白蛋白产生和细胞增殖
阅读：982发布：2020-05-11
专利汇可以提供白蛋白产生和细胞增殖专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了上调 白蛋白 产生的小激活RNA分子。本发明还提供了上调白蛋白产生的方法，此类方法涉及使用能够增加白蛋白表达的小激活RNA分子。本发明还提供了小激活RNA分子在 治疗 例如治疗或 预防 过度增殖性病症和/或特征在于低白蛋白血症的病症中的用途。，下面是白蛋白产生和细胞增殖专利的具体信息内容。
1.一种用于在治疗或预防过度增殖性病症和/或特征在于低白蛋白血症的病症中使用的上调白蛋白产生的小激活RNA。
2.用于根据权利要求1所述使用的根据权利要求1所述的小激活RNA，其中所述过度增殖性病症是肝癌。
3.用于根据权利要求1所述使用的根据权利要求1所述的小激活RNA，其中所述特征在于低白蛋白血症的病症是肝硬化、肝炎或水肿。
4.用于根据权利要求1-3中任一项所述使用的根据权利要求1-3中任一项所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA通过激活选自白蛋白、CEBPA和HNF4a的靶基因来上调白蛋白产生。
5.用于根据权利要求4所述使用的根据权利要求4所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA特异性下调靶RNA转录物，其中，
(i)所述靶RNA转录物与位于所述靶基因的转录起始位点上游500个核苷酸和下游
500个核苷酸之间的所述靶基因的编码链上的序列互补，
和
(ii)所述小激活RNA包含与所述靶转录物的区域具有至少95%互补性的具有至少18个核苷酸的序列。
6.用于根据权利要求1-5中任一项所述使用的根据权利要求1-5中任一项所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA分子是长度最高达30个核苷酸的单链或双链RNA分子。
7.用于根据权利要求1-6中任一项所述使用的根据权利要求1-6中任一项所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA包含具有选自SEQ ID NO:14、16、8、6、10、12、18、20、22、24、26、
28、30、32、34和36的序列的第一链。
8.用于根据权利要求7所述使用的根据权利要求7所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA包含与具有SEQ ID NO:13的序列的第二链碱基配对的具有SEQ ID NO:14的序列的第一链。
9.一种能够上调白蛋白产生且从而抑制细胞增殖的小激活RNA。
10.根据权利要求9所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA包含具有选自SEQ ID NO:14、16、8、6、10、12、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36的序列的第一链。
11.根据权利要求10所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA包含具有选自SEQ ID NO:13、15、7、5、9、11、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35的序列的第二链。
12.根据权利要求9所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA包含具有SEQ ID NO:14的序列的第一链和具有SEQ ID NO:13的序列的第二链。
13.一种上调细胞中的白蛋白表达的方法，所述方法包括用根据权利要求9-12中任一项所述的小激活RNA转染所述细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
15.一种离体或体外细胞，所述细胞包含根据权利要求9-12中任一项所述的小激活RNA，或可通过根据权利要求13或14所述的方法获得，其中所述细胞比不含所述小激活RNA的等价细胞表达更多的白蛋白。
16.一种治疗或预防过度增殖性病症和/或特征在于低白蛋白血症的病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用上调白蛋白产生的小激活RNA。
17.一种方法，所述方法包括：
诊断具有特征在于一种类型细胞过度增殖的状况的患者；和
设计小激活RNA以上调所述类型细胞的白蛋白产生，其中所述上调的白蛋白产生负面影响所述类型细胞的增殖能力。
18.根据权利要求17所述的方法，其还包括生产所述小激活RNA且优选给所述患者施用所述设计的小激活RNA。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述诊断诊断肝癌。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述设计包括执行存储在计算机可读存储介质上的一个或多个指令，所述指令响应于给具有白蛋白编码区的基因提供转录起始位点。
21.一个或多个计算机可读介质，所述计算机可读介质包含计算机可执行指令，以指导计算系统：
接受用于具有白蛋白编码区的基因的转录起始位点；
选择关于所述转录起始位点的有界区域；
表征关于用于上调白蛋白产生的小激活RNA候选物的单元串；和
输出一个或多个表征的单元串作为用于制造小激活RNA分子的优选候选物，所述小激活RNA分子用于施用于人受试者以治疗肝癌。
白蛋白产生和细胞增殖
技术领域
[0001] 本发明涉及上调白蛋白产生的方法。该方法涉及能够增加白蛋白表达的小RNA分子的使用。本发明还涉及此类小RNA分子的设计和合成及其在治疗例如治疗低白蛋白血症或癌症中的用途。还提供了通过上调白蛋白产生来抑制细胞增殖的方法。本文公开的主题因此一般涉及小激活RNA(saRNA)和特别地影响细胞增殖的saRNA。
背景技术
[0002] 上调目的基因表达的目前方法一般需要通过使用病毒将基因的额外拷贝引入宿主基因组内，或通过引入表达靶基因的额外拷贝的质粒，将基因的额外拷贝引入细胞内。相比之下，本发明提供了可上调基因表达特别是白蛋白产生的小激活RNA分子。
[0003] 多种研究指示小激活RNA(saRNA)可靶向基因的启动子区且激活该基因。一些人已提出机制（机制A），其中小双链或单链RNA在基因的启动子区中找到匹配，以形成与启动子区结合且去除所谓的“脱”靶(“off”tag)的复合物；和另一机制（机制B），其中细胞产生以某种方式阻断蛋白质产生以沉默基因的启动子区的RNA拷贝；并且其中小双链或单链RNA找到匹配以结合且破坏RNA拷贝。这些提议的机制（例如被认为是一种或可能是两种）导致打“开”靶基因，例如以提供蛋白质的产生。图1显示就启动子区、编码区和可形成复合物的双链RNA而言示出机制A110（参见图示112和114）和机制B120（参见图示122）的近似图形图解（参见例如通过引用并入本文的Holmes,B.,“Turn genes on,turn diseases off”,New Scientist，2007年4月7日）。
[0004] RNA干扰(RNAi)是重要的基因调节机制，其引起靶mRNA的序列特异性下调。RNAi通过“干扰RNA”(iRNA)介导；包含在RNAi过程中起作用的多种小双链RNA(dsRNA)分子的涵盖性术语(umbrella term)。
[0005] 内源dsRNA可通过核糖核酸酶蛋白质切酶加工成19至25个碱基对、优选21-23个碱基对的双链片段，其中在每个3'末端上的若干未配对碱基形成3'突出端。优选地，每个3'突出端长1-3个、更优选2个核苷酸。这些小双链片段被称为小干扰RNA(siRNA)，并且这些分子实现靶基因的表达下调。因为其功能的阐明，siRNA已用作下调特异性基因的工具。
[0006] 称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的蛋白质复合物掺入siRNA链之一且使用该链作为识别靶mRNA的引导。取决于引导RNA和mRNA之间的互补性，RISC随后破坏或抑制mRNA的翻译。完全互补性导致mRNA切割和破坏，并且由于切割，mRNA可不再翻译成蛋白质。特别是与mRNA的3'非翻译区(UTR)中的位点的部分互补性导致翻译抑制。
[0007] 近来已发现尽管RISC主要调节基因后转录，RNAi自身也可调节基因转录。认为小RNA通过靶向用于破坏的转录物来调节转录，所述转录物对于调节RNA是有义或反义的，并且假定为非编码转录物。取决于RNA靶的性质，这些非编码转录物通过RNA靶向的破坏对后生调节模式具有不同作用。对于给定mRNA有义的ncRNA靶的破坏导致该mRNA的转录阻遏，而对于给定mRNA反义的ncRNA靶的破坏导致该mRNA的转录激活。通过靶向此类反义转录物，RNAi因此可用于上调特异性基因。
[0008] 通过引用并入本文的公开的美国专利申请2010/0210707A1（‘707申请）阐述关于使用saRNA的一些技术。‘707申请描述了选择基因核酸序列的非编码区以提供saRNA链的互补性，依次又提供相应基因转录中的增加。此类方法先验推断“靶”是已知的。此外，‘707申请明确陈述了“saRNA不靶向隐藏启动子转录”。详细地，‘707申请指明使用基因特异性引物组检测到E-钙粘蛋白、p21和GAPDH的表达；使用与E-钙粘蛋白启动子互补的引物未检测到隐藏转录物；并且在p21启动子中未扩增隐藏转录物。
[0009] ‘707申请还描述了具有至少第一核糖核酸链的saRNA分子，所述第一核糖核酸链具有与编码抑制细胞增殖的多肽的基因的非编码序列互补的5'区，和具有至少一个与非编码序列不互补的核苷酸的3'末端区，其中saRNA的施用提供多肽表达中的增加和细胞增殖中的降低。如明确陈述的，提及多肽自身“抑制细胞增殖”。
[0010] 如本文描述的，多种工艺、技术等可提供saRNA，任选无需特定的先验知识，其中此类saRNA可直接或间接施用，以影响细胞增殖。在多个例子中，细胞增殖不受抑制细胞增殖的多肽存在的影响，而是受控制一种或多种多肽产生的一种或多种机制影响。如本文描述的，此类一种或多种多肽各自可以是或不是通过多肽分子自身的存在来抑制细胞增殖。
发明内容
[0011] 本发明人已阐述提供在体内或体外上调白蛋白产生的新方法。他已开发上调白蛋白产生的新型小RNA。这种上调通过上调涉及白蛋白产生的靶基因来实现。这些RNA激活基因表达，因此它们也被称为小激活RNA(saRNA)。术语“小RNA”和“saRNA”在本文中可互换使用。
[0012] 不希望受理论束缚，认为本发明的小RNA分子可通过上文提及的机制A和/或B起作用。本发明的小RNA可通过诱导靶RNA转录物的siRNA样切割来实现靶基因的调节，所述靶RNA转录物对靶基因的区域是反义的。本发明的小RNA也可能能够与AGO蛋白(Argonaute protein)复合来充当调节染色质修饰蛋白质的锚。saRNA作用机制可涉及例如通过多梳家族蛋白的染色质重塑。多梳家族蛋白可明显直接与ncRNA包括启动子相关RNA相互作用，并且从而召募至启动子且实现沉默。saRNA因此可通过干扰此类多梳召募ncRNA，减少在启动子上的多梳水平，并且允许“阳性”染色质重塑复合物例如三胸家族蛋白(Trithorax group protein)建立阳性组蛋白标记。
[0013] 因此，saRNA分子可经由下调靶反义RNA转录物来上调白蛋白产生。
具体实施方式
[0015] 本发明的小RNA在本文中也称为“白蛋白产生上调”RNA。本发明的saRNA的优选特征在下文讨论。
[0016] “涉及白蛋白产生的靶基因”在本文中方便地称为“靶基因”，意指当激活/上调时导致增加的白蛋白产生的基因。如实例中所示，白蛋白产生尤其可使用上调白蛋白基因的saRNA或上调CEBPA基因的saRNA进行上调。因此，靶基因可方便地是编码白蛋白的基因（“白蛋白基因”），在所述情况下saRNA可被说成具有直接效应。作为另外一种选择，靶基因可编码立即或最终上调白蛋白产生的因子，在所述情况下saRNA可被说成具有间接效应。此类因子可例如是转录因子。优选例子包括CEBPA和HNF4α。
[0017] 白蛋白是机体占优势的血清结合蛋白。它具有若干重要功能。它影响渗透压，因此当白蛋白不再支持足够的胶体渗透压以抗衡静水压时，发展水肿。白蛋白转运多种物质包括胆红素、脂肪酸、金属、离子、激素和外源药物。它还影响血小板功能。
[0018] CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPA，也称为C/EBPα）是无内含子基因，其编码碱性亮氨酸拉链种类的蛋白质。CEBPA蛋白质由2个N末端反式激活结构域、碱性DNA结合结构域和C末端亮氨酸拉链结构域组成。CEBPA是最初由大鼠肝脏核纯化的序列特异性的DNA结合蛋白。关于CEBPA的结合位点包括CCAAT盒和增强子核同源性。它能够与顺式调节DNA序列选择性整合，以正面控制mRNA合成。基于其正面调节顺式调节序列的能力，将CEBPA分类为转录因子。
[0019] CEBPA在多种组织中表达，在所述组织中它在许多细胞类型包括脂肪细胞、II型肺泡细胞和肝细胞的分化中起重要作用。在小鼠中，CEBPA在脂肪、肝和肺组织中最丰富地发现。CEBPA还局限于终末分化的肝实质细胞。CEBPA在肝脏细胞中的功能作用由Darnell等人报道，显示其调节α-1-抗胰蛋白酶、转甲状腺素蛋白和白蛋白。此外，功能CEBPA在肝脏细胞系(HepG2)中的表达导致增加水平的细胞色素P450，所述细胞色素P450是参与内源底物代谢且在关键异生物质的解毒和代谢激活中起关键作用的单加氧酶超家族。CEBPA在肝特异性基因中起生理学相关作用，如通过其在白蛋白基因的启动子元件上的存在证明的。
[0020] HNF4A（肝细胞核因子4α）是控制若干基因表达的核转录因子。它作为同二聚体结合，并且可在肝、肾和小肠的发育中起作用。HNF4A突变与单基因常染色体显性非胰岛素依赖性糖尿病I型相关。
[0021] 可通过上调优选选自上文讨论的靶基因的单一靶基因，或通过上调至少2种或至少3种不同的靶基因，来实现根据本发明的白蛋白产生上调。优选组合是白蛋白基因和CEBPA基因；白蛋白基因和HNF4A基因；CEBPA基因和HNF4A基因；或白蛋白基因、CEBPA基因和HNF4A基因的上调。可使用单一saRNA（单链或双链）或者两种或更多种不同saRNA（单链或双链）的组合来实现任何特定靶基因的上调。当上调两种或更多种靶基因时，则使用对于第一靶基因特异性的至少一种saRNA和对于第二靶基因特异性的至少一种saRNA的组合。因此，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种不同saRNA可以任何组合使用。优选地，saRNA包括包含SEQ ID NO:5-36的序列或由SEQ ID NO:5-36的序列组成的第一链。
