技术领域
[0001] 本
发明涉及天然产物提取、分离纯化技术领域，具体涉及一种鹿药多糖及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 多糖(Polysaccharides)是由单糖连接形成的大分子物质，为
生物体必需的生物大分子之一，在细胞识别、生物体受精、生长发育、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面都起着重要作用。由于其特殊的结构、理化性质及生物活性，使得多糖在医药领域有广泛的应用，如
疫苗、抗
肿瘤或抗病毒药物，以及制备药物缓释剂、医用
透析膜、人工血液、人工
皮肤等。目前，有关多糖的化学结构、药理作用与机理、构效关系已成为生命科学研究中最活跃的领域之一。从不同生物体内提取的多糖具有不同的生理作用。
[0003] 鹿药(Smilacinajaponica A.Gray)为百合科鹿药属多年生草本
植物，我国野生鹿药资源分布十分广泛，储量巨大。鹿药为药食同源植物，地上部分的幼嫩茎叶从出苗到开花前均可食用，
味道鲜美，是广受欢迎的山野菜；而地下部分的根茎及根为民间常用中药，性味“甘、苦、温，无毒”，具有补气益肾、祛
风除湿、活血调经功能，用于
治疗风湿骨痛、神经性头痛、
乳腺炎、月经不调、痈疖肿毒、跌打损伤等症。目前，也有报道称，猪、鸡等养殖户将鹿药添加在
饲料中喂养动物，以提高动物的免疫
力。现代化学及药理研究显示鹿药根茎中含有黄
酮、皂苷、多糖等活性成分，经研究发现鹿药中多糖含量较高，约占干燥生药的20％，且具有抗
氧化和抑制肿瘤
细胞增殖的作用。除上述研究外，未见有关鹿药多糖的研究报道。
发明内容
[0004] 为了填补目前鹿药多糖成分研究的空白，本发明提供一种鹿药多糖及其制备方法和应用。
[0005] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] 本发明的一种鹿药多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 以水为
溶剂对鹿药根茎及根进行超声提取，料液比1∶20，超声
温度30℃，超声时间20min，超声提取3次，合并滤液，得到鹿药多糖水提取液；
[0010] 将步骤一所得的鹿药多糖水提取液减压浓缩至原体积的1/10，加入无水乙醇至乙醇体积分数为70％，4℃放置24h后，7000r/min离心10min，分离出上清液得沉淀物，将所得沉淀物用无水乙醇和丙酮反复洗涤后
冷冻干燥得70％乙醇沉淀鹿药粗多糖；向上清液中继续加入无水乙醇至乙醇体积分数为80％，按上述方法处理得到80％乙醇沉淀鹿药粗多糖；继续向上清液中加入无水乙醇至乙醇体积分数为90％，按上述方法处理得到90％乙醇沉淀鹿药粗多糖；
[0011] 步骤三、纯化
[0012] 将步骤二所得的70％乙醇沉淀鹿药粗多糖、80％乙醇沉淀鹿药粗多糖和90％乙醇沉淀鹿药粗多糖分别依次经脱蛋白、离子交换色谱柱分离纯化、透析、琼脂糖凝胶柱分离纯化、醇沉干燥后得到三种均一组分的鹿药多糖。
[0013] 作为优选的
实施例，所得的三种均一组分的鹿药多糖的比旋光度分别为-45°、-75°、-35°；以
葡萄糖计所得的三种均一组分的鹿药多糖中的多糖含量分别为89.22％、
93.05％、59.83％。
[0014] 作为优选的实施例，所述脱蛋白的具体步骤为：
[0015] 将步骤二所得的70％乙醇沉淀鹿药粗多糖、80％乙醇沉淀鹿药粗多糖和90％乙醇沉淀鹿药粗多糖分别配制成浓度为2mg/mL的多糖水溶液，采用Sevag法分别除蛋白6次，经冷冻干燥后得到三种脱蛋白的鹿药多糖。
[0016] 作为优选的实施例，采用Sevag法除蛋白的工艺条件为：氯仿与正丁醇的体积比为4∶1，浓度为2mg/mL的多糖水溶液与Sevag
试剂的体积比为2∶1，洗脱6次，每次振荡15min。
[0017] 作为优选的实施例，所述离子交换色谱柱分离纯化的具体步骤为：
[0018] 将所得的脱蛋白的鹿药多糖加入蒸馏水溶解至浓度为45mg/mL，以离子交换色谱柱分离，依次采用超纯水及0.1～0.4mol/L NaCI溶液洗脱，采用
苯酚-
硫酸法检测，合并呈峰部分。
[0019] 作为优选的实施例，所述离子交换色谱柱为DEAE Sepharose FF色谱柱，填料95mL。
[0020] 作为优选的实施例，步骤三中，所述透析的具体步骤为：
[0021] 将所得的呈峰部分浓缩后以截留分子量4000Da的透析袋进行透析，先以
自来水透析48h，再以蒸馏水透析24h，得到截留物质。
[0022] 作为优选的实施例，步骤三中，所述琼脂糖凝胶柱分离纯化的具体步骤为：
