(1：50)，和TRA-1-81(MAB4381)(1：50)，来自Chemicon。 细胞洗涤之后，第二抗体Alexa Fluor 546(橙色荧光)和488(绿色荧光)(Molecular Probes，Invitrogen)在PBS+0.05％Tween-20中1：1000稀释，并在室温下应用一小时。 洗涤细胞，并且在室温下在10分钟期间用PBS+0.05％Tween-20中的DAPI(Sigma) 0.1μg/ml对核染色。洗涤细胞并用Mowiol(Calbiochem)裱在载玻片上。用荧光显微镜 可以看见荧光图象。
【0173】为了检测三周龄拟胚体或有收缩性的拟胚体中的中胚层标志物，应用单克隆 鼠抗结蛋白(anti-desmina)抗体抗人α肌动蛋白抗体(Chemicon)作为肌肉特异性标 志物，抗人CD31/PECAM-1抗体(R&D Systems)、抗人VE钙粘蛋白(DC144)抗体 (R&D Systems)作为内皮标志物。
【0174】为检测拟胚体中的内胚层标志物，应用单克隆鼠抗人α-甲胎蛋白抗体(R&D Systems)。
【0175】碱性磷酸酶和端粒酶活性
【0176】根据AP试剂盒和TRAPEZETM试剂盒(Chemicon)的制造商说明书，进行 碱性磷酸酶和端粒酶活性测定。
【0177】核型分析
【0178】为了分析核型，hES细胞用10μg/ml秋水仙胺(Sigma)处理二小时，用0.05％ 胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)收获并且以700×rpm离心三分钟。沉淀物在5ml的0.56％ KCL中重悬浮，并且在室温下温育15分钟。在重复离心之后，去除上清液并重悬浮 细胞，和在+4℃下用5ml的甲醇/醋酸(3：1)冰冷混合物固定细胞5分钟。重复固 定细胞二次，随后将细胞悬浮液放置到显微镜载玻片上，用Giemsa修改型染色 (Giemsa Modified Stain)(Sigma)对制备物染色。通过标准的G-显带法分析用这种方 式制备的细胞的中期。5/1000的中期分散量(metaphase spreads)被显示并且63个中期 被分析。
【0179】拟胚体形成
【0180】hES和phESC细胞集落被机械地分成簇并且被铺在24孔板的孔中，所述板 预先包被有1.5％琼脂糖(Sigma)，在含85％ Knockout DMEM、15％人脐带血血清、 1×MEM NEAA、1mM Glutamax、0.055mMβ-巯基乙醇、青霉素/链霉素(50U/50mg)、 4ng/ml hrbFGF的培养基中(所有材料选自Invitrogen，除了血清)。人类EBs在悬浮培 养中培养14天并被铺在培养皿上以产生生长物或再悬浮培养一周。
【0181】神经分化通过在1周时期内、在分化培养基中培养二周龄的拟胚体而诱导， 所述拟胚体附着在培养皿表面，所述分化培养基为：DMEM/F12、B27、2mM Glutamax、 青霉素/链霉素(100U/100μg)和20ng/ml hrbFGF(都来自Invitrogen)。一些拟胚体产 生具有神经形态的分化细胞，其它被切开和再培养以产生神经球(neurosphere)。
【0182】在与用于拟胚体产生的培养基相同的培养基中，在铺于附着表面后培养5 天后，节律性搏动(Rhythmically beating)的拟胚体自发出现。
【0183】HLA分型
【0184】用来自Dynal的Dynabeads DNA Direct Blood(Invitrogen)从供体血液、hES、 phESC细胞、和人新生儿皮肤成纤维细胞(NSFs)中提取基因组DNA。根据制造商 的说明书，应用等位基因特异测序引物(PCR-SSP，Protrans)通过PCR进行HLA 分型。HLA I类基因(HLA A*，B*，Cw*)用定义A*01-A*80、B*07-B*83、Cw*01-Cw*18 区的PROTRANS HLA A*B*Cw*来分型。HLA II类基因(HLA DRB1*，DRB3*， DRB4*，DRB5*，DQA1*，DQB1*)用定义DRB1*01-DRB1*16(DR1-DR18)、DRB3*、 DRB4*、DRB5*区的PROTRANS HLA DRB1*和定义DQQB1*02-DQB1*06 (DQ2-DQ9)、DQA1*0101-DQA1*0601区的PROTRANS HLA DQB1*DQA1*来分 析。PCR扩增在下列条件下取得：94℃，2分钟；94℃，10秒，65℃，1分钟，10 个循环；94℃，10秒，61℃，50秒，72℃，30秒，20个循环。扩增产物在琼脂糖凝 胶中检测。
【0185】Affimetrix SNP微阵列分析(microarray analysis)
【0186】通过酚/氯仿抽提法，从血液、卵丘细胞、phESC和NSF分离基因组DNA。 从四个白种人(Caucasian)对象中得到的这些DNA样品用Affimetrix Mapping 50K Hind 240 Array(Affimetrix GeneChip Mapping 100K试剂盒的一部分)被基因分型。最 初，数据集包括57,244个二元的SNP标记。因为标记的数目多于鉴定相等的基因样 品和研究杂合性所需的数目，22个常染色体中的15个(染色体1-15)被选择。较短 的七个染色体被去除，以降低在随机采样期间选择的指定染色体没有标记、或仅有1 个标记的机会。1,459个标记由Relcheck(版本0.67， 2000 Karl W.Broman. Johns Hopkins University，GNU General Public License版本2(1991年6月)下被许 可)分析。
【0187】基因组印记分析
【0188】所有核酸如Li等(J Biol Chem(2002)277(16)：13518-13527)所述制备。使用 Tri-试剂(Sigma)或使用来自Qiagen(Valencia，CA)的RNA制备试剂盒来提取RNA 和DNA。
【0189】含有来自多种样品RNA的RNA印迹(参考图3)通过标准方法(参考，例如， Sambrook等，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989，2nd ed， Cold Spring Harbor Press)被印迹在滤器上。使RNA印迹滤器与特异性杂交于mRNAs 的单链寡核苷酸探针杂交。寡核苷酸探针用[γ32P]ATP(Amersham Biosciences)末端 标记。滤器随后在60℃下用含有0.1％ SDS的0.2×SSC(1×SSC＝0.15M Nacl和0.015M 柠檬酸钠)洗涤3次，每次10分钟，并通过磷屏成像(PhosphorImage)(Molecular Dynamics)分析。寡核苷酸探针的序列得自基于下列登录号(Accession Nos)的序列： NP002393(Peg1_2和Peg1_A；对于这些基因，人类PEG1从二个可选的启动子转录， 获得二个异构体的翻译，其中仅仅一个(异构体1_2)被印记。父系表达异构体1连 同父亲等位基因的外显子中未甲基化的CpG岛发生，而母系基因(异构体1_A)中相 应的CpG岛完全甲基化。参见，例如，Li等(2002)，出处同上)；CAG29346(SNRPN)； AF087017(H19)；NR_001564(X染色体失活特异转录子(inactive X specific transcripts) XIST)；和P04406(GAPDH)。
【0190】DNA指纹分析
【0191】通过酚/氯仿抽提从血液、hES细胞、和NSFs分离基因组DNA，用HinfI 限制酶(Fermentas)消化并加入0.8％琼脂糖凝胶中。电泳后，变性的DNA通过RNA 印迹被转移到尼龙膜(Hybond N，Amersham)并用32P-标记的(CAC)5寡核苷酸探 针杂交。使用Cronex增感屏(intensifying screen)在X射线胶片(Kodak XAR)上 对膜曝光之后分析mData。
【0192】单基因座(Monolocus)PCR基因型分型
【0193】为了确定血液供体DNA和干细胞DNA之间小卫星基因座的等位基因特性， 通过PCR基因型分型分析11个多态性位点((1)3’载脂蛋白B超变小卫星基因座 (3’ApoB)；(2)D1S80(PMCT118)超变小卫星基因座(D1S80)；(3)D6S366； (4)D16S359；(5)D7S820；(6)人冯威勒布兰特因子基因超变小卫星基因座II (vWFII)；(7)D13S317；(8)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座(vWA)； (9)针对CFS-1受体基因微卫星基因座(CSF1PO)的人c-fms原癌基因；(10)人 甲状腺过氧化物酶基因微卫星基因座(TPOX)；以及(11)人酪氨酸羟化酶基因微 卫星基因座(TH01))。将已知人群(例如，俄罗斯和白种-美国人群)中针对上述 多态性位点确定的等位基因的频率与测试样品(例如，hES、NSF、和供体血液DNA) 中这些位点的等位基因频率相比较。对于所公开的分析群体的11个小卫星基因座， 染色体位置、Genbank基因座和基因座解释、重复序列数据、等位基因梯范围(allelic ladderrange)、VNTR梯尺寸范围(VNTR ladder size range)、其它已知等位基因、 等位基因尺寸、PCR方案、和等位基因频率的结果在下文提供。
【0194】(1)3’载脂蛋白B超变小卫星基因座(3’ApoB VNTR)
【0195】染色体位置：2p23-p23
【0196】Genbank基因座和基因座解释(Genbank locus and locus definition)：APOB， 载脂蛋白B(包括Ag(x)抗原)非翻译区
【0197】重复序列5’-3’：
(TATAATTAAATATTTTATAATTAAAATATT)n(SEQ ID NO：1)
【0198】等位基因梯范围(碱基)：450+10+2引物+连接
【0199】VNTR梯尺寸范围(#重复，根据Ludwig等，1989)：30，32，34，36，38， 40，42，44，46，48，50，52
【0200】其它已知等位基因(#重复)：25，27，28，31，33，35，37，39，41，43， 45，47，49，51，53，54，55
【0201】Promega K562DNA等位基因尺寸(#重复)：36/36
【0202】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
如在Verbenko等中所描述(Apolipoprotein B 3’-VNTR polymorphism in Eastern European populations.Eur J Hum Gen(2003)11(1)：444-451)进行分析。参考表4。
表4.俄罗斯人群的等位基因频率
【0203】(2)D1S80(pMCT118)超变小卫星基因座(D1S80 VNTR)
【0204】染色体位置：1p35-36
【0205】Genbank基因座和基因座解释：人D1S80和MCT118基因
【0206】重复序列5’-3’：(GAAGACAGACCACAG)n(SEQID NO：2)
【0207】等位基因梯尺寸范围(碱基)：387-762
【0208】VNTR梯尺寸范围(#重复)：16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28， 29，30，31，34，35，36，37，40，41
【0209】其它已知等位基因(#重复)：13，14，15，38，39，>41
【0210】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：18/29
【0211】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 60℃，30”
延伸 72℃，45”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0212】可以如在Verbenko等中所描述(Allele frequencies for D1S80(pMCT118)locus in some Eastern European populations.J Forensic Sci(2003)48(1)：207-208)进行分析。参 考表5。
表5.俄罗斯人群的等位基因频率
【0213】(3)D6S366
【0214】染色体的位置：6q21-qter
【0215】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0216】等位基因梯尺寸范围(碱基)：150-162
【0217】STR梯尺寸范围(#重复)：12，13，15
【0218】其它已知等位基因(#重复)：10，11，14，16，17
【0219】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：13/14
【0220】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0221】可以如在Efremov等中所描述(An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats.Sud Med Ekspert(1998)41(2)：33-36)进行分析。参见表6。
表6.俄罗斯人群的等位基因频率
【0222】(4)D16S539
【0223】染色体位置：16q24-qter
【0224】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0225】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0226】等位基因梯尺寸范围(碱基)：264-304
【0227】STR梯尺寸范围(#重复)：5，8，9，10，11，12，13，14，15
【0228】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：11/12
【0229】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0230】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表7。
表7.白种-美国人群的等位基因频率
【0231】(5)D7S820
【0232】染色体位置：7q11.21-22
【0233】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0234】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0235】等位基因梯尺寸范围(碱基)：215-247
【0236】VNTR梯尺寸范围(#重复)：6，7，8，9，10，11，12，13，14，
【0237】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9/11
【0238】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0239】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表8。
表8.在不同群体中D7S820的等位基因频率
【0240】(6)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座II(vWFII)
【0241】染色体位置：12p13.3-12p13.2
【0242】GenBank基因座和基因座解释：HUMvWFII，人冯威勒布兰特因子基因
【0243】重复序列5’-3’：(ACAT)n/(AGAT)n
【0244】等位基因梯尺寸范围(碱基)：154-178
【0245】STR梯尺寸范围(#重复)：9，11，12，13，
【0246】其它已知等位基因(#重复)：8，10，14，15
【0247】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：13/13
【0248】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0249】已经如在Efremov等中描述(An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats.Sud Med Ekspert(1998)41(2)：33-36)进行了分析。参见表9。
表9.俄罗斯人群的等位基因频率
【0250】(7)D13S317
【0251】染色体位置：13q22-q31
【0252】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0253】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0254】等位基因梯尺寸范围(碱基)：165-197
【0255】STR梯尺寸范围(#重复)：8，9，10，11，12，13，14，15
【0256】其它已知等位基因(#重复)：7
【0257】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：8/8
【0258】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0259】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表10。
表10.在不同人群中D13S317的等位基因频率
【0260】(8)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座(vWA)
【0261】染色体位置：12p12pter
【0262】GenBank基因座和基因座解释：HUMVWFA31，人冯威勒布兰特因子基因
【0263】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0264】等位基因梯尺寸范围(碱基)：139-167
【0265】STR梯尺寸范围(#重复)：14，16，17，18
【0266】其它已知等位基因(#重复)：11，12，13，15，19，20，21
【0267】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：16/16
【0268】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0269】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表11。
表11.在不同人群中HUMVWFA31的等位基因频率
【0270】(9)针对CFS-1受体基因微卫星基因座(CSF1PO)的人c-fms原癌基因
【0271】染色体位置：5q33.3-34
【0272】GenBank基因座和基因座解释：HUMCSF1PO，人c-fms原癌基因
【0273】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0274】等位基因梯尺寸范围(碱基)：295-327
【0275】STR梯尺寸范围(#重复)：7，8，9，10，11，12，13，14，15
【0276】其它已知等位基因(#重复)：6
【0277】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9/10
【0278】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0279】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表12。
表12 白种-美国人的等位基因频率
【0280】(10)人甲状腺过氧化物酶基因微卫星基因座(TPOX)
【0281】染色体位置：2p25.1-pter
【0282】GenBank基因座和基因座解释：HUMTPOX，人甲状腺过氧化物酶基因
【0283】重复序列5’-3’：(AATG)n
【0284】等位基因梯尺寸范围(碱基)：224-252
【0285】STR梯尺寸范围(#重复)：6，7，8，9，10，11，12，13，
【0286】其它已知等位基因(#重复)：无
【0287】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：8/9
【0288】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0289】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表13。
表13.白种-美国人的等位基因频率
【0290】(11)人酪氨酸羟化酶基因微卫星基因座(TH01)
【0291】染色体位置：5q33.3-34
【0292】GenBank基因座和基因座解释：HUMTHO1，人酪氨酸羟化酶基因
【0293】重复序列5’-3’：(AATG)n
【0294】等位基因梯尺寸范围(碱基)：179-203
【0295】STR梯尺寸范围(#重复)：5，6，7，8，9，10，11，
【0296】其它已知等位基因(#重复)：9.3
【0297】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9.3/9.3
【0298】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0299】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表14。
表14.白种-美国人的等位基因频率
【0300】结果
【0301】用这种方法产生的hES细胞显示出胚胎干细胞的许多典型特征：胞质脂质 小体(lipid bodies)、胞浆/核的比例小和可清晰识别的核仁。hES细胞集落显示了与 先前报道的体外受精后产生的人胚胎干细胞相似的形态学。该细胞对磷酸酶碱(图 1A)、八核苷酸结合转录因子4mRNA(Oct-4)(图1B)、阶段特异胚抗原1(SSEA-1) (图1C)、阶段特异胚抗原3(SSEA-3)(图1D)、阶段特异胚抗原4(SSEA-4) (图1E)、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)(图1F)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81) (图1G)的免疫反应性为阳性，对阶段特异胚抗原1(SSEA-1)(图1C)的免疫反 应性为阴性(其对小鼠胚胎干细胞为阳性但对人类并非如此)。端粒酶活性通常与复 制永生化相关并且一般在生殖细胞、癌细胞、和多种干细胞——包括干细胞中被表达， 但在大多数体细胞类型中不存在。通过这种方法制备的细胞在体外繁殖三个月之后， 保持着它们的未分化形态学并显示高水平的端粒酶活性(图2A)。细胞的多能性通 过拟胚体形成在体外被研究(图2B，2C)，G-带核型分析显示，细胞具有正常的人 46XX核型(图2D)。
