一种分离培养间充质干细胞的方法
阅读：74发布：2023-01-10
专利汇可以提供一种分离培养间充质干细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种分离培养间充质干细胞的方法。本发明的方法包括高温诱导的步骤，能够缩短间充质干细胞的分离时间，提高间充质干细胞的产量，增强其增殖能 力 以及 生物 学效力。，下面是一种分离培养间充质干细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种分离培养间充质干细胞的方法，其特征在于包括高温诱导的步骤，所述高温是指高于37℃的温度。
2.根据权利要求1的方法，其中，高温为38～39℃；优选地，高温为38℃。
3.根据权利要求1的方法，其包括将含有间充质干细胞的组织或者从组织中分离的间充质干细胞置于高温条件下诱导的步骤。
4.根据权利要求3的方法，其包括以下步骤：分离含有间充质干细胞的组织，将该组织置于高温条件下诱导，随后在间充质干细胞培养液中培养该组织；或者分离含有间充质干细胞的组织，在间充质干细胞培养液中培养该组织，将得到的间充质干细胞置于高温条件下诱导。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，所述高温诱导时间为30分钟～2小时，优选1小时。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，在高温诱导步骤后还包括在37℃下孵育的步骤；优选地，孵育时间为3～6小时；最优选地，孵育时间为5小时。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，所述高温诱导和/或孵育步骤在5% CO2条件下进行。
8.根据权利要求1的方法，所述组织选自骨髓、脂肪组织、血液、脐带、羊水、牙髓和胎盘；优选地，所述组织为脐带或脂肪组织。
9.根据权利要求8的方法，其中，脐带组织不含脐带血，不去除任何固体成分，包括羊膜上皮、血管和华通氏胶成分，将脐带组织剪为直径为1～1.5mm的小段，不清洗，以便保留组织原有环境。
10.根据权利要求8或9的方法，其中，脐带组织在高温诱导和/或孵育步骤中均不添加细胞培养液。
11.根据权利要求8的方法，其中，脂肪组织去除血液，通过胶原酶将脂肪颗粒消化破碎后加入细胞培养液重悬浮。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，培养间充质干细胞的细胞培养液包括基础培养基以及血清或无血清细胞培养补充剂；优选地，细胞培养液为DMEM/F12（DF12）培养液加10%胎牛血清（FBS）。
13.根据权利要求1的方法，其还包括采取以下一种或多种方式进行诱导：物理刺激（如剪切、搅拌），炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白细胞介素-1）刺激，干细胞迁移相关蛋白（如CXCL12、G-CSF、SCF、PDGF-BB）刺激，缺氧（<20% O2）刺激。
14.权利要求1-13任一项的方法得到的间充质干细胞。
15.高温诱导在缩短从组织中分离间充质干细胞所需的时间中的用途。
16.高温诱导在提高从组织中分离间充质干细胞的效率中的用途。
17.根据权利要求15或16的用途，其中，将含有间充质干细胞的组织置于高温条件下诱导。
18.高温诱导在增强传代过程中间充质干细胞增殖效率中的用途。
19.高温诱导在提高间充质干细胞生物学效力中的用途，优选地，所述生物学效力是TNFRI分泌水平。
20.根据权利要求18或19的用途，其中，将含有间充质干细胞的组织或者从组织中分离得到的间充质干细胞置于高温条件下诱导。
一种分离培养间充质干细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明属于干细胞技术领域，涉及分离培养间充质干细胞的方法，特别地，涉及利用高温诱导的方法，缩短从相应组织中分离间充质干细胞的时间，提高分离间充质干细胞的效率并增强细胞的增殖能力和治疗效力。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于发育早期中胚层的一类成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能。
