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用于治疗少肌症和肌肉损伤的方法

阅读：125发布：2023-01-13

专利汇可以提供用于治疗少肌症和肌肉损伤的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体，该WISP1或其片段或变体用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。，下面是用于治疗少肌症和肌肉损伤的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体，所述WISP1或其片段或变体用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。
2.根据权利要求1使用的所述WISP1或其片段或变体，其中所述WISP1或其片段或变体维持或增加肌肉质量。
3.Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体，所述WISP1或其片段或变体用于治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。
4.根据任一前述权利要求使用的所述WISP1或其片段或变体，其中所述个体是老年个体。
5.根据任一前述权利要求使用的所述WISP1或其片段或变体，其中所述个体通过外科手术干预和/或创伤和/或作为化学暴露于药物或毒素的副作用而发生肌肉损伤。
6.根据权利要求1至4中任一项使用的所述WISP1或其片段或变体，其中所述个体将经历计划的外科手术干预。
7.根据任一前述权利要求使用的所述WISP1片段或变体，其中所述WISP1片段或变体：
(a)缺少VWC、TSP1和CT结构域；
(b)缺少IGFB和VWC结构域；或
(c)由CT结构域组成。
8.根据任一前述权利要求使用的所述WISP1或其片段或变体，其中所述WISP1或其片段或变体包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或9、优选地SEQ ID NO：1、5、7或9、更优选地SEQ ID NO：1具有至少60％同一性的氨基酸序列。
9.Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体用于增加肌肉干细胞和/或祖细胞增殖的用途。
10.一种维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损的方法，所述方法包括将Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于对其有需要的个体。
11.一种治疗或预防少肌症、虚弱和/或肌肉损伤的方法，所述方法包括将Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于对其有需要的个体。
12.一种筛选能够增加个体的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)水平的药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使细胞群与候选药剂接触；
(b)测定所述细胞群中的所述WISP1的水平；以及
(c)将在步骤(b)中测得的所述WISP1的水平与未与所述候选药剂接触的对照细胞群中的WISP1水平进行比较。
13.一种用于增加个体的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)水平的药剂，优选地其中所述药剂已通过根据权利要求12所述的方法鉴定，和/或优选地其中所述药剂为营养补充剂。
14.根据权利要求13所述的药剂，所述药剂用于
(a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；
(b)基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或
(c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。
15.一种诊断少肌症或虚弱的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供从个体分离的生物样品；
(b)测定所述生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；
以及
(c)将在步骤(b)中测得的所述WISP1的水平与由一种或多种对照样品测得的WISP1水平或参考水平进行比较。

说明书全文

用于治疗少肌症和肌肉损伤的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)用于例如在老年个体和/或患有肌肉损伤的个体中改善肌肉再生以利于维护或增加肌肉功能和/或肌肉质量的用途。具体而言，本发明涉及WISP1用于治疗少肌症或身体虚弱和/或治疗肌肉损伤的用途。

背景技术

[0002] 与年龄相关的肌肉功能和肌肉质量损失在所有个体中都不可避免地发生，但是其进展取决于一系列遗传因素和环境因素，诸如体力活动和营养摄入。

[0003] 在一些个体中，衰老对肌肉的影响可能进展到发病状态，其具体病症包括少肌症和虚弱。少肌症被定义为发生在与年龄相关的肌肉功能和肌肉质量损失使个体变得虚弱并影响生活质量的时刻(Sayer，A.A.等人(2013)Age Ageing 42：145-150)。相比之下，虚弱是与年龄相关的肌肉功能障碍的一种分类，其依赖于肌肉强度和功能而不是肌肉质量(Morley，J.E.等人(2013)J.Am.Med.Dir.Assoc.14：392-397)。

[0004] 少肌症和虚弱是多因素综合征，其与病理生理变化相关联，诸如神经肌肉转变受损、兴奋/收缩耦联改变、与干细胞衰竭相关的再生能力受损、肌纤维中线粒体和能量代谢的缺陷，以及脂肪沉积和纤维化造成的骨骼肌大理石纹(Ali，S.等人(2014)Gerontology 60：294-305)。因此，这些综合征的病因学较为复杂并且人们对其了解不多，但身体活动少、促合成激素(雄激素，IGF-1)的激素下降和营养不良/营养不足起到重要的作用(Mithal，A.等人(2013)Osteoporos.Int.24：1555-1566)。

[0005] 少肌症正成为发达国家的主要健康问题，在这些国家中，人们的体力活动随着年龄的增长和寿命的延长而减少的现象尤为普遍。在严重情况下，少肌症可能导致一个人失去独立生活的能力。此外，少肌症是以人群为基础的研究中更广泛的残疾预测指标，并且其与平衡能力较差、步行速度、跌倒和骨折的发生率有关。

[0006] 减少体力活动被认为会增加患上少肌症的可能性，因此加强锻炼将有利于抵御这种病症。实际上，抗阻运动与骨骼肌中蛋白质合成的增加有关。然而，作为治疗的锻炼通常会因患者遵从性差而受到影响。

[0007] 目前没有已批准用于治疗少肌症的药物制剂。在此背景下，已经研究了许多生长激素，但是这些生长激素几乎没有效果。此外，合成代谢类固醇可以增加肌肉质量和强度，但有许多副作用，诸如增加前列腺癌的风险。

[0008] 类似地，对肌肉功能和肌肉质量的负面影响也可能由肌肉损伤引起，例如在创伤或医学干预(例如，外科手术)之后。在损伤后可能会经历更困难和/或更长时间的康复的老年个体中，此类事件的影响可能更为严重。

[0009] 尽管物理疗法可能有助于肌肉损伤后的康复，但这也可能导致患者的遵从性差。此外，可能需要其它方法来补充物理疗法以增加其易用性和有效性。

[0010] 因此，仍然非常需要例如在老年个体中改善肌肉再生以利于维持或增加肌肉功能和/或肌肉质量的方法。具体而言，需要治疗少肌症和虚弱的方法和/或治疗肌肉损伤的方法。

发明内容

[0011] 本发明人发现，Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)是在肌肉再生期间大量表达的蛋白质。此外，本发明人还发现，WISP1水平在个体中随着年龄的增长而降低。

[0012] 本发明人证明，WISP1在肌肉损伤时由若干种肌肉驻留细胞类型表达，但主要由纤维/脂肪形成祖细胞(FAP)表达，这种细胞的WISP-1表达也随着年龄增长而显著降低。此外，本发明人的研究结果还表明，WISP1在整个肌肉功能随年龄增长而退化中的作用，因为这些结果证明WISP1水平在老化的非损伤肌肉和少肌症大鼠血清中大幅下调。

[0013] 通过应用WISP1，本发明人能够离体改善旧卫星细胞(肌肉干细胞)的有缺陷的粘附和增殖特性，以及增强年轻卫星细胞功能。在体内，再生期间对老年个体的WISP1处理在损伤后几天转化为祖细胞标志物的激活增加和再生纤维的更快恢复。因此，虽然不希望受理论束缚，但WISP1似乎通过促进肌肉干细胞功能来增加肌肉再生。