【0302】在卵母细胞供体血液上、ES细胞上、和HNSF饲养细胞上，通过DNA印 迹和用32P-标记的(CAC)s寡核苷酸探针杂交，和与不同基因座的单基因座聚合酶 链反应(PCR)，进行DNA指纹分析(图2E)。
【0303】对于单基因座PCR，基因型分型揭示，在血液(供体)和OL1DNA之间， 所有基因座(除了一个，D7S820)具有相同的等位基因。参见表15。
表15.单基因座PCR基因型分型
NN 基因座定义 染色体位置 hES NSF 血液 1 3’ApoB 2p24-p23 36/48 36/36 36/48 2 D1S80 1p35-36 18/24 22/31 18/24 3 D6S366 6q21-qter 13/15 17/17 13/15 4 D16S359 16q24-qter 8/13 12/13 8/13 5 D7S820 7q11.21-22 11/11 9/10 10/11 6 vMFII 12p13.3-12p13.2 11/13 9/11 11/13 7 D13S317 13q22-q31 9/12 11/12 9/12 8 vWA 12p12pter 14/18 17/18 14/18 9 CSF1PO 5q33.3-34 12/12 12/13 12/12 10 TPOX 2p25.1-pter 8/11 8/11 8/11 11 TH01 5q33.3-34 6/6 6/9，3 6/6
【0304】所有杂合的供体基因座(除了一个，D7S820)的杂合性(杂合现象)在hES 基因座中没变化。在hESDNA中的D7S820的杂合性(杂合现象)是突变(在微卫星 重复序列中插入一个AGAT单体)的结果，所述突变是由于在DNA复制和DNA修 复期间的滑动链错配(slipped-strand mispairing)。
【0305】这些结果与用多基因座DNA指纹分析得到的结果(当发现用于供体DNA 和hES DNA的指纹型实质上相同时)一致。
【0306】图2E证明了hES细胞的杂合性以及与卵母细胞供体血液的一致性，和在hES 细胞与它们的饲养细胞之间没有相似性。使用MHC I类和II类中多态基因通过基于 PCR的单元型分析，确认hES细胞系的DNA图谱。来自卵母细胞供体血液、hES细 胞、和饲养细胞HNSFs的全基因组DNA被基因型分型和比较。数据显示，hES细胞 和来自供体血液的细胞彼此之间不可区分，因此应当被认为是自体的，并且二者都与 饲养细胞的DNA区分开。
表16.HLA分型
【0307】DNA指纹分析和HLA分型分析确认，hES细胞是杂合的并且包含全部的供 体遗传物质。这些结果与来自单性生殖猴干细胞系的结果一致(Vrana等，Proc Natl Acad Sci USA(2003)100(Suppl 1)：11911-11916)，以及与来自单性生殖小鼠干细胞系的 结果不一致(Lin等，Stem Cells(2003)21：153-161)，其所包括供体遗传物质的 一半。
【0308】phESC系呈现出在hES细胞中期望的形态学，形成具有紧密填充细胞的集 落，突出的核以和小的胞浆对胞核的比例(图4)。这些细胞表达常规的hES标志物 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、和OCT-4，不表达SSEA-1——其为未分 化小鼠胚胎干细胞的阳性标志物(图4)。来自所有系的细胞证实了高水平的碱性磷 酸酶和端粒酶活性(图5和图6)。G-带核型分析显示，phESC系具有正常的人类46、 XX核型，但phESC-7系除外(图7)。来自phESC-7系的细胞中的大约91％具有 47、XXX核型，并且该细胞中的9％具有48、XXX、+6核型。在这些系中观察到不 同程度的X染色体异态性：phESC-1和phESC-6系的大约12％；phESC-5系的42％； 以及细胞系phESC-7、phESC-3和phESC-4中分别为70％、80％和86％(图7)。
【0309】在所有的phESC系、供体体细胞和饲养细胞上，进行比较性DNA绘图。这 些研究使用Affimetrix SNP微阵列(Mapping 50K Hind 240 Arrays)研究染色体变化 并且证实phESC对供体体细胞的遗传相似性。在phESC系和它们相关的供体体细胞 之间完全配对的基因型关联被鉴定为“全同胞”，并且所有其它配对组合被视为“无 关”。内部对照(internal control)将来自相同的phESC系的分裂培养物之间的配对 基因型关联鉴定为“单卵双生”(表17，数据库S1)。
表17.数据库S1
数据库S1.鉴定来自phESC和相关供体的DNA样品
基 因 型 1 基 因 型 2 假 定 关 联 推 断 关 联 IBS 0 IBS 1 IBS 2 n-型 单卵双 生 LOD par/off LOD 全同 胞 LOD 半同胞 LOD 无关 1 2 无 关 无 关 166 662 631 1459 -1503.03 -300.45 -23.15 -8.41 0 1 3 无 关 无 关 241 616 602 1459 -1560.65 -434.85 -28.04 -12.22 0 1 4 无 关 无 关 225 623 611 1459 -1535.94 -400.61 -31.39 -14.39 0 1 5 无 关 无 关 225 623 611 1459 -1535.94 -400.61 -31.39 -14.39 0 1 6 无 关 无 关 243 644 572 1459 -1642.35 -445.78 -31.74 -14.54 0 1 7 无 关 无 关 252 638 569 1459 -1641.11 -453.5 -29.25 -12.86 0 1 8 无 关 无 关 250 643 566 1459 -1656.02 -460.02 -32.86 -15.32 0 1 9 无 关 无 关 219 657 583 1459 -1605.31 -382.39 -27.37 -11.58 0 1 10 无 关 无 关 158 707 594 1459 -1591.43 -279.21 -26.37 -10..89 0 1 11 无 关 无 关 193 668 598 1459 -1584.71 -354.76 -29.65 -13..31 0 1 12 无 关 无 关 166 671 622 1459 -1523.1 -300.5 -30.53 -13..92 0 2 3 无 关 全 同 0 282 1177 1459 -440.02 -146.3 0 -167.42 -363.63
胞 2 4 无 关 无 关 233 627 599 1459 -1569.66 -423.24 -28.24 -12.91 0 2 5 无 关 无 关 233 627 599 1459 -1569.66 -423.24 -28.24 -12.91 0 2 6 无 关 无 关 217 650 592 1459 -1584.75 -388.44 -22.62 -8.53 0 2 7 无 关 无 关 243 650 566 1459 -1645.94 -437.91 -23.23 -8.72 0 2 8 无 关 无 关 225 649 585 1459 -1603.18 -404.41 -27.04 -11.97 0 2 9 无 关 无 关 210 639 610 1459 -1532.75 -360.46 -24.72 -9.89 0 2 10 无 关 无 关 144 683 632 1459 -1491.18 -243.56 -16.82 -4.51 0 2 11 无 关 无 关 172 680 607 1459 -1556.46 -310.03 -23.5 -9.7 0 2 12 无 关 无 关 176 667 616 1459 -1538.57 -327.95 -27.31 -12..06 0 3 4 无 关 无 关 336 457 666 1459 -1391.57 -599.92 -30.6 -14.62 0 3 5 无 关 无 关 336 457 666 1459 -1391.57 -599.92 -30.6 -14.62 0 3 6 无 关 无 关 322 482 655 1459 -1415.98 -571.23 -26.08 -11.86 0 3 7 无 关 无 关 369 442 648 1459 -1432.05 -664.95 -27.39 -11.93 0 3 8 无 关 无 关 334 483 642 1459 -1449.86 -597.75 -31.68 -15.14 0 3 9 无 关 无 关 307 493 659 1459 -1395.19 -530.45 -24.56 -10 0 3 10 无 关 无 关 215 623 621 1459 -1503.92 -364.97 -17.26 -4.43 0 3 11 无 无 264 582 613 1459 -1531.91 -473.48 -28.41 -12..81 0
关 关 3 12 无 关 无 关 254 595 610 1459 -1544.73 -460.57 -29.92 -13..88 0 4 5 无 关 单 卵 双 生 0 0 1459 1459 0 -379.58 -45.47 -401.67 -677.74 4 6 无 关 无 关 334 475 650 1459 -1436.59 -599.55 -32.73 -15.19 0 4 7 无 关 无 关 365 439 655 1459 -1418.34 -656.01 -31.6 -14.56 0 4 8 无 关 无 关 329 486 644 1459 -1450.75 -586.4 -32.06 -14.88 0 4 9 无 关 无 关 332 466 661 1459 -1395.18 -590.12 -28.69 -12.94 0 4 10 无 关 无 关 245 606 608 1459 -1542.32 -438.93 -28.75 -12..74 0 4 11 无 关 无 关 273 569 617 1459 -1530.97 -492.84 -29.03 -12..34 0 4 12 无 关 全 同 胞 0 224 1235 1459 -326.17 -162.34 0 -183.44 -393.46 5 6 无 关 无 关 334 475 650 1459 -1436.59 -599.55 -32.73 -15.19 0 5 7 无 关 无 关 365 439 655 1459 -1418.34 -656.01 -31.6 -14.56 0 5 8 无 关 无 关 329 486 644 1459 -1450.75 -586.4 -32.06 -14.88 0 5 9 无 关 无 关 332 466 661 1459 -1395.18 -590.12 -28.69 -12.94 0 5 10 无 关 无 关 245 606 608 1459 -1542.32 -438.93 -28.75 -12..74 0 5 11 无 关 无 关 273 569 617 1459 -1530.97 -492.84 -29.03 -12..34 0
5 12 无 关 全 同 胞 0 224 1235 1459 -326.17 -162.34 0 -183.44 -393.46 6 7 无 关 全 同 胞 45 176 1238 1459 -277.78 -217.21 0 -165.72 -390.62 6 8 无 关 全 同 胞 44 187 1228 1459 -289.8 -201.32 0 -153.75 -365.51 6 9 无 关 无 关 333 481 645 1459 -1436.5 -595.4 -30.3 -13.77 0 6 10 无 关 无 关 240 601 618 1459 -1518.17 -425.03 -27.11 -11..53 0 6 11 无 关 全 同 胞 0 164 1295 1459 -209.27 -191.66 0 -213.25 -440.56 6 12 无 关 无 关 234 615 610 1459 -1547.15 -416.14 -30.21 -13..64 0 7 8 无 关 全 同 胞 38 225 1196 1459 -326.62 -150.16 0 -121.55 -334.09 7 9 无 关 无 关 359 473 627 1459 -1479.28 -642.41 -30.61 -14.47 0 7 10 无 关 无 关 252 623 584 1459 -1598.35 -443.81 -28.88 -13..09 0 7 11 无 关 全 同 胞 0 230 1229 1459 -318.49 -137.93 0 -159.55 -389.58 7 12 无 关 无 关 265 583 611 1459 -1539.33 -472.91 -30.55 -13..87 0 8 9 无 关 无 关 347 480 632 1459 -1472.41 -625.68 -30.93 -14.31 0 8 10 无 关 无 关 244 614 601 1459 -1561.3 -434 -28.07 -12..37 0
8 11 无 关 全 同 胞 0 175 1284 1459 -223.73 -178.56 0 -200.12 -428.04 8 12 无 关 无 关 236 610 613 1459 -1539.08 -417.14 -29.32 -13..14 0 9 10 无 关 全 同 胞 0 228 1231 1459 -315.15 -152.88 0 -174.27 -392.91 9 11 无 关 无 关 269 567 623 1459 -1502.69 -479.57 -28.47 -12..55 0 9 12 无 关 无 关 245 612 602 1459 -1557.25 -438.53 -26.07 -11..15 0 10 11 无 关 无 关 187 635 637 1459 -1478.7 -328.06 -25.52 -10.6 0 10 12 无 关 无 关 181 662 616 1459 -1534.36 -329 -25.2 -10.6 0
DNA样品编号如下：1-人新生儿皮肤成纤维细胞；2-phESC-7系供体；3-phESC-7系； 4-phESC-1系；5-phESC-1系；6-phESC-3系；7-phESC-4系；8-phESC-5系；9-phESC-6 系；10-phESC-6系供体；11-phESC-3到phESC-5系供体；和12-phESC-1系供体。
结果显示仅仅一对(样品4-5)被确认为单卵(MZ)双生。其余十对(样品2-3、 4-12、5-12、6-7、6-11、7-8、7-11、8-11、9-10)被确认为全同胞，以及所有其它对 的组合被确认为无关联。输出中的IBS列显示标记的数目——在该处，配对(pair) 都被分型并且具有所声明的0、1、或2个相同的等位基因(在无基因型缺陷的理想 条件下，MZ双生的所有标记必须置于IBS＝2下)。输出并没有直接显示P(观察标记/ 给定联系)，但是它显示LOD分数—log10{P(观察标记丨假定关联/P(观察标记丨 关联，其得到最大可能性从而如此称呼)}作为相似性的度量。LOD分数越小，在二 个样品之间假定关联的可能性越小。
【0310】1,459个SNP标志物的比较性分析揭示了phESC杂合性并且显示phESC细 胞基因型相比于相关供体体细胞基因型发生了变化。以前是杂合的一些体细胞基因组 片断在相关的phESC系基因组中成为纯合的。这种杂合型到纯合型在11-15％的 phESC-1、phESC-3、phESC-4、phESC-5和phESC-6系中发生，并且对于phESC-7 系为19％(数据库S2)。此外，在来自相同卵母细胞供体的phESC和phESC-5系之 间观察到遗传差异(表18，数据库S2)。
表18.数据库S2
结果表明产生的phESC系的杂合性，并且通过与相关供体基因型比较显示出基因型 变化。供体基因组的杂合片段部分在phESC中变为纯合。染色体——染色体编号； RS ID—dbSNP数据库中的RS编号；碱基对——如Affimetrix基因芯片(Affimetrix GeneChip)记录的碱基对距离；白种人中的频率A——白种人群中A等位基因的频 率。
【0311】在现有的研究中，小鼠卵母细胞的单性生殖激活产生了纯合的胚胎干细胞系 (Lin等，Stem Cells(2003)21：152)。在人卵母细胞中，卵母细胞单性生殖激活 之后第二次减数分裂的抑制和二倍体胚胎的产生没有引起完全纯合的hES细胞的产 生。
【0312】基于HLA-分型结果，从所有phESC系衍生的分化细胞应该与卵母细胞供体 完全地组织相容，这使得这种方法产生具有治疗用途的细胞(表19)。
表19.phESC细胞系的HLA-分型
【0313】衍生自用作饲养细胞的人成纤维细胞的遗传物质的DNA图谱表明，phESC 细胞系没有污染来自人成纤维细胞的物质(图19)。
【0314】phESC-1系在十个月的培养期间、跨越35代保持未分化。其它细胞系成功 地被培育至少21代以上。来自所有phESC系的细胞在悬浮液培养基中形成囊状拟胚 体，并且在体外分化后产生所有三个胚层的产物：外胚层、中胚层、内胚层(图4)。 来自phESC-1系的拟胚体中的大约5％在铺板后第5天后产生搏动细胞(beating cell)。 phESC-6系产生色着色的上皮样细胞(图4I，K)。外胚层分化由对神经元细胞特异 性标志物神经丝68(图4A)、NCAM(图4B)、βIII-微管蛋白(图4C)和神经胶 质细胞标志物GFAP(图4D，M)的阳性免疫细胞化学染色表示。分化细胞对中胚 层标志物呈阳性，所述标志物包括α-肌动蛋白(图4G)和结蛋白(图4J)——它们 是肌肉特异性标志物，和内皮标志物PECAM-1(图4E)和VE-钙粘蛋白(图4F)。内 胚层分化由分化产生物对α-甲胎蛋白呈阳性染色表示。这些数据表明，phESC可以 被分化成产生人体所有细胞类型的三个胚层。
【0315】phESC-7的变化核型可能是将它排除在临床应用之外的原因。在人类胚胎中 的基因组印记的变化可以促成与母系或父系表达基因相关的疾病的产生(Gabriel等， Proc Natl Acad Sci USA(1998)95：14857)。为了研究phESC系的其它特性，以及确定 它们用于细胞治疗的适用性，进行印记分析。
【0316】如上述进行RNA印迹并用DNA探针SNRPN、Peg1_2、Peg1_A、H19、和 GAPDH(作为内部对照)进行筛选。从NSF，新生儿皮肤成纤维细胞；hES，来自 受精卵母细胞的人胚胎干细胞系；1，phESC-1；2，phESC-3，3，phESC-4，4，phESC-5； 5，phESC-6；6，phESC-7得到印迹核酸。NSF RT-、hES RT-、1RT-为阴性对照。 图3显示印刻印迹的结果。
【0317】母系印迹基因Peg1_A在测试的所有细胞系中表现出强结合。对于母系印迹 基因H19，在所有细胞系中，观察到较弱的(相对于Peg1_A)但一致的结合。在NSF、 hES、phESC-4和phESC-6中，SNRPN表现出显著的结合。在NSF、hES、phESC-1 (信号较弱)、phESC-3、phESC-5和phESC-6中，Peg1_2表现出显著的结合。GAPDH 带结合证实，在所有泳道中的RNA加样是相似的。
【0318】尽管本发明参考上述实施例进行了描述，但是可以理解，修改和变更包含在 本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅仅由所附权利要求所限定。
参考文献：
1.J.Cibelli et al.，Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells.US Patent Application No. 20030232430，December 18，2003.
2.H.Lin et al.，Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.Stem Cells(2003)21：153-161
3.K.E.Vrana et al.，Nonhuman primate parthenogenetic stem cells.PNAS(2003) 100(Suppl 1)：11911-11916.
4.J.P.M.Dumoulin et al.，Effect of oxygen concentration on human in vitro fertilization and embryo culture.Human Reproduction.(1999)14(2)：465-469.
5.B.Fischer and B.D.Bavister，Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys，hamsters and rabbits.J Reprod Fertil(1993)99：673-679.
6.D.I.Kaufman and J.A.Mitchell，Intauterine oxygen tension during oestrous cycle in the hamster：patterns of change.Comp Biochem Physiol Comp Physiol(1994) 107(4)：673-678.
7.F.D.Houghton et al.，Oxygen consumption and energy metabolism of the early mouse embryo.Mol Reprod Dev(1996)44：476-485.
8.A.Van Soom et al.，Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different oxygen tension with or without cysteine addition. Theriogenology(2002)57(5)：1453-1465.