[0003] 1968年，德国科学家Frieden Stein和他的同事在骨髓中发现了间充质干细胞，后来的研究者陆续发现间充质干细胞广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。由于其具有的免疫调节能力和组织修复能力，间充质干细胞具有广阔的临床应用前景，可用于治疗神经系统疾病、肝肾损伤、自身免疫疾病、心脏疾病、骨疾病、软骨疾病、缺血性血管疾病、糖尿病并发症和肿瘤等多种疾病，也可用于组织工程和面部整形中，另外还可与造血干细胞共同移植治疗血液疾病等。
[0004] 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。
[0005] 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。美国NIH的Clinical Trials是全球最大的临床研究数据库，根据该数据库的检索结果，截至2017年7月12日，在该数据库登记的关于间充质干细胞的临床研究超过950项，其中，在中国、欧洲和美国开展的临床研究数目位居全球三甲。从治疗的疾病种类来看，间充质干细胞的临床研究涉及上百种疾病。将这些疾病按照器官系统分类，可以发现神经系统、心血管和骨科疾病是三类主要的研究领域，另外，糖尿病、肝脏、肺脏、胃肠道、皮肤和移植物抗宿主病也是重要的临床研究方向。
[0006] 在工程化方面，从不同组织中分离出MSC并扩增培养是其生产工艺的关键环节。然而，MSC通常在生理条件下是静止的，比如，采用爬片法从脐带组织中获取MSC时，MSC分离获取周期较长，一般需要15天左右收获P0代细胞；而且在细胞体外扩增时，MSC的增殖速率会随着MSC的传代而降低，因此影响MSC的产业化。
[0007] 本发明针对以上问题，提供了利用高温诱导分离培养间充质干细胞的方法，缩短了从组织中分离MSC的时间、提高了分离MSC的效率并增强了MSC在传代过程中的增殖能力和治疗效力。
发明内容
[0008] 为了解决产业中MSC分离培养效率不高、周期过长的问题，本发明人旨在开发一种新的MSC分离培养方法。
[0009] 本发明人意外地发现，在常规MSC分离培养方法中增加将含有MSC的组织置于高温条件下诱导的步骤，可以显著缩短MSC的分离时间和提高分离效率。更令人惊讶的是，与常规方法相比，高温诱导分离得到的MSC显示出增强的增殖能力和生物学效力。在替代实施方式中，高温条件也用于在分离后处理MSC，以提高其增殖能力和生物学效力。
[0010] 因此，本发明提供了一种分离培养MSC的方法，该方法包括高温诱导的步骤。优选地，可以直接将含有MSC的组织置于高温条件下诱导，也可以在高温条件下分离后处理MSC。
[0011] 具体地，在一个实施方案中，本发明的MSC分离培养方法包括：分离含有MSC的组织，将该组织置于高温条件下诱导，随后在MSC培养液中培养该组织。
[0012] 在另一个实施方案中，MSC分离培养方法包括：分离含有MSC的组织，在MSC培养液中培养该组织，将得到的MSC置于高温条件下诱导。
[0014] 本发明中，高温诱导时间一般为30分钟～2小时，优选地，高温诱导1小时。
[0015] 为了达到最佳MSC分离培养效果，在高温诱导步骤之后还可以包括在37℃下孵育的步骤；优选地，孵育时间为3～6小时；最优选地，孵育时间为5小时。
[0016] 在一个特定的实施方案中，所述高温诱导和/或孵育步骤在5％CO2条件下进行。
[0017] 本发明中，间充质干细胞生物学效力检测是通过ELISA方法检测细胞上清液中TNFRI的分泌水平来表征的，界定1×106个MSC培养48小时后达到216pg以上则为生物学效力合格。目前该方法已申报专利。
[0018] 本发明中，MSC可来自不同的组织，包括骨髓、脂肪组织、血液、脐带、羊水、牙髓和胎盘等；优选地，MSC来自于脐带组织及脂肪组织。脐带组织不含脐带血，与脐带血不同，其由完整的脐带实质组织组成，不去除任何固体成分，包括羊膜上皮、血管(两条动脉和一条静脉)和华通氏胶成分，将脐带组织剪至直径为1～1.5mm的小段，不清洗，以便保留组织原有环境；优选地，脐带组织在高温诱导和/或孵育步骤中均不添加细胞培养液。脂肪组织需通过PBS洗涤并去除血液，通过胶原酶将脂肪颗粒消化破碎后加入细胞培养液重悬浮。