[0014] 总之，本发明人出乎意料地发现，增加的WISP1水平在临床上适用于治疗肌肉功能和肌肉质量的减少，尤其是在老年个体中。

[0015] 因此，在一个方面，本发明提供了Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体，以用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。在一个方面，所述用途是非治疗性的。

[0016] 在另一方面，本发明提供一种维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损的方法，该方法包括将Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于对其有需要的个体。

[0017] 在一个实施方案中，WISP1或其片段或变体维持或增加肌肉质量。

[0018] 在另一个实施方案中，WISP1或其片段或变体基本上预防或减少肌肉质量的减少。肌肉质量的预防或减少可以与在不存在本发明的WISP1或其片段或变体时预期的肌肉质量的减少进行比较。

[0019] 在另一方面，本发明提供Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体，用于治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。

[0020] 在另一方面，本发明提供一种治疗或预防少肌症、虚弱和/或肌肉损伤的方法，该方法包括将Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于对其有需要的个体。

[0021] 在一个实施方案中，肌肉是骨骼肌。

[0022] 在一个实施方案中，个体是老年个体。

[0023] 老年个体可以例如是30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁年龄段的人类个体。

[0024] 在一个实施方案中，个体通过外科手术干预和/或创伤而发生肌肉损伤。

[0025] 在另一个实施方案中，个体将经历计划的外科手术干预。

[0026] 在一个实施方案中，WISP1片段或变体：

[0027] (a)缺少VWC、TSP1和CT结构域；

[0028] (b)缺少IGFB和VWC结构域；或

[0029] (c)由CT结构域组成。

[0030] 在一个实施方案中，WISP1片段或变体缺少VWC、TSP1和CT结构域。在另一个实施方案中，WISP1片段或变体缺少IGFB和VWC结构域。在另一个实施方案中，WISP1片段或变体由CT结构域组成。

[0031] 在一个实施方案中，WISP1或其片段或变体包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或9、优选地SEQ ID NO：1、5、7或9、更优选地SEQ ID NO：1具有至少60％同一性的氨基酸序列。

[0032] 优选地，WISP1或其片段或变体用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。优选地，WISP1或其片段或变体基本上保留了由SEQ ID NO：1表示的蛋白质的天然功能。

[0033] 在另一个实施方案中，WISP1或其片段或变体包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或9、优选地SEQ ID NO：1、5、7或9、更优选地SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，WISP1或其片段或变体用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。优选地，WISP1或其片段或变体基本上保留了由SEQ ID NO：1表示的蛋白质的天然功能。

[0034] 优选地，WISP1或其片段或变体提供了与SEQ ID NO：1的蛋白质相比类似的或增强的以下效果：

[0035] (a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；

[0036] (b)预防或减少个体的肌肉耗损；和/或

[0037] (c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。

[0038] 本文所公开的WISP1或其片段或变体可以例如全身或局部施用。在一个实施方案中，WISP1或其片段或变体例如经由皮下注射、静脉内注射或肌内注射以胃肠外方式施用。

[0039] 在一个实施方案中，WISP1或其片段或变体使用包含编码WISP1或其片段或变体的多核苷酸序列的载体(例如，病毒载体，诸如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或与腺病毒相关的病毒载体)施用。

[0040] 在另一方面，本发明提供了本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体用于制备药物的用途，该药物用于：

[0041] (a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；

[0042] (b)基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或

[0043] (c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。

[0044] 在另一方面，本发明提供了本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体在以下方面的用途：

[0045] (a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；

[0046] (b)基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或

[0047] (c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。

[0048] 在一个实施方案中，本文所公开的药物或WISP1维持或增加肌肉质量。

[0049] 在另一个实施方案中，本文所公开的药物或WISP1基本上预防或减少肌肉质量的减少。

[0050] 在另一方面，本发明提供了本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体用于增加肌肉干细胞和/或祖细胞增殖(例如，卫星(SAT)和/或纤维/脂肪形成祖细胞(FAP)增殖)的用途。肌肉干细胞和/或祖细胞的增殖可为在存在本文所公开的WISP1或其片段或变体时比其不存在时高例如至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％或100％。这种细胞增殖可使用本领域已知的任何合适的方法来测量。

[0051] 所述用途可为例如体外或离体用途，优选体外用途。

[0052] WISP1或其片段或变体可用于离体细胞治疗方案中。在一个方面，本发明提供了细胞群，该细胞群用于：

[0053] (a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；

[0054] (b)基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或

[0055] (c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤，

[0056] 其中在本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体的存在下，离体培养细胞群。该细胞群可以是例如肌肉细胞的群体，尤其是肌肉干细胞和/或祖细胞(例如，卫星(SAT)和/或纤维/脂肪形成祖细胞(FAP))的群体。该细胞群可以在WISP1的存在下施用于个体。

[0057] 在另一方面，本发明提供一种筛选能够增加个体的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)水平的药剂的方法，该方法包括以下步骤：

[0058] (a)使细胞群与候选药剂接触；

[0059] (b)测定细胞群中的WISP1的水平；以及

[0060] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1的水平与未与候选药剂接触的对照细胞群中的WISP1水平进行比较。

[0061] 在另一方面，本发明提供一种筛选药剂的方法，该药剂能够维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤，该方法包括以下步骤：

[0062] (a)使细胞群与候选药剂接触；

[0063] (b)测定细胞群中的WISP1水平；以及

[0064] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与未与候选药剂接触的对照细胞群中的WISP1水平进行比较。

[0065] 候选药剂可为例如药物制剂或营养补充剂。优选地，候选药剂为营养补充剂。

[0066] 在一个实施方案中，候选药剂被包含在候选药剂库中。

[0067] 在另一方面，本发明提供了用于增加个体的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)水平的药剂，优选地其中该药剂已通过本文所公开的筛选方法鉴定。

[0068] 优选地，该药剂为营养补充剂。

[0069] 在另一方面，本发明提供了本发明的药剂，该药剂用于：

[0070] (a)维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量；

[0071] (b)基本上预防或减少个体的肌肉耗损；和/或

[0072] (c)治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤。

[0073] 在另一方面，本发明提供一种诊断少肌症或虚弱的方法，该方法包括以下步骤：

[0074] (a)提供从个体分离的生物样品；

[0075] (b)测定生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；以及

[0076] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与由一种或多种对照样品测得的WISP1水平或参考水平进行比较。

[0077] 在另一方面，本发明提供一种维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损的方法，该方法包括将本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于使用本文所公开的方法被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险或者被诊断为衰弱或有变得衰弱的风险的个体。

[0078] 在另一方面，本发明提供一种治疗或预防少肌症、虚弱和/或肌肉损伤的方法，该方法包括将本文所公开的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体施用于使用本文所公开的方法被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险或者被诊断为衰弱或有变得衰弱的风险的个体。

[0079] 在另一方面，本发明提供一种包含WISP1或其片段或变体的膳食产品，该膳食产品用于维持或增加个体的肌肉功能和/或肌肉质量和/或基本上预防或减少个体的肌肉耗损。