[0022] 如下文讨论的，许多状况特征在于低白蛋白血症，因此存在增加患有此类状况的患者中的白蛋白水平的需要。本发明因此提供用于治疗此类状况的新治疗方法。
[0023] 令人惊讶的是，本发明人已发现上调过度增生性细胞中的白蛋白表达抑制该细胞的增殖，并且上调体内白蛋白表达抑制肿瘤发展和生长，如实例中所示。这开辟用于治疗过度增殖性病症的新治疗方法。
[0024] 如本文描述的，可通过施用小激活RNA修饰细胞，从而引起该细胞增加其产生影响细胞增殖的分子的产生。例如，通过施用saRNA修饰肝细胞以增加白蛋白产生。依次地，肝细胞分裂（即增殖）的能力受负面影响。换言之，与白蛋白产生中的增加相关的一种或多种机制引起处理过的肝细胞显示出减少的增殖。如本文描述的，saRNA可用于治疗或预防癌症，例如原发性肝癌。例如，关于肝癌，治疗或预防可通过给具有肝硬变（例如由于病毒性肝炎或乙醇中毒）的患者施用saRNA而发生。
[0025] 例如，进行目的是探究在人肝细胞癌(HepG2)细胞系中上调白蛋白mRNA转录物对细胞增殖的作用的试验。该试验包括使用靶向白蛋白的合成saRNA，所述合成saRNA使用纳米转染试剂(Nanofectin)脂质体法转染到HepG2内。对于这些试验，通过HepG2细胞中的mRNA水平中的增加测量成功转染。为了证实该影响，使用四唑盐4-[3-(4-碘苯基)2-(硝基苯基)2H-5-四氮唑]1,3苯二磺酸酯(WST-1)增殖测定来测量细胞增殖中的变化。
[0026] 这些试验提供证实靶向白蛋白基因启动子区的saRNA成功转染到HepG2细胞内的结果（例如当与用混杂RNA对照转染的细胞相比较时，白蛋白mRNA水平增加）。这些结果显示细胞增殖仅在重编程以上调白蛋白表达的细胞中显著降低。此类效应也在表达白蛋白的人细胞系中观察到。还值得注意的是，对于不表达白蛋白的大鼠肝成纤维细胞，这些大鼠细胞用相同saRNA转染不导致白蛋白mRNA的上调或细胞增殖中的变化。
[0027] 如本文描述的，增强HepG2细胞中的白蛋白转录物间接阻遏细胞增殖。与转录因子p53、HNF4-α、CEBPA-α和CEBPA-β具有白蛋白表达和细胞凋亡诱导的确定作用一致；本文描述的工艺、技术等提供用对白蛋白特异性的saRNA分子靶向肝癌的机会。更一般地，如本文描述的，saRNA分子可增加一种或多种分子的产生，由此与产生相关的一种或多种机制影响细胞增殖，以特异性减少细胞增殖。细胞增殖中的减少对于多种状况的治疗可以是有益的。
[0028] 肝细胞一般被认为对于维持若干生活机能是重要的。例如，它们可调节碳水化合物和脂质代谢以及外源和内源化合物的解毒。它们还可产生血浆蛋白质例如白蛋白。白蛋白是典型的肝特异性基因，其对于粒子通过机体的转运和血液中血清胶体渗透压的保存是重要的。关于白蛋白的基因（白蛋白基因）在出生后在肝中高度表达，并且它的调节是转录控制的，如通过与白蛋白启动子元件结合的众多因子指示的（参见例如Panduro等人，1987；Tilghman和Belayew，1982）。在白蛋白启动子中存在若干顺式作用元件（位点A-F）。
B和D位点已显示为作为与这些元件结合的肝特异性转录因子是重要的（参见例如Maire等人，1989）。HNF-1已显示与B位点结合（参见例如Courtois等人，1988；Lichtsteiner和Schibler，1989）。属于转录因子的亮氨酸拉链蛋白质的C/EBP家族成员已显示在白蛋白启动子的D位点上相互作用（参见例如Descombes等人，1990；Landschulz等人，1988；
Mueller等人，1990)。
B和D位点已显示为作为与这些元件结合的肝特异性转录因子是重要的（参见例如Maire等人，1989）。HNF-1已显示与B位点结合（参见例如Courtois等人，1988；Lichtsteiner和Schibler，1989）。属于转录因子的亮氨酸拉链蛋白质的C/EBP家族成员已显示在白蛋白启动子的D位点上相互作用（参见例如Descombes等人，1990；Landschulz等人，1988；
Mueller等人，1990)。
[0029] 一般而言，若干事件可影响白蛋白基因的表达。在生理条件下，细胞外膨胀压已显示经由HNF-1控制白蛋白基因表达（参见例如Pietrangelo等人，1992；Pietrangelo和Shafritz，1994）。在病理状态例如肝急性期应答期间，白蛋白基因表达已显示为下调的（参见例如Trautwein等人，1994）。近年来，已显示涉及急性期基因调节的若干转录因子已得到克隆。这些包括STAT3、C/EBP-β、IL6-DBP、NF-IL6、LAP或CRP2（参见例如Akira等人，1990；Akira等人，1994；Cao等人，1991；Chang等人，1990；Descombes等人，1990；Poli等人，1990；Williams等人，1991；Zhong等人，1994）。转录因子的C/EBP家族是特别相关的，因为这个家族的成员与白蛋白启动子的D位点结合，并且还经由p53和HNF4-α调节细胞周期停滞（参见例如Barone等人，1994；Buck等人，1994；Johnson，2005；Nagao等人，1995）。HNF4-α和CEBP-α均已显示对于肝功能和分化是关键的（参见例如Hayhurst等人，
2001；Lee等人，1997；Wang等人，1995）。一些研究已显示HNF4-α和CEBP通过肿瘤抑制基因p53过表达的转录阻遏与癌症中的肝分化不良关联（参见例如Itoh等人，2000；Nagao等人，1995；Ng等人，1995）。p53水平中的增加已显示可能通过CEBP-α和β转录活性的抑制与白蛋白表达中的降低关联（参见例如Kubicka等人，1999）。在正常状态下，p53的野生型水平极低并且仅响应细胞应激例如DNA损伤、生长因子的撤出和缺氧而增加（参见例如Prives，1998）。p53蛋白质水平的紧密调节已显示为阻止细胞周期的阻断和细胞凋亡的诱导所需的。
2001；Lee等人，1997；Wang等人，1995）。一些研究已显示HNF4-α和CEBP通过肿瘤抑制基因p53过表达的转录阻遏与癌症中的肝分化不良关联（参见例如Itoh等人，2000；Nagao等人，1995；Ng等人，1995）。p53水平中的增加已显示可能通过CEBP-α和β转录活性的抑制与白蛋白表达中的降低关联（参见例如Kubicka等人，1999）。在正常状态下，p53的野生型水平极低并且仅响应细胞应激例如DNA损伤、生长因子的撤出和缺氧而增加（参见例如Prives，1998）。p53蛋白质水平的紧密调节已显示为阻止细胞周期的阻断和细胞凋亡的诱导所需的。
[0030] 白蛋白并不认为在细胞增殖中具有作用，即它不涉及细胞周期且不是细胞增殖所需的，正常水平的白蛋白也不认为影响细胞增殖。它可与涉及细胞增殖的蛋白质例如细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶相比。不希望受理论束缚，本发明人提议通过上调白蛋白产生，细胞的资源从细胞增殖处引开，并且细胞增殖因而减慢或完全踏步(steps)。
[0031] 如本文描述的，例如，白蛋白的上调（参见图2）可“哄骗”细胞回到其中p53水平减少的正常状态的逆转，导致HNF4α、CEBPA-α和β-转录中的增加，以限制细胞增殖和生长（参见例如Maeda等人，2002）。来自该试验的证据证实通过saRNA上调白蛋白显著阻遏肝癌细胞系的增殖（参见图3）。
[0032] 因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防过度增殖性病症的方法，其包括给有此需要的受试者施用小激活RNA，所述小激活RNA上调白蛋白产生且从而抑制细胞增殖。
[0033] 另外看来，本发明提供了用于在治疗中使用，优选用于在治疗或预防过度增殖性病症中使用的小激活RNA，所述小激活RNA上调白蛋白产生且从而抑制细胞增殖。
[0034] 还提供的是抑制细胞增殖的体外、离体或体内方法，其包括使细胞（样品）、组织（样品）、器官或受试者与小激活RNA接触，所述小激活RNA上调白蛋白产生且从而抑制细胞增殖。
[0035] 还提供的是治疗具有特征在于低白蛋白血症的状况的受试者的方法，其包括给所述受试者施用上调白蛋白产生的小激活RNA。
[0036] 另外看来，本发明提供了用于在治疗中使用，优选用于在治疗特征在于低白蛋白血症的病症中使用的小激活RNA，所述小激活RNA上调白蛋白产生。
[0037] 还提供的是上调细胞的白蛋白产生的体外、离体或体内方法，其包括使细胞（样品）、组织（样品）、器官或受试者与小激活RNA接触，所述小激活RNA上调白蛋白产生。
[0038] 在另一方面，本发明提供了能够上调白蛋白产生的saRNA。saRNA分子的任选特征在本文其他地方描述。
[0039] 本发明的saRNA可有利地发挥双重效应，即抑制细胞过度增殖且增加白蛋白水平。当施用于患有过度增殖性病症的受试者时，saRNA不仅减少过度增殖性细胞的增殖，它们还增加白蛋白水平，这可具有多种正面结果例如改善肝功能。当施用于患有低白蛋白血症的受试者时，saRNA增加白蛋白水平且从而减轻低白蛋白血症，并且它们还帮助阻止过度增殖性病症的发展。许多肝病症特别是肝硬化的特征在于低白蛋白血症，并且特别在未加处理时，一般增加受试者发展癌症的危险。本发明提供了用于此类肝病症的特别有利的治疗，该治疗减轻低白蛋白血症且减少癌症的危险。因此，提供的是同时治疗特征在于低白蛋白血症的状况和过度增殖性病症的saRNA。
[0040] “能够上调白蛋白产生”意指saRNA在细胞内时上调白蛋白产生，所述细胞具有用于产生白蛋白的必需机制，且优选天然产生一些白蛋白。有利地，上调白蛋白产生抑制细胞增殖，特别是过度增殖，因此所述saRNA能够抑制细胞增殖，特别是过度增殖。“能够抑制细胞增殖”意指saRNA在细胞内时抑制细胞增殖，所述细胞具有用于细胞增殖的必需机制。
[0041] 在另一方面，本发明提供了包含本发明的saRNA分子的离体或体外细胞。在另一方面，本发明提供了其中白蛋白产生已通过本文公开的方法上调的离体或体外细胞。因此，此类细胞通过本文公开的方法获得，或可通过本文公开的方法获得。还提供的是用于在治疗特别是特征在于低白蛋白血症的状况或任何其他类型肝疾病的治疗中使用的此类细胞。
[0042] “过度增殖性细胞”可以是与等价的健康细胞（其可被称为“对照”）的增殖率相比较，以异常高的速率增殖的任何细胞。“等价的健康”细胞是细胞的正常、健康配对物。因此，它是例如来自相同器官的具有相同类型的细胞，其执行与比较物细胞相同的一种或多种功能。例如，过度增殖性肝细胞的增殖应通过参考健康肝细胞进行评价，而过度增殖性前列腺细胞的增殖应通过参考健康前列腺细胞进行评价。
[0043] “异常高的”增殖率意指与等价的健康细胞（非过度增殖性）细胞的增殖率相比较，过度增殖性细胞的增殖率增加至少20、30、40%，或至少45、50、55、60、65、70、75%，或至少80%。“异常高的”增殖率还可指与等价的健康细胞细胞的增殖率相比较，增加至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10倍，或至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或至少60、70、80、90、100倍的速率。
6、7、8、9、10倍，或至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或至少60、70、80、90、100倍的速率。
[0044] 过度增殖性细胞的例子包括癌细胞（包括癌、肉瘤、淋巴瘤和胚细胞瘤）。此类癌细胞可以是良性或恶性的。过度增殖性细胞还可起因于自身免疫状况例如类风湿性关节炎、炎性肠病或牛皮癣。过度增殖性细胞还可在与变应原接触的具有过分敏感的免疫系统的患者内产生。此类涉及过分敏感的免疫系统的状况包括但不限于哮喘、变应性鼻炎、湿疹和过敏反应例如变应性过敏性反应。
[0045] 如本文使用的，术语“过度增殖性细胞”不是指与大多数细胞相比较天然以更高速率增殖的细胞，而是健康细胞。已知在生命自始至终不断分裂的细胞的例子是皮肤细胞、胃肠道细胞、血细胞和骨髓细胞。然而，当此类细胞以比其健康配对物更高的速率增殖时，则它们是过度增殖的。
[0046] “过度增殖性病症”可以是涉及如上定义的过度增殖性细胞的任何病症。过度增殖性病症的例子包括肿瘤性病症例如癌症、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、胃过度增殖性病症例如炎性肠病、皮肤病症包括牛皮癣、莱特尔综合征、毛发红糠疹和角化病症的过度增殖性变体。
[0047] 癌症代表特别感兴趣的过度增殖性病症，并且包括所有类型的癌症包括例如实体瘤和血液学癌症。代表性癌症类型包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头与颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病（例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病和慢性髓性白血病）、脑癌（例如星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成髓细胞瘤）、成神经细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、肛门癌、膀胱癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤、成视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤、尤因肉瘤、黑素瘤及其他皮肤癌。肝癌或前列腺癌是优选的。肝癌可包括胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤或肝细胞癌(HCC)，或由胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤或肝细胞癌(HCC)组成。HCC是特别感兴趣的。
[0048] 优选地，肿瘤发展和/或生长被抑制。在优选实施例中，治疗实体瘤。在另一优选实施例中，预防转移。
[0049] “抑制细胞增殖”或“减少的增殖”意指增殖是减少的或完全停止。因此，“减少增殖”是“抑制增殖”的实施例。与用本发明的寡核苷酸处理前的细胞增殖相比较，或与等价未处理的细胞增殖相比较，在本发明的寡核苷酸的存在下，所述细胞增殖减少至少20%、30%或40%，或优选至少45、50、55、60、65、70或75%，甚至更优选至少80、90或95%。在其中细胞增殖在过度增殖性细胞中被抑制的实施例中，“等价”细胞也是过度增殖性细胞。在优选实施例中，增殖减少至可与等价的健康（非过度增殖性）细胞的增殖率比较的速率。另外看来，“抑制细胞增殖”的优选实施例是过度增殖的抑制，或调控细胞增殖以达到正常、健康的增殖水平。