[0020] 本发明的MSC分离培养方法中，除了高温诱导之外，还可以包括以下一种或多种方式进行诱导：剪切或搅拌等物理刺激，炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白细胞介素-1等)刺激，干细胞迁移相关蛋白(CXCL12、G-CSF、SCF、PDGF-BB等)刺激和缺氧(<20％O2)刺激等。
[0021] 本发明中，分离得到的MSC显示出增强的增殖能力和生物学效力，其可以用于治疗内科疾病，包括：抗炎、免疫调节、蛋白分泌、MSC的迁移分化；还可用于治疗自身免疫性疾病(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性胰腺炎、1型糖尿病、系统性硬化症等)、肝病(包括肝功能衰竭、肝硬化、肝脂肪变性、肝炎等)和癌症。
[0022] 在另一方面，本发明还提供了高温诱导在MSC分离培养中的用途。具体地，高温诱导可以缩短从组织中分离MSC所需的时间，提高分离MSC的效率，增强MSC在传代过程中的增殖能力，以及提高MSC的生物学效力。
[0023] 总的来说，基于对高温诱导在MSC分离培养中具有预料不到的作用的惊人发现，本发明提供了分离MSC的新方法及通过该方法得到的具有增强增殖能力和治疗效力的MSC。本发明能够缩短MSC的分离时间，大大提高MSC的产量，并在传代过程中增强其增殖能力以及生物学效力。附图说明
[0024] 图1A-1B显示了每一组中分离出来的UC-MSC总数。37-UC、38-UC和39-UC分别代表37℃、38℃及39℃诱导组，38℃或39℃高温诱导1小时的组织块中分离得到的MSC显著多于
37℃组(*P<0.05)。
37℃组(*P<0.05)。
[0025] 图2A-2B显示了每一组中分离出来的AD-MSC总数。37-UC、38-UC和39-UC分别代表37℃、38℃及39℃诱导组，38℃或39℃高温诱导1小时分离得到的MSC显著多于37℃组(*P<
0.05)。
0.05)。
[0026] 图3A-3C显示了在的高温条件下，从脐带中分离得到的UC-MSC。提供了在(A)37℃、(B)38℃、(C)39℃分离的细胞的代表性图片。
[0027] 图4A显示了不同温度诱导组的UC-MSC传代后每一代次细胞总数的统计表，各组均为3瓶细胞的平均值。图4B显示了P6代UC-MSC的总数。38℃或39℃高温诱导组得到的P6代UC-MSC显著多于37℃组(*P<0.05)。
[0028] 图5A-5C显示了在高温条件下，从脂肪中分离得到的ADSC。提供了在(A)37℃；(B)38℃；(C)39℃分离的细胞的代表性图片。
[0029] 图6A显示了不同温度诱导组的AD-MSC传代后每一代次细胞总数的统计表，各组均为3瓶细胞的平均值。图6B显示了P6代AD-MSC的总数。38℃或39℃组得到的P6代AD-MSC显著多于37℃组(*P<0.05)。
[0030] 图7显示了不同温度诱导组的P6代UC-MSC的表型，各组均为3瓶细胞的平均值。生物标记物检测结果显示：CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR(阴性)以及CD73、CD90和CD105(阳性)。
[0031] 图8显示了不同温度诱导组的P6代UC-MSC的增殖能力，各组均为3瓶细胞的平均值。采用CCK-8检测发现，38℃组细胞增殖效率显著高于37℃组(P<0.05)。
[0032] 图9显示了不同温度诱导组的P6代UC-MSC的成骨及成脂分化能力。油红-O染色结果(A)及茜素红-S染色结果(B)表明各组UC-MSC均具有成骨及脂肪分化的潜能。
[0033] 图10显示了不同温度诱导组的P6代UC-MSC分泌TNFRI的水平，各组均为3瓶细胞的平均值。38℃组得到的P6代UC-MSC的TNFRI分泌能力显著高于37℃组(*P<0.05)。
[0034] 图11显示了不同温度诱导组的P6代AD-MSC的表型，各组均为3瓶细胞的平均值。生物标记物检测结果显示：CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR(阴性)以及CD73、CD90和CD105(阳性)。
