一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用
专利汇可以提供一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及干细胞领域。本发明初步建立一种脐带、胎盘干细胞分离培养培养体系及应用。所述方法包括：（1）新生 胎儿 脐带、胎盘的处理与运输；（2）脐带、胎盘冲洗、切割、消化处理；（3）原代细胞及组织快细致处理；（4）全新添加物、传代换液处理。本发明可以在节约成本的 基础 上更高效率分离培养脐带、胎盘间充质干细胞。，下面是一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用专利的具体信息内容。
1.本发明建立一种高效分离培养脐带、胎盘干细胞的方法：A.取材安全；B.冷链运输，全程监控，安全运输；C.进一步处理组织，挑选好的部位；D.组织消化液分散细胞；E.筛网过滤细胞，密度梯度离心进一步提纯细胞，保留组织块；F.用添加胎盘组织液的MSC培养基，37℃，5% CO2培养箱培养；G.传代或冻存细胞；H.质量安全、生物学效力检测，保障培养安全、细胞纯度及增殖分化能力。
2.根据权利要求1的方法，其步骤A，所用脐带、胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘；产妇必须经过健康体检，无遗传病、感染性疾病或携带者，以及其他疾病，严格无菌操作；脐带、胎盘必须新鲜（0-2小时内）。
3.根据权利要求1的方法，其步骤B,将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，清洗液可以是含有青链霉素和咪康唑的生理盐水；脐带、胎盘全程冷链运输，全程监控，安全运输指将胎盘放入脐带、胎盘保存液中，低温冷链全程监控快速运输到实验室，即到即处理（0-72小时），提高安全等级，做到安全效率。
4.根据权利要求1的方法，其步骤C，用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗脐带、胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，最后一次用纯净的PBS冲洗，选取质量较好部分，剥离组织块，这样保证我们培养的细胞更加安全、活力高。
5.根据权利要求1的方法，其步骤D,将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在新的PBS溶液中，不含抗生素和胎牛血清，避免造成残留，组织消化液37℃摇床，b.室温静置；c.2-8℃静置冷消化，多元化消化处理，样本再多，一样可以保证效率。
6.根据权利要求5的方法，组织消化液指以下一种或几种成分：胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA，比单一酶消化效率高。
7.根据权利要求6的方法，各种酶的浓度可以是：胰蛋白酶0.05-0.25%，胶原酶Ⅱ0.05-
0.3%，胶原酶Ⅳ0.05-0.3%，分散酶0.1-2.4u/ml，EDTA0.005-0.1%。
8.根据权利要求1的方法，其步骤E，消化液经筛网过滤，PBS冲洗，去除杂细胞，挑选单细胞，进一步提纯可以用羟乙基淀粉离心法也可以用Ficoll离心法；未完全消化的组织块不研磨，用PBS重悬，一起离心，避免研磨对细胞造成更大的损伤。
9. 根据权利要求1的方法，其步骤F，用添加胎盘组织液的无血清培养基；胎盘组织液含有多种因子，正是胎盘细胞原始的生长环境，将细胞和组织块分瓶，37℃，5% CO2培养箱培养，缩短培养时间。
10.根据权利要求9的方法，待细胞瓶组形成克隆后，胰酶消化，以一定密度重铺或作传代处理，组织块瓶组克隆消化处理，剩余组织块半量换液重贴，既不浪费培养基也利于细胞增殖。
11.根据权利要求1的方法，其步骤G，克隆增多，选择传代或冻存处理，每一次操作完成都对样本进行安全监测。
12.根据权利要求1的方法，其步骤H，对细胞进行生物安全、生物学效力及表型检测，并做数据归档，从源头到结束全部保证安全、有条理。
一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用
技术领域
背景技术
发明内容
3.脐带、胎盘组织进入实验室必须遵守严格制度，登记相应表格，交由专业人员快速用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，选取质量较好部分，用经过121℃，103.4kPa灭菌的手术器械，剥离组织块；
4.将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在PBS溶液中，组织消化液37℃，摇床处理
10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h；
5.根据方法4，组织消化液包含胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶中的一种或多种酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的EDTA、 0.1-1%胶原酶Ⅱ、Ⅳ、0.1mg/mL分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相对单一酶消化效率显著提高；
6.根据方法4，37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h，方法多元，更加适合大量样本处理；
7.消化结束后，经200目筛网过滤，细胞滤液1200-1600rpm离心10分钟，再用PBS冲洗一次，然后经羟乙基淀粉或Ficoll分离液2000rpm无升降离心20min，纯化所需单细胞，滤网内的组织块经消化后比较松散，研磨会造成细胞损伤，所以采用PBS冲洗一次，1000rpm离心
10min；
8.将细胞和组织块分别接种到T75细胞培养瓶，细胞密度在0.5-1*106/ml,每瓶10ml MSC培养基，37℃，5%CO2，培养3-4天后，如果出现大克隆，胰酶消化，添加新鲜培养基及20-
50%经过2000rpm离心原液重贴，掉落的组织块重新再贴，采用这样的换液方法对细胞环境影响较小，对数期会延长；
9.根据方法8，在MSC培养基中添加胎盘组织液、EGF因子、胰岛素等因子，更好的模拟胎盘环境，让细胞快速增殖；
10.8-10天左右，细胞融合会达到90%, 0.01%胰酶消化传代，每T75瓶接种1*106/ml,每瓶10ml,2-3天融合率会达到90%，传代不超过7代；
11.细胞冻存1*106/支，每支1ml，冻存液采用10%DMSO、10%人白、30%羟乙基淀粉、50%MSC培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取；
12.根据方法10、11，每一次的传代和冻存都做留样处理，并做安全监测；
细胞培养前后、冻存、复苏；细胞数目、活率及表型检测；安全性检测包括以下一项或多项：细菌、真菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、人白残留、抗生素残留等；生物学效力包括其免疫抑制力检测，客户资料、培养时间、各项数据统一归档
附图说明：
图1是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞光镜观察图（200×）。
具体实施方式
胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶，胎盘组织液、EGF因子，胰岛素，羟乙基淀粉，DMSO购自sigma公司。无血清的MSC培养基为公司自制。保护液配制：为公司自制消化液配制：胰蛋白酶浓度：0.25%，胶原酶Ⅱ：0.5mg/ml, 胶原酶Ⅳ：1mg/ml分散酶浓度：0.1mg/ml。
10ml PBS重悬。进一步提纯采用羟乙基淀粉离心法，6%的羟乙基淀粉溶液与重悬细胞按1:5混合，2000rpm，10℃，20min离心，离心完毕后吸取上层到新的离心管中。按1：3比例加入PBS, 1200 rpm 5min，离心清洗两次，弃上清，用含有胎盘组织液的MSC培养基重悬，接种于T75细胞培养瓶内。过滤时剩余的组织块也接种到T75细胞培养瓶中。培养瓶放置在5% CO2，
37℃的培养箱内进行培养。
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