[0080] 在另一方面，本发明提供一种用于治疗或预防个体的少肌症、虚弱和/或肌肉损伤的本文所述膳食产品。

[0081] 优选地，本发明的膳食产品用于使用本文所公开的方法被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险或者被诊断为衰弱或有变得衰弱的风险的个体。

[0082] 在另一方面，本发明提供一种内源性WISP-1的调节剂，其优选地单独施用或与本文所公开的WISP1或其片段或变体一起施用，例如全身或局部施用。

[0083] 在一个实施方案中，内源性WISP-1的调节剂与WISP1或片段或变体一起例如经由皮下注射、静脉内注射或肌内注射以胃肠外方式施用。

[0084] 在另一方面，本发明的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)或其片段或变体、药剂或膳食产品可以与锻炼方案结合使用。附图说明

[0085] 图1

[0086] WISP1随年龄增长以不同方式表达

[0087] (a)通过qPCR评估新鲜分离的细胞中的WISP1表达。卫星细胞(SAT；CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1-/CD34+/整合素α7+)；纤维/脂肪形成祖细胞(FAP；CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1+/CD34+/PDGFRα+)；谱系细胞(Lin+；CD31+/CD11b+/CD45+)；以及PDGFRα-细胞(CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1+/CD34+/PDGFRα-)是从年轻(Y)和年老(O)小鼠的未损伤肌肉(静止细胞；Q)或肌肉损伤后3天(活化细胞；A)分离而来。数据归一化为YQ SAT；*：对比年轻静止相应细胞类型的p值＜0.05；**：对比年轻静止相应细胞类型的p值＜0.01；***：对比年轻静止相应细胞类型的p值＜0.001；###：年老与年轻活化相应细胞类型的p值＜0.001，n＞4。

[0088] (b)左图-通过qPCR评估的完全再生肌肉中的WISP1表达。年轻和年老肌肉受到损伤，并在损伤后3、7和14天(dpi)收集肌肉用于生物分子分析。数据归一化为年轻未损伤肌肉(对照)；*：对比年轻对照的p值＜0.05；**：对比年轻对照的p值＜0.01；***：对比年轻对照的p值＜0.001；###：相应时间点处年老与年轻的p值＜0.001，n＝8。右图-突出显示未损伤肌肉中的表达值，##：年老与年轻的p值＜0.01，n＝8。

[0089] (c)通过SOMALOGICS测量的再生肌肉中的WISP1蛋白水平。年轻和年老肌肉受到损伤，并在损伤后3、7和14天(dpi)收集肌肉用于生物分子分析；*：对比年轻对照的p值＜0.05；**：对比年轻对照的p值＜0.01；***：对比年轻对照的p值＜0.001；##：相应时间点处年老与年轻的p值＜0.01，n＝8。

[0090] (d)通过SOMALOGICS测量的大鼠血清中的WISP1蛋白水平。**：对比8月龄大鼠的p值＜0.01，***：对比8月龄大鼠的p值＜0.001，n＞9。

[0091] 图2

[0092] WISP1调节肌肉干细胞功能

[0093] (a)mrWISP1处理后的卫星细胞离体粘附。将新鲜分离的年轻(上图)和年老(下图)卫星细胞接种在含有PBS、1μg/mL mrWISP1或8μg/mL mrWISP1的培养基的0.2％胶原蛋白包被平板上，固定并在接种后36小时计数，以评估粘附力。

[0094] (b，c)mrWISP1处理后的卫星细胞离体增殖。将新鲜分离的年轻(上图)和年老(下图)卫星细胞接种在含有PBS、1μg/mL mrWISP1或8μg/mL mrWISP1的培养基的0.2％胶原蛋白包被平板上；或使其在3天内增殖。将接受了10μM EdU脉冲3小时的增殖细胞固定，并基于细胞总数(b)或EdU+细胞百分比(c)评估增殖。将数据归一化为未经处理的细胞，*：对比PBS的p值＜0.05，**：对比PBS的p值＜0.01，***：对比PBS的p值＜0.001，n＞16个技术重复样。

[0095] (d)mrWISP1处理后的体外HSMM增殖。使HSMM在3天内增殖并且接受10μm EdU脉冲3小时，固定并对EdU染色。将数据归一化为未经处理的细胞，*：对比PBS的p值＜0.05，**：对比PBS的p值＜0.01，***：对比PBS的p值＜0.001，n＞16个技术重复样。

[0096] (e)mrWISP1处理后的年轻卫星细胞分化。使SAT在生长培养基中增殖，并诱导以在含有WISP1的分化培养基中分化2天。将数据归一化为未经处理的细胞，n.s：对比PBS的p值＞0.05，**：n＞16个技术重复样，n＝使用独立生物重复样的3个独立实验。

[0097] 图3

[0098] WISP1体内处理在生物分子水平上改善年老小鼠的肌肉再生

[0099] 完全再生肌肉中不同肌原性标志物(Pax7、MyoD、肌细胞生成素和Myh3)的qPCR。年老(O)肌肉受到损伤，并在损伤后3、7和14天(dpi)收集肌肉用于生物分子分析。每天用PBS或1mg/kg/天的mrWISP1处理小鼠。将数据归一化为对侧未损伤胫骨前肌(TA cl)中的基因表达；*：对比TA cl的p值＜0.05；**：对比TA cl的p值＜0.01；***：对比TA cl的p值＜0.001；#：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.05；##：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜
0.01；###：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.001，n＞6。

[0100] 图4

[0101] WISP1体内处理增强了与FAP相关联的标志物的表达，完全再生肌肉中FAP活性标志物(PDGFRa、纤连蛋白(FN)和WISP1)的qPCR。年老(O)肌肉受到损伤，并在损伤后3、7和14天(dpi)收集肌肉用于生物分子分析。每天用PBS或1mg/kg/天的mrWISP1处理小鼠。将数据归一化为对侧未损伤胫骨前肌(TA cl)中的基因表达；*：对比TA cl的p值＜0.05；**：对比TA cl的p值＜0.01；***：对比TA cl的p值＜0.001；#：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.05；##：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.01；###：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.001，n＞6。

[0102] 图5

[0103] WISP1体内处理在组织学水平上挽救肌肉再生

[0104] 用胚胎肌球蛋白重链(eMHC)(新形成的纤维的标志物)对肌肉切片染色，并量化eMHC+纤维所覆盖的区域。年轻(Y)和年老(O)肌肉受到损伤，并在损伤后7天和14天(dpi)收集肌肉用于组织学分析。每天用PBS或1mg/kg/天的mrWISP1处理小鼠。#：WISP1对比PBS处理小鼠的p值＜0.05。

具体实施方式

[0105] 现将通过非限制性示例来描述本发明的各优选特征和实施方案。

[0106] 除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围之内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等人(1995and periodic supplements)Current Protocols in Molecular Biology，Ch.9，13 and 16，John Wiley&Sons；Roe，B.、Crabtree、J.和Kahn，A.，1996年，“DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques”，John Wiley&Sons；Polak，J.M.和McGee，J.O’D.，1990年，“In Situ Hybridization：Principles and Practice”，Oxford University Press；Gait，M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；以及Lilley，D.M.和Dahlberg，J.E.，(1992)Methods in Enzymology：DNA Structures Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA，Academic Press。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。