【0003】对于治疗移植以及对于药物试验和开发而言，人类ES细胞和它们的分化后 代是正常人类细胞的重要来源。这两个目标所需要的都是提供足够的细胞，该细胞被 分化成适合患者需求或适当的药理学试验的组织类型。与此相关的是，需要从胚胎干 细胞产生分化细胞的有效和可靠的方法。
【0004】目前，人类胚胎干细胞(hES)来自三个来源：在不育治疗后剩余的和捐赠 用于研究的胚泡，从捐赠配子(卵母细胞和精子)产生的胚泡，和核移植(nuclear transfer(NT))的产物。尸体胎儿组织是人类胚胎生殖干细胞(hEG)的唯一来源。 hES和hEG细胞提供值得注意的科学可能性和治疗可能性，包括产生更加特化的细胞 或组织的潜能。然而，对于hES和hEG细胞来源的伦理关注，和使用NT进行研究会导 致使用NT产生人类的担心，已经引起大量的公众讨论和争辩。
【0005】哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化(单性生殖激活，parthenogenic activation) 可以被用作通过精子/NT受精的替代方案，以制备卵母细胞用于胚胎干细胞产生。单 性生殖活化是在不存在来自雄性配子的任何贡献的情况下，从雌性配子产生胚细胞， 最终发育为成体或不发育为成体。
【0006】哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化可以以多种方式被诱发。使用电刺激诱导 活化特别有意义，因为电融合是目前核移植程序的一部分。已经报道，应用用于胚细 胞-卵母细胞膜融合的电融合仪器，通过电刺激进行体外单性生殖活化。
【0007】小鼠卵母细胞通过暴露于无Ca+2-Mg+2培养基、包括透明质酸酶的培养基、 暴露于乙醇、Ca+2离子载体或螯合剂、蛋白质合成抑制剂，以及电刺激被活化。这些 过程引起小鼠卵母细胞的高速率的单性生殖活化和发育，但不活化小牛卵母细胞和/ 或引起小牛卵母细胞的较低发育速率。而且，小鼠卵母细胞的受精和单性生殖活化还 取决于排卵后老化。
【0008】已经报道，牛卵母细胞通过乙醇、电刺激、暴露于室温、以及电刺激和用放 线酮进行蛋白质抑制的组合而活化。虽然这些过程被认为提高了细胞内Ca+2，但当卵 母细胞老化达28小时以上时，它们是最成功的。
发明概述
【0010】本发明基于创造性地发现：某些条件对于单性生殖活化人类卵母细胞而言是 最佳的。
【0011】在一个实施方式中，提供了产生人类干细胞的方法，其包括单性生殖地激活 卵母细胞，其中激活包括：在高氧(O2)张力下使卵母细胞与离子载体接触，和在低 氧张力(氧气张力，O2tension)下使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触；在 低氧张力下培养激活的卵母细胞，直到胚泡形成；转移胚泡到饲养细胞层；和在高氧 张力下培养转移的胚泡；从胚泡的滋养外胚层机械分离内细胞团(inner cell mass (ICM))；以及在饲养细胞层上培养ICM的细胞，其中培养ICM细胞在高氧张力下 进行。优选地，卵母细胞是人卵母细胞。
【0012】在一个相关方面，低氧张力通过在包含大约2％ O2到大约5％ O2的O2浓度的 气体混合物环境中培育而保持，其中气体混合物环境进一步包括大约5％ CO2和大约 90％氮气(N2)至93％ N2。
【0013】在另一个实施方式中，提供了激活人分裂中期II卵母细胞的方法，其包括： 在高氧气张力下在体外受精(IVF)培养基中培育人类分裂中期II卵母细胞；在高氧 气张力下通过在包含离子载体的IVF培养基中培育细胞而激活；和随后在低氧气张力 下，在包含丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂(STKI)的IVF培养基中培育细胞；和在低氧 气张力下，培育STKI处理细胞直到胚泡形成，其中从胚泡得到的内细胞团(ICM)产 生可培养的干细胞。高氧气张力可以通过在含有大约5％CO2、大约20％O2和大约75％ N2的气体混合物环境中培育细胞而保持。
【0014】在一个相关的方面，用于激活后的培育步骤的氧张力通过在气体混合物环境 中培育细胞来保持，所述气体混合物环境包括大约2％ O2到5％ O2的O2浓度，其中气 体混合物环境进一步包括大约5％ CO2和大约90％ N2到大约93％ N2。
【0015】在另一个相关方面，IVF培养基基本上不含非人类产品。
【0016】在又一相关方面，提供了通过本发明方法制备的分离卵母细胞，包括从这种 卵母细胞制备的分离内细胞团(ICM)和从其中分离的相应的干细胞。
【0017】在另一个实施方式中，提供了产生胚胎发生干细胞(embryogenic stem cells) 和它们的分化后代的哺乳动物卵母细胞的人类单性生殖激活。这种细胞和后代与卵母 细胞供体实质上同基因，因此允许相对于卵母细胞供体的细胞自体移植，以及典型地 避免了卵母细胞供体的免疫系统的排斥。
【0018】在一个相关方面，提供了来自单性生殖激活卵母细胞的hES细胞系的细胞库。
【0019】在一个实施方式中，提供了从冷藏卵母细胞或孤雌生殖体(parthenote)产 生人类干细胞的方法，其包括：将冷藏剂显微注射到卵母细胞或孤雌生殖体的细胞质 中；冷冻卵母细胞或孤雌生殖体到使其进入休眠状态的低温温度；在休眠状态中存储 卵母细胞或孤雌生殖体；解冻卵母细胞或孤雌生殖体；单性生殖地激活卵母细胞，其 中激活包括在高氧气张力下使卵母细胞与离子载体接触和在低氧气张力下使卵母细 胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触；在低氧气张力下培养孤雌生殖体和激活的卵母 细胞直到胚泡形成；从胚泡的滋养外胚层分离内细胞团(ICM)；以及在饲养细胞层 上培养ICM细胞，其中培养在高氧气张力下进行。
【0020】在另一个实施方式中，提供了来自人类供体的单性生殖激活卵母细胞的自体 干细胞。在一方面，干细胞具有与供体细胞实质上相同的单元型(haplotype)。在一 个相关方面，干细胞与供体细胞在遗传上实质上相同。
【0021】一方面，根据单核苷酸多态性(SNP)标记，干细胞被确定为供体的全同胞 (full sibling)。在另一方面，根据供体来源，干细胞被基因组印记化(genomically imprinted)。
【0022】在一个实施方式中，公开了来自从人类供体的单性生殖激活卵母细胞取得的 干细胞的分化细胞。在一个相关方面，分化细胞包括但不限于：神经细胞、心脏细胞、 平滑肌细胞、横纹肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细 胞、基质细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体 细胞、肥大细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞。在另一相关方面，分化细胞表达一个 或多个标志物，包括但不限于：神经丝68(neurofiliment 68)、NCAM(神经细胞黏 附分子)、βIII-微管蛋白、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)、α-肌动蛋白、结蛋白、 PECAM-1(血小板内皮细胞黏附分子-1)、VE-钙粘蛋白、α-甲胎蛋白、或它们的组合。
【0023】在另一实施方式中，公开了包括自体干细胞的细胞系，其中干细胞来自人类 供体的单性生殖激活的卵母细胞。在一方面，细胞不表达SSEA-1。在另一方面，细 胞系中的细胞产生外胚层、中胚层、和内胚层胚系(germ line)。
【0024】在一个实施方式中，公开了细胞库，其包括冷藏的孤雌生殖体，其中孤雌生 殖体从来自一个或多个人类供体的单性生殖激活的卵母细胞得到。在一个相关方面， 孤雌生殖体在低O2张力下被培养直到胚泡形成。
【0025】在一个实施方式中，公开了细胞库，其包括冷藏的自体干细胞，其中干细胞 是从来自一个或多个人类供体的单性生殖激活的卵母细胞得到的。
【0026】在另一个实施方式中，提供了治疗需要所述方法的对象的方法，包括施用包 含分化细胞的细胞组分，其中分化细胞从得自人类供体单性生殖激活卵母细胞的干细 胞得到。在一方面，分化细胞选自：神经元细胞、心脏细胞、平滑肌细胞、横纹肌细 胞、内皮细胞、成骨细胞、少突胶质细胞、造血细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细 胞、星形胶质细胞、树突细胞、角质化细胞、胰岛、淋巴前体细胞、肥大细胞、中胚 层细胞、和内胚层细胞。
【0027】在一个相关方面，对象表现出的疾病选自：帕金森病，亨廷顿病，阿尔茨海 默病，ALS(肌萎缩侧索硬化症)，脊髓缺陷或损伤，多发性硬化，肌肉萎缩症，囊 性纤维化，肝病，糖尿病，心脏病，视网膜疾病(例如黄斑变性和色素性视网膜炎)， 软骨缺陷或损伤，烧伤，足部溃疡，脉管疾病，尿路疾病，AIDS(获得性免疫缺陷 综合症)，和癌症。
【0028】在一个实施方式中，公开了产生克隆人类胚胎干细胞的方法，包括：从前面 受精的人类卵母细胞中去除第一前核；将第二前核转移到去核卵母细胞中，其中第二 前核来自供体卵母细胞或供体母亲的卵母细胞、或单性生殖激活的卵母细胞，其中卵 母细胞的前核在激活之前已经被供体体细胞的细胞核所取代；和培养得到的卵母细胞 直到胚泡形成，其中来自胚泡的内细胞团包含胚胎干细胞。
【0029】在下面更加详细地描述根据本发明的示范性方法和组分。
附图简述
【0030】图1A显示单性生殖来源的hES细胞的碱性磷酸酶表面标志物(surface marker) 表达的显微图。
【0031】图1B表示表面标志物Oct4的表达显微图。
【0032】图1C表示表面标志物SSEA-1的表达显微图。
【0033】图1D表示表面标志物SSEA-3的表达显微图。
【0034】图1E表示表面标志物SSEA-4的表达显微图。
【0035】图1F表示表面标志物TRA-1-60的表达显微图。
【0036】图1G表示表面标志物TRA-1-81的表达显微图。
【0037】图2A表示单性生殖来源的hES细胞的端粒酶活性的分析。应用500、1000 和10000(单位)提取物进行分析。ΔH-热处理测试提取物(阴性对照)；阳性对照 -端粒酶阳性细胞；CHAPS-裂解缓冲液；TSR8-对照模板。
【0038】图2B显示来自培育9天的单性生殖来源的hES细胞的拟胚体(embryoid body)形成的显微图。
【0039】图2C显示来自培育10天的单性生殖来源的hES细胞的拟胚体形成的显微 图。
【0040】图2D示例单性生殖来源的hES细胞的核型。
【0041】图2E显示单性生殖来源的hES细胞的DNA指纹分析的结果。1-来自卵母 细胞供体的血液的DNA；2-来自从同一供体得到的单性生殖hES细胞的DNA；3-来 自人饲养成纤维细胞的DNA。
【0042】图3显示表征与基因组印记相关的基因表达的RNA印迹。DNA探针： SNRPN，Peg1_2，Peg1_A，H19，和GAPDH(作为内部对照)。NSF，新生儿皮肤 成纤维细胞；Hes，来自受精的卵母细胞的人类胚胎干细胞系；1，phESC-1；2，phESC-3， 3，phESC-4，4，phESC-5；5，phESC-6；6，phESC-7。NSF RT-、hES RT-、1RT- 是阴性对照。
【0043】图4显示phESC分化为全部三个胚层的产生物。外胚层分化通过对神经元 特异标志物68(A)，NCAM(B)，βIII-微管蛋白(C)和神经胶质细胞标志物GFAP (D、M)的阳性免疫细胞化学染色表示。对于中胚层标志物：肌肉特异性α肌动蛋 白(G)和结蛋白(J)，内皮标志物PECAM-1(E)和VE-钙粘蛋白(F)，分化细胞 是阳性的。内胚层分化通过对α-甲胎蛋白(H，L)的阳性染色表示。PhESC产生有 色的上皮样细胞(I，K)。放大倍数(I)×100；(A-H，J-M)，×400。
【0044】图5显示phESC系针对特定标志物的特征。在人类饲养层细胞上phESC的 未分化集落(A-F)，对SSEA-1的阴性染色(G-L)，细胞表面标志物SSEA-3(M-R)、 SSEA-4(S-X)的表达。放大倍数(A)到(E)×100；(F)×200；(G)到(X)×400。 在饲养细胞(A-F)，OCT-4(G-L)，TRA-1-60(K-R)和TRA-1-81(S-X)上phESC 集落的碱性磷酸酶阳性染色。放大倍数(A，B，O，R)×100；(C-F，M，S，X) ×200；(G-L，N，P，Q，T-W)×400。
【0045】图6证实通过与阳性对照细胞比较，phESC细胞具有高水平的端粒酶活性： “+”-来自500个细胞的提取物；“-”热处理的细胞提取物，具有未活化的端粒酶； “对照+”端粒酶阳性细胞提取物(用TRAPEZE试剂盒)；“B”-CHAPS裂解缓冲 液，引物二聚体/PCR污染物对照；TSR8-端粒酶定量对照模板(0.1和0.2摩尔(amole) /μl)；“M”-标记物，DNA梯(DNA分子量标准，DNA ladder)。
【0046】图7显示phESC系的G-带核型分型。phESC-1(A)、phESC-3(B)、phESC-4(C)、 phESC-5(D)和phESC-6(E)系具有正常的46，xx核型。PhESC-7系具有47，XXX核 型(F)。
发明详述
【0047】在描述本组分、方法和培养方法学之前，应该理解，本发明不限于所述的具 体组分、方法、和试验条件，因为这样的组分、方法和条件可能变化。也应该理解， 本文所使用的术语仅仅为描述具体实施方式的目的，并且不意图于是限制性的，因为 本发明的范围仅仅限定在所附的权利要求书中。
【0048】如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个或一种(a)”， “一个或一种(an)”，和“该(the)”包括多数指代物，除非上下文清楚地表明。 因此，例如，“该方法”包括一种或多种方法，和/或本文所描述类型的步骤，这对 于本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将是显而易见的。
【0049】“分化”指代发生在细胞中的变化，这种变化使那些细胞呈现某些特化的功 能以及失去变化成某些其它特化的功能单元的能力。能够分化的细胞可以是全能的、 多能的(pluripotent)、或多能(multipotent)细胞中的任意。分化相对于成熟的成体 细胞可能是部分的或完全的。
【0050】单雌生殖(gynogenesis)指，在细胞活化后导致产生包含可辨别的滋养外胚 层和内细胞团的胚胎，所述细胞例如卵母细胞或其它胚胎细胞类型，包括全部雌性来 源的哺乳动物DNA，优选人类雌性来源，例如人类或非人类灵长动物卵母细胞DNA。 这种雌性哺乳动物DNA可以通过例如，至少一个DNA序列的插入、缺失或取代被 遗传修饰，或可以未被修饰。例如，DNA可以通过插入或缺失期望的编码序列，或 促进或抑制胚胎发生的序列被修饰。一般地，这样的胚胎将通过体外激活包含全部雌 性来源DNA的卵母细胞而获得。单雌生殖包含在下面所定义的单性生殖中。它还包 括其中精子的DNA没有贡献于被激活卵母细胞中的DNA的激活方法。
【0051】在一个相关的方面，卵母细胞从制备用于IVF的超排卵(superovulating)对 象获得。用于IVF中的“超排卵”技术，如用激素处理雌性对象，被设计成促进卵巢 产生几个卵(卵母细胞)，而不是如在自然周期中通常的一个卵。
【0052】促进卵产生所需要的药物治疗，包括但不限于下列：醋酸亮丙瑞林(Lupron) (促性腺素释放激素激动剂)、Orgalutran、Antagon或西曲肽(Cetrotide)(促性腺素 释放激素激动剂)、Follistim、Bravelle或果纳芬(Gonal-F)(FSH，促卵泡激素)、 Repronex(FSH和LH的组合，促黄体激素)、和波热尼乐(Pregnyl)或Novarel(hCG， 人绒毛膜促性腺素)。
【0053】在一个相关方面，在经阴道超声指引下可以进行卵的收集。为完成这一过程， 应用超声将针通过阴道壁插入(例如，在IV镇静下)到卵巢中以查找每一个卵泡。 卵泡液被抽到试管中以取得卵。
【0054】通过“单性生殖(孤雌生殖，Parthenogenesis)”(“单性生殖激活 (parthenogenically activated)”和“孤雌生殖激活(parthenogenetically activated)” 被交换使用)过程，卵母细胞的激活在缺少精子穿入下发生，并且其指代包含滋养外 胚层和内细胞团的早期阶段胚胎的发育，所述胚胎通过激活包含全部雌性来源DNA 的卵母细胞或胚胎细胞例如卵裂球而获得。在一个相关方面，“孤雌生殖体”指代通 过这种激活得到的最终细胞。在另一相关方面，“胚泡”指代分裂阶段的受精或激活 的卵母细胞，其包含由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的中空细胞球。在又一 相关方面，“胚泡形成”指代在卵母细胞受精或激活之后的过程，其中随后卵母细胞 在培养基中被培养一段时间，所述时间能够使其发育成由外滋养层细胞和ICM组成 的中空细胞球(例如，5到6天)。
【0055】在一个实施方式中，公开了通过单性生殖激活的卵母细胞产生克隆人类胚胎 干细胞系的方法。虽然单性生殖在自然界中不是罕见的繁殖形式，但不知道哺乳动物 能够进行这种繁殖形式。然而，从雌性近交系小鼠LT/Sv的卵母细胞中，可以发现比 例为10％的自发单性生殖(Ozil和Huneau，Development(2001)128：917-928；Vrana等， Proc Natl Acad Sci USA(2003)100(Suppl 1)：11911-11916；Berkowitz and Goldstein， New Eng J Med(1990)335(23)；1740-1748)。有胎盘哺乳动物的卵母细胞能够被诱导 进行体外单性生殖；但是，胚胎发育是不成功的。
【0056】单性生殖激活哺乳动物卵母细胞和将激活的卵母细胞转移进入代理母亲之 后，具有有限的胚胎存活：小鼠为十天；羊为21天；猪为29天；兔为11.5天 (Kure-bayashi等，Theriogenology(2000)53：1105-1119；Hagemann等，Mol Repord dev (1998)50：154-162；Surani and Barton，Science(1983)222：1034-1036)。这种发育停滞的 原因可能是由于遗传印记(genetic imprinting)。已经显示，母亲与父亲的基因组是 表观遗传上不同的(epigentically different)并且这两组对于成功的胚胎发育都是必需 的(Surani，Cell(1998)93：309-312；Sasaki et al.，(1992)6：1843-1856)。在孤雌生殖体中， 所有的遗传物质应该是母亲来源，因此应当缺少父亲印记。父亲印记被认为负责胚外 (extra-embryo)组织发育，因此，在去核卵母细胞受精之后滋养组织发育(Stevens， Nature(1978)276：266-276)。因此，在动物中，去核的受精卵对于核转移和随后的单 性生殖激活可能是有用的。