[0023] 将所得的截留物质通过Sephacryl S-300色谱柱分离纯化，以超纯水洗脱，采用苯酚-硫酸法追踪检测，收集呈单峰的洗脱液，洗脱液依次经减压浓缩、无水乙醇沉淀、冷冻干燥后得到均一组分的鹿药多糖。
[0024] 本发明还提供了一种采用上述的制备方法获得的鹿药多糖。
[0025] 采用上述的制备方法获得的鹿药多糖在促进猪小肠上皮细胞增殖方面的应用。
[0026] 本发明的有益效果是：
[0027] 1、本发明提供了一种操作简单、重复性好、污染小、效率高、方法学良好，适用于工业化大规模生产的提取分离纯化鹿药多糖的方法，填补了目前鹿药多糖成分研究的空白。
[0028] 2、通过本发明的制备方法得到的鹿药多糖为均一组分，具有促进猪小肠上皮细胞增殖的作用，有潜力被开发成养猪饲料的添加剂或提高免疫力的药物。
[0029] 3、本发明能够从鹿药中提取出新型多糖，并且该多糖具有独特的功效，能够为鹿药资源的开发利用提供物质
基础和技术指导。
[0030] 4、采用本发明的制备方法获得的三种均一组分的鹿药多糖的比旋光度分别为-45°、-75°、-35°；以葡萄糖计所得的三种均一组分的鹿药多糖中的多糖含量分别为
89.22％、93.05％、59.83％。
具体实施方式
[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 实施例1鹿药多糖的制备
[0033] 本发明的一种鹿药多糖的制备方法，包括鹿药多糖的提取和鹿药多糖的纯化两个步骤。
[0034] 1、鹿药多糖的提取，包括以下步骤：
[0035] (1)超声水提：将鹿药根茎及根洗净、阴干、
粉碎，以水为溶剂对其进行超声提取，通过
正交实验考察料液比、超声温度、超声时间、提取次数对提取率的影响，最终得到最佳提取工艺：料液比1∶20，超声温度30℃，超声时间20min，超声提取3次，按照此最佳工艺提取，合并滤液，得到鹿药多糖水提取液。
[0036] (2)乙醇分级沉淀：将上述所得的鹿药水提取液减压浓缩至原体积的1/10，加入无水乙醇至乙醇体积分数为70％，4℃放置24h后，7000r/min离心10min，分离出上清液，将所得沉淀物用无水乙醇和丙酮反复洗涤后冷冻干燥得70％乙醇沉淀鹿药粗多糖，标记为SJP1；向上清液中继续加入无水乙醇至乙醇体积分数为80％，按上述方法(4℃放置24h后，7000r/min离心10min，分离出上清液，将所得沉淀物用无水乙醇和丙酮反复洗涤后冷冻干燥)处理得到80％乙醇沉淀鹿药粗多糖，标记为SJP2；向上清液中继续加入无水乙醇至乙醇体积分数为90％，按上述方法(4℃放置24h后，7000r/min离心10min，分离出上清液，将所得沉淀物用无水乙醇和丙酮反复洗涤后冷冻干燥)处理得到90％乙醇沉淀鹿药粗多糖，标记为SJP3。
[0037] 2、鹿药多糖的纯化，包括以下步骤：
[0038] 将乙醇分级沉淀所得的70％乙醇沉淀鹿药粗多糖、80％乙醇沉淀鹿药粗多糖和90％乙醇沉淀鹿药粗多糖分别依次经脱蛋白、离子交换色谱柱分离纯化、透析、琼脂糖凝胶柱分离纯化、醇沉干燥后得到三种均一组分的鹿药多糖。其具体步骤如下：
[0039] (1)脱蛋白：将乙醇分级沉淀所得的SJP1、SJP2、SJP3分别配制成浓度为2mg/mL的多糖水溶液，采用Sevag法除蛋白，通过正交实验确定最佳工艺，按照最佳工艺条件：氯仿∶正丁醇＝4∶1(V/V)，多糖水溶液(2mg/mL)∶Sevag试剂＝2∶1(V/V)，洗脱6次，每次振荡15min以除蛋白，将水层冷冻干燥后得到三种脱蛋白的鹿药多糖。
[0040] (2)离子交换色谱柱分离纯化：将上述脱蛋白的鹿药多糖加入蒸馏水进行溶解，至鹿药多糖浓度为45mg/mL，过DEAE Sepharose FF色谱柱，填料95mL，依次采用超纯水及0.1～0.4mol/L NaCI溶液洗脱，流速1mL/min，自动接收器以5mL/管进行收集，采用苯酚-硫酸法检测，合并呈峰部分；
[0041] (3)透析：将上述呈峰部分浓缩后，以截留分子量4000Da的透析袋进行透析，先以自来水透析48h，再以蒸馏水透析24h，得到截留物质。
[0042] (4)琼脂糖凝胶柱分离纯化：将上述透析后的截留物质通过Sephacryl S-300色谱柱分离纯化，所用凝胶为Sephacryl S-300，以超纯水洗脱，采用苯酚-硫酸法追踪检测，收集呈良好单峰的洗脱液，洗脱液依次经过减压浓缩、无水乙醇沉淀、沉淀冷冻干燥后从SJP1、SJP2、SJP3中分别对应得到一种均一组分的鹿药多糖，分别标记为SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1。
[0043] 实施例2鹿药多糖含量的测量