[0035] 图12显示了不同温度诱导组的P6代UC-MSC的增殖能力，各组均为3瓶细胞的平均值。采用CCK-8检测发现，38℃组细胞增殖效率显著高于37℃组(P<0.05)。
[0036] 图13显示了不同温度诱导组的P6代AD-MSC的成骨及成脂分化能力。油红-O染色结果(A)及茜素红-S染色结果(B)表明各组AD-MSC均具有成骨及脂肪分化的潜能。
[0037] 图14显示了不同温度诱导组的P6代AD-MSC分泌TNFRI的水平，各组均为3瓶细胞的平均值。38℃组得到的P6代AD-MSC的TNFRI分泌能力显著高于37℃组(*P<0.05)。
具体实施方式
[0038] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0039] 实施例1高温诱导分离UC-MSC的工艺研究
[0040] 实验方法：
[0041] 人脐带组织来源于合作妇产科医院剖腹产出生的健康胎儿。选择15cm以上的健康供者脐带组织，将脐带组织剪至直径为1-1.5mm的小段，不清洗，以便保留组织原有环境，然后直接将每份脐带组织块按56块/瓶均匀平铺接种到9个T75培养瓶中。
[0042] 将含有脐带组织的培养瓶分成3组，每组3瓶，并分别置于温度为37℃、38℃及39℃的5％CO2培养箱中孵育1小时，该过程不添加细胞培养液。孵育结束后，将各组含脐带组织的培养瓶置于37℃下在5％CO2培养箱中继续孵育5小时，该过程不添加细胞培养液。孵育结束后，向各组培养瓶中加入5ml细胞完全培养基(DMEM/F12(DF12)培养液加10％胎牛血清(FBS))，过夜培养后补加10ml完全培养液，此后，每3-5天换培养液一次，大概10天后仔细观察每瓶细胞爬出水平，待细胞融合度为80％后，小心将脐带组织块取出，并对细胞进行蛋白酶消化和计数。
[0043] 分组如下：
[0044] 表1.UC-MSC分组情况
[0045]培养体系 温度/时间 温度/时间 温度/时间
DF12+10％FBS 37℃，1小时 38℃，1小时 39℃，1小时
DF12+10％FBS 37℃，1小时 38℃，1小时 39℃，1小时
[0046] 实验结果：
[0047] 结果显示，38℃及39℃高温刺激均可促进MSC从脐带组织中爬出，其中38℃诱导组的脐带组织块中爬出的MSC最多，平均每瓶中脐带组织产生的MSC比37℃组多约63％(图1A和1B)。
[0048] 实验结果表明：高温诱导组分离效率高于37℃组；38℃组比39℃组分离MSC的效率更高。
[0049] 实施例2高温诱导分离AD-MSC的工艺研究
[0050] 实验方法：
[0051] 人脂肪组织来源于合作整形美容医院抽取的健康供者脂肪组织。将100ml脂肪组织经PBS清洗3次，小心吸弃PBS溶液并去除血液及组织液后，按照1:1的比例加入0.2％(w/v)的NB4通用型胶原酶(德国Serva公司)，37℃振荡器中按200rpm速度消化30分钟，离心去除胶原酶后，用PBS将消化后的细胞洗2次，加入9ml细胞完全培养液(DMEM/F12(DF12，美国Thermo公司)培养液加10％胎牛血清(FBS，美国Gibco))并重悬细胞，将重悬后的细胞平均加入9个T75培养瓶中，补充完全培养液至4ml，将细胞悬液平均铺满瓶底。
[0052] 将9个含有4ml细胞悬液的培养瓶分成3组，并分别置于温度为37℃、38℃及39℃的5％CO2培养箱中孵育1小时。孵育结束后，向各组培养瓶中补加6ml细胞完全培养基，过夜培养后半量换液：吸出5ml培养液后再补加5ml新鲜完全培养液。此后，每2-3天换培养液一次，大概7天后仔细观察每瓶细胞生长状态，待细胞融合度为80％后，对细胞进行蛋白酶消化和计数。
[0053] 分组如下：
[0054] 表2.AD-MSC分组情况
[0055] 培养体系 温度/时间 温度/时间 温度/时间DF12+10％FBS 37℃，1小时 38℃，1小时 39℃，1小时
[0056] 实验结果：
[0057] 结果显示，38℃及39℃高温刺激均可提高脂肪组织来源的MSC的分离效率，其中38℃诱导组的脂肪组织分离得到的MSC最多，平均每瓶中脂肪组织产生的MSC比37℃组多约37％(图2A和图2B)。
[0058] 实验结果表明：高温诱导组分离效率高于37℃组；38℃组比39℃组分离MSC的效率更高。
[0059] 实施例3UC-MSC的扩增培养研究