[0107] Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)

[0108] Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)是分泌的细胞外基质相关蛋白，也称为结缔组织生长因子(CTGF)。

[0109] WISP1是6个CCN家族基质细胞蛋白中的第4个成员。CCN蛋白包含4个保守的功能结构域，这些功能结构域被认为独立地和协同地起作用以促进一系列细胞功能(Hall-Glenn，F.等人(2011)Cell.Mol.Life Sci.68：3209-3217)。这四个功能结构域允许CCN蛋白与许多信号分子和细胞外基质蛋白结合，从而潜在地诱导多种细胞信号通路。

[0110] WISP1已被证实能够调节各种生物过程，诸如神经元发育、神经形成、干细胞、存活和血管生成(Maiese，K.(2014)Curr.Neurovasc.Res.11：378-389)。WISP1的致癌作用在乳腺癌中得到证实(Chiang，K.C.等人(2015)Sci.Rep.5：8686；Klinke，D.J.(2014)PLoS Comput.Biol.10；e1003409)，并且WISP1功能与肿瘤细胞生长和进展相关联(Maiese，K.(2014)Curr.Neurovasc.Res.11：378-389；Nagai，Y.等人(2011)Anticancer Res.31：991-997)。然而，WISP1与致癌作用之间的直接关联仍有待阐明。WISP1也被证明在其它情况下起到肿瘤抑制作用(Hashimoto，Y.等人(1998)J.Exp.Med.187：289-296)。WISP1被证明能够在体外和体内在大鼠成纤维细胞中发挥促有丝分裂作用(Xu，L.等人(2000)Genes Dev.14：
585-595)，并且进一步证实由成纤维细胞分泌的WISP1可通过旁分泌信号起作用(Tanaka，S.等人(2001)Oncogene.20：5525-5532)。CCN蛋白也已在组织修复环境中进行了研究。实际上，WISP1表达已被证明能够在心肌缺血(Colston，J.T.等人(2007)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.293：H1839-1846)、肺上皮损伤(Heise，R.L.等人(2011)J.Biol.Chem.286：
17435-17444)、骨折(French，D.M.等人(2004)Am.J.Pathol.165：855-867；Macsai，C.E.等人(2012)Bone 50：1081-1091)之后以及神经元组织氧化应激(Wang，S.等人(2012)Curr.Neurovasc.Res.9：91-101；Wang，S.等人(2012)Curr.Neurovasc.Res.9：20-31)时升高。最近，WISP1被证明在代谢和脂肪组织生物学中具有新的作用。事实上，据发现，WISP1在分化期间由脂肪细胞分泌，并与脂肪组织中胰岛素抗性的标志物相关(Murahovschi，V.等人(2015)Diabetes 64：856-866)。小鼠和人的体重减轻与脂肪库和血液中的WISP1水平降低相关，并且表明WISP1可能会维持脂肪组织内的炎症状态。

[0111] 然而，之前尚未证实WISP1在骨骼肌和肌肉干细胞中的作用。

[0112] 在一个实施方案中，WISP1或其片段或变体是人WISP1或其片段或变体。

[0113] WISP1的示例性氨基酸序列为：

[0114]

[0115]

[0116] 编码WISP1的示例性多核苷酸序列为：

[0117]

[0118]

[0119]

[0120] WISP1的另一个示例性氨基酸序列为：

[0121]

[0122] 编码WISP1的另一个示例性多核苷酸序列为：

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127] WISP1 N端结构域与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFB)具有同源性，但据报道重组人IGF对人CTGF的亲和力非常低(Vorwerk，P.等人(2002)Endocrinology 143：1677-1685)。

[0128] N端结构域之后是富含半胱氨酸(CR)的结构域，也称为Von Willebrand因子C(VWC)重复序列。CCN VWC结构域已被证实能够与骨形成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)相互作用(Abreu，J.G.等人(2002)Nat.Cell Biol.4：599-604)。具体而言，据报道，非洲蟾蜍(Xenopus laevis)CTGF可以通过阻断其与受体的结合来拮抗BMP4活性，同时它可以结合TGF-β1并加强与其受体的结合，从而加强下游信号传导(Abreu，J.G.等人(2002)Nat.Cell Biol.4：599-604)。此外，基质细胞蛋白的CCN1和CCN2成员也被证实能够经由其CR结构域与整合素αvβ3、α6β1以及硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，转化为内皮细胞的促血管生成活性或肝细胞粘附(Chen，N.等人(2004)J.Biol.Chem.279：44166-44176；Leu，S.J.等人(2002)J.Biol.Chem.277：46248-46255；Gao，R.等人(2004)J.Biol.Chem.279：8848-8855；Kawaki，H.等人(2008)J.Bone Miner.Res.23：1751-1764)。在软骨细胞中进一步表明CCN2通过IGFBP和VWC结构域与聚集蛋白聚糖结合可以引发聚集蛋白聚糖释放(Aoyama，E.等人(2009)Biochem.J.420：413-420)。

[0129] 第三功能结构域是1型血小板反应蛋白重复序列(TSP)。据报道，许多靶标与一系列蛋白质中的TSP1结构域结合，诸如整合素α6β1(Leu，S.J.等人(2003)J.Biol.Chem.278：33801-33808)、纤连蛋白(Sipes，J.M.等人(1993)J.Cell Biol.121：469-477)、胶原蛋白V(Takagi，J.等人(1993)J.Biol.Chem.268：15544-15549)、CD36(Asch，A.S.等人(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.182：1208-1217)、TGF-β(Schultz-Cherry，S.等人(1995)J.Biol.Chem.270：7304-7310)和肝素(Guo，N.H.等人(1992)J.Biol.Chem.267：19349-
19355)。然而，与TSP1结构域结合的CCN靶标的特征较少(Holbourn，K.P.等人(2008)Trends Biochem.Sci.33：461-473)。已证实CCN2通过其TSP1结构域与VEGF-A相互作用，并且已表明金属蛋白酶可以与相同的结构域相互作用(Hashimoto，G.等人(2002)J.Biol.Chem.277：
36288-36295；Inoki，I.等人(2002)FASEB J.16：219-221)；但CCN TSP1结构域与建议靶标相互作用的直接证据仍有待建立。

[0130] CCN成员的C端结构域具有半胱氨酸结基序。该CT结构域被证明能够与CCN2中的LRP-6、纤连蛋白、基底膜聚糖和fibulin-1相互作用(Mercurio，S.等人(2004)Development 131：2137-2147；Nishida，T.等人(2003)J.Cell Physiol.196：265-275；Perbal，B.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：869-874)。

[0131] 除了全长WISP1之外，多个WISP1剪接变体是已知的。

[0132] 缺少VWC、TSP1和CT结构域的WISP1剪接变体的示例性氨基酸序列为：

[0133]

[0134] 编码缺少VWC、TSP1和CT结构域的WISP1剪接变体的示例性多核苷酸序列为：

[0135]