[0050] 技术人员完全知道如何鉴定过度增殖性细胞。在动物内过度增殖性细胞的存在可使用扫描例如X射线、MRI或CT扫描鉴定。使用细胞增殖测定例如MTT、XTT、MTS或WST-1测定，通过在体外培养样品，还可鉴定过度增殖性细胞，或可测定细胞的增殖。在体外的细胞增殖还可使用流式细胞术进行测定。
[0051] 上文列出的细胞增殖测定均通过相同原理工作；通过复杂细胞机制切割稳定四唑盐以形成可溶性甲瓒，所述复杂细胞机制主要在细胞表面上发生。这种生物还原在很大程度上依赖于活细胞中的NAD(P)H糖酵解生产。因此，形成的甲瓒染料的量与培养中的代谢活性细胞数目直接关联。在组织培养板中生长的细胞与试剂一起温育约0.5–4小时。在该温育期后，用扫描多孔分光光度计（ELISA阅读器）定量形成的甲瓒染料。测量的吸光度与活细胞数目直接关联。
[0052] 肿瘤发展或生长可使用一种或多种已知技术进行测定，例如使用外部测径器测量肿瘤大小、例如通过使用椭圆体公式计算肿瘤体积、计算机断层摄影术(CT)、微型CT、正电子发射断层摄影术(PET)、微型PET、磁共振成像(MRI)、免疫组织化学和/或光学成像例如生物发光成像(BLI)或荧光成像(FLI)。在动物研究中，一旦动物已处死，就还可通过测量水置换体积来测定肿瘤体积，并且可使用称来测定肿瘤重量。
[0053] 本发明的方法优选减少肿瘤体积，优选减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。优选地，一个或多个新肿瘤的发展被抑制，例如根据本发明治疗的受试者发展更少和/或更小的肿瘤。“更少的肿瘤”意指经过设定时间段，他发展比等价受试者更少数目的肿瘤。优选地，他比等价的对照（未加处理的）受试者少发展至少1、2、3、4或5个肿瘤。“更小的”肿瘤意指肿瘤在重量和/或体积方面比等价受试者的肿瘤小至少10、20、30、40、50、60、
70、80或90%。
70、80或90%。
[0054] 设定时间段可以是任何合适的时期，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个月或年。
[0055] 优选地，癌症发作被阻止或延迟。这可通过参考等价的对照（未加处理的）受试者进行评价。
[0056] “等价受试者”可以是例如具有相似年龄、性别和健康例如肝健康或癌症阶段的受试者，或在根据本发明治疗前的相同受试者。等价受试者是“未加处理的”，因为他不接受用根据本发明的saRNA的治疗。然而，他可接受常规抗癌治疗，条件是用本发明的saRNA治疗的受试者接受相同或等价的常规抗癌治疗。
[0057] 白蛋白表达可通过使用技术人员充分知道的充分确定的技术进行测定。可使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，优选半定量或定量PCR(qRT-PCR)，测定编码白蛋白的信使RNA的上调。这种方法涉及在用于定量分析的杂交报道探针的存在下执行实时扩增循环前，将分离的mRNA逆转录成cDNA。白蛋白mRNA表达也可使用RNA印迹分析进行测定。
[0058] 白蛋白蛋白质产生的上调可使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行测定。这种ELISA可以是夹心ELISA，例如AssayMax Albumin ELISA试剂盒。此处，将样品应用于已用对白蛋白特异性的抗体预包被的微板。在去除任何非白蛋白蛋白质的洗涤后，通过使用另一特异性抗体夹心剩余白蛋白。在应用具有可检测标记的第二抗体前洗涤过量抗体。蛋白质表达还可使用蛋白质印迹分析或蛋白质质谱法进行测定。
[0059] “上调白蛋白表达”意指与在不存在saRNA寡核苷酸的情况下的白蛋白表达相比较，在本发明的saRNA寡核苷酸的存在下，白蛋白蛋白质的表达增加至少20、30、40%，更优选至少45、50、55、60、65、70、75%、甚至更优选至少80%。在进一步优选的实施例中，与在不存在saRNA寡核苷酸的情况下的白蛋白表达相比较，在本发明的saRNA寡核苷酸的存在下，白蛋白蛋白质的表达增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更优选至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更优选至少60、70、80、90、100倍。在另一优选实施例中，上调将涉及血清白蛋白蛋白质的合成和加工成其活性形式。
[0060] 可通过参考在用本发明的saRNA处理前测试细胞的白蛋白表达，或通过参考通过等价未加处理的细胞（对照）的白蛋白表达，来测定白蛋白产生的上调。
[0061] 优选地，本发明的方法还导致白蛋白的分泌，更优选地增加的白蛋白分泌。优选地，细胞内白蛋白水平和/或血清白蛋白水平是增加的。
[0062] 在一些实施例中，本发明的方法导致CEBPA和/或HNF4A表达的上调，但在其他实施例中，本发明的方法导致CEBPA和/或HNF4A的下调。
[0063] 在一些实施例中，本发明的方法导致甲胎蛋白和/或肝细胞生长因子的下调。
[0064] 在一些实施例中，本文公开的方法可包括在给受试者施用saRNA前和/或后测定细胞增殖和/或测定白蛋白产生的步骤。例如，该方法可包括测定由于根据本发明的处理，白蛋白表达已增加和/或过度增殖性细胞例如癌细胞的增殖已降低的步骤。
[0065] 低白蛋白血症是其中血液血清内的白蛋白不足够或异常低的状况。存在许多特征在于低白蛋白血症的状况，包括引起低白蛋白血症的状况和其为低白蛋白血症原因的状况。此类状况包括但不限于肝疾病例如乙型和丙型肝炎，肝病毒感染，酒精性肝病例如脂肪肝、肝硬变或酒精性肝炎，引起过量水平的白蛋白被排泄的状况例如肾病综合征，引起白蛋白通过肠而丧失的状况例如梅内特里耶病(Ménétrier's disease)，通过血浆丧失而丧失白蛋白的烧伤患者，和引起白蛋白再分布的状况例如水肿。此类状况可获益于可通过本发明的saRNA寡核苷酸提供的增加的白蛋白水平。
[0066] 不足够的白蛋白水平通过超出对于该动物视为健康的水平的白蛋白水平进行限定。例如，在人中，不足够的白蛋白水平将视为低于38g/L或35g/L，或甚至低于32或30g/L的水平。
[0067] 肝疾病或肝功能不全因此一般特征在于低白蛋白血症，因此评价肝功能以测定受试者是否可获益于由本发明提供的治疗可以是有用的。肝功能评价还可提供测定特定治疗的成功的有用方法。
[0068] 可用于诊断可获益于本发明治疗的患病肝，或测定特定治疗的成功的方法是本领域众所周知的。肝功能测试可通过分析得自动物的血液样品来执行。在此类肝功能测试中将定量的蛋白质可包括胆红素、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)、总蛋白和球蛋白蛋白质以及血清白蛋白。这些蛋白质可被称为“肝功能标记”或“肝健康标记”。下文是显示上述蛋白质在人中的健康范围的表。
[0069] 表3
[0070]蛋白质 最小浓度 最大浓度
胆红素 0μmol/L 20μmol/L
AST 0U/L 45U/L
ALT 0U/L 45U/L
ALP 30U/L 120U/L
GGT 0U/L 45U/L
总蛋白 60g/L 80g/L
球蛋白蛋白质 20g/L 32g/L
血清白蛋白 38g/L 55g/L
胆红素 0μmol/L 20μmol/L
AST 0U/L 45U/L
ALT 0U/L 45U/L
ALP 30U/L 120U/L
GGT 0U/L 45U/L
总蛋白 60g/L 80g/L
球蛋白蛋白质 20g/L 32g/L
血清白蛋白 38g/L 55g/L
[0071]
[0072] 上述蛋白质中的许多不是肝特异性的疾病指示剂。然而，升高的GGT单独通常指示一些形式的肝疾病。当一些蛋白质水平组合分析时，它们可以是测定特异性肝疾病的准确方式。例如，组合的升高的GGT、ALT中的降低和ALP中的降低可以是酒精性肝病或脂肪性肝病的指示。组合的升高的GGT、升高的ALT和ALP中的降低可以是肝炎的指示，但也可以是脂肪性肝病的指示。
[0073] 在一些实施例中，本发明的方法包括诊断肝疾病/诊断可获益于本发明的saRNA或细胞的受试者的步骤。所述步骤可包括执行这些肝功能测试中的一种或多种。作为另外一种选择或另外地，该方法可包括在本发明的saRNA或细胞施用后分析肝功能的步骤。所述步骤可包括执行这些肝功能测试中的一种或多种。优选地，在所述治疗后，测定所述肝功能标记的至少一种中的改善。
[0074] 例如，胆红素、AST、ALT、ALP和GGT中的至少1种可显示1、2、3、4或5倍的降低，或至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%的增加。优选地，这些标记中的至少2、3、4种或全部显示此类降低。因此，本发明的方法优选导致小于20、15、10或5μmol/L的血液胆红素浓度；小于45、40、30、25、20、15、10或5U/L的血液AST浓度；小于45、40、30、25、20、15、10或5U/L的血液ALT浓度；小于45、40、30、25、20、15、10或5U/L的血液GGT浓度；和/或小于120、100、80、70、60、50或40U/L，但优选不小于30U/L的血液ALP浓度。
[0075] 本发明的方法优选导致至少32、34、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50g/L，例如38-55、40-55、42-55、45-55g/L的血液白蛋白浓度。
[0076] 根据本发明的有效治疗可意指待治疗的疾病被治愈，所述疾病是涉及过度增殖性细胞或低白蛋白血症的疾病。然而，有效“治疗”包含对该患者具有暂时或永久利益的任何结果。治疗可影响潜在状况，和/或它可影响症状。因此，还考虑了纯粹的症状缓解。
[0077] 根据本发明的预防意指本发明的saRNA寡核苷酸或细胞的预防施用预防状况、减少状况的危险、或延迟状况发展的发作，所述状况的特征在于过度增殖性细胞或不足够的白蛋白水平。此类预防施用可用于处于发展状况的危险中的患者，所述状况的特征在于过度增殖性细胞或低白蛋白血症。预防施用可经过该患者的寿命是有效的。然而，预防施用还可能需要经过该患者的寿命重复，或直至使该患者处于危险中的状况可缓和时。
[0078] 在本发明的方法中，使细胞与本发明的小RNA分子接触。细胞可以是体外的，例如建立的细胞系或先前已得自受试者的样品，或它们可以是在受试者体内的。通过使用与呈现的小RNA结合的任何合适的递送试剂，小RNA分子可在体外或体内施用于细胞。此类合适的递送试剂包括Mirus Transit TKO亲脂试剂；阳离子脂质体(lipofectin)；脂质转染胺(lipofectamine)；细胞转染试剂(cellfectin)；或多聚阳离子（例如聚赖氨酸）、基于病毒的颗粒、电穿孔树枝状聚合物(dendrimer)或脂质体。优选的递送试剂是脂质体。用于制备脂质体的多种方法是已知的。
[0079] 另一优选的递送试剂是树枝状聚合物。树枝状聚合物在Singha等人(2011),Nucleic Acid Ther.21:133中描述，所述参考文献的完整公开内容通过引用并入本文。树枝状聚合物是有规则和高度分支的大分子。优选地，树枝状聚合物是多聚阳离子树枝状聚合物，例如PAMAM树枝状聚合物。不希望受理论束缚，PAMAM树枝状聚合物在其表面上具有促进核酸结合的伯胺基团，并且含有增强细胞质中的核酸释放的叔氨基团。
[0080] 使细胞与saRNA接触的步骤也可被称为“转染”。
[0081] 特别优选地，封装呈现的小RNA的脂质体例如通过具有与结构表面结合的调理素作用抑制部分进行修饰，以便避免通过单核巨噬细胞和网状内皮系统的清除。在一个实施例中，本发明的脂质体可包含调理素作用抑制部分和配体。
[0082] 可表达小RNA的重组质粒还可直接或与合适的递送试剂结合施用，所述递送试剂包括Mirus Transit LT1亲脂试剂；阳离子脂质体；脂质转染胺；细胞转染试剂；多聚阳离子（例如聚赖氨酸）或脂质体。表达小RNA的重组病毒载体和用于将此类载体递送给细胞的方法是本领域已知的。
[0083] 优选地，所述接触步骤优选每3天执行超过一次，尽管它也可以是每天，或每2、4或5天。接触优选执行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，约6或9天是优选的。还考虑了经过数周或数月时期以规则间隔的接触。
[0084] 在本文公开的方法中，如果超过一种靶基因是上调的，则用于上调不同靶基因的小RNA可以不同频率和不同时间段施用。待使用的特定施用方案可容易地通过本领域普通技术人员测定，以适合其所需目的、特定起始细胞类型和递送方法。例如，可使用皮摩尔浓度的呈现的小RNA分子。
[0085] 本发明的小RNA可单独或与其他一种或多种活性剂组合提供，所述活性剂已知在待考虑的特定方法中具有效应。其他一种或多种活性剂可与本发明的小RNA同时、分开或序贯施用。因此，可使用本发明的单一小RNA、本发明的两种或更多种小RNA的组合、或所述一种或多种小RNA和其他一种或多种活性物质的组合。
[0086] 本发明的方法优选对细胞或受试者执行，所述细胞或受试者是动物，更优选哺乳动物，例如小鼠、大鼠、猴、犬、母牛、绵羊，最优选人，尽管任选地该细胞或受试者是非人的。该细胞或受试者可以是胚胎的，但优选是成体的。
[0087] 必须理解本发明的方法可能不实现且事实上无需实现细胞群体内的所有细胞中的白蛋白产生上调，所述细胞群体与本发明的saRNA接触。因此，从实施本发明的方法即与本发明的saRNA接触的细胞群体当中，优选可诱导至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%，以产生更多白蛋白，尽管在一些实施例中，白蛋白产生在至少95或99%的细胞中是上调的。
[0088] 体外和体内方法可使用下述执行：(i)天然产生白蛋白的细胞，例如肝细胞；(ii)具有分化成天然产生白蛋白的细胞的潜力的细胞，例如干细胞；或(iii)通常不产生白蛋白的细胞，例如体细胞非肝脏细胞。肝细胞或干细胞是优选的。干细胞可以是全能的、多能的或多潜能的，例如造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或诱导的多能干细胞。
[0089] WO2005/059113公开了特别有利类型的多能干细胞。这种干细胞可直接从骨髓和/或血液例如外周血或得自脐带血或胎盘的材料中分离，并且具有分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞的独特能力。这些细胞因此明确地是多潜能或多能的，如果不是全能的。因此，WO2005/059113中所述的干细胞提供有用的用于组织移植的细胞来源，所述组织移植可以自体（自身至自身）方式使用。