【0057】哺乳动物的孤雌生殖体仅仅经历有限的发育，胚胎最终死亡。在食蟹猴 (Macac fascicularis)中，体外单性生殖激活之后的中期II阶段卵母细胞中的仅仅14％ 在培养8天之后发育到胚泡阶段(Monk，Genes Dev(1988)2：921-925)。相似地，核 转移之后被体外单性生殖激活的人卵母细胞中的12％发育成胚泡状态(Monk，1998)。 在这二种情况中，都产生一个干细胞系。
【0058】在LT/Sv近交系小鼠的未交配雌性中，以自发激活孤雌生殖体形成的胚胎在 几天内死亡。当从包含这些胚胎的内细胞团(ICM)的细胞进行核转移到受精的去核 的C57BL/6j小鼠卵母细胞中时，得到了具有LT/Sv基因组的克隆小鼠(Kaufman et al.， Nature(1977)265：53-55)。因此，受精卵母细胞的使用允许孤雌生殖体的足月发育。 在一方面，受精的去核人卵母细胞能够被用于支持包含供体细胞核的单性生殖胚胎的 发育，直到胚泡阶段。
【0059】在一个实施方式中，在单性生殖激活之后，供体卵母细胞或供体母亲的卵母 细胞的前核可以被转移到受精的人卵母细胞中，雌性和雄性前核已经从所述受精的人 卵母细胞取出。
【0060】在另一个实施方式中，公开了用于产生人类干细胞的二阶段过程，其包括： 将供体体细胞的细胞核转移到供体卵母细胞中，其中卵母细胞随后通过单性生殖激 活；和将激活卵母细胞的前核转移到受精卵母细胞中，其中雄性和雌性前核已经被取 出。
【0061】在另一个实施方式中，来自供体体细胞的细胞核可以被转移到受精的去核人 卵母细胞中，随后进行单性生殖激活。上述的三个实施方式通过下面的流程图被说明。
情况1
雌性患者→取出卵母细胞→单性生殖激活→取出前核→将前核加入到去核的受精卵 母细胞中
雄性患者→从患者母亲得到卵母细胞→单性生殖激活→取出前核→将前核加入到去 核的受精卵母细胞中
情况2
取得供体卵母细胞→取出前核→使用核转移，加入来自患者的体细胞的细胞核→单性 生殖激活→取出前核→将前核加入到去核的受精卵母细胞中
情况3
取得供体卵母细胞→受精→去除细胞核→加入患者的体细胞细胞核→单性生殖激活
【0062】“多能细胞”指代来自通过激活包含全部雌性或雄性来源DNA的细胞而产 生的胚胎的细胞，其可以在未分化状态下在体外保持长期、理论上为无限的时期，其 可以产生不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层、和内胚层。细胞的多能状态优选 地通过在合适条件下培养内细胞团或来自胚胎的内细胞团的细胞而保持，所述胚胎由 雄核发育或雌核发育方法产生，所述条件例如，通过在成纤维细胞饲养层或其它饲养 层或包含白血病抑制因子(LIF)的培养物上培养。这种培养细胞的多能状态可以通 过多种方法确认，例如，(i)确认表征多能细胞的标志物的表达；(ii)包含表达多 能细胞基因型的细胞的嵌合动物的产生；(iii)将细胞注入到动物例如SCID小鼠中， 在体内产生不同的分化细胞类型；以及(iv)在体外，观察到细胞分化(例如，当在 缺少饲养层或LIF时培养)为拟胚体和其它分化细胞类型。
【0063】“二倍体细胞”指代细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有全部雄性或雌性 来源的二倍DNA内容物。
【0064】“单倍体细胞”指代细胞，例如，卵母细胞或卵裂球，其具有单倍DNA内 容物，其中单倍DNA是全部雄性或雌性来源。
【0065】激活指代一种过程，其中例如——但不限于此，在减数分裂中期II中，受 精或未受精卵母细胞进行这样的过程：所述过程一般包括染色单体对的分离，第二极 体挤出，产生具有单倍数目染色体的卵母细胞，每一染色体具有一个染色单体。激活 包括这样的方法，通过该方法，包含全部雄性或雌性来源DNA的细胞被诱导发育成 具有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎，这对于产生多能细胞是有用的，但其本 身可能不能发育成存活的后代。例如，激活可以在下面的一种条件下进行：(i)不 引起第二极体挤出的条件；(ii)引起极体挤出但其中极体挤出被抑制的条件；或(iii) 抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。
【0066】“中期II’指代细胞发育的一个阶段，其中细胞的DNA内容物由单倍数目染 色体组成，每一染色体由二条染色单体表示。
【0067】在一个实施方式中，中期II卵母细胞在不同的O2张力气体环境下通过孵育 卵母细胞被激活。在一个相关方面，低O2张力气体环境由包含大约2％、3％、4％、 或5％的O2浓度的气体混合物产生。在另一相关方面，气体混合物包含大约5％ CO2。 进一步地，气体混合物包含大约90％ N2、91％ N2、或93％ N2。这种气体混合物区别 于含有5％ CO2的空气，其大约有约5％ CO2、20％O2、和75％ N2。
【0068】“O2张力”指代在流体中(例如，液体或气体)的氧气的分压(气体混合 物的单一成分施加的压力)。低张力是当氧分压(pO2)低时的情况，高张力是当氧 分压高时的情况。
【0069】“确定成分培养基条件”指代培养细胞的环境，其中详细描述了最佳成长所 需要的其成分的浓度。例如，取决于细胞的用途(例如，治疗应用)，从包含异种蛋 白质的条件中取出细胞是重要的；例如，培养条件是无动物条件或无非人动物蛋白质。 在一个相关方面。“体外受精(IVF)培养基”指代包含受精卵母细胞能够在其中或 其上成长的化学限定物质的营养系统。
【0070】“胞外基质(ECM)基底(Extracellular matrix substrate)”指代支撑最佳生 长的细胞下的表面。例如，这种ECM基底包括但不限于，Matrigel、层粘连蛋白、明 胶、和纤连蛋白基底。在一个相关方面，这样的基底可以包括胶原蛋白IV、巢蛋白， 肝素硫酸盐蛋白聚糖，包括不同的生长因子(例如，bFGF、表皮生长因子、胰岛素 样生长因子-1、血小板衍生生长因子、神经生长因子、和TGF-β-1)。
【0071】“胚胎(Embryo)”指代细胞激活产生的胚胎，所述细胞例如，卵母细胞 或包含所有雄性或雌性来源DNA的其它胚胎细胞，其可以任选地被修饰，其包括可 辨别的滋养外胚层和内细胞团，其不能产生存活的后代并且其中DNA为全部雄性或 雌性来源。内细胞团或其中包含的细胞，对于如前面所定义的多能细胞的产生是有用 的。
【0072】“内细胞团(ICM)”指代产生胎儿组织的胚胎内部部分。在本文中，这些 细胞被用于在体外提供多能细胞的持续来源。而且，ICM包括从雄核发育或雌核发 育得到的胚胎的内部部分，例如，包含所有雄性或雌性来源DNA的细胞激活后得到 的胚胎。这种DNA，例如，将是人DNA，例如，人类卵母细胞或精子的DNA，其 可以被遗传修饰或可以不被遗传修饰。
【0073】“滋养外胚层”指代产生胎盘组织的早期胚胎的另一部分，包括从雄核发育 或雌核发育得到的胚胎的组织，例如，包含所有雄性或雌性来源例如人类卵巢或精子 的DNA的细胞激活得到的胚胎。
【0074】“分化细胞”指代具有特定分化状态，例如，非胚胎状态的非胚胎细胞。三 种最早分化的细胞类型是内胚层、中胚层、和外胚层。
【0075】“实质上相同的”指针对特定特征的值相同，其如此相近以至于在测量差异 (例如，通过HLA分型、SNP分析、和类似方法)能力内基本上相同。
【0076】“组织相容的”指代生物体耐受外来组织移植的程度。
【0077】“基因组印记”指代这样的机制，通过该机制，基因组中的许多基因根据它 们的双亲来源被单等位基因地表达。
【0078】“同型异源性”，包括其语法上的变化，指代在细胞或个体中存在相同类型 的线粒体DNA(mtDNA)。
【0079】“异质性”，包括其语法的变化，指代在细胞或个体中存在一种以上类型的 线粒体DNA(mtDNA)的混合物。
【0080】“单亲的”指代一个或多个细胞或个体，另一细胞或个体从其中产生并且对 其保持次生性(subsidiary)。
【0081】“机械地分离”指代通过物理力量分离细胞集合体的过程。例如，这种过程 将排除可能含有非人物质的酶(或其它细胞分裂产物)的应用。
【0082】在天然的环境中，卵巢的未成熟卵母细胞(卵)经历成熟过程，其导致通过 减数分裂进展到减数分裂中期II。随后卵母细胞停滞在中期II。在中期II中，细胞的 DNA内容物由单倍数目的染色体组成，每个染色体由二个染色单体表示。
【0083】这样的卵母细胞可以通过冷藏被无限保存，例如通过用糖显微注射，但不限 于此。
【0084】在一个实施方式中，提供了从冷藏的卵母细胞或孤雌生殖体产生人类干细胞 的方法，包括：向卵母细胞或孤雌生殖体的细胞质中显微注射冷藏试剂，冷冻卵母细 胞或孤雌生殖体到低温温度使它进入休眠状态，在休眠状态下保存卵母细胞或孤雌生 殖体，解冻卵母细胞或孤雌生殖体，在高O2张力下在离子载体存在下单性生殖激活 卵母细胞，随后在低O2张力下使卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触，培养激 活的卵母细胞或孤雌生殖体直到胚泡形成，从胚泡分离内细胞团(ICM)，和在人饲养 细胞层上培养ICM细胞，其中培养ICM细胞在高O2张力下进行。
【0085】在一方面，如所述取得的卵母细胞被转移到改良型、等张的IVF——其被胚 胎测试矿物油(Sigma)覆盖，或任何其它适合的培养基。如果期望，卵母细胞可以 用与计划进行显微注射的量浓度相同的细胞外糖孵育。例如，为注入0.1M糖，卵母 细胞可以在DMEM/F-12中用0.1M糖平衡。在一方面，冷藏剂包含比标准DMEM低 的Na+浓度(例如，低Na+培养基(media))。在一相关方面，冷藏剂包含比标准 DMEM更高的K+浓度(例如，高K+)。在另一相关方面，冷藏剂包含比标准DMEM 更低的Na+和更高的K+浓度(例如，低Na+低/高K+培养基)。在一方面，冷藏剂包 括有机缓冲剂，包括但不限于HEPES。在另一方面，冷藏剂包括抑制凋亡蛋白(例 如，胱天蛋白酶)的部分。
【0086】可选地，卵母细胞可以任选地与任何其它实质上不可渗透的溶质例如NaCl 平衡，以在显微注射之前降低它们的细胞体积。相对于在显微注射之前没有在高渗培 养基中孵育的卵母细胞，细胞体积的这种最初的降低可以导致较小最终体积的显微注 射卵母细胞。这种较小最终体积可以最小化卵母细胞膨胀引起的任何可能的负面影 响。用于制备显微注射的细胞的这种一般程序也可以用于其它细胞类型(例如，激活 的卵母细胞、hES细胞、和类似细胞)。
【0087】随后卵母细胞用冷藏剂显微注射。显微注射设备和程序在本领域被充分表征， 并且已知用于注射小分子到细胞中的显微注射设备可以在本发明中使用。在示范性显 微注射步骤中，卵母细胞可以在10psi压力下被显微注射30毫秒。另一个标准显微 注射技术的实例为由Nakayama和Yanagimachi(Nature Biotech.16：639-642，1998)描 述的方法。
【0088】在这个过程中有用的冷藏剂包括具有低温防护性质和一般不可渗透的任何化 学物质。具体地，冷藏剂可以包括单独的糖或糖与其它传统的冷藏剂混合在一起。碳 水化合物糖例如海藻糖、蔗糖、果糖、和蜜三糖，可以被显微注射到浓度少于或等于 大约1.0M，更优选地，少于或等于约0.4M。在一方面，浓度为0.05到0.20M之间， 包括0.05和0.20M。此外，细胞外糖或传统冷藏剂可以在存储之前被加入。如果细 胞在显微注射之前在高渗溶液中被孵育，在显微注射之后实质上不可渗透的溶质可以 允许保持在培养基中，或可以通过用含有更低浓度的这种溶质或不含这种溶质的培养 基洗涤细胞而从培养基中去除。
【0089】一些糖或多糖一般不透过细胞膜，因为它们太大以至于不能穿过细胞膜，它 们对用于冷藏目的具有优良的物理化学和生物学性质。虽然这些糖一般自身不渗透细 胞膜，但利用所描述的方法，这些一般非渗透性的糖可以被细胞内显微注射，产生有 利效果。
【0090】非渗透性糖——其对细胞具有稳定或保存作用，在本方法中特别用作冷藏剂 ——包括：蔗糖、海藻糖、果糖、葡聚糖和蜜三糖。在这些糖中，海藻糖——葡萄糖 的非还原二糖——已经显示了在低浓度下在稳定细胞结构方面的优异效应。细胞外糖 脂或糖蛋白的加入也可以稳定细胞膜。
【0091】在冷藏剂显微注射之后，细胞被制备用于存储。多种冷冻和/或干燥方法可 以被用于制备储存用细胞。具体地，本文描述三种方法：真空或风干、冷冻干燥、和 冷冻-解冻(冻-融)方案。干燥过程具有稳定的生物材料可以在环境温度下被运输和 储存的优点。
【0092】典型地，在投入储存用液氮之前，加载有1到2M DMSO的卵母细胞以非常 慢的冷却速率(0.3到0.5℃/分钟)被冷却到中间温度(-60℃到-80℃)。然后样品可 以在此温度下被保存。
【0093】随后悬浮材料可以在冷藏温度下被保存所希望的时间，例如，通过使小瓶留 在液氮中(LN2)。
【0094】真空或风干或冷冻干燥蛋白质的方案在本领域中被充分表征(Frank等 “Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals”BioPharm，October 1991，p.39；Shalaev等”Changes in the Physical State of Model Mixture during Freezing and Drying：Impact on Product Quality，”Cryobiol.33，14-26(1996))，并且这些方案 可以被用于制备使用描述的方法存储的细胞悬浮液。除风干之外，可以用来从细胞悬 浮液中去除水的其它对流干燥方法包括氮气或其它气体的对流。
【0095】对本发明方法有用的示范性蒸发真空干燥方案可以包括在12孔板上的孔中 各放置20μl并且在环境温度下真空干燥2小时。当然，可以使用其它的干燥方法， 包括干燥小瓶中的细胞。以这种方式制备的细胞可以被干燥保存，并且通过在DMEM 中或任何其它适合培养基中稀释而再水合。
【0096】使用冷冻干燥制备用于储存的细胞的本发明的方法由冷冻细胞悬浮液开始。 虽然本领域已知的冷冻方法可以被使用，但本文针对冷冻-解冻方法所描述的简单投 入冷冻(plunge freezing)方法也可以被用于冷冻干燥方案中的冷冻步骤。
【0097】冷冻之后，可以应用二阶段干燥过程。在第一阶段，升华作用能被加入以便 蒸发冷冻水。在样品中的纯晶体冰已经被升华之后，进行第二干燥。冷冻干燥的细胞 能够被保存并且以如上面针对真空干燥所述的相同方式被水合。随后存活细胞可以被 恢复。
【0098】细胞从冷冻或干燥状态恢复之后，任何外部的冷藏剂可以任选地从培养基中 去除。例如，可以通过加入具有较低浓度冷藏剂的相应培养基来稀释培养基。例如， 恢复细胞可以在含有比用于细胞储存的糖浓度低的糖的培养基中孵育大约五分钟。对 于这一孵育，培养基可以包含与用作冷藏剂的糖相同的糖；不同冷藏剂，例如半乳糖； 或任何其它实质上不可渗透的溶质。为了最小化由培养基渗透性降低而诱发的任何渗 透震扰，细胞外冷藏剂的浓度可以通过进行多次这种稀释步骤而缓慢地降低，每次稀 释使用更低浓度的冷藏剂。这些稀释步骤可以重复直到不存在细胞外冷藏剂或直到冷 藏剂的浓度或培养基的渗透性降低到所期望的水平。
【0099】单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和自体干细胞，可以以允许细胞应 将来需要而复苏的方式被存储或“库存(banked)”。单性生殖激活的卵母细胞和自 体干细胞的等分试样可以在任何时间被移出，成长为许多未分化细胞的培养物和随后 分化成特定的细胞类型或组织类型，并且随后可以被用于治疗疾病或替代对象中的功 能异常组织。因为细胞从供体单性生殖得到，所以细胞能够被保存，使得个体或近亲 能够长时期地得到细胞。
【0100】在一个实施方式中，提供了用于储存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、 和/或自体干细胞样品的细胞库。在另一个实施方式中，提供了用于施用这种细胞库 的方法。美国专利申请公开号20030215942在此引入全文作为参考，其提供了干细胞 库系统的实例。
【0101】使用如上面所描述的方法，单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或 自体干细胞样品的分离和体外繁殖以及它们的冷藏帮助建立可移植人干细胞“库”。 因为有可能储存更小的细胞等分试样，建库过程可以占据相对小得空间。因此，许多 个体的细胞可以以短期或长期基础、以相对少的费用被储存或“库存”。
【0102】在一个实施方式中，在加工和储存之前或之后，使一部分样品用于测试。
【0103】本发明还提供了纪录或指示(索引，indexing)单性生殖激活的卵母细胞、 胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品的方法，以便当需要查找样品时，它可以容易地 被找回。任何指示和检索系统(indexing and retrieval system)可以被用于实施此目的。 任何合适的存储系统类型可以被应用，以便能够贮存单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、 ICM、和/或自体干细胞。样品可以被设计以储存单独的样品，或可以被设计以储存 数百、数千、甚至数百万的不同细胞样品。
【0104】单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品可以被指示， 以便可靠和准确地找回。例如，每一样品可以以字母数字编码、条形码、或任何其它 方法或它们的组合来标记。还可以有可得到的和可读的信息列表，其能够识别每一单 性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品和它们在库中的位置以 及能够识别库外的细胞样品的来源和/或类型。这种指示系统可以以本领域任何熟知 的方式操作，例如，手工地或非手工地操作，例如，可以应用计算机和常规软件。
【0105】在一个实施方式中，使用指示系统组织(organized)细胞样品，以便对于供 体的使用，无论什么时间需要，样品都将是可得到的。在其它实施方式中，细胞样品 可以被与起初供体相关的个体使用。一旦在被记录到指示系统中，细胞样品可以用于 匹配目的，例如，匹配程序将确定具有匹配类型信息的个体以及个体将具有被提供匹 配样品的选择。
【0106】储存库系统(storage banking system)可以包括用于储存多个记录的系统， 所述记录与多个个体和多个细胞样品有关。每条记录可包含类型信息，与细胞样品或 具体个体相关的基因型信息或表型信息。在一个实施方式中，系统将包括交叉-匹配 表(cross-match table)，其将样品类型与想接受样品的个体的类型相匹配。
【0107】在一个实施方式中，数据库系统储存了在库中的每一单性生殖激活的卵母细 胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞样品的信息。某些信息与每一样品关联储存。信 息可以与具体供体，例如，供体的身份和供体的医疗史相关。例如，每一样品可以是 HLA分型的并且HLA类型信息可以与每一样品关联储存。储存的信息还可以是可利 用信息。每一样品储存的信息是可搜索的，并且以样品可以被查找(定位)和立即提 供给客户这样的方式鉴定样品。