[0136] 缺少IGFB和VWC结构域的WISP1剪接变体的示例性氨基酸序列为：

[0137]

[0138] 编码缺少IGFB和VWC结构域的WISP1剪接变体的示例性多核苷酸序列为：

[0139]

[0140] 仅由CT结构域构成的WISP1剪接变体的示例性氨基酸序列为：

[0141]

[0142] 编码仅由CT结构域构成的WISP1剪接变体的示例性多核苷酸序列为：

[0143]

[0144] 肌肉功能和肌肉质量

[0145] 本文所公开的化合物、组合物、用途和方法可用于维持或增加肌肉功能和/或肌肉质量。

[0146] 术语“肌肉功能”是指肌肉以对个体的生活不产生负面影响的方式行使功能的能力，并且包括肌肉强度、肌肉收缩、肌肉耐力和/或肌肉弹性的参数。

[0147] 适用于评估肌肉功能的测试包括：使用测力计评估抓握力；腿部按压、胸部按压或腿部伸展时的最多重复次数；步行速度；6分钟步行测试；计时起立行走；简易机体功能评估；Fried衰弱指标；以及爬楼梯时间评估。

[0148] 可通过双能量X线吸收测量法(DXA)或生物阻抗测试来测量肌肉质量(其可等同于肌肉体积、肌肉厚度或肌纤维尺寸)。类似地，可使用MRI来评估肌肉体积，并且可使用超声来评估肌肉厚度和羽状角。

[0149] “肌肉耗损”可以是肌肉质量减少，例如减少到肌肉损失变得使人衰弱的阶段。在一个实施方案中，个体未损失超过其肌肉质量的10％、5％、4％、3％、2％或1％。

[0150] 优选地，本文所公开的化合物、组合物、用途和方法用于维持或增加肌肉质量。

[0151] 术语“维持”是指特定参数，诸如肌肉功能和/或肌肉质量，在一段时间内(例如5年、10年、15年、20年、25年、30年、40年、50年或更多年)基本上保持不变。

[0152] 在一个实施方案中，肌肉质量增加至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％或20％。

[0153] 在另一个实施方案中，肌肉质量增加1％-2.5％、1％-5％、1％-10％或1％-20％。

[0154] 优选地，肌肉是骨骼肌。

[0155] 少肌症和虚弱

[0156] 本发明提供了解决随年龄增长而发生的肌肉功能和肌肉质量损失的方法。与年龄相关的肌肉功能和肌肉质量的损失在所有个体中都不可避免地发生，但是其进展取决于一系列遗传因素和环境因素，诸如体力活动和营养摄入。

[0157] 少肌症的具体情况被定义为发生在与年龄相关的肌肉质量和肌肉功能的损失使个体变得虚弱并影响生活质量的时刻(Sayer，A.A.等人(2013)Age Ageing 42：145-150)。相比之下，虚弱是与年龄相关的肌肉功能障碍的一种分类，其依赖于肌肉强度和功能而不是肌肉质量(Morley，J.E.等人(2013)J.Am.Med.Dir.Assoc.14：392-397)。

[0158] 少肌症和虚弱是多因素综合征，其与病理生理变化相关联，诸如神经肌肉转变受损、兴奋/收缩耦联改变、与干细胞衰竭相关的再生能力受损、肌纤维中线粒体和能量代谢的缺陷，以及脂肪沉积和纤维化造成的骨骼肌大理石纹(Ali，S.等人(2014)Gerontology 60：294-305)。因此，这些综合征的病因学较为复杂并且人们对其了解不多，但身体活动少、促合成激素(例如，雄激素和IGF-1)的激素下降和营养不良/营养不足起到重要的作用(Mithal，A.等人(2013)Osteoporos.Int.24：1555-1566)。

[0159] 肌肉损伤

[0160] 在实验环境中(例如，在小鼠中)，肌肉损伤通常通过肌内注射蛇毒毒素或甘油来诱导。这些肌内注射在肌肉损伤后的前3天内诱导急性肌肉退化。此过程模拟自然肌肉损伤期间发生的情况。

[0161] 急性肌肉退化的特征在于肌纤维的强烈破坏，以及免疫细胞向肌肉的渗透。免疫反应在肌肉再生期间的作用至关重要，必须正确协调。中性粒细胞和促炎性巨噬细胞首先侵入肌肉并参与损伤后肌肉碎片的清除。然后，免疫细胞群转变为维持肌肉再生的抗炎巨噬细胞。因此，免疫细胞顺序分泌的细胞因子在肌肉损伤后的头几天内被精细地协调，并且调节肌肉祖细胞的活性。实际上，一旦肌肉碎片被清除，许多肌肉驻留的祖细胞开始活化和增殖，并且很快将参与特定的谱系提交以再生肌肉。具体而言，肌肉干细胞(卫星细胞，SAT)增殖并最终分化成肌肉纤维。间充质非肌源性祖细胞或纤维/脂肪形成祖细胞(FAP)也同时被激活，以便维持肌生成。在肌肉损伤后7天，大多数祖细胞群已提交，并且免疫反应已得到解决。在损伤后14天，肌肉由新形成的肌纤维组成，并且大部分信号恢复到基础水平。

[0162] 本文所公开的化合物、组合物、用途和方法可用于治疗、预防或减少肌肉损伤的不利影响。虽然不希望受理论束缚，本文所公开的WISP1或其片段或变体似乎会增加肌肉再生(例如，通过促进肌肉干细胞功能)。

[0163] 在一个实施方案中，个体通过外科手术干预和/或创伤而发生肌肉损伤。

[0164] 术语“外科手术干预”是指导致肌肉损伤的任何外科手术方法。因此，本文所公开的化合物、组合物、用途和方法可用于帮助在外科手术之后恢复。

[0165] 如本文所用，术语“创伤”是指导致肌肉损伤的计划外事件，例如事故或运动损伤。

[0166] 在另一个实施方案中，个体将经历计划的外科手术干预。例如，本文所公开的化合物、组合物、用途和方法可应用于预定在少于1个月、或少于3周、2周或1周的时间内接受外科手术的个体。

[0167] 在另一个实施方案中，个体已发生肌肉损伤或横纹肌溶解作为化学暴露于毒素或药物(例如，来自降低胆固醇的药物诸如他汀类药物)的副作用。

[0168] 治疗方法

[0169] 应认识到，本文对治疗的所有提及包括治愈性、姑息性和预防性治疗；但在本发明的上下文中，对预防的提及更常与预防性治疗相关。治疗还可包括抑制疾病严重性的进展。

[0170] 个体

[0171] 优选哺乳动物、特别是人类的治疗。然而，人类和兽类治疗均在本发明的范围之内。

[0172] 对于兽类个体，优选的是马科个体。

[0173] 待治疗的老年个体可以是例如30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁年龄段的人类个体。对于兽类应用而言，动物的年龄应根据人类的情况使用平均寿命进行缩小来校准。

[0174] 筛选方法

[0175] 在一个方面，本发明提供了筛选能够增加个体的Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)水平的药剂的方法。该方法可包括以下步骤：