[0090] 公开于WO2005/059113中的细胞在本领域中被称为“OmniCyte”。WO2005/059113的教导通过引用全文并入本文。OmniCyte是其为CD34+、能够自我再生且能够分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞包括造血细胞的干细胞。如上所述，它们可直接从骨髓和/或血液中分离。它们还通过其在培养期间附着至塑料（例如标准组织培养容器的塑料）的能力进行表征。合适的容器是由Corning Incorporated,New York,USA制造的那些。
[0091] OmniCyte还可通过下述事实进行表征：它们不需要饲养层，即支持干细胞生长的细胞（一般通过γ照射灭活，所述细胞供应重要的代谢产物而无其自身的更多生长或分裂）。
[0092] OmniCyte还可如可通过下述获得的进行表征：
[0093] a)就CD34+细胞富集组织或血液样品；
[0094] b)使该样品与固体载体接触且收集附着至所述固体载体的细胞。
[0095] 合适的组织或血液样品包括骨髓、外周血、脐带血或组织、胎盘和得自抽脂术的样品。
[0096] 更特别地，它们可通过下述获得：
[0097] 对组织或血液样品（优选造血组织例如血液或骨髓样品）实施密度梯度分离；
[0098] 使低密度细胞暴露于关于CD34的亲和配体（优选附接至顺磁珠）；
[0099] 回收附接至所述CD34配体的细胞；
[0100] 使CD34+亚群暴露于组织培养级别塑料；和
[0101] 回收附着至该塑料的CD34+细胞。
[0102] Omnicyte优选是成体的，因此是非胎儿的。
[0103] Omnicytes样品于2004年9月24日在登记号04092401下保藏于在PortonDown,Salisbury,SP40JG的ECACC。该保藏由Willow Tree Cottage,Spinning Wheel Lane,Binfield,Berkshire RG42 5QH,Great Britain的Myrtle Gordon教授作出，并且该细胞系给予名称“干细胞OmniCyte”。在2012年6月14日，Myrtle Gordon教授授权Mina Therapeutics Limited在任何和所有专利申请中提及该保藏的生物材料，并且她给出关于该保藏材料依照条例33EPC对公众可获得的毫无保留和不可撤回的同意书。
[0104] 如实例中所述，本发明的方法允许生成产生白蛋白的细胞。更具体而言，它们产生比其未加处理的配对物更多的白蛋白，因此它们过度产生白蛋白，或它们是一般不产生白蛋白但已诱导为产生白蛋白的细胞。因此，在进一步方面，提供了产生或过度产生白蛋白的细胞。细胞可通过本文公开的方法获得。优选地，细胞通过诱导CD34+干细胞例如OmniCyte产生白蛋白而获得。
[0105] 该细胞优选是离体的，即不是活生物的部分。任选地，该细胞可被称为“体外的”或“分离的”。
[0106] 此类细胞在治疗中的用途代表本发明的进一步方面。任选地，本发明的细胞和本发明的saRNA可与本文公开的治疗应用组合使用。“组合”包括分开、同时或序贯施用。
[0107] 另外看来，本发明提供了治疗方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的白蛋白产生细胞和/或治疗有效量的如本文定义的saRNA。
[0108] saRNA可设计为与靶转录物互补，并且它们可通过下调靶反义RNA转录物来发挥其对白蛋白产生的作用。
[0109] 靶RNA转录物优选由靶基因的转录起始位点上游最高达100、80、60、40、20或10kb的基因座转录，或由靶基因的转录终止位点下游最高达100、80、60、40、20或10kb的基因座转录。任选地，RNA转录物由靶基因的转录起始位点上游最高达1kb的基因座转录，或由靶基因的转录终止位点下游最高达1kb的基因座转录。任选地，RNA转录物由靶基因的转录起始位点上游最高达500、250或100个核苷酸的基因座转录，或由靶基因的转录终止位点下游最高达500、250或100个核苷酸的基因座转录，更优选地，该基因座距离靶基因的转录起始位点上游或下游不超过500个核苷酸。最优选地，靶RNA转录物由靶基因的转录起始位点上游最高达500个核苷酸或下游最高达500个核苷酸的基因座转录。
[0110] 在本发明的靶RNA转录物的背景中的术语“由[特定基因座]转录”意指“靶RNA转录物的转录起始位点[在该特定基因座处]发现”。优选地，靶RNA转录物的转录起始位点和转录终止位点两者分别位于靶基因的转录起始位点上游最高达100kb或靶基因的转录终止位点下游最高达100kb。上文与靶RNA转录物由其转录的位置有关描述的优选实施例已作必要的修正应用于靶RNA转录物的转录终止位点的位置。
[0111] 靶RNA转录物与基因组序列的编码链互补，并且本文对“基因组序列”的任何提及是“基因组序列的编码链”的简写。
[0112] 因此，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列位于靶基因的转录起始位点上游100、80、60、40、20或10kb和靶基因的转录终止位点下游100、80、60、40、20或10kb之间。更优选地，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列位于靶基因的转录起始位点上游1kb和靶基因的转录终止位点下游1kb之间。
更优选地，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列位于靶基因的转录起始位点上游500、250或100个核苷酸和靶基因的转录终止位点下游终末500、250或100个核苷酸之间。任选地，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列包括该靶基因的编码区。最优选地，靶转录物包含对于基因组序列是反义的序列或由对于基因组序列是反义的序列组成，所述基因组序列与靶基因的启动子区重叠。因此，靶RNA转录物优选包含对于启动子区是反义的序列。
更优选地，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列位于靶基因的转录起始位点上游500、250或100个核苷酸和靶基因的转录终止位点下游终末500、250或100个核苷酸之间。任选地，靶RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列包括该靶基因的编码区。最优选地，靶转录物包含对于基因组序列是反义的序列或由对于基因组序列是反义的序列组成，所述基因组序列与靶基因的启动子区重叠。因此，靶RNA转录物优选包含对于启动子区是反义的序列。
[0113] 基因可具有多个启动子区，在所述情况下靶RNA转录物可与启动子区中的一个、两个或更多个重叠。注释基因基因座的在线数据库可用于鉴定基因的启动子区。
[0114] 对于任何给定启动子区，整个启动子区不必是重叠的，在启动子区内的序列由靶RNA转录物重叠就足够，即重叠可以是部分重叠。类似地，整个靶RNA转录物无需对于启动子区内的序列是反义的，靶RNA转录物仅需要包含对于启动子区是反义的序列。
[0115] 靶RNA转录物和靶基因的启动子区之间的重叠区可短至长度单个核苷酸，尽管它优选是长度至少15个核苷酸，更优选长度至少25个核苷酸，更优选长度至少50个核苷酸，更优选长度至少75个核苷酸，最优选长度至少100个核苷酸。下述具体安排各自预期属于术语“重叠”的范围内。
[0116] a)靶RNA转录物和靶基因的启动子区在长度中是等同的，并且它们在其整个长度上重叠（即，它们是互补的）。
[0117] b)靶RNA转录物短于靶基因的启动子区，并且在其整个长度上与靶基因的启动子区重叠（即，它在其整个长度上与靶基因的启动子区内的序列是互补的）。
[0118] c)靶RNA转录物长于靶基因的启动子区，并且靶基因的启动子区由其完全重叠，即靶基因的启动子区在其整个长度上与靶RNA转录物内的序列是互补的）。
[0119] d)靶RNA转录物和靶基因的启动子区具有相同或不同长度，并且重叠区短于靶RNA转录物的长度和靶基因的启动子区的长度。
[0120] 上述“重叠”的定义已作必要的修正应用于说明书自始至终其他重叠序列的描述。明确的是，如果反义RNA转录物描述为与除启动子区外的靶基因区域重叠，则转录物的序列与该区域内的序列而不是启动子区内的序列是互补的。
[0121] 优选地，RNA转录物包含对于基因组序列是反义的序列，所述基因组序列包含靶基因的转录起始位点。换言之，优选地，靶RNA转录物包含与靶基因的转录起始位点重叠的序列。
[0122] 靶RNA转录物优选是至少1kb，更优选至少长2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如20、25、30、35或40kb。
[0123] 当在本发明的背景中用于描述核酸序列时，术语“有义的”意指该序列与靶基因的编码链上的序列具有同一性。当在本发明的背景中用于描述核酸序列时，术语“反义的”意指该序列与靶基因的编码链上的序列是互补的。
[0124] 基因的“编码链”是含有关于该基因的mRNA的编码序列的链。基因的“模板链”是不含关于该基因的mRNA的编码序列的链。
[0125] 优选地，靶RNA转录物包含沿着其全长与靶基因的编码链上的序列至少75%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%互补的序列。
[0126] 本发明提供了可有效且特异性下调此类靶转录物的saRNA分子。这可通过与靶RNA转录物内的序列具有高度互补性的saRNA分子来实现。小RNA与靶RNA转录物的区域具有不超过5个、优选不超过4或3个、更优选不超过2个、甚至更优选不超过1个错配、最优选无错配。
[0127] 优选地，saRNA包含具有至少13个核苷酸的序列，其与靶转录物的区域具有至少95、98、99或100%互补性。优选地，所述与靶转录物的区域具有至少95、98、99或100%互补性的序列是长度至少15-20个，例如至少15、16、17、18或19个核苷酸，优选18-22个或19至21个，最优选正好19个。如其他地方提及的，saRNA还可包含3'尾部。
[0128] 在一个实施例中，本发明的小RNA分子可与靶转录物的区域具有siRNA样互补性；即，在距离saRNA双链体中的引导链5'末端的核苷酸2-6和靶转录物的区域之间的100%互补性。小RNA分子的其他核苷酸可另外与靶转录物的区域具有至少70、80、90、95、99或
100%互补性。例如，直到3'末端的核苷酸7（从5'末端开始计数）可与靶转录物的区域具有至少70、80、90、95、99或100%互补性。
100%互补性。例如，直到3'末端的核苷酸7（从5'末端开始计数）可与靶转录物的区域具有至少70、80、90、95、99或100%互补性。
[0129] 在本发明的saRNA分子优选与之具有高度互补性的靶RNA转录物内的序列优选对于基因组序列是反义的，所述基因组序列是靶基因的转录起始位点上游或下游最高达500个核苷酸。优选地，它重叠靶基因的启动子。
[0130] 技术人员应当理解通过参考靶转录物来限定saRNA是方便的，与saRNA通过其上调白蛋白产生的机制无关。然而，saRNA可替代地可通过参考靶基因来限定。靶转录物与靶基因的编码链上的基因组区域是互补的，并且saRNA依次又与靶转录物的区域是互补的，因此saRNA可定义为与靶基因的编码链上的区域具有序列同一性。本文就通过参考靶转录物限定saRNA而言讨论的所有特征已作必要的修正应用于通过参考靶基因限定saRNA，因此与“靶转录物”的“互补性”的任何讨论应理解为包括与“基因组序列”的“同一性”。因此，saRNA优选与靶基因的转录起始位点周围的基因组序列具有高同一性百分比，例如至少75、80、85、90、95、98或99，优选100%同一性。基因组序列可与TSS具有的距离在上文讨论。
优选基因组序列是TSS上游或下游最高达500个核苷酸。最优选地，它重叠靶基因的启动子。因此，saRNA优选与重叠靶基因的启动子区的序列具有序列同一性。
优选基因组序列是TSS上游或下游最高达500个核苷酸。最优选地，它重叠靶基因的启动子。因此，saRNA优选与重叠靶基因的启动子区的序列具有序列同一性。
[0131] 优选地，本发明的“小”RNA分子是长度13个核苷酸到30个核苷酸，优选15或17到30个核苷酸，更优选长度16到25个核苷酸，甚至更优选长度17到21个核苷酸，最优选长度19、20、21或22个核苷酸。换言之，小RNA分子可包含具有上文讨论长度的第一链。如果存在3'尾部，则该链可更长，优选19个核苷酸加上优选为UU或UUU的3'尾部。
[0132] 小RNA分子可以是单链的或优选是双链的。双链分子包含第一链和第二链。如果是双链的，则优选双链体的每条链是长度至少14，更优选至少18例如19、20、21或22个核苷酸。优选地，双链体在至少12、更优选至少15、更优选17、甚至更优选至少19个核苷酸的长度上杂交。每条链可正好是长度19个核苷酸。如果存在3'尾部，则该链可更长，优选19个核苷酸加上优选为UU或UUU的3'尾部。
[0133] 优选地，双链体长度小于30个核苷酸，因为超过这个长度的双链体可具有增加的诱导干扰素应答的危险。形成dsRNA双链体的链可具有相等或不等长度。
[0134] 最优选地，小RNA分子是小干扰RNA(siRNA)分子。
[0135] 任选地，小RNA分子是dsRNA分子，其由稳定碱基配对的两条链连同在每条链的3'末端上形成3'突出端的许多不成对核苷酸组成。每条链形成3'突出端的不成对核苷酸数目优选在1到5个核苷酸的范围内，更优选1到3个核苷酸且最优选2个核苷酸。3'突出端可由上文提及的3'尾部形成，因此3'尾部可以是3'突出端。
[0136] 对于本文使用的序列互补性或同一性的所有提及是指小RNA分子的整个长度，除非另有具体说明。
[0137] 小RNA可包括与靶RNA转录物不互补的极短的3'或5'序列。优选地，此类序列是3'。所述序列可以是长度1-5个核苷酸，优选2-3个例如2或3个。所述序列优选包含尿嘧啶或由尿嘧啶组成，因此最优选地它是2或3个尿嘧啶的3'段。该非互补序列可被称为“尾部”。因此，小RNA优选由下述组成：(i)与靶RNA的区域具有至少95%互补性的序列；和(ii)优选包含尿嘧啶残基或由尿嘧啶残基组成的1-5个核苷酸的3'尾部。小RNA因此一般在其整个长度上与靶RNA转录物的区域具有互补性，除了可能存在的3'尾部外。如上所述，代替与“靶RNA转录物互补”，saRNA可定义为与有关基因组序列的编码链具有“同一性”。
[0138] 本发明的合适saRNA的优选序列在表1中提供。因此，提供的是具有包含选自下述的序列或由选自下述的序列组成的第一链的小RNA：SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36。任选地，小RNA可包含在这些序列中任何的3'末端上的3'尾部。