【0108】因此，本发明的实施方式使用基于计算机的系统，所述系统包含信息例如供 体、提交日期、提交细胞的类型、存在的细胞表面标志物类型、关于供体的遗传信息、 或其它相关的信息、以及例如保藏记录和储存样品的位置的储存细节、和其它有用的 信息。
【0109】术语“基于计算机的系统”指代硬件，软件，和任何用于储存、搜索和检索 关于储存细胞的信息的数据库。基于计算机的系统优选地包括上面所描述的储存介 质，和用于存取和操作数据的处理器。这种实施方式的基于计算机系统的硬件包括中 央处理单元(CPU)和数据库。技术人员可以容易地知道，目前可用的任何一种基于 计算机系统都是适合的。
【0110】在一个实施方式中，计算机系统包括与母线(总线，bus)相连的处理器， 母线与主存储器(优选地执行为RAM)和许多辅助存储设备例如硬盘驱动器和可移 动介质存储设备相连。可移动介质存储设备可以表现为，例如，软盘驱动器、DVD 驱动器、光盘驱动器、只读光盘驱动器(compact disk drive)、磁带驱动器等。可移 动存储介质例如软盘、只读光盘、磁带等可以被插入到可移动储存设备中，所述可移 动存储介质包含记录在其中的控制逻辑和/或数据。计算机系统包括合适的软件，用 于在插入可移动介质存储设备中时阅读来自可移动介质存储设备的控制逻辑和/或数 据。关于单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞的信息可以以众 所周知的方式存储在主存储器、任何辅助存储设备、和/或可移动存储介质中。在运 行期间，用于存取和处理这些数据的软件(例如搜索工具、比较工具等)保留在主存 储器中。
【0111】如本文所用，“数据库”指代存储器，其能够存储与单性生殖激活的卵母细 胞和/或自体干细胞集合和供体相关的任何有用的信息。
【0112】与存储的单性生殖激活的卵母细胞，胚泡，ICM，和/或自体干细胞相关的 数据可以在多种格式的多种数据处理程序中被存储和操作。例如，数据可以作为文本 存储在文字处理文件中，如Microsoft WORD或WORDPERFECT，ASCII文件，html 文件，或以本领域技术人员熟悉的多种数据库程序如DB2、SYBASE、或ORACLE 存储在pdf文件中。
【0113】“搜索程序(search program)”指代一个或多个程序，其在基于计算机的 系统上执行，以便搜索与数据库中的冷藏样品有关的细节或比较与数据库中的冷藏样 品有关的信息。“检索程序(retrieval program)”指代一个或多个程序，其在基于计 算机的系统上执行，以便识别数据库中的感兴趣的参数。例如，检索程序可以用于发 现适合具体特征的样品，具有特定标志物或DNA序列的样品，或用于发现对应于具 体个体的样品位置。
【0114】能够被储存于一个细胞库中的细胞样品的数目没有上限。在一个实施方式中， 来自不同个体的数百个产品被储存在一个库或储存设备(storage facility)中。在另一 个实施方式中，多达数百万的产品被储存在一个储存设备中。单个储存设备可以被用 于储存单性生殖激活的卵母细胞和/或自体干细胞样品，或多个储存设备可以被应用。
【0115】在本发明的一些实施方式中，储存设备可以具有用于组织和指示储存的细胞 样品的任何方法的手段，例如，自动机器人检索装置和细胞样品操作装置。设备可以 包括用于处理细胞样品的微操作装置。已知的常规技术可以被用于有效储存和找回细 胞样品。示范性技术包括但不限于机器视觉(Machine Vision)、机器人、自动引导 车系统(Automated Guided Vehicle System)、自动储存和检索系统、计算机集成制造、 计算机辅助工艺设计、统计过程控制等。
【0116】与需要样品的个体有关的类型信息或其它信息可以被记录在系统中，其可以 被用于鉴定合适的匹配产品，如，例如，数据库系统，指示系统等。一旦在系统中被 记录，则个体与供体细胞样品的类型之间可以进行匹配。在优选的实施方式中，供体 样品来自与需要样品的个体相同的个体。然而，也可以使用相似但不相同的供体/接 受体匹配。对于具有匹配类型标识符的个体，匹配样品是可得的。在本发明的一个实 施方式中，个体的识别信息与细胞样品关联储存。在一些实施方式中，匹配过程发生 在大约收获样品的时间，或可以发生在处理、存储期间的任何时间，或在出现需求时。 因此，在本发明的一些实施方式中，匹配过程发生在个体实际需要细胞样品之前。
【0117】当个体需要单性生殖激活的卵母细胞、胚泡、ICM、和/或自体干细胞时， 如果需要，可以在几分钟内找到它并且使其可用于研究、移植或其它目的。也可以进 一步处理样品以便制备样品用于移植或其它需求。
【0118】通常地，在这个阶段卵母细胞排卵和经过精子受精。精子在所谓的激活过程 中开始完成减数分裂。在激活过程中，染色单体对分离，第二极体被挤出，以及卵母 细胞保留单倍数目的染色体，每一个染色体具有一个染色单体。精子贡献染色体的另 一单倍体互补物，以便形成具有单个染色单体的完整的二倍体细胞。随后染色体在第 一次细胞周期期间经过DNA合成而发展。这些细胞随后发育成为胚胎。
【0119】相反地，本文所描述的胚胎通过细胞的人工激活而发育，所述细胞一般为哺 乳动物卵母细胞或包含所有雄性或雌性来源DNA的卵裂球。如本发明背景中讨论的， 在文献中已经报道了未受精卵母细胞的人工激活方法。这样的方法包括物理方法，例 如，机械方法例如刺破、操作培养中的卵母细胞；热方法例如冷却和加热；反复电脉 冲；酶处理例如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶；渗透处理；离子处理例如利用 二价阳离子和钙离子载体，例如离子霉素和A23187；麻醉剂的使用例如醚、乙醇、 丁卡因、利诺卡因、普鲁卡因、吩噻嗪；镇定剂例如甲硫哒嗪、三氟啦嗪、氟奋乃静、 氯丙嗪；蛋白质合成抑制剂的使用例如环己酰亚胺(放线菌酮)、嘌呤霉素；磷酸化 作用抑制剂的使用，例如蛋白质激酶抑制剂例如星形孢菌素(staurosporine)、2-氨 基嘌呤、鞘氨醇、和DMAP；它们的组合；以及其它方法。
【0120】在本领域这些方法是已知的，并且在美国专利第5,945,577中讨论，在此引 用以作参考。
【0121】在一个实施方式中，在中期II中的人细胞，一般是包括所有雄性或雌性来 源的DNA的卵母细胞或卵裂球，被人工激活用于引起卵母细胞的人工激活。
【0122】在一个相关的方面，激活的细胞，例如，卵母细胞——其为二倍体，可以发 育成为包含滋养外胚层和内细胞团的胚胎。这可以使用已知的方法和帮助胚泡发育的 培养基来实现。
【0123】在单雌生殖胚胎已经被培养产生可辨别的滋养外胚层和内细胞团之后，内细 胞团的细胞随后被用于产生希望的多能细胞系。这可以通过将来自内细胞团的细胞或 整个内细胞团转移到抑制分化的培养物上而完成。这可以通过将内细胞团细胞转移到 抑制分化的饲养层上而完成，例如成纤维细胞或上皮细胞，例如从出生后人类组织得 到的成纤维细胞等，或产生LIF的其它细胞。为将细胞保持在未分化状态，可以使用 其它的因子/成分以提供合适的培养条件，包括但不限于，加入条件培养基(Amit等， Developmental Biol(2000)227：271-278)、bFGF和TGF-β1(含有或不含有LIF)(Amit 等，Biol Reprod(2004)70：837-845)、激活gp130/STAT3途径的因子(Hoffman和 Carpenter，Nature Biotech(2005)23(6)：699-708)、激活PI3K/Akt，PKB途径的因子(Kim 等，FEBS Lett(2005)579：534-540)、为骨形成蛋白(BMP)超家族成员的因子(Hoffman 和Carpenter(2005)，出处同上)、以及激活规范/β-联蛋白(canonical/β-catenin)Wnt 信号途径的因子(例如，GSK-3-特异性抑制剂；Sato等，Nat Med(2004)10：55-63)。 在一相关的地方面，这些因子可以包含含有饲养细胞和/或ECM基底的培养条件 (Hoffman和Carpenter(2005)，出处同上)。
【0124】在一方面，内细胞团细胞在人出生后包皮或皮肤成纤维细胞或产生白细胞抑 制因子的其它细胞上，或在白细胞抑制因子存在的情况下被培养。在一相关的方面， 在ICM种植(seeding)之前，饲养细胞被失活。例如，饲养细胞可以使用抗生素被 有丝分裂失活。在一相关方面，抗生素可以是丝裂霉素C，但不限于此。
【0125】培养将在这样的条件下进行，所述条件将细胞维持在未分化的多能状态下达 延长的时期，理论上无限期。在一个实施方式中，卵母细胞在高O2张力下用钙离子 载体被单性生殖激活，随后使卵母细胞在低O2张力下与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接 触。从单性生殖激活的卵母细胞得到的ICM在高O2张力下被培育，其中例如使用含 有20％ O2的气体混合物维持细胞。在另一方面，可培养是指能够或适于被培养。在 一相关的方面，在胚泡培养四天之后，机械地进行ICM分离，其中培养在饲养细胞 上进行。这样的培养，例如，排除了使用来自动物来源的材料的需求——如免疫切除 法的情况。
【0126】在一相关的方面，用于ICM的培养基补充有非动物血清，包括但不限于， 人脐带血清，其中血清在确定成分培养基中存在(例如，IVF，可从MediCultA/S， Denmark；Vitrolife，Sweden；或Zander IVF，Inc，Vero Beach，FL获得)。另一方面， 所提供的培养基和过程不含动物产品。在一相关方面，动物产品是那些来自非人来源 的产品，包括血清、干扰素、趋化因子、细胞因子、激素、以及生长因子。
【0127】本发明产生的多能状态的细胞可以通过多种方法确认。例如，可以测试细胞 中特征性ES细胞标志物的存在或不存在。在人类ES细胞的情况下，这种标志物的 实例如上述被鉴定，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT4， 它们在本领域中是已知的。
【0128】而且，可以通过将细胞注射到合适的动物例如SCID小鼠中和观察分化细胞 和组织的产生来确认多能性。确认多能性的又一方法是，使用对象多能细胞产生嵌合 动物以及观察引入细胞对不同细胞类型的贡献。生产嵌合动物的方法在本领域中是公 知的，并且在美国专利第6,642,433号中描述，其在此引用作为参考。
【0129】确认多能性的又一方法是，在有利于分化的条件下(例如，成纤维细胞饲养 层的移除)培养时，观察到ES细胞分化为拟胚体和其它分化细胞类型。这一方法已 经被使用，并且已经确认，对象多能细胞在组织培养中产生拟胚体和不同的分化细胞 类型。
【0130】得到的多能细胞和细胞系，优选人多能细胞和细胞系——其来自全部雌性来 源的DNA，具有多种治疗和诊断应用。在多种疾病状态的治疗中，这种多能细胞可 以被用于细胞移植治疗或基因治疗(如果被遗传修饰)。
【0131】就此而言，已知小鼠胚胎干(ES)细胞能分化成几乎任何细胞类型。因此， 根据本发明产生的人多能(ES)细胞应当具有类似的分化能力。根据本发明的多能 细胞将根据已知方法被诱导分化，得到期望的细胞类型。例如，根据本发明产生的人 ES细胞可以被诱导分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、视 网膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞等，这是通过在分化培养基中和在提供进 行细胞分化的条件下培养这些细胞来实施的。引起ES细胞分化的培养基和方法与合 适的培养条件一样，是本领域已知的。
【0132】例如，Palacios等，Proc，Natl.Acad，USA，92；7530-7537(1995)教导了造 血干细胞从胚细胞系的产生，通过使干细胞接受诱导过程实施，所述诱导过程包括： 最初，在缺乏视黄酸的悬浮培养基中，培养这种细胞的聚集体，随后，在包含视黄酸 的相同培养基中进行培养，随后，将细胞聚集体转移到提供用于细胞粘附的基底上。
【0133】而且，Pedersen，J，.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-552(1994)是综述性论文，其引 用了公开体外分化胚胎干细胞产生多种分化细胞类型的方法的许多论文，所述细胞类 型包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。
【0134】并且，Bain等，Dev.Biol.，168：342-357(1995)教导了体外分化胚胎干细 胞产生具有神经元性质的神经细胞。这些参考文献示范了用于从胚细胞或干细胞获得 分化细胞的已报道方法。这些参考文献、特别是其中与分化胚胎干细胞的方法相关的 公开内容，在此整体引入以作参考。因此，使用已知的方法和培养基，本领域技术人 员可以培养对象ES细胞，包括基因工程化的或转基因的ES细胞，以取得希望的分 化细胞类型，例如，神经细胞、肌细胞、造血细胞等。通过本文所描述的方法产生的 多能细胞可被用于获得任何希望的分化细胞类型。分化的人类细胞的治疗用途是空前 的。例如，人造血干细胞可以被用于需要骨髓移植的医学治疗中。这种过程被用于治 疗许多疾病，例如，晚期癌症如卵巢癌和白血病，和损害免疫系统的疾病如AIDS。 造血干细胞可以如下取得，例如，通过将来自雄性或雌性癌症或AIDS患者的雄性或 雌性DNA与去核卵母细胞整合，得到如上述的多能细胞，和在有利于分化的条件下 培养这样的细胞，直到得到造血干细胞。这样的造血细胞可以被用在包括癌症和AIDS 的疾病的治疗中。
【0135】可选地，通过在产生神经细胞系的分化条件下培养对象多能细胞(the subject pluripotent cells)，所述多能细胞可以被用于治疗患有神经疾病的患者。能够通过移 植这样的人神经细胞治疗的具体疾病示范性地包括，帕金森病、阿尔茨海默病、ALS 和大脑性麻痹等。在帕金森病的具体情况下，已经证实，移植的胎儿脑神经细胞与周 围细胞正确连接并且产生多巴胺。这可以使得帕金森病症状长期逆转。在一个相关的 方面，神经前体可以用于恢复(reanneal)切断的/受伤的神经纤维，以便在手、腿、 和脊髓损伤后恢复运动。
【0136】本发明的一个目标提供基本上无限的多能人细胞供应，所述细胞可以被用于 产生适合于对卵母细胞供体进行自体移植的分化细胞。人胚胎干细胞和来自胚泡的它 们的分化后代——其在不育治疗后残留，或使用NT产生，当用在异基因细胞移植治 疗中时，可能会被受体的免疫系统排斥。单性生殖产生的干细胞会产生分化细胞，其 能减轻与目前移植方法相关的重要问题，例如，可能因为相对于卵母细胞供体的宿主 -抗-移植物或移植物-抗-宿主排斥而发生的移植组织排斥。常规地，通过施用抗排斥 药物例如环孢菌素来预防或减轻排斥。但是，这样的药物具有显著的副作用，例如抑 制免疫、致癌性质、和非常昂贵。所公开的方法产生的细胞会消除或至少大大降低相 对于卵母细胞供体的抗排斥药物的需求。
【0137】本发明的另一个目标是提供基本上无限的多能人细胞供应，所述细胞可以被 用于产生适合于卵母细胞供体家族成员(例如，同胞)的异基因移植的分化细胞。这 种细胞对于卵母细胞供体的直系家族成员的细胞在免疫和遗传方面将是相似的，因此 被供体的家族成员排斥的可能性低。
【0138】本方法的另一个目标是，与SCNT比较时，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激 活是相对简单的方法，并且使得用更少的细胞操作产生干细胞。
【0139】已经显示，在干细胞产生方面，哺乳动物卵母细胞的单性生殖激活比需要用 机械操作卵母细胞的方法(例如，SCNT)更有效。
【0140】SCNT的一个缺点是，线粒体呼吸链活性不足的对象表现出与通常在SCNT 胎儿和子代中遇到的表现型异常惊人相似的表现型(Hiendleder等，Repro Fertil Dev (2005)17(1-2)：69-83)。细胞通常仅仅含有一种类型的线粒体DNA(mtDNA)，其 被称为同型异源性，但是，异质性确实存在，通常作为突变和野生型mtDNA分子的 组合或形成野生型变体的组合(Spikings等，Hum Repro Update(2006)12(4)：401-415)。 因为异质性可以导致线粒体疾病，因此存在多种机制以确保仅仅母系的传送 (maternal-only transmission)。但是，随着绕过用于维持同型异源性的正常机制的方 案(例如，胞浆运输(CT)和SCNT)越来越多的应用，扰乱的线粒体功能对于来自 这些来源的干细胞可以是内在的。
【0141】在一方面，因为孤雌生殖体是单亲的，异质性的可能性被最小化。
【0142】可以由细胞疗法治疗的其它疾病和病示范性地包括，脊髓损伤、多发性硬化 症，肌肉萎缩症，糖尿病，肝病包括急性疾病(病毒性肝炎、药物过量(对乙酰氨基 酚)和其它)、慢性疾病(慢性肝炎和其它(通常导致硬化))、遗传性肝脏疾病(血 友病B、因子IX缺乏、胆红素代谢缺陷、尿素循环缺陷、溶酶体贮积病、a1-抗胰蛋 白酶缺陷和其它)，心脏疾病，软骨替代(cartilage replacement)，烧伤，足部溃疡， 胃肠疾病，脉管疾病，肾病，视网膜疾病，尿路疾病，和衰老相关性疾病和病。
【0143】这种方法可以被用于替代缺陷的基因，例如，缺陷的免疫系统基因、囊性纤 维化基因，或被用于引入引起治疗有利的蛋白质表达的基因，所述蛋白质例如生长因 子、淋巴因子、细胞因子、酶等。
【0144】例如，编码脑衍生生长因子的基因可以被引入根据本发明产生的人多能细胞 中，该细胞分化成神经细胞并且该细胞被移植进入帕金森患者体内以延缓这种病期间 神经细胞的丢失。
【0145】并且，本多能人ES细胞可以被用作体外分化模型，尤其用于参与早期发育 调节的基因的研究。而且，使用本ES细胞而产生的分化细胞组织和器官可以在药物 研究中被使用。
【0146】进一步地，本ES细胞或由其得到的分化细胞可以被用作产生其它ES细胞 和细胞集落的核供体。
【0147】更进一步地，根据本公开内容得到的多能细胞可以用于鉴定参与胚胎发生的 蛋白质和基因。这可以通过例如差异表达实施，即，通过比较根据本发明提供的多能 细胞中表达的mRNAs和当这些细胞分化成不同的细胞类型例如神经细胞、心肌细胞、 其它肌细胞、皮肤细胞等时所表达的mRNAs。因此，有可能确定哪种基因参与了特 定细胞类型的分化。
【0148】进一步地，具有特定遗传缺陷如导致杜兴肌营养不良(Duchene’s Muscular Dystrophy)的遗传缺陷的ES细胞和/或它们的分化后代，可以被用作研究与该遗传 缺陷相关的特定疾病的模型。
【0149】并且，本公开内容的另一个目标是，以不同浓度以及在不同细胞培养条件下， 例如，在不同细胞基质中或在不同的气体分压下培养，使根据所述方法产生的多能细 胞系暴露于不同生长因子的混合物，以便确定诱导期望的分化细胞类型产生和繁殖的 条件。
【0150】下述的实施例意图说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
人单性生殖胚胎发生干细胞的产生
【0151】材料和方法