[0176] (a)使细胞群与候选药剂接触；

[0177] (b)测定细胞群中的WISP1水平；以及

[0178] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与未与候选药剂接触的对照细胞群中的WISP1水平进行比较。

[0179] 优选地，该方法为体外方法。

[0180] 候选药剂可为例如药物制剂或营养补充剂。优选地，候选药剂为营养补充剂。术语“营养补充剂”是指旨在补充个体的一般饮食的产品。

[0181] 在一个实施方案中，候选药剂被包含在候选药剂库中。

[0182] 在一个实施方案中，细胞群是肌肉细胞的群体(例如，C2C12细胞系和/或人原代成肌细胞)。该肌肉细胞群可以是例如肌肉干细胞和/或祖细胞(例如，卫星(SAT)和/或纤维/脂肪形成祖细胞(FAP)细胞)的群体。

[0183] 术语“WISP1水平”是指在样品中存在的WISP1蛋白的量。WISP1蛋白的量可直接或间接测定。测定WISP1的直接方法包括SDS-PAGE、免疫印迹、色谱方法(例如，HPLC或FPLC)、基于质谱的方法(例如，LC/MS)和NMR。测定WISP1的间接方法包括基于检测编码WISP1的多核核酸、尤其是mRNA的方法，诸如qPCR。

[0184] 候选药剂对WISP1水平的影响可作为时间的函数，通过在特定时间过程中进行重复测量来评估。

[0185] 例如，候选药剂可包括Wnt配体或Frizzled激动剂。

[0186] 诊断方法

[0187] 在一个方面，本发明提供了诊断少肌症或虚弱的方法，该方法包括以下步骤：

[0188] (a)提供从个体分离的生物样品；

[0189] (b)测定生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；以及

[0190] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与由一种或多种对照样品测得的WISP1水平或参考水平进行比较。

[0191] 一种或多种对照样品可从患有或未患少肌症或虚弱的个体分离。因此，与这些对照样品进行比较可提供个体患有少肌症或虚弱或向少肌症或虚弱状态恶化的指示。

[0192] 另选地或除此之外，低于预先确定的参考水平的WISP1水平可指示个体患有少肌症或虚弱，而高于预先确定的参考水平的WISP1水平可指示个体未患少肌症或虚弱。

[0193] 术语“WISP1水平”是指在样品中存在的WISP1蛋白的量。WISP1蛋白的量可直接或间接测定。测定WISP1的直接方法包括SDS-PAGE、免疫印迹、色谱方法(例如，HPLC或FPLC)、基于质谱的方法(例如，LC/MS)和NMR。测定WISP1的间接方法包括基于检测编码WISP1的多核核酸、尤其是mRNA的方法，诸如qPCR。

[0194] 生物样品可以是用于从个体体内分离的任何合适的样品，诸如血液样本(诸如血浆或血清)或组织活检(特别是肌肉活检)。

[0195] 在一个实施方案中，该方法可包括将本文所公开的WISP1或其片段或变体施用于个体的另一个步骤，其中个体已被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险，或者被诊断为虚弱或有变得虚弱的风险。

[0196] 在另一个实施方案中，该方法可包括施用膳食干预以维持或增加肌肉功能和/或肌肉质量的另一个步骤，其中个体已被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险，或者被诊断为虚弱或有变得虚弱的风险。优选地，膳食干预用于维持或增加肌肉质量。示例性膳食干预包括高蛋白和/或碳水化合物膳食。

[0197] 在另一方面，本发明提供一种诊断肌肉功能和/或肌肉质量的损失(例如，随年龄增长)的方法，该方法包括以下步骤：

[0198] (a)提供从个体分离的生物样品；

[0199] (b)测定生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；以及

[0200] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与由一种或多种对照样品测得的WISP1水平或参考水平进行比较。

[0201] 肌肉功能和/或肌肉质量的损失可能与少肌症或虚弱有关。

[0202] 在另一方面，本发明提供了选择膳食干预的方法，该方法包括以下步骤：

[0203] (a)提供从个体分离的生物样品；

[0204] (b)测定生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；

[0205] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与由一种或多种对照样品测得的WISP1水平或参考水平进行比较；以及

[0206] (d)施用膳食干预以维持或增加肌肉功能和/或肌肉质量，其中个体已被诊断为患有少肌症或有患上少肌症的风险，或被诊断为虚弱或有变得虚弱的风险。

[0207] 优选地，膳食干预用于维持或增加肌肉质量。示例性膳食干预包括高蛋白质和/或碳水化合物膳食，以及维生素B12和/或维生素D补充剂。

[0208] 对照样品可来自同一个体，在较早的时间点采集。类似地，可基于对同一个体进行的先前分析来确定参考水平。因此，在另一方面，本发明提供了一种确定个体的少肌症或虚弱的进展的方法，该方法包括以下步骤：

[0209] (a)提供从个体分离的生物样品；

[0210] (b)测定生物样品中Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的水平；以及

[0211] (c)将在步骤(b)中测得的WISP1水平与由在较早时间从同一个体采集的样品测得的WISP1水平进行比较。

[0212] 膳食干预和产品

[0213] 术语“膳食干预”是指应用于个体且引起个体的膳食变化的外部因素。在一个实施方案中，膳食干预是高热量膳食。在另一个实施方案中，膳食干预是高蛋白和/或碳水化合物膳食。在另一个实施方案中，膳食干预是补充有维生素和矿物质的膳食，特别是维生素B12和/或维生素D。

[0214] 膳食可以是适应个体的起始体重的膳食。

[0215] 膳食干预可包括施用至少一种膳食产品。膳食产品可以是可例如增加个体的食欲的代餐产品或补充产品。膳食产品可包括食物产品、饮料、宠物食物产品、食品补充剂、营养品、食品添加剂或营养配方产品。示例性口服营养补充剂包括雀巢Boost和Meritene产品。

[0216] 变体、衍生物、类似物、同源物和片段

[0217] 除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、衍生物、类似物、同源物及片段的用途。

[0218] 在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中各残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已被修饰，该修饰方式使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保持了其功能。可通过对天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、缺失、置换、修饰、替代和/或变异来获得变体序列。

[0219] 与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对来自序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何置换、变异、修饰、替代、缺失和/或将一个(或多个)氨基酸残基添加至序列，前提条件是所产生的蛋白质或多肽基本上保持其内源功能中的至少一种。

[0220] 与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模拟物，即这样的化学化合物，其具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。

[0221] 通常，可进行氨基酸置换，例如进行1、2或3至10或20个置换，前提条件是被修饰的序列基本上保持所需的活性或能力。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物。

[0222] 用于本发明中的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即所述缺失、插入或置换产生沉默变化并且得到功能上等同的蛋白质。还可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性做出有意的氨基酸置换，只要内源功能得以保持即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及包含具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸，包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

[0223] 保守置换可例如按下表进行。第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：

[0224]

[0225]

[0226] 如本文所用，术语“同源物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同一性的实体。术语“同源性”可等同于“同一性”。