[0139] 单链小RNA分子仅由第一链组成，而双链小RNA分子还具有第二链。小RNA因此可具有包含选自下述的序列或由选自下述的序列组成的第二链：SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35。
[0140] 具有SEQ ID NO:14的第一链和SEQ ID NO:13的第二链的小RNA显示在治疗癌症中是特别有效的，因此这是特别优选的。
[0141] 表1指示优选配对，每行代表一个优选配对。因此，例如，小RNA优选具有包含SEQ ID NO:14的序列或由SEQ ID NO:14的序列组成，任选具有3'尾部的第一链，和包含SEQ ID NO:13的序列或由SEQ ID NO:13的序列组成，任选具有3'尾部的第二链。
[0142] 本文公开的小RNA序列中的任何可任选包括此类3'尾部。因此，该表中公开的序列中的任何可任选包括此类3'尾部。
[0143] 如本文使用的，术语“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置上具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及改变的RNA，所述改变的RNA由于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而不同于天然存在的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料例如对RNA的一个或多个末端或内部的添加，例如在RNA的一个或多个核苷酸上的添加。在本发明的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
[0144] 如本文使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸双链体。
[0145] 如本文使用的，术语“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够通过RNAi经由序列特异性介导的一种或多种靶RNA转录物切割来调控基因表达的核酸分子。一般地，在RNAi中，RNA转录物是mRNA，并且因此该靶的切割导致基因表达的下调。然而，在本发明中，靶基因的上调或下调可通过RNA转录物的切割来实现，所述RNA转录物对于靶目的基因分别是反义或有义的。
[0146] “互补性”和“互补的”意指第一核酸可例如通过沃森克里克碱基配对与第二核酸形成一个或多个氢键。可通过非沃森克里克碱基配对与另一核酸形成一个或多个氢键的核酸也属于具有互补性的定义。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键（例如沃森克里克碱基配对）的残基百分比（例如10个中的5、6、7、8、9、10个是50%、60%、70%、80%、90%和100%互补的）。
[0147] “同一性”、“相同的”或“序列同一性”意指第一核酸在序列中与第二核酸序列相同。同一性百分比指示第一核酸分子中与第二核酸序列相同的残基百分比（例如10个中的5、6、7、8、9、10个是50%、60%、70%、80%、90%和100%相同的）。
[0148] 序列比对和同一性百分比或互补性百分比计算可使用本领域已知的任何方法或工具进行测定，所述方法或工具包括但不限于LASARGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(DNASTAR Inc.,Madison,Wl)、Clustal V比对法（Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153）和BLAST2.0程序套件。用于执行BLAST分析的软件例如可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。技术人员将能够设定这些工具的参数以适合其所需目的。
[0149] 当评价其中一个序列是DNA序列并且另一个是RNA序列的第一和第二核酸序列的同一性或互补性时，必须记住RNA序列包含尿嘧啶，而DNA序列将包含胸腺嘧啶代替。因此，在这些情况下，当评价序列同一性时，尿嘧啶残基视为等同于胸腺嘧啶残基，并且当评价互补性时，尿嘧啶残基视为与腺嘌呤残基互补/能够与腺嘌呤残基形成氢键。
[0150] 两个或更多个序列的互补性程度的测定可通过本领域已知的任何方法执行。优选地，使用的方法是Hossbach等人（同上）中所述的那种。依照该方法，使用在http://www.mpibpc.mpg.de/groups/luehrmann/siRNA处可取得的Perl脚本。
[0151] 此外，用于设计和分析小RNA分子的多种工具是众所周知的，其允许本领域普通技术人员测定可实现靶RNA转录物的有效和特异性下调的RNA分子。建立的方法包括例如GPboost和Reynolds算法(PMIDs:15201190,14758366)。此外，小RNA引起靶RNA的有效下调的能力可使用用于测量细胞中的RNA或蛋白质水平的标准技术进行评估。例如，本发明的小RNA可递送至培养细胞，并且靶RNA的水平可通过技术包括但不限于RNA印迹或斑点印迹技术或通过定量RT-PCR进行测量。
[0152] 优选地，小RNA不具有基序aaaa、cccc、gggg或uuuu中的任何一个。优选地，小RNA具有至少20%和不超过75%的GC百分比，即20%-75%，优选20%-55%。上述方法的小RNA理想地是热力学稳定的双链体，在所述情况下每条链的GC百分比是至少25%和不超过75%，即25%-75%，优选20%-55%。
[0153] 用于测定RNA是否具有基序aaaa、cccc、gggg或uuuu和用于测定分子/链的GC含量百分比的工具和算法是技术人员众所周知的。此类工具包括在Saetrom和Snove,(2004)Biochem Biophys Res Commun321:247-253和Vert等人，(2006)BMC Bioinformatics7:520（17页）中描述且参考的那些。
[0154] 小RNA可诱导与小RNA链具有有限数目错配的非靶转录物的下调，所述小RNA链被掺入RISC蛋白质复合物内。这减少小RNA分子的效率且因此是不期望的。因此，小RNA分子应与除预期靶外的转录物具有有限的互补性，以防止非故意的脱靶效应。具有基于切割的脱靶效应的小RNA候选物的概率是其与非靶RNA序列的互补性的函数，并且可通过本领域已知的任何方法进行测定。任选地，无缺口史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)方法(TF Smith & MS Waterman(1981)Journal of molecular biology147:195-197)可用于针对Ensembl（Flicek,P.,等人(2008)Ensembl2008.Nucleic Acids Res36:D707-714）人转录组数据库（ ,O.,Jr.,等人(2004)Biochem Biophys Res Commun325:769-773）筛选候选小RNA，以鉴定小RNA的潜在非靶转录物。作为另外一种选择，小RNA可针对一群选择的RNA序列例如选择的GenBank序列进行筛选，所述序列不含完整的Ensembl人转录组数据库。作为另外一种选择，可使用海明(Hamming)距离测量。
[0155] 优选地，小RNA分子与鉴定的非靶转录物具有超过两个错配。另外看来，优选地，小RNA分子与所有潜在的非靶转录物具有2或更大的海明距离。如果小RNA是双链的，则优选两条链均满足该需求。
[0156] 任选地，小RNA分子与已知高度有效的标准siRNA具有共同的特征。优选地，小RNA如果是双链的，则该小RNA的一条或两条链具有超过0.1的GPboost得分。GPboost是基于已知遗传编程的siRNA效率预测系统，并且用于测定siRNA链的GPboost得分的方法公开于"Predicting the efficacy of short oligonucleotides in antisense and RNAi experiments with boosted genetic programming", Saetrom(2004)Bioinformatics20(17):3055-3063中，所述参考文献的内容通过引用在此并入。作为另外一种选择或另外地，小RNA分子具有与高度有效的siRNA相关的特异性序列特征。通过引用在此并入的由Reynolds描述的算法[Reynolds等人(2004)Nature biotechnology
22(3):326-330]允许测定小RNA是否具有这个类型的足够特征。本领域普通技术人员将能够限定且改善其阈值用于其特定目的。
22(3):326-330]允许测定小RNA是否具有这个类型的足够特征。本领域普通技术人员将能够限定且改善其阈值用于其特定目的。
[0157] 任选地，小RNA分子含有与高度有效的siRNA相关的位置特异性序列基序。siRNA效率预测算法是本领域众所周知的，并且与高度有效的siRNA相关的基序在Saetrom和Snove，(2004)Biochem Biophys Res Commun321:247-253中讨论，所述参考文献的内容通过引用在此并入。
[0158] 优选地，小RNA分子能够直接进入细胞的RNAi机制内，或能够在进入细胞的RNAi机制内之前由切酶加工。测定小RNA分子在进入细胞的RNAi机制内之前是否能够由切酶加工的方法是本领域众所周知的，例如体外切酶测定，例如公开于Tiemann等人(2010)RNA16(6):1275-1284和Rose等人(2005)Nucleic Acid Research33(13):4140-4156中的那种。
[0159] 如果小RNA分子是双链的，并且如果该分子内的仅一条链能够有效且特异性下调靶RNA转录物，则优选地，该链优先装载到RISC内。其中一条链优先装载到RISC内的双链RNA分子的设计在本领域普通技术人员的能力内。例如，靶向靶RNA转录物的小RNA分子的链的5'末端可制备或选择为比另一条链的5'末端在热力学上更不稳定。优选地，在双链体热力学末端稳定性中存在大差异，使得靶向靶RNA转录物的小RNA分子的链的5'末端比另一条链的5'末端在热力学上更不稳定。双链体热力学末端稳定性中的差异绝对值(ΔΔG)可依照本领域的任何标准方法进行计算。任选地，通过考虑在双链体末端上的5个关闭核苷酸，通过RNA折叠(RNAfold)（Hofacker等人，(2003)Nucleic Acids Research第31卷，No.13,第3429-3431页）计算双链体热力学末端稳定性中的差异绝对值。优选地，如通过RNA折叠计算的双链体热力学末端稳定性中的差异绝对值超过0kcal/mol，更优选超过1kcal/mol，更优选超过3kcal/mol。
[0160] 许多用于小RNA设计的标准工具例如上文描述的那些，提供了用于评价分子的这个性质的方法。例如，如果双链分子具有有利于一条链超过另一条掺入RNAi机制内的热力学性质，则可选择它们。作为另外一种选择，一条链的优先装载可通过使用dsRNA来实现，所述dsRNA含有由于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而不同于天然存在的RNA的RNA。
[0161] 测定细胞中存在的靶RNA转录物的方法是本领域众所周知的。例如，可在目的基因的基因座周围的基因组区域中搜索剪接的表达序列标签。表达序列标签或EST是转录cDNA序列的小子序列。EST通常用于鉴定基因转录物。EST的公开数据库是本领域已知的，例如GenBank数据库。作为另外一种选择，逆转录酶PCR(RT-PCR)，众所周知的用于鉴定RNA的工具，可用于鉴定潜在的靶RNA转录物。作为另外一种选择，高流通量测序或其他此类方法可用于测序总RNA、大小分馏的RNA或其他合适的RNA子集，并且使用此类测序文库以鉴定源于目的区域的RNA转录物。作为另外一种选择，可在一群已知RNA转录物中搜索，以鉴定合适的转录物。可使用本领域已知的任何RNA转录物数据库，例如University of California Santa Cruz (UCSC)剪接EST轨迹(Spliced EST track)。作为另外一种选择，该群体可通过为了其自身特异性目的而操作本发明的技术人员具有的群体进行制备。例如，如果靶基因已知在特定细胞类型中表达，则转录物的数据库可以是已测定为存在于该细胞类型中的转录物。技术人员将能够测定该群体以用于其特异性所需目的。
[0162] 然而，为了本发明的目的，事实上不需要对于靶基因是反义的任何RNA转录物的阳性鉴定。因此，无需测定所述非编码RNA转录物（即待下调的靶转录物）的存在。本发明人发现如果获得围绕该基因的转录起始位点的区域中的基因编码链的核苷酸序列，即通过测序测定或在数据库上发现，并且测定针对该区域的反向互补的RNA序列，则与后面一种序列互补的小RNA分子可用于上调靶基因。互补性需求在本文其他地方讨论。围绕该基因的转录起始位点的区域是位于转录起始位点上游和下游100、200、300、400、500、800、1000或2000个核苷酸之间的区域。
[0163] 因此，saRNA分子可基于上文所述的原理进行设计。在一些实施例中，可采取下文描述的方法。
[0164] 例如，图4显示方法400的方框图。在方法400中，选择框410包括选择基因的基因序列用于设计一种或多种小激活RNA分子的目的。优选基因在本文其他地方讨论。在供应框420中，方法400包括提供信息例如关于靶基因组定位、定向和转录结构的信息（例如来自数据库）。在鉴定框430中，发生一种或多种反义转录物的鉴定（例如在数据中搜索对于靶基因是反义的且在靶基因附近的转录物），尽管实际上无需测定非编码RNA转录物的存在。在供应框440中，方法400包括提供在转录起始位点(TSS)周围的有界区域。例如，在TSS的一侧上的许多单元和在另一侧上的许多单元可提供作为有界区域。在设计过程开始框450中，方法400可开始计算机辅助过程，其作用于促进设计一种或多种saRNA。此类过程可依赖选自下述的一种或多种技术：例如统计技术、遗传编程(GP)技术、提升技术、神经网络技术、隐马尔可夫模型(HMM)技术、向量机技术(SVM)技术等。一般而言，当提供有界的TSS区域作为输入时，此类技术提供用于设计一种或多种saRNA。
[0165] 在图4的例子中，方法400还包括输出框460，其可输出一种或多种设计的saRNA，并且任选要求或主动采取一个或多个步骤以构建一种或多种saRNA。关于输出，框460可输出信息至显示器、打印机、存储器、接口等。例如，框460可经由网络接口输出信息至网络，输出信息至配置为用于化学加工以构建分子的机器等。