【0152】供体自愿地捐献卵母细胞、卵丘细胞(cumulous cell)和血液(用于DNA 分析)而没有支付金钱。供体签署全面知情同意文件并且被告知所有的捐献材料被用 于研究而不是用于生殖目的。在卵巢刺激之前，根据针对人类细胞、组织和基于细胞 和组织的产品的FDA合格测定指南(Food and Drug Administration.(Draft)Guidance for Industry：Eligibility Determination for Donors of Human Cells，Tissues，and Cellular and Tissue Based Products(HCT/Ps)，2004年5月)和俄罗斯公共卫生部第N67号 (02.26.03)，卵母细胞供体接受医学适应性检查。其包括X-射线、血液和尿液分析、 和肝功能试验。供体还被筛查梅毒、HIV、HBV、和HCV。
【0153】使用标准的激素刺激产生对象供体的过排卵，得到卵母细胞。在她们月经周 期的第3天到第13天，每一供卵经历通过FSH的卵巢刺激。给予总共1500IU的FSH。 从供体月经周期的第10天到第14天，以每日0.25毫克注射促性腺激素释放素拮抗 剂Orgalutran(Organon，Holland)。从供体的月经周期第12天到第14天，每日注射 75IU FSH+75IU LH(Menopur，Ferring GmbH，Germany)，如果超声波检查显示卵 泡直径为18mm到20mm之间，则在供体月经周期的第14天施用单剂量的8000IU hGC(Choragon，Ferring GmbH，Germany)。在大约第16天，hCG注射之后35小时， 进行经阴道穿刺。通过超声波引导的针抽吸，将来自麻醉供体囊状卵泡的卵泡液收集 到无菌试管中。
【0154】从卵泡液中选出卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在冲洗培养基(Flushing Medium)(MediCult)中冲洗，随后在20％ O2、5％ CO2，37℃潮湿气氛下，在具有液 体石蜡覆盖物的通用IVF培养基(Universal IVF medium)(Medocult，见表1)中 孵育2小时。
表1.IVF培养基
组成 氯化钙 EDTA 葡萄糖 人血清白蛋白 硫酸镁 青霉素G 氯化钾 磷酸二氢钾 碳酸氢钠 氯化纳 乳酸钠 丙酮酸钠 水
【0155】在激活之前，卵丘卵母细胞复合体(COCs)用SynVitro Hyadase(MediCult， A/S，Denmark)处理而去除卵丘细胞，随后在带有石蜡覆盖物的通用IVF培养基中孵 育30分钟。
【0156】从此时起，除离子霉素处理外，卵母细胞和胚胎的培养在37℃下使用O2减 少的气体混合物(90％N2+5％O2+5％CO2)在潮湿气氛中进行。卵母细胞通过在20％ O2、5％CO2的气体环境中，在37℃下，在CO2培养箱中，在5μM离子霉素中孵育5 分钟，随后在37℃下，在90％N2、5％ O2、5％ CO2的气体环境中，在带有石蜡覆盖 物的IVF培养基中，用1mM 6-二甲氨基嘌呤(DMAP)培养4小时而被激活。卵母 细胞随后在IVF中洗涤3次。激活和培养在4孔板(Nunclon，A/S，Denmark)中、 在覆盖有液体石蜡油(MediCult，A/S，Denmark)的500μl培养基中进行。
【0157】激活的卵母细胞在含有5％ O2、5％ CO2、90％N2的气体环境中在IVF培养 基中培育，从激活的卵母细胞产生的胚胎在相同的气体混合物中被培养。
【0158】在上述条件下(即，低O2张力)使激活的卵母细胞在IVF培养基中孵育， 直到观察到Blastocyst Scoring Modification为1AA或2AA的含有内细胞团(ICM) 的完全膨胀的胚泡(Shady Grove Fertility Center，Rockville，MD，和Georgia Reproductive Specialists，Atlanta，GA)。
【0159】用0.5％的链霉蛋白酶(Sigma，St.Louis)处理，以去除透明带。通过免疫 外科分离来自胚泡的ICM，其中胚泡用针对人脾细胞的马抗血清孵育，随后暴露于 豚鼠补体。通过轻轻地吸取处理的胚泡从ICM去除滋养外胚层细胞。
【0160】对于ICM从整个胚泡的产生，胚泡被放置在被设计用于培养phESC的培养 基(即，VitroHESTM培养基(例如，DMEM/高葡萄糖培养基，VitroLife，Sweden)， 补充有10％的人类脐带血血清、5ng/ml人重组LIF(Chemicon Int’l，Inc，Temecula，CA)、 4ng/ml重组人FGF(Chemicon Int’l，Inc，Temecula，CA)和青霉素-链霉素(100U/100μg)) 中的饲养层上。当胚泡附着和质体细胞扩展时，ICM成为可见的。经过三到四天的 额外培养，使用精细拉伸的(finely drawn)玻璃吸管，通过机械切割ICM，将ICM 从滋养外胚层生长物分离出来。进一步地，在37℃、在5％ CO2和5％ O2中的96孔 板中，在VitroHESTM培养基(如上面阐述的)中，ICM细胞在有丝分裂失活的出生 后皮肤成纤维细胞的饲养细胞层上培养。这种气体混合物被用于培养干细胞。使用非 动物材料进行人成纤维细胞培养。成纤维细胞的失活使用10μg/ml的丝裂霉素C (Sigma，St.Louis，MO)进行3小时。
【0161】在一个单独的方法中，通过用针对人脾细胞的马抗血清孵育卵泡、随后暴露 于兔补体实施免疫外科。通过轻轻地吸取处理的胚泡，从ICM去除滋养外胚层细胞。 在得自遗传上不相关个体的(双亲许可)的新生儿人皮肤成纤维细胞(HSF)的饲养 层上实施分离ICMs的进一步培养，使用包含人脐带血血清的培养基得到。HSF饲养 层使用丝裂霉素C被有丝分裂失活。
【0162】用于HSF培养的培养基由90％ DMEM(高葡萄糖，带有L-谷氨酰胺 (Invitrogen)，10％人脐带血血清和青霉素-链霉素(100U/100mg)Invitrogen)组成。
【0163】为培养ICM和phESC，使用补充有4ng/ml hrbFGF、5ng/ml hrLIF和10％人 脐带血血清的VitroHESTM(Vitrolife)。ICM被机械地铺在新鲜的饲养层上并且培养3 到4天。第一集落被机械地切割去掉并且在培养五天后被重新铺置。在培养五到六天 之后得到所有随后的传代细胞(passage)。对于早期的传代细胞，集落被机械地分成 簇并且重新铺置。phESC的进一步传代用胶原酶IV处理和机械分离进行。phESC的 繁殖在37℃下、5％CO2下、在潮湿气氛中进行。
【0164】卵母细胞激活
【0165】从最初的供体，四个卵母细胞被激活，并且激活的卵母细胞在包括5％ O2、 5％ CO2和90％N2的气体环境中在IVF培养基中被培育，并在五(5)天期间进行。
表2显示了激活卵母细胞的成熟过程。每个卵母细胞在4-孔板中被分离。
表2.培养的激活的卵母细胞*
第一天 第二天 第三天 第五天 N1 1前核(pn) 1极体(pb) 2个卵裂球(bl)，相等 分裂(fr)-0％ 4bl，相等 Fr-2％ 1个桑椹胚 fr-15％ N2 0pn， 1pb 4bl，不相等 Fr-4％ 5bl，不相等 Fr-20％ 4bl，不相等 fr-40％
N3 1pn， 1pb 2bl，不相等 Fr-0％ 6bl，相等 fr-0％ 早期胚泡 N4 1pn， 1pb 4bl，相等 fr-10％ 4bl，相等 fr-20％ 具有优良ICM 1AA的完全膨 胀的胚泡
*细胞第一天在M1TM培养基(MediCult)中孵育，在第2-5天在M2TM培养基(MediCult) 中孵育。培养基每天变化。M1TM和M2TM包含人血清白蛋白、葡萄糖和衍生的代谢 物、生理盐、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素、核苷酸、碳酸氢钠、链霉素(40mg/l)、 青霉素(40.000IU/l)和酚红。
【0166】内细胞团从N4中被分离并且被转移到如上面所述的人成纤维饲养细胞。N1 和N2在第六天退化。而且，在第六天，N3产生完全膨胀的胚泡，ICM为2AB。N3 随后在第六天被转移到人成纤维饲养细胞。来自N4的ICM未改变。N3被用于分离 干细胞。
【0167】ICM细胞在VitroHESTM培养基中、在含有5％ CO2和95％ N2的气体环境中 被培育并进行四十五(45)天。表2a显示N3ICM细胞培养的过程。
表2a.N3-ICM培育的过程*
第3天 ICM，在新鲜饲养细胞上移植。 第8天 细胞集落被机械分成6份，并在96-孔板的3个孔中培育——第一代。 第14天 从第一代细胞的5个集落，细胞被机械地分开，第二代的20个集落 在24-孔板的3个孔中被培育。 第20天 细胞被铺在35mm的皿中——第三代 第24天 对五(5)个35mm的皿种植细胞——第四代。在室温下用5％链霉 蛋白酶(Sigma)化学分开第一个皿。 第30天 对二十五(25)个35mm种植细胞——第五**代 第34天 第六**代细胞 第35天 从第六代细胞冷冻11个安瓿 第37天 第七**代细胞 第44天 从第七代细胞冷冻12个安瓿 第45天 第八代细胞
*细胞在M2TM培养基(MediaCult)中成长
**这些传代细胞用链霉蛋白酶消化得到
【0168】干细胞分离
【0169】从5个供体的卵母细胞，使用MediCult培养基随后在减少的氧气下培养， 使得在培养的第五天或第六天产生23个胚泡。胚泡中的11个具有可见的ICMs(表 3)。
表3.孤雌生殖体和单性生殖胚胎干细胞系的产生
1-二个卵母细胞没有被激活；2-一个卵母细胞在激活后退化；3-一个卵母细胞未被激活；
4-二个卵母细胞处于中期阶段I并且被弃去。
【0170】这些结果表明，从单性生殖激活的卵母细胞中形成胚泡的成功率是大约 57.5％。
【0171】免疫组织化学染色
【0172】对于免疫染色，hES细胞集落和在饲养层上的phESC细胞被种植在微盖玻 片上，用PBS洗涤二次并且用100％甲醇在-20℃固定5分钟。细胞用 PBS+0.05％Tween-20洗涤二次并且在室温下用PBS+0.1％ Triton X-100渗透10分钟。 细胞洗涤后，通过在室温(RT)下使用封闭液(PBS+0.05％Tween-20+4％羊血清加 3％人脐带血血清)温育30分钟，封闭非特异性结合。在封闭液中稀释单克隆抗体并 在室温下使用1小时：SSEA-1(MAB4301)(1：30)，SSEA-3(MAB4303)(1： 10)，SSEA-4(MAB4304)(1：50)，OCT-4(MAB4305)(1：30)，TRA-1-60 (MAB4360)(1：50)，和TRA-1-81(MAB4381)(1：50)，来自Chemicon。 细胞洗涤之后，第二抗体Alexa Fluor 546(橙色荧光)和488(绿色荧光)(Molecular Probes，Invitrogen)在PBS+0.05％Tween-20中1：1000稀释，并在室温下应用一小时。 洗涤细胞，并且在室温下在10分钟期间用PBS+0.05％Tween-20中的DAPI(Sigma) 0.1μg/ml对核染色。洗涤细胞并用Mowiol(Calbiochem)裱在载玻片上。用荧光显微镜 可以看见荧光图象。
【0173】为了检测三周龄拟胚体或有收缩性的拟胚体中的中胚层标志物，应用单克隆 鼠抗结蛋白(anti-desmina)抗体抗人α肌动蛋白抗体(Chemicon)作为肌肉特异性标 志物，抗人CD31/PECAM-1抗体(R&D Systems)、抗人VE钙粘蛋白(DC144)抗体 (R&D Systems)作为内皮标志物。
【0174】为检测拟胚体中的内胚层标志物，应用单克隆鼠抗人α-甲胎蛋白抗体(R&D Systems)。
【0175】碱性磷酸酶和端粒酶活性
【0176】根据AP试剂盒和TRAPEZETM试剂盒(Chemicon)的制造商说明书，进行 碱性磷酸酶和端粒酶活性测定。
【0177】核型分析
【0178】为了分析核型，hES细胞用10μg/ml秋水仙胺(Sigma)处理二小时，用0.05％ 胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)收获并且以700×rpm离心三分钟。沉淀物在5ml的0.56％ KCL中重悬浮，并且在室温下温育15分钟。在重复离心之后，去除上清液并重悬浮 细胞，和在+4℃下用5ml的甲醇/醋酸(3：1)冰冷混合物固定细胞5分钟。重复固 定细胞二次，随后将细胞悬浮液放置到显微镜载玻片上，用Giemsa修改型染色 (Giemsa Modified Stain)(Sigma)对制备物染色。通过标准的G-显带法分析用这种方 式制备的细胞的中期。5/1000的中期分散量(metaphase spreads)被显示并且63个中期 被分析。
【0179】拟胚体形成
【0180】hES和phESC细胞集落被机械地分成簇并且被铺在24孔板的孔中，所述板 预先包被有1.5％琼脂糖(Sigma)，在含85％ Knockout DMEM、15％人脐带血血清、 1×MEM NEAA、1mM Glutamax、0.055mMβ-巯基乙醇、青霉素/链霉素(50U/50mg)、 4ng/ml hrbFGF的培养基中(所有材料选自Invitrogen，除了血清)。人类EBs在悬浮培 养中培养14天并被铺在培养皿上以产生生长物或再悬浮培养一周。
【0181】神经分化通过在1周时期内、在分化培养基中培养二周龄的拟胚体而诱导， 所述拟胚体附着在培养皿表面，所述分化培养基为：DMEM/F12、B27、2mM Glutamax、 青霉素/链霉素(100U/100μg)和20ng/ml hrbFGF(都来自Invitrogen)。一些拟胚体产 生具有神经形态的分化细胞，其它被切开和再培养以产生神经球(neurosphere)。
【0182】在与用于拟胚体产生的培养基相同的培养基中，在铺于附着表面后培养5 天后，节律性搏动(Rhythmically beating)的拟胚体自发出现。
【0183】HLA分型
【0184】用来自Dynal的Dynabeads DNA Direct Blood(Invitrogen)从供体血液、hES、 phESC细胞、和人新生儿皮肤成纤维细胞(NSFs)中提取基因组DNA。根据制造商 的说明书，应用等位基因特异测序引物(PCR-SSP，Protrans)通过PCR进行HLA 分型。HLA I类基因(HLA A*，B*，Cw*)用定义A*01-A*80、B*07-B*83、Cw*01-Cw*18 区的PROTRANS HLA A*B*Cw*来分型。HLA II类基因(HLA DRB1*，DRB3*， DRB4*，DRB5*，DQA1*，DQB1*)用定义DRB1*01-DRB1*16(DR1-DR18)、DRB3*、 DRB4*、DRB5*区的PROTRANS HLA DRB1*和定义DQQB1*02-DQB1*06 (DQ2-DQ9)、DQA1*0101-DQA1*0601区的PROTRANS HLA DQB1*DQA1*来分 析。PCR扩增在下列条件下取得：94℃，2分钟；94℃，10秒，65℃，1分钟，10 个循环；94℃，10秒，61℃，50秒，72℃，30秒，20个循环。扩增产物在琼脂糖凝 胶中检测。
【0185】Affimetrix SNP微阵列分析(microarray analysis)
【0186】通过酚/氯仿抽提法，从血液、卵丘细胞、phESC和NSF分离基因组DNA。 从四个白种人(Caucasian)对象中得到的这些DNA样品用Affimetrix Mapping 50K Hind 240 Array(Affimetrix GeneChip Mapping 100K试剂盒的一部分)被基因分型。最 初，数据集包括57,244个二元的SNP标记。因为标记的数目多于鉴定相等的基因样 品和研究杂合性所需的数目，22个常染色体中的15个(染色体1-15)被选择。较短 的七个染色体被去除，以降低在随机采样期间选择的指定染色体没有标记、或仅有1 个标记的机会。1,459个标记由Relcheck(版本0.67， 2000 Karl W.Broman. Johns Hopkins University，GNU General Public License版本2(1991年6月)下被许 可)分析。
【0187】基因组印记分析
【0188】所有核酸如Li等(J Biol Chem(2002)277(16)：13518-13527)所述制备。使用 Tri-试剂(Sigma)或使用来自Qiagen(Valencia，CA)的RNA制备试剂盒来提取RNA 和DNA。
【0189】含有来自多种样品RNA的RNA印迹(参考图3)通过标准方法(参考，例如， Sambrook等，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989，2nd ed， Cold Spring Harbor Press)被印迹在滤器上。使RNA印迹滤器与特异性杂交于mRNAs 的单链寡核苷酸探针杂交。寡核苷酸探针用[γ32P]ATP(Amersham Biosciences)末端 标记。滤器随后在60℃下用含有0.1％ SDS的0.2×SSC(1×SSC＝0.15M Nacl和0.015M 柠檬酸钠)洗涤3次，每次10分钟，并通过磷屏成像(PhosphorImage)(Molecular Dynamics)分析。寡核苷酸探针的序列得自基于下列登录号(Accession Nos)的序列： NP002393(Peg1_2和Peg1_A；对于这些基因，人类PEG1从二个可选的启动子转录， 获得二个异构体的翻译，其中仅仅一个(异构体1_2)被印记。父系表达异构体1连 同父亲等位基因的外显子中未甲基化的CpG岛发生，而母系基因(异构体1_A)中相 应的CpG岛完全甲基化。参见，例如，Li等(2002)，出处同上)；CAG29346(SNRPN)； AF087017(H19)；NR_001564(X染色体失活特异转录子(inactive X specific transcripts) XIST)；和P04406(GAPDH)。
【0190】DNA指纹分析
【0191】通过酚/氯仿抽提从血液、hES细胞、和NSFs分离基因组DNA，用HinfI 限制酶(Fermentas)消化并加入0.8％琼脂糖凝胶中。电泳后，变性的DNA通过RNA 印迹被转移到尼龙膜(Hybond N，Amersham)并用32P-标记的(CAC)5寡核苷酸探 针杂交。使用Cronex增感屏(intensifying screen)在X射线胶片(Kodak XAR)上 对膜曝光之后分析mData。
【0192】单基因座(Monolocus)PCR基因型分型