[0060] 将实施例1中不同温度诱导分离得到的UC-MSC继续培养，当细胞扩增至≥80％融合度时，消化、收集细胞并计数。按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(大约1:3比例)接种到新的T75培养瓶中，同时每瓶加入10ml完全培养液以使细胞进一步扩增。当UC-MSC再次达到≥80％融合度时，以相同的接种密度和培养条件进行传代扩增直至P6代。在传代过程中对每代次细胞使用倒置显微镜观察细胞状态，采用细胞计数仪检测细胞数量并进行统计分析。
[0061] 结果：
[0062] 1.细胞形态
[0063] 各组细胞均生长状态良好，单个细胞呈梭形，融合生长呈纺锤形，各组细胞之间无显著差异(图3A-3C)。
[0064] 2.各代次细胞总数
[0065] 各组UC-MSC细胞总数随传代次数增加呈快速生长状态(图4A)，P6代细胞收获时高温诱导组细胞总数明显多于37℃组(P<0.05)，且38℃组细胞总数明显多于其他组，并且为37℃组的2.15倍(图4B)。
[0066] 实施例4 AD-MSC的扩增培养研究
[0067] 将实施例1中不同温度诱导分离得到的AD-MSC继续培养，当细胞扩增至≥80％融合度时，消化、收集细胞并计数。按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(大约1:3比例)接种到新的T75培养瓶中，同时每瓶加入10ml完全培养液以使细胞进一步扩增。当AD-MSC再次达到≥80％融合度时，将以相同的接种密度和培养条件进行传代扩增直至P6代。在传代过程中对每代次细胞使用倒置显微镜观察细胞状态，采用细胞计数仪检测细胞数量并进行统计分析。
[0068] 结果：
[0069] 1.细胞形态
[0070] 各组细胞均生长状态良好，单个细胞呈梭形，融合生长呈纺锤形，各组细胞之间无显著差异(图5A-5C)。
[0071] 2.各代次细胞总数
[0072] 各组AD-MSC细胞总数随传代次数增加呈快速生长状态(图6A)，P6代细胞收获时高温诱导组细胞总数明显高于37℃组(P<0.05)，且38℃组细胞总数明显多于其他组，并且为37℃组的1.47倍(图6B)。
[0073] 实施例5 UC-MSC的功能研究
[0074] 1.流式细胞仪细胞表型分析
[0075] 取实施例3中培养得到的各组P6代UC-MSC进行如下操作：收集5×106UC-MSC，均分到10个离心管中，300g离心5分钟后吸弃上清液，分别加入以下抗体：PE-IgG1、PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105、PE-CD45、PE-HLA-DR、FITC-IgG1、FITC-CD34、FITC-CD11b及PE-CD19(美国BD公司抗体)，通过BD Calibur流式细胞仪检测细胞表面抗原。
[0076] 结果：
[0077] 各组培养至P6代的细胞均符合MSC表型(图7)：
[0078] CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR均为阴性；
[0079] CD73、CD90、CD105均为阳性。
[0080] 2.CCK-8细胞活性验证实验
[0081] 取实施例3中培养得到的各组P6代UC-MSC，接种至96孔板中，于24h、48h、72h及96h分别采用CCK-8法分析细胞的增殖能力。
[0082] 结果：
[0083] 各组UC-MSC均表现出较好的细胞活性。其中38℃组细胞增殖效率显著高于37℃组(P<0.05，图8)。
[0084] 3.诱导分化实验
[0085] 取实施例3中培养得到的各组P6代UC-MSC，分别接种至2个24孔板中，各组细胞待细胞密度达到80％融合度时分别加入成骨诱导培养液及成脂诱导培养液(美国Gibco产品)进行诱导，2-3天换一次诱导培养液。诱导培养3-4周后，成脂诱导的细胞采用油红-O进行染色，成骨诱导后的细胞采用茜素红-S进行染色，结果见图9A图9B。
[0086] 结果：由油红-O染色的结果可见，不同温度诱导分离的UC-MSC均具有成脂分化的潜能；由茜素红-S染色的结果可见，不同温度诱导分离的UC-MSC均具有成骨分化的潜能。
[0087] 4.TNFRI检测