[0166] 图4中还显示的是多个装置412、422、432、442、452和462，其可以是配置为存储用于执行相关框410、420、430、440、450和460的一个或多个动作的指令的存储介质。例如，框412、422、432、442、452和462可以是一个或多个计算机可读介质，其包括信息例如处理器或计算机可执行指令。虽然个别显示，但单个存储介质可包括用于框412、422、432、442、452和462中超过一个的指令。存储介质可以是硬驱、光盘、存储器（例如存储卡）等。
[0167] 如本文描述的，一个或多个计算机可读介质可包括计算机可执行指令，以指导计算系统接受信息（例如如在框420中），鉴定反义转录物（例如如在框430中），鉴定关于转录起始位点的有界区域（例如如在框440中），和要求saRNA设计过程的开始（例如如在框450中）。此类一个或多个计算机可读介质可任选包括指导计算系统设计一种或多种saRNA的指令。此外，一个或多个计算机可读介质可包括促使计算系统写入或发送一种或多种设计的saRNA的指令。例如，关于一种或多种saRNA的信息可写入存储介质，经由接口（例如网络接口）发送等。相应地，配置为构建一种或多种saRNA的机器可接受此类信息且随后构建此类一种或多种saRNA（例如如在框460中）。作为另一例子，考虑其中一种或多种saRNA可得自一个或多个来源的情况。如本文描述的，可发生此类一个或多个来源的搜索，以鉴定一种或多种可获得的saRNA（例如考虑目录、saRNA库等）。
[0168] 如本文描述的，在多个试验中，选择用于人白蛋白的基因序列（参见例如框410）。此类基因序列选择用于设计小激活RNA分子用于其特异性激活，其中使用四个参数：1)来自UCSC RefSeq数据库的靶向基因注释；2)来自反义RNA的靶向序列；3)反义序列的启动子选择；和4)候选小激活RNA的鉴定。接下来，发生对于来自一个或多个可用数据库（例如在UCSC的RefSeq）的靶的基因组定位、定向和转录结构的信息下载（参见例如框420）。
[0169] 接下来，考虑到具有已知阅读方向的RNA转录物的数据库，例如UCSC剪接EST轨迹，发生就对于靶基因是反义的且在靶基因附近的转录物的数据库搜索（参见例如框430）。更具体而言，过程包括鉴定下述反义转录物：其(a)重叠靶的启动子和靶mRNA的5'末端；
(b)重叠靶mRNA；(c)在靶的转录起始位点上游至多20–100kb；或(d)在靶的多腺苷酸化位点下游至多20–100kb。过程可使用这四个标准作为分层滤器，使得它找到例如满足标准(a)的反义转录物，该过程不一定需要考虑其他三个标准。
(b)重叠靶mRNA；(c)在靶的转录起始位点上游至多20–100kb；或(d)在靶的多腺苷酸化位点下游至多20–100kb。过程可使用这四个标准作为分层滤器，使得它找到例如满足标准(a)的反义转录物，该过程不一定需要考虑其他三个标准。
[0170] 接下来，基于靶的转录起始位点(TSS)，过程可包括下载距离例如TSS上游和下游固定大小区域的反义基因组序列。在多个试验中，使用的一般区域大小是TSS上游和下游500个核苷酸，但可适当地应用更大或更小的尺寸（参见例如框440）。
[0171] 在下载后，过程可包括设计一种或多种siRNA，其给予反义靶序列的有效和特异性下调（参见例如框450）。例如，过程可(a)使用siRNA设计算法，例如GPboost，以鉴定候选有效siRNA；(b)去除具有aaaa、cccc、gggg或uuuu基序和GC含量小于20%或大于55%的所有候选siRNA；(c)去除与所有潜在非靶转录物具有小于二的海明距离的所有候选物；和(d)返回给定数目的通过其预测的siRNA击倒效率分选的剩余非重叠siRNA。在此类例子中，该过程可对于给定反义靶序列返回多个（例如两个最高评分的）saRNA。如本文描述的，随后为一种或多种saRNA的输出和构建（参见例如框460）。
[0172] 本发明的saRNA可通过任何合适的方法例如合成或通过使用技术人员众所周知的标准分子生物学技术在细胞中表达而产生。例如，saRNA可使用本领域已知的方法进行化学合成或重组产生。
[0173] 如上所述，saRNA和/或细胞可在治疗上使用。saRNA或细胞可经由注射例如静脉内、皮下、肌内施用到靶器官内。因此，注射可以是全身的或在靶位点上或进入靶位点内，所述靶位点例如靶器官，优选肝，尽管也考虑了前列腺或胰腺。作为另外一种选择，施用可以是经口或经直肠的（经直肠）。细胞注射到肝内是优选的。
[0174] 本发明的小RNA和/或细胞可通过本领域已知的任何方法或递送媒介物施用于有此需要的患者，例如经由纳米颗粒、阳离子脂质、脂质例如胆固醇或α-生育酚、脂质体例如带正电的阳离子脂质体、聚合物例如聚乙烯亚胺、树枝状聚合物、适体或作为抗体缀合物。小RNA还可作为病毒载体表达的shRNA或miRNA模拟物施用。
[0175] 优选地，saRNA或细胞与部分结合，例如与部分复合、与部分连接或包含在部分内，所述部分使saRNA或细胞靶向特异性组织或细胞类型，例如肝脏细胞，例如肝细胞。所述部分可以是上文提及的工具/递送媒介物之一。然而，靶向递送事实上可能是不需要的，因为药物和特别的saRNA在全身施用后天然递送至肝。
[0176] 适体是具有高选择性、亲和力和稳定性的寡核苷酸或肽。它们采取特异性和稳定的三维形状，从而提供与靶分子的高度特异性的紧密结合。对于任何特异性分子靶，例如通过称为配体指数富集的系统进化(SELEX)的技术（参见例如Tuerk C和Gold L:Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science1990,249:505-510），可由核酸的组合文库鉴定核酸适体。肽适体可例如使用酵母双杂交系统进行鉴定。技术人员因此能够设计合适的适体用于将本发明的saRNA或细胞递送至靶细胞例如肝脏细胞。考虑了DNA适体、RNA适体和肽适体。本发明的小RNA使用肝特异性适体对肝的施用是特别优选的。
[0177] 还提供的是适体和本发明的小RNA的缀合物。缀合物可使用任何已知用于连接两个部分的方法形成，例如直接化学键形成、经由接头例如链霉抗生物素蛋白的连接等等。
[0178] 生成针对靶细胞表面受体的抗体的方法是众所周知的。本发明的saRNA分子可例如使用RNA载体蛋白质附接至此类抗体。所得的复合物随后可施用于受试者，且经由受体介导的内吞作用通过靶细胞摄取。本发明的细胞可使用已知方法连接至此类抗体。
[0179] saRNA或细胞可使用本领域已知的方法封装在脂质体中。脂质体可任选与靶细胞特异性部分例如抗体或肽结合。
[0180] 如上文讨论的，本发明的分子基于靶基因的序列分析生成，并且与这些小核酸分子的递送相关的方法和产品是本发明的更多方面。因此，本发明还提供了包括计算机可读存储介质和数据结构的方法和产品，其可在图4-9中示意性阐述，并且在下文关于图4-9讨论。除非另有说明，上文与本发明的方法和产品有关描述的说明书和优选实施例已作必要的修正应用于下文讨论的方面。
[0182] 通过参考与附图中所示的实例结合考虑的下述详细详述，可具有本文描述的多种方法、装置、组件、系统、安排等及其等价物的更全面理解，在所述附图中：
[0183] 图1是一些可能机制（机制A和机制B）的图解；
[0184] 图2是关于saRNA转染的HepG2细胞证实白蛋白上调的结果的一系列图表。关于白蛋白PR1、PR2、PR3和PR4的序列参见表1；
[0185] 图3是在saRNA转染后的HepG2细胞中的WST-1增殖测定结果的一系列图表。关于白蛋白PR1、PR2、PR3和PR4的序列参见表1；
[0186] 图4是方法例子的方框图；
[0187] 图5是设备和计算装置例子的方框图；
[0188] 图6是方法例子的方框图；
[0189] 图7是方法例子的方框图；
[0190] 图8是处理计划的例子和工艺、技术等的其他例子的方框图；
[0191] 图9是待递送至一个或多个细胞类型的saRNA的图解。
[0192] 图10显示用白蛋白saRNA转染肝脏细胞的体外效应（参见实例2）。数据代表来自三次独立转染的平均值、SEM。(A)针对对照HepG2细胞比较用对白蛋白特异性的saRNA转染的HepG2细胞的小鼠白蛋白ELISA结果。*=p(0.0136)。(B)针对对照HepG2细胞比较用对白蛋白特异性的saRNA转染的HepG2细胞的白蛋白mRNA的qPCR分析。**=p(<0.003)。(C)针对对照大鼠肝上皮细胞比较用对白蛋白特异性的saRNA转染的大鼠肝上皮细胞的白蛋白mRNA的qPCR分析。
[0193] 图11显示针对对照用CEBPA saRNA构建体AW1和AW2转染HepG2细胞系的效应（参见实例4）。(A)显示CEBPA的相对mRNA转录物水平，(B)显示白蛋白的相对mRNA转录物水平，(c)显示白蛋白表达(ng/ml)，和(D)显示HepG2细胞生存。
[0194] 图12显示针对对照用CEBPA saRNA构建体AW1和AW2转染DU145前列腺癌上皮细胞系的效应（参见实例4）。(A)显示CEBPA的相对mRNA转录物水平，(B)显示白蛋白的相对mRNA转录物水平，和(c)显示HepG2细胞生存。
[0195] 图13显示对于每个对照、或树枝状聚合物+白蛋白saRNA组的尾部注射小鼠(n=5)的血液分析（参见实例5）。(A)白蛋白、(B)γ谷氨酰转肽酶、(C)丙氨酸氨基转移酶和(D)天冬氨酸氨基转移酶。
[0196] 图14显示针对对照比较的，在AW1saRNA施用于大鼠后的血清白蛋白水平。参见实例6。AW1靶向CEBPA（关于序列参见表1）。
[0197] 图15显示关于血清白蛋白水平的合并数据，组合对大鼠的AW1和AW2（关于序列参见表1）施用的数据且针对对大鼠的对照施用比较。参见实例6。
[0198] 图16显示针对对照在用白蛋白saRNA+树枝状聚合物施用的小鼠中，来自组织活组织检查的转录物水平的定量分析。(A)显示甲胎蛋白(AFP)的相对mRNA转录物水平，和(B)显示肝细胞生长因子(HGF)的相对mRNA转录物水平。
[0199] 表1显示设计用于上调白蛋白表达的小RNA分子。
[0200] 表2显示设计用于上调白蛋白表达的小RNA分子。
[0201] 更具体而言，图2显示关于saRNA转染的HepG2细胞证实白蛋白上调的数据图表。5
在图2中，(A)代表来自以2.5x10 细胞/孔的密度在24孔板中铺平板的HepG2细胞的结果图表。使用针对白蛋白基因的启动子区的四个saRNA克隆（PR1、PR2、PR3和PR4）。在24孔板中铺平板后0、12和24小时，将细胞用150ng saRNA转染，随后收获用于提取总RNA。
mRNA水平的RT-PCR概况显示仅在用saRNA转染的细胞中的白蛋白水平中的增加。在图
2中，(B)代表来自两个独立试验的半定量分析的结果图表，以显示PR3saRNA具有白蛋白mRNA水平中的最显著增加(158%+/5.7%)。关于图3，在saRNA转染后的HepG2细胞中显示
5
来自WST-1增殖测定的结果。HepG2细胞以1.5x10 细胞/孔的密度在24孔中铺平板，随后为在0、12和24小时的三次转染。随后在多板阅读器中在Amax450nm处分析前30分钟加入WST-1试剂。在图3中，(A)是呈现指示代谢活性和增殖细胞的甲瓒染料的量的图表，所述甲瓒染料的量仅在用针对白蛋白的saRNA转染的细胞中是急剧减少的。在图3中，(B)是呈现相对于未经转染的细胞的细胞生存百分比的图表，以证实用PR3 saRNA转染的细胞具有细胞增殖中的最显著降低。
在图2中，(A)代表来自以2.5x10 细胞/孔的密度在24孔板中铺平板的HepG2细胞的结果图表。使用针对白蛋白基因的启动子区的四个saRNA克隆（PR1、PR2、PR3和PR4）。在24孔板中铺平板后0、12和24小时，将细胞用150ng saRNA转染，随后收获用于提取总RNA。
mRNA水平的RT-PCR概况显示仅在用saRNA转染的细胞中的白蛋白水平中的增加。在图
2中，(B)代表来自两个独立试验的半定量分析的结果图表，以显示PR3saRNA具有白蛋白mRNA水平中的最显著增加(158%+/5.7%)。关于图3，在saRNA转染后的HepG2细胞中显示
5
来自WST-1增殖测定的结果。HepG2细胞以1.5x10 细胞/孔的密度在24孔中铺平板，随后为在0、12和24小时的三次转染。随后在多板阅读器中在Amax450nm处分析前30分钟加入WST-1试剂。在图3中，(A)是呈现指示代谢活性和增殖细胞的甲瓒染料的量的图表，所述甲瓒染料的量仅在用针对白蛋白的saRNA转染的细胞中是急剧减少的。在图3中，(B)是呈现相对于未经转染的细胞的细胞生存百分比的图表，以证实用PR3 saRNA转染的细胞具有细胞增殖中的最显著降低。
[0202] 关于本文描述的多个试验，具体地关于细胞培养的细节，将HepG2细胞（美国典型培养物中心）在RPMI-140培养基(Sigma,USA)中在37℃下在加湿5%CO2空气中培养，所述RPMI-140培养基补充有10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen,USA)、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺(Sigma,USA)。
[0203] 关于化学加工，对于多个试验，在90℃下的变性步骤后，使用50mMTris-HCl pH8.0、100mM NaCl和5mM EDTA使配对的saRNA寡核苷酸退火，随后为至室温的逐步退火步骤。
[0204] 分离用于半定量rtPCR的总RNA的过程可包括多个动作。例如，所有总RNA提取可使用RNAqueous-Micro试剂盒(Ambion,UK)（例如按照制造商的说明书）执行。关于多个试验，将细胞轻轻离心，随后为在裂解缓冲液(Ambion,UK)中以输出量3的3次超声脉冲。随后通过RNA结合柱处理细胞裂解产物，随后为多次洗涤和洗脱。分离的总RNA通过Nanodrop2000分光光度计进行定量。使用一步RT-PCR（Qiagen，德国）（例如按照制造商的说明书），将500ng总RNA逆转录。使用其各自的引物对，通过PCR执行用于白蛋白和用于装载对照持家基因肌动蛋白的表达：白蛋白-F:TCC AGC ACT GCC TGC GGT GA；R:TCC GTC ACG CAC TGG GAG GA；按照在95℃-45秒；55℃-45秒；61℃-45秒的37个循环。肌动蛋白-F:GAG AAA ATC TGG CAC CAC ACC；R:ATA CCC CTC GTA GAT GGG CAC，按照在95℃-5分钟；60℃-30秒；70℃-45秒的37个循环；在37个循环时的72℃-10分钟。产物使用UVP VisonWorks LS(v6.2.)一式三份半定量地进行分析。
[0205] 对于本文描述的试验，使用四唑盐4-[3-(4-碘苯基)2-(硝基苯基)2H-5-四氮5
唑]1,3苯二磺酸酯(WST-1)增殖测定。具体地，将HepG2（1.5x10 细胞/孔）在96孔板中铺平板，并且在500ul RPMI-140培养基(Sigma,USA)中培养，所述RPMI-140培养基补充有