[0044] 利用紫外分光光度法，以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸显色测定鹿药多糖含量，其具体过程如下：
[0045] 1、苯酚液的制备：称取新蒸馏的苯酚4g，加蒸馏水溶解，定容至100mL，混匀后转移至棕色瓶中，得4％苯酚溶液，置
冰箱中备用。
[0046] 2、葡萄糖标准溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品200mg，用蒸馏水溶解定容至100mL容量瓶中，取10mL再定溶至100mL，摇匀即得0.2mg/mL标准品溶液。
[0047] 3、标准曲线的绘制：精密量取标准品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL分别置于具塞试管中，加蒸馏水至1mL，摇匀，加入4％苯酚溶液0.75mL，摇匀，迅速加入浓硫酸3.0mL，摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5min，取出，以相应试剂为空白，测定最大吸收
波长490nm的吸光度，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程为：y＝11.677x+0.3249，R2＝0.9958。
[0048] 以葡萄糖计所得的三种均一组分的鹿药多糖中的多糖含量分别为89.22％、93.05％、59.83％。
[0049] 实施例3
[0050] 对实施例1中得到的三种均一组分的鹿药多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1进行旋光度测定：分别称取25mg三种均一组分的鹿药多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1，以蒸馏水溶解，定容至25mL，以水为空白对照，自动旋光仪测量旋光度，经计算，三种均一组分的鹿药多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1的比旋光度分别为-45°、-75°、-35°。
[0051] 对三种均一组分的鹿药多糖溶液进行稀释测定吸光度，稀释后比旋光度没有变化，进一步说明SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1均为均一组分的鹿药多糖。
[0052] 实施例4鹿药多糖对猪小肠上皮细胞增殖的影响
[0053] 将猪小肠上皮细胞PIEC以DMEM培养基复苏、培养，选对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，培养24h，吸去培养液，加入含有鹿药多糖的培养液200μL，鹿药多糖设置6个不同终浓度组(1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)，阴性对照组(含溶媒DMSO的培养液)，另设调零组(只加培养液)，每组设6复孔，加药后置37℃、5％CO2
培养箱培养48h，吸去含有鹿药多糖的培养液，加入体积比为4∶1的无血清培养液和MTT(终浓度5mg/mL)共100μL，继续孵育4h，小心吸去上清液后每孔加入150μL DMSO，放于震荡器上震荡使结晶完全溶解(5min)后，于酶标仪在570nm处检测各孔的吸光度(A值)，统计三种鹿药多糖对猪小肠上皮细胞PIEC增殖的影响情况，结果见表1。
[0054] 表1三种鹿药多糖对PIEC细胞增殖的影响(n＝4，x±s)
[0055]
[0056]
[0057] 注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。
[0058] 由此可见，三种鹿药多糖SJP1-1、SJP2-1、SJP3-1对猪小肠上皮细胞PIEC均有促进增殖作用，总体来说，在实验浓度范围内都是随着浓度增大而促进作用减弱，浓度达到40μg/mL时，鹿药多糖SJP1-1、SJP2-1出现微弱的抑制作用；在浓度1.25～10μg/mL范围内，对猪小肠上皮细胞PIEC增殖的促进作用是SJP3-1>SJP2-1>SJP1-1>鹿药呋甾皂苷。
[0059] 小肠上皮细胞是小肠的功能细胞，其功能主要为在消化道中分泌消化液消化食物、吸收和交换营养物质及免疫屏障作用，被认为在宿主黏膜表面的天然及获得性免疫系统中起中心调节作用。鹿药多糖对猪小肠上皮细胞PIEC增殖有明显的促进作用，可以应用于制备有益于猪小肠上皮细胞增殖方面的药物或饲料添加剂，为鹿药多糖作为猪饲料添加剂提高免疫力及改善肠道黏膜损伤修复等的药物研究提供参考。
[0060] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