【0193】为了确定血液供体DNA和干细胞DNA之间小卫星基因座的等位基因特性， 通过PCR基因型分型分析11个多态性位点((1)3’载脂蛋白B超变小卫星基因座 (3’ApoB)；(2)D1S80(PMCT118)超变小卫星基因座(D1S80)；(3)D6S366； (4)D16S359；(5)D7S820；(6)人冯威勒布兰特因子基因超变小卫星基因座II (vWFII)；(7)D13S317；(8)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座(vWA)； (9)针对CFS-1受体基因微卫星基因座(CSF1PO)的人c-fms原癌基因；(10)人 甲状腺过氧化物酶基因微卫星基因座(TPOX)；以及(11)人酪氨酸羟化酶基因微 卫星基因座(TH01))。将已知人群(例如，俄罗斯和白种-美国人群)中针对上述 多态性位点确定的等位基因的频率与测试样品(例如，hES、NSF、和供体血液DNA) 中这些位点的等位基因频率相比较。对于所公开的分析群体的11个小卫星基因座， 染色体位置、Genbank基因座和基因座解释、重复序列数据、等位基因梯范围(allelic ladderrange)、VNTR梯尺寸范围(VNTR ladder size range)、其它已知等位基因、 等位基因尺寸、PCR方案、和等位基因频率的结果在下文提供。
【0194】(1)3’载脂蛋白B超变小卫星基因座(3’ApoB VNTR)
【0195】染色体位置：2p23-p23
【0196】Genbank基因座和基因座解释(Genbank locus and locus definition)：APOB， 载脂蛋白B(包括Ag(x)抗原)非翻译区
【0197】重复序列5’-3’：
(TATAATTAAATATTTTATAATTAAAATATT)n(SEQ ID NO：1)
【0198】等位基因梯范围(碱基)：450+10+2引物+连接
【0199】VNTR梯尺寸范围(#重复，根据Ludwig等，1989)：30，32，34，36，38， 40，42，44，46，48，50，52
【0200】其它已知等位基因(#重复)：25，27，28，31，33，35，37，39，41，43， 45，47，49，51，53，54，55
【0201】Promega K562DNA等位基因尺寸(#重复)：36/36
【0202】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
如在Verbenko等中所描述(Apolipoprotein B 3’-VNTR polymorphism in Eastern European populations.Eur J Hum Gen(2003)11(1)：444-451)进行分析。参考表4。
表4.俄罗斯人群的等位基因频率
【0203】(2)D1S80(pMCT118)超变小卫星基因座(D1S80 VNTR)
【0204】染色体位置：1p35-36
【0205】Genbank基因座和基因座解释：人D1S80和MCT118基因
【0206】重复序列5’-3’：(GAAGACAGACCACAG)n(SEQID NO：2)
【0207】等位基因梯尺寸范围(碱基)：387-762
【0208】VNTR梯尺寸范围(#重复)：16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28， 29，30，31，34，35，36，37，40，41
【0209】其它已知等位基因(#重复)：13，14，15，38，39，>41
【0210】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：18/29
【0211】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 60℃，30”
延伸 72℃，45”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0212】可以如在Verbenko等中所描述(Allele frequencies for D1S80(pMCT118)locus in some Eastern European populations.J Forensic Sci(2003)48(1)：207-208)进行分析。参 考表5。
表5.俄罗斯人群的等位基因频率
【0213】(3)D6S366
【0214】染色体的位置：6q21-qter
【0215】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0216】等位基因梯尺寸范围(碱基)：150-162
【0217】STR梯尺寸范围(#重复)：12，13，15
【0218】其它已知等位基因(#重复)：10，11，14，16，17
【0219】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：13/14
【0220】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0221】可以如在Efremov等中所描述(An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats.Sud Med Ekspert(1998)41(2)：33-36)进行分析。参见表6。
表6.俄罗斯人群的等位基因频率
【0222】(4)D16S539
【0223】染色体位置：16q24-qter
【0224】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0225】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0226】等位基因梯尺寸范围(碱基)：264-304
【0227】STR梯尺寸范围(#重复)：5，8，9，10，11，12，13，14，15
【0228】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：11/12
【0229】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0230】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表7。
表7.白种-美国人群的等位基因频率
【0231】(5)D7S820
【0232】染色体位置：7q11.21-22
【0233】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0234】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0235】等位基因梯尺寸范围(碱基)：215-247
【0236】VNTR梯尺寸范围(#重复)：6，7，8，9，10，11，12，13，14，
【0237】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9/11
【0238】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0239】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表8。
表8.在不同群体中D7S820的等位基因频率
【0240】(6)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座II(vWFII)
【0241】染色体位置：12p13.3-12p13.2
【0242】GenBank基因座和基因座解释：HUMvWFII，人冯威勒布兰特因子基因
【0243】重复序列5’-3’：(ACAT)n/(AGAT)n
【0244】等位基因梯尺寸范围(碱基)：154-178
【0245】STR梯尺寸范围(#重复)：9，11，12，13，
【0246】其它已知等位基因(#重复)：8，10，14，15
【0247】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：13/13
【0248】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0249】已经如在Efremov等中描述(An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats.Sud Med Ekspert(1998)41(2)：33-36)进行了分析。参见表9。
表9.俄罗斯人群的等位基因频率
【0250】(7)D13S317
【0251】染色体位置：13q22-q31
【0252】GenBank基因座和基因座解释：NA
【0253】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0254】等位基因梯尺寸范围(碱基)：165-197
【0255】STR梯尺寸范围(#重复)：8，9，10，11，12，13，14，15
【0256】其它已知等位基因(#重复)：7
【0257】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：8/8
【0258】PCR方案：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0259】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表10。
表10.在不同人群中D13S317的等位基因频率
【0260】(8)人冯威勒布兰特因子基因超变微卫星基因座(vWA)
【0261】染色体位置：12p12pter
【0262】GenBank基因座和基因座解释：HUMVWFA31，人冯威勒布兰特因子基因
【0263】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0264】等位基因梯尺寸范围(碱基)：139-167
【0265】STR梯尺寸范围(#重复)：14，16，17，18
【0266】其它已知等位基因(#重复)：11，12，13，15，19，20，21
【0267】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：16/16
【0268】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，1’
延伸和引物连接 60℃，2’
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0269】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表11。
表11.在不同人群中HUMVWFA31的等位基因频率
【0270】(9)针对CFS-1受体基因微卫星基因座(CSF1PO)的人c-fms原癌基因
【0271】染色体位置：5q33.3-34
【0272】GenBank基因座和基因座解释：HUMCSF1PO，人c-fms原癌基因
【0273】重复序列5’-3’：(AGAT)n
【0274】等位基因梯尺寸范围(碱基)：295-327
【0275】STR梯尺寸范围(#重复)：7，8，9，10，11，12，13，14，15
【0276】其它已知等位基因(#重复)：6
【0277】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9/10
【0278】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0279】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所描述进行了分析。 参见表12。
表12 白种-美国人的等位基因频率
【0280】(10)人甲状腺过氧化物酶基因微卫星基因座(TPOX)
【0281】染色体位置：2p25.1-pter
【0282】GenBank基因座和基因座解释：HUMTPOX，人甲状腺过氧化物酶基因
【0283】重复序列5’-3’：(AATG)n
【0284】等位基因梯尺寸范围(碱基)：224-252
【0285】STR梯尺寸范围(#重复)：6，7，8，9，10，11，12，13，
【0286】其它已知等位基因(#重复)：无
【0287】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：8/9
【0288】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0289】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表13。
表13.白种-美国人的等位基因频率
【0290】(11)人酪氨酸羟化酶基因微卫星基因座(TH01)
【0291】染色体位置：5q33.3-34
【0292】GenBank基因座和基因座解释：HUMTHO1，人酪氨酸羟化酶基因
【0293】重复序列5’-3’：(AATG)n
【0294】等位基因梯尺寸范围(碱基)：179-203
【0295】STR梯尺寸范围(#重复)：5，6，7，8，9，10，11，
【0296】其它已知等位基因(#重复)：9.3
【0297】Promega K562 等位基因尺寸(#重复)：9.3/9.3
【0298】PCR流程：
热循环仪：DNA Technology Ltd.，俄罗斯
最初温育： 95℃，2’
30个循环的循环：
变性 94℃，45”
引物连接 64℃，30”
延伸 72℃，30”
延伸步骤 72℃，5’
保持步骤 4℃，无限定时间
【0299】已经如在 STR Systems(Silver Stain Detection)Technical Manual No.D004.Promega Corporation，Madison，WI USA：1993-2001中所述进行了分析。参 见表14。
表14.白种-美国人的等位基因频率
【0300】结果
【0301】用这种方法产生的hES细胞显示出胚胎干细胞的许多典型特征：胞质脂质 小体(lipid bodies)、胞浆/核的比例小和可清晰识别的核仁。hES细胞集落显示了与 先前报道的体外受精后产生的人胚胎干细胞相似的形态学。该细胞对磷酸酶碱(图 1A)、八核苷酸结合转录因子4mRNA(Oct-4)(图1B)、阶段特异胚抗原1(SSEA-1) (图1C)、阶段特异胚抗原3(SSEA-3)(图1D)、阶段特异胚抗原4(SSEA-4) (图1E)、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)(图1F)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81) (图1G)的免疫反应性为阳性，对阶段特异胚抗原1(SSEA-1)(图1C)的免疫反 应性为阴性(其对小鼠胚胎干细胞为阳性但对人类并非如此)。端粒酶活性通常与复 制永生化相关并且一般在生殖细胞、癌细胞、和多种干细胞——包括干细胞中被表达， 但在大多数体细胞类型中不存在。通过这种方法制备的细胞在体外繁殖三个月之后， 保持着它们的未分化形态学并显示高水平的端粒酶活性(图2A)。细胞的多能性通 过拟胚体形成在体外被研究(图2B，2C)，G-带核型分析显示，细胞具有正常的人 46XX核型(图2D)。
【0302】在卵母细胞供体血液上、ES细胞上、和HNSF饲养细胞上，通过DNA印 迹和用32P-标记的(CAC)s寡核苷酸探针杂交，和与不同基因座的单基因座聚合酶 链反应(PCR)，进行DNA指纹分析(图2E)。
【0303】对于单基因座PCR，基因型分型揭示，在血液(供体)和OL1DNA之间， 所有基因座(除了一个，D7S820)具有相同的等位基因。参见表15。
表15.单基因座PCR基因型分型
NN 基因座定义 染色体位置 hES NSF 血液 1 3’ApoB 2p24-p23 36/48 36/36 36/48 2 D1S80 1p35-36 18/24 22/31 18/24 3 D6S366 6q21-qter 13/15 17/17 13/15 4 D16S359 16q24-qter 8/13 12/13 8/13 5 D7S820 7q11.21-22 11/11 9/10 10/11 6 vMFII 12p13.3-12p13.2 11/13 9/11 11/13 7 D13S317 13q22-q31 9/12 11/12 9/12 8 vWA 12p12pter 14/18 17/18 14/18 9 CSF1PO 5q33.3-34 12/12 12/13 12/12 10 TPOX 2p25.1-pter 8/11 8/11 8/11 11 TH01 5q33.3-34 6/6 6/9，3 6/6
【0304】所有杂合的供体基因座(除了一个，D7S820)的杂合性(杂合现象)在hES 基因座中没变化。在hESDNA中的D7S820的杂合性(杂合现象)是突变(在微卫星 重复序列中插入一个AGAT单体)的结果，所述突变是由于在DNA复制和DNA修 复期间的滑动链错配(slipped-strand mispairing)。
【0305】这些结果与用多基因座DNA指纹分析得到的结果(当发现用于供体DNA 和hES DNA的指纹型实质上相同时)一致。
【0306】图2E证明了hES细胞的杂合性以及与卵母细胞供体血液的一致性，和在hES 细胞与它们的饲养细胞之间没有相似性。使用MHC I类和II类中多态基因通过基于 PCR的单元型分析，确认hES细胞系的DNA图谱。来自卵母细胞供体血液、hES细 胞、和饲养细胞HNSFs的全基因组DNA被基因型分型和比较。数据显示，hES细胞 和来自供体血液的细胞彼此之间不可区分，因此应当被认为是自体的，并且二者都与 饲养细胞的DNA区分开。
表16.HLA分型
【0307】DNA指纹分析和HLA分型分析确认，hES细胞是杂合的并且包含全部的供 体遗传物质。这些结果与来自单性生殖猴干细胞系的结果一致(Vrana等，Proc Natl Acad Sci USA(2003)100(Suppl 1)：11911-11916)，以及与来自单性生殖小鼠干细胞系的 结果不一致(Lin等，Stem Cells(2003)21：153-161)，其所包括供体遗传物质的 一半。
【0308】phESC系呈现出在hES细胞中期望的形态学，形成具有紧密填充细胞的集 落，突出的核以和小的胞浆对胞核的比例(图4)。这些细胞表达常规的hES标志物 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、和OCT-4，不表达SSEA-1——其为未分 化小鼠胚胎干细胞的阳性标志物(图4)。来自所有系的细胞证实了高水平的碱性磷 酸酶和端粒酶活性(图5和图6)。G-带核型分析显示，phESC系具有正常的人类46、 XX核型，但phESC-7系除外(图7)。来自phESC-7系的细胞中的大约91％具有 47、XXX核型，并且该细胞中的9％具有48、XXX、+6核型。在这些系中观察到不 同程度的X染色体异态性：phESC-1和phESC-6系的大约12％；phESC-5系的42％； 以及细胞系phESC-7、phESC-3和phESC-4中分别为70％、80％和86％(图7)。