10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen,USA)、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺(Sigma,USA)，使用纳米转染试剂转染（使用纳米转染胺(Nanofectamine)(PAA,UK)（例如按照制造商的说明书）转染150ng退火的靶向MafA的saRNA）。前述过程在距离铺平板
0小时、12小时和24小时重复三次。加入细胞增殖试剂WST-1(Roche Applied Science,UK)（例如按照制造商的说明书）。随后将比色测定温育30分钟，以允许通过活细胞中的线粒体琥珀酸盐四唑鎓还原酶将四唑盐WST-1切割为甲瓒染料。在多孔板阅读器中在Amax450nm处测量与代谢活性增殖细胞数目直接相关的甲瓒染料的量。对于试验，测定总共三次独立实验。
唑]1,3苯二磺酸酯(WST-1)增殖测定。具体地，将HepG2（1.5x10 细胞/孔）在96孔板中铺平板，并且在500ul RPMI-140培养基(Sigma,USA)中培养，所述RPMI-140培养基补充有
10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen,USA)、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺(Sigma,USA)，使用纳米转染试剂转染（使用纳米转染胺(Nanofectamine)(PAA,UK)（例如按照制造商的说明书）转染150ng退火的靶向MafA的saRNA）。前述过程在距离铺平板
0小时、12小时和24小时重复三次。加入细胞增殖试剂WST-1(Roche Applied Science,UK)（例如按照制造商的说明书）。随后将比色测定温育30分钟，以允许通过活细胞中的线粒体琥珀酸盐四唑鎓还原酶将四唑盐WST-1切割为甲瓒染料。在多孔板阅读器中在Amax450nm处测量与代谢活性增殖细胞数目直接相关的甲瓒染料的量。对于试验，测定总共三次独立实验。
[0206] 再次，如图2和3中所示，saRNA转染的HepG2细胞证实白蛋白的上调，并且在saRNA转染后的HepG2细胞中的WST-1增殖测定结果证实减少的增殖。
[0207] 图5显示可包括多个部件的系统500（例如计算系统）。在图5的例子中，系统500可包括输入信息510，其可例如经由网络接口540或其他接口提供给一个或多个处理器520和存储器530。如所示的，CRM框534可包括一个或多个计算机可读介质。此类一个或多个介质可以是图4中的那些中的一个或多个（参见例如412、422、432、442、452和462）。图5中还显示的是显示装置550、存储装置570和制造装置590。
[0208] 如本文描述的，制造装置590可包括一种或多种化学制品（例如一种或多种探针，任选的一种或多种其他化学制品例如酶等），和任选的用于容纳一种或多种化学制品的容器、孔等。
[0209] 在图5的例子中，系统500可包括可操作地偶联至存储器530的一个或多个处理器520，所述存储器530可配置为存储由一个或多个计算机可读（或处理器可读）存储介质534阅读的指令。如本文描述的，CRM534可存储指令，在通过一个或多个处理器执行后，所述指令指导系统500执行图4的方法400的至少部分。
[0210] 图5的例子中还显示的是网络接口540，其可允许往来系统500的信息通讯。例如，指令可与系统500通讯（例如以开始操作、终止操作、质量控制、更新软件指令等）。一个或多个处理器520的输出可经由网络接口540由系统500（例如与健康护理提供者、科学家、数据库、药物制造商等）通讯。
[0211] 图6显示方法600的方框图。如所述的，saRNA可用于治疗或预防癌症，例如原发性肝癌。例如，关于肝癌，治疗或预防可通过给具有肝硬变（例如由于病毒性肝炎或乙醇中毒）的患者施用saRNA而发生。方法600包括诊断框610用于诊断患者状况、供应框620用于提供saRNA和施用框630用于给患者施用所提供的saRNA。如本文描述的，此类动作可完全或部分经由一个或多个机器发生，任选基于指令例如存储在一个或多个计算机可读介质（参见例如CRM612、622和632）上的指令而操作。
[0212] 图6的方法600可与图4的方法400的一个或多个框结合执行。例如，供应框620可包括如就图4的方法400的框450而言描述的设计。
[0213] 关于诊断框610，它可提供用于诊断癌细胞611、诊断癌前细胞613、诊断其他危险615或其任何组合。如所述的，某些状况造成关于癌症的危险。例如，患者感染、患者习惯、患者中毒等可造成关于癌症的危险。如本文描述的，方法可包括输入信息、至少部分基于该信息评价危险、和决定是否对类似情况的一个或多个患者施用RNA。此类一次或多次施用可以是例如用于癌症的预防或癌症的治疗。
[0214] 图7显示方法700的方框图。在供应框710中，提供了saRNA，任选具有载体。例如，设计的saRNA可任选由针对肝癌例如已转移到肝外的肝癌的脂质体或适体或RNA适体携带。在施用框720中，将saRNA（和任选的载体）施用于患者（例如人患者）。例如，对于肝肿瘤，可通过全身注射或通过经皮直接注射局部施用设计的saRNA以到达患者的肝。无论是对于肝肿瘤还是其他类型的肿瘤，施用可通过根据框725的引导技术进行引导。引导技术可包括超声、荧光透视法、MR、CT、血管内递送的剖腹术(laparotomo)或腹腔镜检查等。如本文描述的，施用可以是经由经口递送。
[0215] 在图7的例子中，可提供附加治疗，如由决定框730指示的。附加治疗可任选选自下述疗法中的一种或多种：RF消融、微波消融、选择性放射疗法、不可逆电穿孔、高聚焦超声、经动脉化疗栓塞等。如所示的，如果决定框730决定要递送一种或多种附加治疗，则方法700进入附加治疗框740。如果决定框730决定不递送附加治疗，则方法700进入任选的等待框735，且随后适当时在施用框720处继续。例如，对于将saRNA施用于患者（例如以除零级方式外）的疗法，剂量可经过数天时期在有效性中减小。因此，等待框735可提供在后续剂量施用前的等待时间。例如，当施用剂量时，可一周数次（例如每周二到三个剂量用于预防或治疗）给予患者剂量。如本文描述的，一种或多种附加治疗可呈现测定或改变saRNA的相继剂量之间的等待时间的因素。
[0216] 图7中还显示的是多个装置712、722、727、732、737和742，其可以是配置为存储用于执行相关框的一个或多个动作的指令的存储介质。例如，这些可以是一个或多个计算机可读介质，其包括信息例如处理器或计算机可执行指令。虽然个别显示，但单个存储介质可包括用于框中超过一个的指令。存储介质可以是硬驱、光盘、存储器（例如存储卡）等。
[0217] 图7还显示治疗计划模块770。在图7的例子中，模块770包括RNA动态框772、化学治疗动态框774、放射疗法动态框776、患者信息框778、测定框780和输出框782。如本文描述的，当施用时，RNA可具有特定动态并且一种或多种其他疗法可具有特定动态。如本文描述的，存在关于RNA疗法（例如saRNA）和一种或多种其他疗法之间的协同作用的机会。图7的治疗计划模块770可以是计算系统的部分（例如以计算机可执行指令的形式），其允许用于一个或多个患者的自动或交互治疗计划。
[0218] 图8显示可由多个子模块构成的图7的治疗计划模块770，连同作为图形用户界面(GUI)811图解展示（例如呈递）的治疗计划810的例子。相应地，子模块782可包括执行GUI的指令，所述GUI提供由用户的输入以与计划模块770相互作用。例如，用户可能能够选择或调整治疗的剂量和类型，以最佳化用于患者的治疗计划（参见例如在化学剂量之间给予的saRNA剂量）。动作动力学、清除率等可在计划期间加以考虑（例如如通过动态子模块提供的）。
[0219] 图8还显示RNA剂量812，其可以是saRNA813或mRNA815。关于mRNA剂量815，这可与适体816或基因疗法817一起提供，例如以引起多肽（例如白蛋白或其他多肽）的上调。图8还显示化学剂量822作为例子，其可以是适合于缓慢增殖细胞823的化学疗法或适合于快速增殖细胞825的化学疗法。因素例如细胞周期时间、S期持续时间等已报道为与化学疗法的有效性关系密切。更特别地，细胞增殖动力学可以是关于化学疗法的总体有效性的因素。
[0220] 如本文描述的，在化学疗法施用后、前或后和前，一个或多个RNA（例如saRNA）剂量可施用于患者（例如肿瘤细胞等）作为降低增殖的机制。因为化学疗法可以展开的剂量（例如由于对患者的毒性危险）递送，所以在化学剂量之间的时期中施用saRNA可作用于最佳化患者的总体治疗。
[0221] 如本文描述的，方法可包括施用saRNA以在细胞变成癌性或癌前之前，引起该细胞上调该细胞的多肽（例如“天然分泌的”）产生。例如，白蛋白是由多种细胞（例如在此类细胞变成癌性或癌前之前）天然分泌的多肽。如本文描述的，方法可包括施用saRNA以引起未分化的细胞恢复为分化的细胞（例如以使细胞的细胞行为朝向更具有分化细胞特征的行为转变）。
[0222] 图9显示待递送至正常细胞、癌前细胞和癌细胞的saRNA的图解，连同分子产生率和细胞增殖率的示例图表。如所示的，saRNA可递送至一个或多个细胞类型，引起分子产生率中的增加且引起细胞增殖率中的降低。
[0223] 如本文描述的，小激活RNA可包括引起哺乳动物细胞的多肽上调的一系列单元，其中哺乳动物细胞的多肽产生负面影响哺乳动物细胞的增殖能力。如本文描述的，多肽（如与saRNA相关的）可以是哺乳动物细胞在其天然状态中天然分泌的多肽。如本文描述的，多肽（如与saRNA相关的）可以是白蛋白。
[0224] 如本文描述的，saRNA可被提供或设计或设计且提供用于肝细胞。更一般地，saRNA可被提供或设计或设计且提供用于正常细胞、癌前细胞、癌细胞，其中此类细胞可以是哺乳动物细胞。
[0225] 如本文描述的，方法可包括诊断具有特征在于细胞类型的过度增殖的状况的患者；和设计上调该细胞类型的多肽产生的小激活RNA，其中上调的多肽产生负面影响该细胞类型的增殖能力。此类方法还可包括生产小激活RNA。此类方法还可包括给该患者施用设计的小激活RNA。关于诊断，方法可包括诊断肝癌。如所述的，方法可包括施用附加治疗（例如非saRNA疗法），所述附加治疗靶向与saRNA疗法相关的细胞类型。此类附加治疗可以是化学疗法、放射疗法、RF消融疗法、微波消融疗法或其他疗法。
[0226] 如本文描述的，方法可包括通过执行存储在计算机可读存储介质上的一个或多个指令来设计saRNA，所述指令响应于给具有关于多肽的编码区的基因提供转录起始位点。
[0227] 如本文描述的，一个或多个计算机可读介质可包括计算机可执行指令，以指导计算系统：接受用于具有关于白蛋白的编码区的基因的转录起始位点；选择关于转录起始位点的有界区域；表征关于用于上调白蛋白产生的saRNA候选物的单元串；且输出一个或多个表征的单元串作为用于制造saRNA分子的优选候选物，所述saRNA分子用于施用于人受试者以治疗肝癌。
[0228] 本发明的更多实施例在下文阐述：
[0229] 1.小激活RNA，其包含：
[0230] 引起哺乳动物细胞的多肽上调的一系列单元，其中哺乳动物细胞的多肽产生负面影响哺乳动物细胞的增殖能力。
[0231] 2.实施例1的小激活RNA，其中所述多肽包含哺乳动物细胞在其天然状态中天然分泌的多肽。
[0232] 3.实施例1的小激活RNA，其中所述多肽包含白蛋白。
[0233] 4.实施例1的小激活RNA，其中所述哺乳动物细胞包含肝细胞。
[0234] 5.实施例1的小激活RNA，其中所述哺乳动物细胞包含癌细胞。
[0235] 6.一种方法，其包括：诊断具有特征在于细胞类型的过度增殖的状况的患者；和设计上调该细胞类型的多肽产生的小激活RNA，其中上调的多肽产生负面影响该细胞类型的增殖能力。
[0236] 7.实施例6的方法，其还包括生产小激活RNA。
[0237] 8.实施例6的方法，其还包括给所述患者施用设计的小激活RNA。
[0238] 9.实施例6的方法，其中所述诊断诊断肝癌。
[0239] 10.实施例6的方法，其中所述设计包括执行存储在计算机可读存储介质上的一个或多个指令，所述指令响应于给具有关于多肽的编码区的基因提供转录起始位点。
[0240] 11.实施例6的方法，其还包括施用靶向细胞类型的附加治疗。
[0241] 12.实施例11的方法，其中所述附加治疗包含选自下述的疗法：化学疗法、放射疗法、RF消融疗法和微波消融疗法。
[0242] 13.一个或多个计算机可读介质，其包含计算机可执行指令，以指导计算系统：接受用于具有关于白蛋白的编码区的基因的转录起始位点；选择关于转录起始位点的有界区域；表征关于用于上调白蛋白产生的saRNA候选物的单元串；且输出一个或多个表征的单元串作为用于制造saRNA分子的优选候选物，所述saRNA分子用于施用于人受试者以治疗肝癌。
[0243] 14.一种小激活RNA，其包括引起哺乳动物细胞的多肽上调的一系列单元，其中哺乳动物细胞的多肽产生负面影响哺乳动物细胞的增殖能力。
[0244] 还公开了工艺、技术、装置、组件、系统、方法等的多个其他例子。
[0245] 尽管方法、装置、系统、安排等的一些例子已在附图中示例且在前述详述中描述，但应当理解公开的示例实施例并非限制性的，而是能够具有众多重新安排、修饰和置换，而不背离由下述权利要求阐述且限定的精神。
[0246] 通过引用并入本文的一些参考文献
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[0278] 表
[0279] 表1
[0280]
[0281]
[0282] 表2
[0283]
[0284] 实例
[0285] 实例1-设计用于上调白蛋白表达的小RNA
[0286] 涉及白蛋白产生的基因的基因序列选择用于设计小激活RNA分子用于其特异性激活。特别合适的是白蛋白基因、CEBPA基因和/或HNF4α基因。
[0287] 使用四个参数：1)来自UCSC RefSeq数据库的靶向基因注释；2)来自反义RNA的靶向序列；3)反义序列的启动子选择；和4)候选小激活RNA的鉴定。
[0288] 首先，该方法从可用数据库（在UCSC的RefSeq）下载关于靶的基因组定位、定向和转录结构的信息。其次，考虑到具有已知阅读方向的RNA转录物的数据库，例如UCSC剪接EST轨迹，我们的方法在数据库中搜索对于靶基因是反义的且在靶基因附近的转录物。更具体而言，该方法鉴定下述反义转录物：其(a)重叠靶的启动子和靶mRNA的5'末端；(b)重叠靶mRNA；(c)在靶的转录起始位点上游至多20–100kb；或(d)在靶的多腺苷酸化位点下游至多20–100kb。该方法使用这四个标准作为分层滤器，使得它找到例如满足标准(a)的反义转录物，该方法不考虑其他三个标准。第三，基于靶的TSS，该方法下载距离TSS上游和下游固定大小区域的反义基因组序列。由该方法使用的一般区域大小是TSS上游和下游500个核苷酸，但还可使用更大或更小的尺寸。第四，该方法设计给予反义靶序列的有效和特异性下调的siRNA。该方法(a)使用siRNA设计算法，例如GPboost(Seatrom P,2004)，以鉴定候选有效siRNA；(b)去除具有aaaa、cccc、gggg或uuuu基序和GC含量小于20%或大于55%的所有候选siRNA；(c)去除与所有潜在非靶转录物具有小于二的海明距离的所有候选物；和(d)返回给定数目的通过其预测的siRNA击倒效率分选的剩余非重叠siRNA。该方法对于给定反义靶序列返回例如两个最高评分的saRNA。