[0227] 同源序列可包括可与个体序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与个体序列具有至少95％或97％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与个体氨基酸序列相同的活性位点等。尽管还可以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

[0228] 同源序列可包括可与个体序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与个体序列具有至少95％或97％或99％同一性的核苷酸序列。尽管还可以相似性考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

[0229] 优选地，提及与本文详述的任何一个SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

[0230] 同源性比较可通过肉眼进行，或更通常地，借助于易得序列比较程序进行。这些商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。

[0231] 同源性百分比可通过连续的序列来计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。

[0232] 尽管这是十分简单和一贯的方法，但其未能考虑例如在原本相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可导致后面的密码子不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分比有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

[0233] 然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间具有较高的相关性)将获得比具有许多空位的序列比对结果高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中每一个后续残基收取较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，氨基酸序列的默认空位罚分为：空位：-12，每个延伸：-4。

[0234] 因此，最大同源性百分比的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.12：387)。可进行序列比较的其它软件的示例包括但不限于：BLAST 软件包(参见Ausubel等人(1999)出处同上-第18章)、FASTA(Atschul等人(1990)J.Mol.Biol.403-410)和比较工具的GENEWORKS套件。BLAST和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人(1999)出处同上，第7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2 Sequences的另一种工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.，1999年，第174卷，第247-250页；FEMS Microbiol.Lett.，1999年，第177卷，第187-188页)。

[0235] 尽管最终的同源性百分比也可以同一性来量度，但对比过程本身通常不是基于全有或全无的(all-or-nothing)成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的示例是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用GCG软件包的公共默认值，或就其他软件而言，使用默认矩阵，诸如BLOSUM62。

[0236] 一旦该软件产生了最佳比对，则可计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。

[0237] Wnt诱导型信号蛋白1(WISP1)的“片段”也是变体，该术语通常是指多肽或多核苷酸中在功能上或在例如测定中所关注的选定区域。“片段”因此是指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

[0238] 此类变体可使用标准重组DNA技术诸如定点诱变来制备。在要制备插入物的情况下，可制备编码该插入物的合成DNA以及与天然序列对应的位于插入位点任一侧的5′和3’旁侧区。旁侧区将包含对应于天然序列中的位点的适宜的限制性位点，使得该序列可用适当的酶进行切割并且合成DNA可连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是说明许多本领域已知的用于操纵DNA序列的标准技术，并且其他已知的技术也可使用。

[0239] 实施例

[0240] 实施例1

[0241] 材料和方法

[0242] 小鼠

[0243] 将所有小鼠在标准条件下圈养，并使其可自由采食食物和水。使用品系C57BL/6JRj(Janvier)。年轻小鼠介于9周龄至12周龄之间，并且老年小鼠≥20月龄。

[0244] 通过将50μL的50％v/v甘油肌内注射到胫骨前肌(TA)肌肉中，诱导肌肉再生。在注射后3、7、14或21天(dpi)处死小鼠，并且在分子水平上分析再生TA肌肉。为了分离肌肉祖细胞，分别用50μL、50μL和100μL的50％v/v甘油肌内注射胫骨前肌、腓肠肌和股四头肌。在注射后3天处死小鼠，并通过流式细胞术处理肌肉以进行细胞分离。对于体内WISP1处理，在肌肉损伤后每天腹膜内注射1mg/kg/天的小鼠重组WISP1蛋白。向对照小鼠注射对应体积的PBS。

[0245] 大鼠

[0246] 将所有大鼠在标准条件下圈养，并使其可自由采食食物和水。使用品系WISTAR(Janvier)。在8、18或24月龄处死大鼠，并收集血清。

[0247] 小鼠祖细胞分离

[0248] 在未损伤的情况下或在甘油注射后3天收集肌肉，并用胶原酶B和分散酶I消化。

[0249] 用CD45-FITC(Invitrogen)、CD31-FITC(Invitrogen)、CD11b(Invitrogen)、CD34-Alexa Fluor 647(BD Biosciences)、CD140a-PE(PDGFRα)(eBioscience)、Ly-6A/E-PECy7(Sca1)(BD Biosciences)和整合素α7(R&D)将细胞在4℃下温育30分钟。

[0250] 将卫星细胞(SAT)分离为：CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1-/CD34+/整合素α7+。将纤维/脂肪形成祖细胞(FAP)分离为：CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1+/CD34+/PDGFRα+。将谱系阳性细胞(Lin+)分离为：CD31+/CD11b+/CD45+。还收集CD31-/CD11b-/CD45-/Sca1+/CD34+/PDGFRα-细胞，并命名为PDGFRα-细胞。

[0251] 慢速修饰的适体测定(SOMALOGICS)

[0252] 使用cryoPREP冲击器系统(Covaris)将肌肉样品粉碎。然后使用Polytron均化器对肌肉粉末进行机械裂解，并在50mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、50mM NaF、1mM EDTA、0.5％TritonX中提取蛋白质。通过BCA测定法测定蛋白质浓度，并将样品稀释至250μg/mL。
在SOMAscan平台(Somalogic，Boulder，CO，USA)上，使用，基于DNA适体+的识别分析大鼠血清和小鼠蛋白质提取物，如前所述(Gold，L.等人(2010)PLoS One 5：e15004)。在应用主成分分析和线性模型之前，将中值归一化相对荧光单位(RFU)进行log2+转换。在R 3.1.3中进行统计分析。

[0253] 定量PCR

[0254] 分别使用miRNeasy Mini 试剂盒或RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)从冷冻肌肉或新分选的细胞中提取RNA。使用随机引物(High Capacity cDNA逆转录试剂盒，ABI)对RNA样品进行逆转录。在LightCycler 480上使用SybR Green I master试剂盒(Roche)进行全肌肉的定量PCR。在LightCycler480上使用探针(ABI)联合SybR Green I master试剂盒(Roche)进行分离祖细胞的定量PCR。

[0255] 卫星细胞培养

[0256] 使用Beckman/Coulter Astrios细胞分选仪分离卫星细胞，并以1765个细胞/cm2的密度分配到96孔板中。将新鲜分选的卫星细胞在高葡萄糖DMEM、20％热+灭活FBS、10％灭活马血清、2.5ng/mL bFGF(Invitrogen)、1％青霉素/链霉素、1％L+谷氨酰胺、1％Na+丙酮酸盐(Invitrogen)中生长。培养基中的EdU浓度为10μM EdU，持续3小时。通过切换至分化培养基(高葡萄糖DMEM、5％灭活马血清、1％P/S)中培养2天，在生长四天后诱导卫星细胞分化。通过在培养基中加入小鼠重组WISP1蛋白，用WISP1处理细胞，并且每天更换培养基。

[0257] 人骨骼肌成肌细胞(HSMM)培养

[0258] 人骨骼肌成肌细胞(HSMM)购自Lonza。将HSMM细胞以2000个细胞/孔接种在96孔板中，并在HSMM 生长培养基中生长3天以进行增殖测定。将HSMM细胞以30000个细胞/孔接种在96孔板中，并在第二天切换至分化培养基(DMEM-F12，2％灭活FBS，1％P/S)中培养2天，以进行分化测定。