[0088] 取实施例3中培养得到的各组P6代UC-MSC，分别接种至24孔板中，培养48h后取上清液，同时消化细胞计数。采用ELISA法(R&D systems公司产品)检测上清液中TNFRI的含量。
[0089] 结果：各组细胞培养48h后分泌的TNFRI均可以达到215pg/106细胞以上，其中38℃组细胞分泌的TNFRI量显著高于37℃组(P<0.05，图10)。
[0090] 实施例6 AD-MSC的功能研究
[0091] 1.流式细胞仪细胞表型分析
[0092] 取实施例4中培养得到的各组P6代AD-MSC进行如下操作：收集5×106UC-MSC，均分到10个离心管中，300g离心5分钟后吸弃上清液，分别加入以下抗体：PE-IgG1、PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105、PE-CD45、PE-HLA-DR、FITC-IgG1、FITC-CD34、FITC-CD11b及PE-CD19(美国BD公司抗体)，通过BD Calibur流式细胞仪检测细胞表面抗原。
[0093] 结果：
[0094] 各组培养至P6代的细胞均符合MSC表型(图11)：
[0095] CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR均为阴性；
[0096] CD73、CD90、CD105均为阳性。
[0097] 2.CCK-8细胞活性验证实验
[0098] 取实施例4中培养得到的各组P6代AD-MSC，接种至96孔板中，于24h、48h、72h及96h分别采用CCK-8法分析细胞的增殖能力。
[0099] 结果：
[0100] 各组AD-MSC均表现出较好的细胞活性。其中38℃组细胞增殖效率显著高于37℃组(P<0.05，图12)。
[0101] 3.诱导分化实验
[0102] 取实施例4中培养得到的各组P6代AD-MSC，分别接种至2个24孔板中，各组细胞待细胞密度达到80％融合度时分别加入成骨诱导培养液及成脂诱导培养液(美国Gibco产品)进行诱导，2-3天换一次诱导培养液。诱导培养3-4周后，成脂诱导的细胞采用油红-O进行染色，成骨诱导的细胞采用茜素红-S进行染色，结果见图13A图13B。
[0103] 结果：由油红-O染色的结果可见，不同温度诱导分离的AD-MSC均具有成脂分化的潜能；由茜素红-S染色的结果可见，不同温度诱导分离的AD-MSC均具有成骨分化的潜能。
[0104] 4.TNFRI检测
[0105] 取实施例4中培养得到的各组P6代UC-MSC，分别接种至24孔板中，培养48h后取上清液，同时消化细胞计数。采用ELISA法(R&D systems公司产品)检测上清液中TNFRI的含量。
[0106] 结果：各组细胞培养48h后分泌的TNFRI均可以达到215pg/106细胞以上，其中38℃组细胞分泌的TNFRI量显著高于37℃组(P<0.05，图14)。
[0107] 结论：
[0108] 1.38℃及39℃高温刺激均可促进脐带及脂肪组织来源的MSC的分离效率，其中38℃诱导组分离得到的MSC最多。
[0109] 2.连续培养后每组细胞的形态和数量结果显示，各组MSC均可随传代次数增加而呈快速生长状态，高温诱导组在P6代收获的MSC均明显高于37℃组(P<0.05)。
[0110] 3.流式细胞仪检测结果显示，各体系培养至P6代的细胞均符合MSC表型。
[0111] 4.CCK-8细胞活性实验结果显示，38℃组细胞增殖效率明显高于其他组(P<0.05)。
[0112] 5.不同温度诱导分离的脂肪及脐带来源的MSC均具有成脂分化和成骨分化的潜能。
[0113] 6.生物学效力检测实验表明，各体系MSC均可达到生物学效力检测指标，其中38℃组细胞分泌的TNFRI量显著高于37℃组(P<0.05)。
[0114] 虽然本发明主要针对MSC，但是对于任何类型的干细胞，均可运用高温诱导提高其分离效率、增殖能力和治疗效力。因此，利用高温条件诱导任何类型、任何组织来源的干细胞，使其分离效率、增殖能力和治疗效力提高都属于本发明的保护范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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