[0289] 在90℃下的变性步骤后，使用50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl和5mM EDTA使配对的saRNA寡核苷酸退火。
[0290] 实例2–通过用白蛋白saRNA转染的白蛋白表达上调
[0291] 材料与方法
[0292] 使用纳米转染胺(PAA,UK）按照制造商的说明书，将如实例1中所述设计的25nM退火的白蛋白saRNA转染到细胞单层上。将这个过程重复三次。用于该研究的saRNA序列是人白蛋白PR1（SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6）、人白蛋白PR2（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）、人白蛋白PR3（SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10）和人白蛋白PR4（SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12），如表1中所示。随机、混杂RNA分子用作对照。
[0293] 在转染后，使用RNAqueous-Micro试剂盒(Ambion,UK)按照制造商的说明书执行总RNA的分离。简言之，将细胞轻轻离心，随后为在裂解缓冲液(Ambion,UK)中以输出量3的3次超声脉冲。随后通过RNA结合柱处理细胞裂解产物，随后为多次洗涤和洗脱。分离的总RNA通过Nanodrop 2000分光光度计进行定量。将500ng提取的总RNA处理用于消除基因组DNA，随后为使用来自Qiagen的 逆转录试剂盒的逆转录。
[0294] 使用定量逆转录酶(qRT-PCR)分析分离的RNA提取物。简言之，使用第一链cDNA合成试剂盒(Qiagen)将提取物逆转录。随后使用来自Qiagen的Green PCR试剂盒扩 增cDNA用于定 量分析。使 用Applied Biosystems 7900HT
FAST-Real-Time System执行扩增，伴随在95℃15秒和60℃45秒的40个循环条件，使用
25μl/样品的总体积。随后使用Applied Biosystems RQ Manager1.2.1分析扩增产物。
一式三份扩增5个独立实验用于定量分析。斯氏T检验评分在99%置信区间执行。
FAST-Real-Time System执行扩增，伴随在95℃15秒和60℃45秒的40个循环条件，使用
25μl/样品的总体积。随后使用Applied Biosystems RQ Manager1.2.1分析扩增产物。
一式三份扩增5个独立实验用于定量分析。斯氏T检验评分在99%置信区间执行。
[0295] 通过使用白蛋白ELISA测定细胞内的白蛋白产生。简言之，在活性炭剥离FCS的存在下，使细胞在无酚红RPMI培养基中生长。在8小时、16小时和24小时的三组saRNA转染后，收集培养基用于总白蛋白ELISA(Assay Max,Albumin ELISA,Assay Pro USA)，按照制造商的说明书。
[0296] 结果
[0297] 用白蛋白saRNA寡核苷酸转染对白蛋白产生的作用在图2中示出。mRNA水平的RT-PCR概况显示仅在用saRNA转染的细胞中的白蛋白水平中的增加。
[0298] 图10显示与对照相比较，在转染的HepG2细胞系（图10B）和大鼠肝上皮细胞（图10C）中检测到白蛋白mRNA中的显著增加，并且这依次又导致转染的细胞系中的白蛋白产生中的显著增加（图10A，仅显示关于HepG2的数据）。
[0299] 实例3–通过用白蛋白saRNA转染的细胞增殖抑制
[0300] 用如实例2中所述的白蛋白saRNA转染HepG2细胞和大鼠肝上皮细胞，即在这个实例中使用与实例2中相同的saRNA。在大鼠肝上皮细胞和HepG2细胞内的细胞增殖分别使用WST-1增殖测定进行测量。简言之，加入细胞增殖试剂四唑盐，4-[3-(4-碘苯基)2-(硝基苯基)2H-5-四氮唑]1,3苯二磺酸酯(Roche Applied Science,UK)（例如按照制造商的说明书）。随后将比色测定温育30分钟，以允许通过活细胞中的线粒体琥珀酸盐四唑鎓还原酶将四唑盐WST-1切割为甲瓒染料。在多孔板阅读器中在Amax450nm处测量与代谢活性增殖细胞数目直接相关的甲瓒染料的量。
[0301] 细胞增殖和生存通过saRNA各自显著抑制。用HepG2细胞系获得的结果显示于图3中。
[0302] 实例4–通过在体外用CEBPA saRNA转染的白蛋白上调和细胞增殖抑制
[0303] 下述靶向CEBPA的saRNA双链体（有义/反义）用于该研究：
[0304] AW1有义链：CGGUCAUUGUCACUGGUCA(SEQ ID NO:13)
[0305] AW1反义链：UGACCAGUGACAAUGACCG(SEQ ID NO:14)
[0306] AW2有义链：AGCUGAAAGGAUUCAUCCU(SEQ ID NO:15)
[0307] AW2反义链：AGGAUGAAUCCUUUCAGCU(SEQ ID NO:16)
[0308] 使用脂质体法（纳米转染试剂），将靶向CEBPA的3’UTR启动子区的合成saRNA双链体（上文）转染到细胞系或原代CD34+细胞(Omnicytes)内。通过qPCR定量测量CEBPA和白蛋白的转录物水平中的变化。使用四唑盐4-[3-(4-碘苯基)2-(硝基苯基)2H-5-四氮唑]1,3苯二磺酸酯(WST-1)测定来测量细胞增殖中的另外变化。
[0309] 因为当与其他培养的人肝细胞比较时，HepG2细胞中的CEBPA表达更低，所以HepG2细胞用于研究转染AW1和AW2的效应。在经过48小时培养期的三个转染剂量后，收获HepG2细胞且就mRNA分析进行分析。在这个培养期过程中未观察到CEBPA的mRNA水平中的显著变化（图11A）。这并不令人吃惊，因为CEBPA显示在最初培养阶段期间的早期和快速衰退。相比之下，观察到白蛋白的mRNA转录物水平中的增加（图11B）。为了证实mRNA中的白蛋白增加是否还反映其至蛋白质的翻译，执行功能酶联免疫吸附测定法(ELISA)。saRNA转染的细胞在无血清/活性炭剥离培养基中培养，以去除任何外源白蛋白来源。在AW1或AW2的存在下的48小时培养期后，分离细胞培养基并处理用于使用商购可得的试剂盒检测人白蛋白。当与未经转染的细胞相比较时，在saRNA转染的细胞中检测到白蛋白表达中的显著增加（图11C）。我们还在转染的HepG2细胞中执行WST-1增殖测定。观察到细胞增殖中的减少（图11D）。
[0310] 我们接下来测定AW1或AW2是否将成功诱导在非肝细胞中的白蛋白转录物或翻译的正面调节，所述非肝细胞即前列腺癌上皮细胞系(DU145)（图12）和健康成体造血CD34细胞系。按照经过48小时时期的三个剂量，这些细胞系如上所述用AW1和AW2进行转染。随后收获细胞且分析CEBPA和白蛋白的转录物水平。相对于AW1，当用AW2转染时，前列腺癌细胞系显示CEBPA转录物水平中的强烈增加（图12A），并且两个转染均诱导白蛋白转录物水平中的显著增加（图12B）。还执行WST1测定。在用CEBPA转染后，DU145的生长显著减少（图12C）。
[0311] AW1和AW2还上调CD34+干细胞中的白蛋白产生，但CD34细胞的增殖不受AW1和AW2saRNA构建体影响（数据未显示）。
[0312] 本发明人已成功地确定在人肝细胞癌系和前列腺癌上皮细胞系中，用对CEBPA特异性的saRNA AW1和AW2转染具有上调白蛋白转录物水平和蛋白质表达的能力。此外，白蛋白蛋白质表达中的这种增加导致细胞增殖中的降低。相比之下，用对CEBPA特异性的saRNA AW1和AW2转染健康CD34细胞不影响细胞增殖，暗示对细胞增殖的作用是对癌细胞特异性的。
[0313] 实例5–在体内在小鼠肝中通过用白蛋白saRNA转染的白蛋白上调
[0314] 十只雄性C57Bl6/J、8周龄小鼠用于该实验（对照组N=5）。从机构和地区的监管机构(Institutional and Regional Regulatory bodies)获得批准，并且所有程序均遵照标准国家法规。
[0315] 白蛋白saRNA寡核苷酸如实例1中所述开发。选择如表2中所示的小鼠白蛋白PR2（SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40）用于该研究。用100μL无RNA酶/DNA酶H2O重构寡核苷酸；将50μL复合物A和50μL复合物B(InvivoFectamine,Invitrogen,CA,USA)混合，在50℃下温育30分钟，并且用于尾静脉注射。对照动物用等体积的PBS注射，而阳性对照动物接受针对因子7的siRNA；注射总共5只对照和5只实验动物。
[0316] 在施用后，分离总RNA。将冷冻组织切片置于含有三唑的闪烁瓶中，并且匀浆化30秒。随后将匀浆物转移到Falcon管中用于进一步的2分钟匀浆化。随后将氯仿加入其中并通过涡旋混合，随后为在4℃下以12,000rpm共15分钟的离心步骤。随后将上层水相转移到新鲜微量离心管内，其中使用5mg/ml线性丙烯酰胺(Ambion)和异丙醇在-20℃下将RNA沉淀过夜。通过在4℃下以12,000rpm离心15分钟使RNA形成团块，并且用冰冷的70%乙醇洗涤。RNA再次在4℃下以7,500rpm共5分钟形成团块。立即去除上清液并且允许RNA团块风干。将RNA溶解于无核酸酶水中，用于使用Bionanalyser立即分析RNA完整性。
[0317] 如实例2中所述使用qRT-PCR分析分离的RNA。如实例2中所述使用白蛋白ELISA测定白蛋白产生。
[0318] 图13A显示使用树枝状聚合物递送媒介物给小鼠施用白蛋白saRNA寡核苷酸导致在血液循环内的白蛋白中的显著增加。
[0319] 根据肝功能标记γ谷氨酰转肽酶（图13B）、丙氨酸氨基转移酶（图13C）和天冬氨酸氨基转移酶（图13D）或胆红素（数据未显示），白蛋白saRNA的施用对总体肝功能无有害作用。此外，白蛋白saRNA能够下调编码甲胎蛋白（图16A）和肝细胞生长因子（图16B）的基因的mRNA表达。因为这两种蛋白质均联系至肝细胞增殖，所以通过saRNA下调这些基因暗示它们能够在体内抑制增殖。
[0320] 小鼠肝的免疫组织化学显示肝腺泡的体系结构得到保存，不存在显著的肝门炎症或纤维化，胆管、中央小静脉和窦是不显著的，不存在卵圆细胞增殖的病灶，不存在肝坏死性炎症活性的独特病灶，不存在枯否细胞的激活，至少是无法通过形态学检测的，不存在脉管或内皮改变，不存在可逆细胞损伤的体征，即气胀或皮脂腺病，并且不存在暗示增加的肝细胞增殖的发现，即有丝分裂、板增厚、核拥挤。总之，肝的形态学通过白蛋白saRNA寡核苷酸的施用大部分保持未改变的。
[0321] 实例6–在具有硬化肝的大鼠中通过用CEBPA saRNA转染的血清白蛋白上调
[0322] 对患病动物即具有硬化肝的大鼠评价CEBPA saRNA构建体增加白蛋白的能力。
[0323] 为了评价AW1（SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14）和AW2（SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16）对白蛋白产生的体内作用，用AW1和AW2构建体施用具有硬化肝的大鼠，并且使用如实例2中所述的白蛋白ELISA。
[0324] AW1构建体的施用导致血清白蛋白中的显著增加(p=0.0288)（图14）。将AW1和AW2数据合并在一起显示白蛋白产生中的增加甚至更显著(p=0.0172)（图15，其中合并的AW1和AW2标记为“CEBPA”）。这显示在患病动物体内可见CEBPA saRNA构建体对白蛋白产生的作用。
[0325] 实例7–在大鼠肿瘤模型中通过用CEBPA saRNA转染的肿瘤发展和生长的抑制[0326] 将20只大鼠用四氯化碳(CCl4)处理，以诱导肝硬变。将大鼠用0.2mL/100g体重的CCl4以40mL/L的浓度每周处理两次，共4周。
[0327] 随后将它们随机分成两组。对照组在尾静脉中用盐水注射。在第1、3和5天时，实验组用saRNA的三次注射进行注射，所述saRNA通过上调CEBPA来上调白蛋白：AW1（SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14）或AW2（SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16）。所有动物均在saRNA注射后两周处死。
[0329] 实例8在动物肿瘤模型中通过用白蛋白上调saRNA转染的肿瘤发展和生长的抑制[0330] 用已经化学诱导为具有肝癌的小鼠重复实例6或7中所述的实验。肝癌使用遗传毒性致癌物DEN进行诱导。DEN一般通过单次腹膜内注射（5μg/g体重）施用于在12-15日龄之间的小鼠。使用这个方案，平均起来，100%的B6C3F1雄性小鼠在DEN腹膜内注射后44周发展HCC。随后施用表1中所示的saRNA，并且如实例6中所述测定白蛋白表达。
[0331] 用数字测径器测量肿瘤直径，并且通过下式计算以mm3表示的肿瘤体积：体积=（宽2
度）x长度/2。通过与对照小鼠相比较测定处理过的小鼠的肿瘤体积来分析肿瘤发展和生长。
度）x长度/2。通过与对照小鼠相比较测定处理过的小鼠的肿瘤体积来分析肿瘤发展和生长。
[0332] 实例9–在具有人肿瘤异种移植物的小鼠中通过用白蛋白上调saRNA转染的癌细胞增殖抑制
[0333] 人肝肿瘤细胞在体外培养，洗涤且皮下注射（3.0x106细胞）到裸鼠（4-6周龄）的3
下胁腹内。当肿瘤已达到～50–60mm 的平均体积时，在1-3周后开始使用表1中所示的
3
saRNA的疗法。用数字测径器测量肿瘤直径，并且通过下式计算以mm 表示的肿瘤体积：体
2
积=（宽度）x长度/2。
下胁腹内。当肿瘤已达到～50–60mm 的平均体积时，在1-3周后开始使用表1中所示的
3
saRNA的疗法。用数字测径器测量肿瘤直径，并且通过下式计算以mm 表示的肿瘤体积：体
2
积=（宽度）x长度/2。
[0334] 如实例6中所述执行saRNA施用和白蛋白表达测定。通过与对照小鼠相比较测定处理过的小鼠的肿瘤体积来分析肿瘤发展和生长。
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