[0259] 免疫细胞化学和图像分析

[0260] 根据制造商的说明书，使用Click+iT测定法(Molecular Probes)揭示EdU掺入。简而言之，将细胞在4％PFA中固定15分钟，在0.5％PBTX中透化20分钟，用Click+iT反应混合物染色并用DAPI复染。对于MHC染色，将细胞在4％PFA中固定10分钟，使用冷EtOH/MetOH(v/v)透化5分钟，在室温下与PBS中的一抗抗-MyHC 1/200(Millipore clone A4.1025)、1％马血清一起温育1小时，并在室温下与PBS中的二抗1/1000 Alexa488抗-小鼠IgG(Life Tech.A-10680)和Hoeschst 33342、1％马血清一起温育30分钟。使用ImageXpress(Molecular Devices)对染色细胞成像，并使用MetaXpress软件进行定量。

[0261] 免疫组织化学和图像分析

[0262] 收集肌肉并冷冻在用液氮冷却的异戊烷中。以10μm切割肌肉切片，并冷冻。eMHC抗体购自DSHB(#DSHB，F1.652)。使用层粘连蛋白区分肌肉纤维，其购自Sigma(#L9393)。对于eMHC/层粘连蛋白染色，将肌肉切片解冻并在PBS、4％BSA、1％胎牛血清中阻断1小时。然后在室温下，将切片在一抗中在阻断溶液中温育3小时，洗涤并在室温下在二抗中温育1小时，然后将切片在PBS中的Hoeschst 33342中复染。使用Olympus Slide Scanner对染色切片成像，并使用VS120软件手动定量eMHC+纤维。

[0263] 统计分析

[0264] 对于qPCR或血清水平分析，使用Student′s t-检验评估统计学显著性以进行二元比较。为了对超过2组进行比较，使用单因素ANOVA，然后是Bartlett’s和Bonferroni’s多重比较测试。所有数据均表示为平均值+/-s.e.m；并且n＞5。小于5％的p值被认为具有统计学显著性。对于体外分析，通过配对Student′s t-检验评估统计学显著性以进行二元比较。为了对3组进行比较，使用单因素ANOVA，然后是Bartlett's和Bonferroni’s多重比较测试。当代表若干个重复样时，使用双因素ANOVA，然后使用Bonferroni’s后测试。所有数据均表示为平均值+/-s.e.m。小于5％的p值被认为具有统计学显著性。

[0265] 结果

[0266] 我们使用甘油诱导的肌肉损伤模型来损伤年轻小鼠和年老小鼠的肌肉，并活化肌肉祖细胞(SAT、FAP、PDGFRα-间充质细胞、CD31+内皮细胞)。然后将这些肌肉驻留细胞以及损伤后侵入肌肉的细胞(CD45+、CD11b+细胞或所谓的谱系细胞)以其活化状态分离，并与从未损伤肌肉(处于其静止状态)分离的细胞进行比较。我们发现WISP1在活化后在SAT、FAP和PDGFRα-间充质细胞中强烈上调，在FAP中具有显性表达(图1a)。然而，FAP在活化后的WISP1表达随着年龄的增长而显著降低。在全肌肉水平，WISP1在损伤后几天在mRNA和蛋白质水平上也强烈上调，年老肌肉显著受损；表明WISP1在肌肉修复中的重要作用(图1b和图1c)。此外，还发现WISP1随着年龄增长在健康肌肉中下调，可能表明WISP1在肌肉质量维持中随年龄增长的作用(图1b，右图)。在大鼠中，WISP1存在于循环血浆中并且其含量随年龄增长显著降低(图1d)。总之，这些结果表明，WISP1在肌肉功能中随年龄增长的独特作用。

[0267] 由于卫星细胞是负责肌肉再生的典型肌肉干细胞，我们接下来想要评估在肌肉干细胞小生境中分泌的WISP1是否可以调节卫星细胞功能。因此，我们从年轻和年老的未损伤肌肉中分离出卫星细胞，并使它们在小鼠重组WISP1(mrWISP1)上离体粘附、活化和增殖(图2a至图2c)。在36小时后，WISP1处理显著增加卫星细胞数量，无论是在年轻细胞还是年老细胞中，表明WISP1在卫星细胞粘附和存活中的作用(图2a)。WISP1还表现出对卫星细胞增殖(图2b、图2c)以及人肌肉祖细胞增殖(图2d)的显著正面影响。最后，WISP1对肌肉细胞分化没有影响(图2e)。

[0268] 因此，WISP1是肌肉再生过程中的新型肌肉分泌蛋白，其表达随年龄增长而丧失。WISP1能够改善肌肉干细胞的功能，而不会影响其分化能力。

[0269] 在体内，我们发现在肌肉损伤后每天用小鼠重组WISP1蛋白处理的年老小鼠在损伤后七天具有显著更高的肌原性标志物(Pax7，卫星细胞标志物；MyoD，活化卫星细胞的标志物；肌细胞生成素，分化卫星细胞的标志物；以及Myh3，新形成纤维的标志物)上调(图3)。这表明WISP1增强了体内卫星细胞的活化，从而改善肌源性程序进入。此外，WISP1处理的肌肉显示出PDGFRα水平升高，PDGFRα是FAP的标志物，其对小生境内的卫星细胞起支持作用(Joe，A.W.等人(2010)Nat.Cell Biol.12：153-163；以及Murphy，M.M.等人(2011)Development 138：3625-3637)(图4)。纤连蛋白在WISP1处理的肌肉中也显著升高，可能增强纤连蛋白对肌肉干细胞功能的有益效果(Bentzinger，C.F.等人(2013)Cell Stem Cell
12：75-87)。最后，WISP1可能通过正反馈环调节，因为WISP1内源性表达在WISP1处理的肌肉中也有所增加(图4)。WISP1表达的自动调节已在神经元中被证实，因此也可能发生在骨骼肌中(Wang，S.等人(2012)Curr.Neurovasc.Res.9：91-101)。

[0270] 在组织学水平上，年老小鼠的WISP1处理使eMHC表达(新形成的再生纤维的标志物)能够加速至与肌肉损伤后7天(7dpi)的年轻小鼠相同的水平，表明肌肉再生加速(图5)。相反，在肌肉再生的晚期时间点(14dpi)，在年老对照肌肉中表达eMHC+的再生纤维的比例较高，表明与年轻肌肉相比，纤维成熟延迟，并且在用WISP1处理的年老肌肉中得到挽救。

[0271] 在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。在不脱离本发明的范围和实质的情况下，本发明所述的化合物、组合物、用途和方法的各种修改形式和变型形式对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。虽然已结合具体优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的对用于实践本发明的所述模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。

标题	发布/更新时间	阅读量
阻断肺癌细胞增殖的中药组合物	2020-05-12	639
治疗细胞增殖性疾病的方法和系统	2020-05-13	41
白蛋白产生和细胞增殖	2020-05-11	982
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用于治疗少肌症和肌肉损伤的方法

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