【0309】在所有的phESC系、供体体细胞和饲养细胞上，进行比较性DNA绘图。这 些研究使用Affimetrix SNP微阵列(Mapping 50K Hind 240 Arrays)研究染色体变化 并且证实phESC对供体体细胞的遗传相似性。在phESC系和它们相关的供体体细胞 之间完全配对的基因型关联被鉴定为“全同胞”，并且所有其它配对组合被视为“无 关”。内部对照(internal control)将来自相同的phESC系的分裂培养物之间的配对 基因型关联鉴定为“单卵双生”(表17，数据库S1)。
表17.数据库S1
数据库S1.鉴定来自phESC和相关供体的DNA样品
基 因 型 1 基 因 型 2 假 定 关 联 推 断 关 联 IBS 0 IBS 1 IBS 2 n-型 单卵双 生 LOD par/off LOD 全同 胞 LOD 半同胞 LOD 无关 1 2 无 关 无 关 166 662 631 1459 -1503.03 -300.45 -23.15 -8.41 0 1 3 无 关 无 关 241 616 602 1459 -1560.65 -434.85 -28.04 -12.22 0 1 4 无 关 无 关 225 623 611 1459 -1535.94 -400.61 -31.39 -14.39 0 1 5 无 关 无 关 225 623 611 1459 -1535.94 -400.61 -31.39 -14.39 0 1 6 无 关 无 关 243 644 572 1459 -1642.35 -445.78 -31.74 -14.54 0 1 7 无 关 无 关 252 638 569 1459 -1641.11 -453.5 -29.25 -12.86 0 1 8 无 关 无 关 250 643 566 1459 -1656.02 -460.02 -32.86 -15.32 0 1 9 无 关 无 关 219 657 583 1459 -1605.31 -382.39 -27.37 -11.58 0 1 10 无 关 无 关 158 707 594 1459 -1591.43 -279.21 -26.37 -10..89 0 1 11 无 关 无 关 193 668 598 1459 -1584.71 -354.76 -29.65 -13..31 0 1 12 无 关 无 关 166 671 622 1459 -1523.1 -300.5 -30.53 -13..92 0 2 3 无 关 全 同 0 282 1177 1459 -440.02 -146.3 0 -167.42 -363.63
胞 2 4 无 关 无 关 233 627 599 1459 -1569.66 -423.24 -28.24 -12.91 0 2 5 无 关 无 关 233 627 599 1459 -1569.66 -423.24 -28.24 -12.91 0 2 6 无 关 无 关 217 650 592 1459 -1584.75 -388.44 -22.62 -8.53 0 2 7 无 关 无 关 243 650 566 1459 -1645.94 -437.91 -23.23 -8.72 0 2 8 无 关 无 关 225 649 585 1459 -1603.18 -404.41 -27.04 -11.97 0 2 9 无 关 无 关 210 639 610 1459 -1532.75 -360.46 -24.72 -9.89 0 2 10 无 关 无 关 144 683 632 1459 -1491.18 -243.56 -16.82 -4.51 0 2 11 无 关 无 关 172 680 607 1459 -1556.46 -310.03 -23.5 -9.7 0 2 12 无 关 无 关 176 667 616 1459 -1538.57 -327.95 -27.31 -12..06 0 3 4 无 关 无 关 336 457 666 1459 -1391.57 -599.92 -30.6 -14.62 0 3 5 无 关 无 关 336 457 666 1459 -1391.57 -599.92 -30.6 -14.62 0 3 6 无 关 无 关 322 482 655 1459 -1415.98 -571.23 -26.08 -11.86 0 3 7 无 关 无 关 369 442 648 1459 -1432.05 -664.95 -27.39 -11.93 0 3 8 无 关 无 关 334 483 642 1459 -1449.86 -597.75 -31.68 -15.14 0 3 9 无 关 无 关 307 493 659 1459 -1395.19 -530.45 -24.56 -10 0 3 10 无 关 无 关 215 623 621 1459 -1503.92 -364.97 -17.26 -4.43 0 3 11 无 无 264 582 613 1459 -1531.91 -473.48 -28.41 -12..81 0
关 关 3 12 无 关 无 关 254 595 610 1459 -1544.73 -460.57 -29.92 -13..88 0 4 5 无 关 单 卵 双 生 0 0 1459 1459 0 -379.58 -45.47 -401.67 -677.74 4 6 无 关 无 关 334 475 650 1459 -1436.59 -599.55 -32.73 -15.19 0 4 7 无 关 无 关 365 439 655 1459 -1418.34 -656.01 -31.6 -14.56 0 4 8 无 关 无 关 329 486 644 1459 -1450.75 -586.4 -32.06 -14.88 0 4 9 无 关 无 关 332 466 661 1459 -1395.18 -590.12 -28.69 -12.94 0 4 10 无 关 无 关 245 606 608 1459 -1542.32 -438.93 -28.75 -12..74 0 4 11 无 关 无 关 273 569 617 1459 -1530.97 -492.84 -29.03 -12..34 0 4 12 无 关 全 同 胞 0 224 1235 1459 -326.17 -162.34 0 -183.44 -393.46 5 6 无 关 无 关 334 475 650 1459 -1436.59 -599.55 -32.73 -15.19 0 5 7 无 关 无 关 365 439 655 1459 -1418.34 -656.01 -31.6 -14.56 0 5 8 无 关 无 关 329 486 644 1459 -1450.75 -586.4 -32.06 -14.88 0 5 9 无 关 无 关 332 466 661 1459 -1395.18 -590.12 -28.69 -12.94 0 5 10 无 关 无 关 245 606 608 1459 -1542.32 -438.93 -28.75 -12..74 0 5 11 无 关 无 关 273 569 617 1459 -1530.97 -492.84 -29.03 -12..34 0
5 12 无 关 全 同 胞 0 224 1235 1459 -326.17 -162.34 0 -183.44 -393.46 6 7 无 关 全 同 胞 45 176 1238 1459 -277.78 -217.21 0 -165.72 -390.62 6 8 无 关 全 同 胞 44 187 1228 1459 -289.8 -201.32 0 -153.75 -365.51 6 9 无 关 无 关 333 481 645 1459 -1436.5 -595.4 -30.3 -13.77 0 6 10 无 关 无 关 240 601 618 1459 -1518.17 -425.03 -27.11 -11..53 0 6 11 无 关 全 同 胞 0 164 1295 1459 -209.27 -191.66 0 -213.25 -440.56 6 12 无 关 无 关 234 615 610 1459 -1547.15 -416.14 -30.21 -13..64 0 7 8 无 关 全 同 胞 38 225 1196 1459 -326.62 -150.16 0 -121.55 -334.09 7 9 无 关 无 关 359 473 627 1459 -1479.28 -642.41 -30.61 -14.47 0 7 10 无 关 无 关 252 623 584 1459 -1598.35 -443.81 -28.88 -13..09 0 7 11 无 关 全 同 胞 0 230 1229 1459 -318.49 -137.93 0 -159.55 -389.58 7 12 无 关 无 关 265 583 611 1459 -1539.33 -472.91 -30.55 -13..87 0 8 9 无 关 无 关 347 480 632 1459 -1472.41 -625.68 -30.93 -14.31 0 8 10 无 关 无 关 244 614 601 1459 -1561.3 -434 -28.07 -12..37 0
8 11 无 关 全 同 胞 0 175 1284 1459 -223.73 -178.56 0 -200.12 -428.04 8 12 无 关 无 关 236 610 613 1459 -1539.08 -417.14 -29.32 -13..14 0 9 10 无 关 全 同 胞 0 228 1231 1459 -315.15 -152.88 0 -174.27 -392.91 9 11 无 关 无 关 269 567 623 1459 -1502.69 -479.57 -28.47 -12..55 0 9 12 无 关 无 关 245 612 602 1459 -1557.25 -438.53 -26.07 -11..15 0 10 11 无 关 无 关 187 635 637 1459 -1478.7 -328.06 -25.52 -10.6 0 10 12 无 关 无 关 181 662 616 1459 -1534.36 -329 -25.2 -10.6 0
DNA样品编号如下：1-人新生儿皮肤成纤维细胞；2-phESC-7系供体；3-phESC-7系； 4-phESC-1系；5-phESC-1系；6-phESC-3系；7-phESC-4系；8-phESC-5系；9-phESC-6 系；10-phESC-6系供体；11-phESC-3到phESC-5系供体；和12-phESC-1系供体。
结果显示仅仅一对(样品4-5)被确认为单卵(MZ)双生。其余十对(样品2-3、 4-12、5-12、6-7、6-11、7-8、7-11、8-11、9-10)被确认为全同胞，以及所有其它对 的组合被确认为无关联。输出中的IBS列显示标记的数目——在该处，配对(pair) 都被分型并且具有所声明的0、1、或2个相同的等位基因(在无基因型缺陷的理想 条件下，MZ双生的所有标记必须置于IBS＝2下)。输出并没有直接显示P(观察标记/ 给定联系)，但是它显示LOD分数—log10{P(观察标记丨假定关联/P(观察标记丨 关联，其得到最大可能性从而如此称呼)}作为相似性的度量。LOD分数越小，在二 个样品之间假定关联的可能性越小。
【0310】1,459个SNP标志物的比较性分析揭示了phESC杂合性并且显示phESC细 胞基因型相比于相关供体体细胞基因型发生了变化。以前是杂合的一些体细胞基因组 片断在相关的phESC系基因组中成为纯合的。这种杂合型到纯合型在11-15％的 phESC-1、phESC-3、phESC-4、phESC-5和phESC-6系中发生，并且对于phESC-7 系为19％(数据库S2)。此外，在来自相同卵母细胞供体的phESC和phESC-5系之 间观察到遗传差异(表18，数据库S2)。
表18.数据库S2
结果表明产生的phESC系的杂合性，并且通过与相关供体基因型比较显示出基因型 变化。供体基因组的杂合片段部分在phESC中变为纯合。染色体——染色体编号； RS ID—dbSNP数据库中的RS编号；碱基对——如Affimetrix基因芯片(Affimetrix GeneChip)记录的碱基对距离；白种人中的频率A——白种人群中A等位基因的频 率。
【0311】在现有的研究中，小鼠卵母细胞的单性生殖激活产生了纯合的胚胎干细胞系 (Lin等，Stem Cells(2003)21：152)。在人卵母细胞中，卵母细胞单性生殖激活 之后第二次减数分裂的抑制和二倍体胚胎的产生没有引起完全纯合的hES细胞的产 生。
【0312】基于HLA-分型结果，从所有phESC系衍生的分化细胞应该与卵母细胞供体 完全地组织相容，这使得这种方法产生具有治疗用途的细胞(表19)。
表19.phESC细胞系的HLA-分型
【0313】衍生自用作饲养细胞的人成纤维细胞的遗传物质的DNA图谱表明，phESC 细胞系没有污染来自人成纤维细胞的物质(图19)。
【0314】phESC-1系在十个月的培养期间、跨越35代保持未分化。其它细胞系成功 地被培育至少21代以上。来自所有phESC系的细胞在悬浮液培养基中形成囊状拟胚 体，并且在体外分化后产生所有三个胚层的产物：外胚层、中胚层、内胚层(图4)。 来自phESC-1系的拟胚体中的大约5％在铺板后第5天后产生搏动细胞(beating cell)。 phESC-6系产生色着色的上皮样细胞(图4I，K)。外胚层分化由对神经元细胞特异 性标志物神经丝68(图4A)、NCAM(图4B)、βIII-微管蛋白(图4C)和神经胶 质细胞标志物GFAP(图4D，M)的阳性免疫细胞化学染色表示。分化细胞对中胚 层标志物呈阳性，所述标志物包括α-肌动蛋白(图4G)和结蛋白(图4J)——它们 是肌肉特异性标志物，和内皮标志物PECAM-1(图4E)和VE-钙粘蛋白(图4F)。内 胚层分化由分化产生物对α-甲胎蛋白呈阳性染色表示。这些数据表明，phESC可以 被分化成产生人体所有细胞类型的三个胚层。
【0315】phESC-7的变化核型可能是将它排除在临床应用之外的原因。在人类胚胎中 的基因组印记的变化可以促成与母系或父系表达基因相关的疾病的产生(Gabriel等， Proc Natl Acad Sci USA(1998)95：14857)。为了研究phESC系的其它特性，以及确定 它们用于细胞治疗的适用性，进行印记分析。
【0316】如上述进行RNA印迹并用DNA探针SNRPN、Peg1_2、Peg1_A、H19、和 GAPDH(作为内部对照)进行筛选。从NSF，新生儿皮肤成纤维细胞；hES，来自 受精卵母细胞的人胚胎干细胞系；1，phESC-1；2，phESC-3，3，phESC-4，4，phESC-5； 5，phESC-6；6，phESC-7得到印迹核酸。NSF RT-、hES RT-、1RT-为阴性对照。 图3显示印刻印迹的结果。
【0317】母系印迹基因Peg1_A在测试的所有细胞系中表现出强结合。对于母系印迹 基因H19，在所有细胞系中，观察到较弱的(相对于Peg1_A)但一致的结合。在NSF、 hES、phESC-4和phESC-6中，SNRPN表现出显著的结合。在NSF、hES、phESC-1 (信号较弱)、phESC-3、phESC-5和phESC-6中，Peg1_2表现出显著的结合。GAPDH 带结合证实，在所有泳道中的RNA加样是相似的。
【0318】尽管本发明参考上述实施例进行了描述，但是可以理解，修改和变更包含在 本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅仅由所附权利要求所限定。
参考文献：
1.J.Cibelli et al.，Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells.US Patent Application No. 20030232430，December 18，2003.
2.H.Lin et al.，Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.Stem Cells(2003)21：153-161
3.K.E.Vrana et al.，Nonhuman primate parthenogenetic stem cells.PNAS(2003) 100(Suppl 1)：11911-11916.
4.J.P.M.Dumoulin et al.，Effect of oxygen concentration on human in vitro fertilization and embryo culture.Human Reproduction.(1999)14(2)：465-469.
5.B.Fischer and B.D.Bavister，Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys，hamsters and rabbits.J Reprod Fertil(1993)99：673-679.
6.D.I.Kaufman and J.A.Mitchell，Intauterine oxygen tension during oestrous cycle in the hamster：patterns of change.Comp Biochem Physiol Comp Physiol(1994) 107(4)：673-678.
7.F.D.Houghton et al.，Oxygen consumption and energy metabolism of the early mouse embryo.Mol Reprod Dev(1996)44：476-485.
8.A.Van Soom et al.，Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different oxygen tension with or without cysteine addition. Theriogenology(2002)57(5)：1453-1465.
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 | 2020-05-17 | 767 |
| 牛混合羊精液体外受精新方法 | 2020-05-17 | 599 |
| 体外受精 | 2020-05-11 | 443 |
| 一种牛体外受精的受精液及其使用方法 | 2020-05-12 | 859 |
| 一种大鼠体外受精营养液及其应用 | 2020-05-14 | 920 |
| 体外诱导鲍精子受精方法 | 2020-05-15 | 220 |
| 一种大鼠体外受精营养液及其应用 | 2020-05-18 | 774 |
| 体外受精培养皿及体外胚胎受精方法 | 2020-05-11 | 34 |
| 提高牛体外受精胚胎培养效率的方法 | 2020-05-16 | 979 |
| 体外受精培养皿 | 2020-05-13 | 679 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