技术领域
[0001] 本
发明涉及一种获取参与细胞
生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人胎盘间充质干细胞分离并获取外泌体(exosome)的方法，及其在细胞修复中的应用。
背景技术
[0002] 外泌体(exosome)是由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受
体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游
信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带
蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的exosome上含有MHCII类分子。
因此，不同细胞源的exosome所携带的
信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：
肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤
细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性exosome则能够引起
机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型
给药途径及
基因治疗载体。
[0003] 人胎盘属于医疗废弃物，胎盘间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)分离来源于胎盘绒毛膜，胎盘绒毛膜富含间充质干细胞，是一个可能优于骨髓和其它组织的
种子细胞源泉，目前报道的MSCs主要来源于骨髓，但骨髓中的含量很低，仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105，使骨髓来源的MSCs受到了限制。另外的
牙髓、脂肪和脐血源的间充质干细胞也有报道，但它们的MSCs含量稀少，分离困难，不适合规模化操作。胎盘间充质干细胞来源于人胎盘，取材方便，可在较短的时间内可获得更多的细胞数量，能较好的满足exosome的提取、富集和制备。
[0004] 目前研究发现，胎盘间充质干细胞来源的exosome携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，exosome中含有血管内皮细胞生长因子、
成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤
坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的exosome携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的exosome脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHC I/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗
炎症具有重要的作用。
[0005] 目前进行exosome提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些exosome获取的途径均需要有创伤性的细胞或组织来源。exosome提取方法主要采用超速离心法或昂贵的
试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的exosome
质量不均一、不能保证exosome所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的exosome获取，并且成本昂贵。
发明内容
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，大幅度提高exosome的获取量，并使得成本得以显著下降。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，操作简便，耗时短，并使得成本得以显著下降。
[0008] 本发明的再一个目的在于提供一种分离自人胎盘间充质干细胞源的外泌体在细胞和组织修复中的应用。
[0009] 本发明的又一个目的在于提供一种分离自人胎盘间充质干细胞源的外泌体在对心肌细胞增殖和损伤修复中的应用。
[0010] 本发明提供的一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其包括如下步骤：
[0011] P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜(如：0.22μm)过滤后，收集滤液；再将滤液离心(如：4℃，10,000g，30min-45min)，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的溶液，并充分混匀后第二次离心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，最后所得沉淀即为exosome。
[0012] 本发明所用的培养基如：CN103805562B。
[0013] 本发明提供的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，在获取P2～P3胎盘间充质干细胞还包括：
[0014] 步骤1：去除胎盘脐带侧的羊膜，分离得到绒毛膜；
[0015] 步骤2：再去除绒毛膜表面黏附的结缔组织；
[0016] 步骤3：将绒毛膜剪碎成小
块(如；体积约为1mm3)，加入等体积II型胶原酶消化；
[0017] 步骤4：离心去除组织块、胶原酶分离得到胎盘间充质干细胞，接种(如：于T25cm2型细胞培养瓶中)，并进行原代培养和传代培养。
[0018] 步骤5：取P2～P3细胞进行流式表面
抗原鉴定；
[0019] 步骤6：取P2～P3细胞接种并进行培养细胞；
[0020] 步骤7：当P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时收集。
[0021] 本发明提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，II型胶原酶的终浓度0.1w/v％～0.2w/v％，消化时间为90分钟～100分钟，消化
温度为37℃±1℃，还配合采用速率为200rpm～300rpm的振荡。
[0022] 本发明提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，间充质干细胞培养过程中每隔3天更换一次培养基，直至细胞愈合度达到85-90％进行培养基收集。
[0023] 本发明提供的获取P2～P3胎盘间充质干细胞的方法，流式表面抗原鉴定使用的
抗体为下列鼠抗人单克隆抗体：CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作为同型对照。
[0024] 本发明提供的另一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，其包括如下步骤：
[0025] 步骤8：提取P2～P3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时收集的细胞培养基上清液，进行
膜过滤，并收集滤液；
[0026] 步骤9：离心步骤8所得的滤液，弃沉淀，收集离心上清液；
[0027] 步骤10：向离心上清液中按体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液后，第二次离心，所得沉淀即为exosome。
[0028] 本发明提供的上述人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，对于第二次离心所得的沉淀，还可使用缓冲液(如：PBS)进行重悬后，实施第三次离心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，而获取沉淀物，以进一步纯化exosome。
[0029] 根据本发明提供的各种方法获取的外泌体，具有细胞和组织修复的作用，可制成药物或医疗器械用于细胞和组织修复，尤其是在心肌细胞增殖和损伤修复中的应用。
[0030] 本发明技术方案实现的有益效果：
[0031] 本发明提供的人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，从组织或细胞来源方面，本发明技术方案充分利用医疗废弃物——人胎盘作为exosome获取的组织来源。在制备方法方面，综合运用膜过滤法(如：0.22μm)及在滤液离心的上清液中按体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液等多种手段，不仅简化了操作，缩短了制取时间，还大幅度提高exosome的获取量，进而有效降低制取成本。
[0032] 本发明方法的制取的exosome对细胞和组织具有修复作用，尤其是对心肌细胞增殖和损伤修复有重要的改善作用，可制造药物或医疗器械用于细胞和组织修复。
附图说明
[0033] 图1为原代hPMSCs光学
显微镜下形态；
[0034] 图2为hPMSCs表面抗原分子的流式细胞仪鉴定图；
[0035] 图3为P0～P5胎盘间充质干细胞
光学显微镜下形态图；
[0036] 图4A为胎盘间充质干细胞来源的exosome的高纯度分析；
[0037] 图4B为胎盘间充质干细胞来源的exosome的特异分子表达图；
[0038] 图5为本发明加入不同浓度的聚沉物对胎盘间充质干细胞来源的exosome得率影响的分析图；
[0039] 图6为P0～P5胎盘间充质干细胞来源的exosome对心肌细胞增殖作用的对比图；
[0040] 图7为P0～P5胎盘间充质干细胞来源的exosome的心肌细胞修复关键microRNAs表达的对比图。
具体实施方式
[0041] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明
实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围中。
[0042] 本发明实施例其它所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
[0043] 实施例1胎盘间充质干细胞分离制备及鉴定
[0044] 使用经产妇同意授权的新生儿胎盘作为间充质干细胞的来源。
[0045] 无菌条件下取产后新鲜胎盘，采用胎盘保存液(参见中国发明
专利第ZL201410028687.X号)和胎盘采集保存装置(参见中国实用新型专利第ZL2014203904164号)进行胎盘的保存运输。48h内无菌条件下采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，然后小心剪取胎盘绒毛膜，尽量多的去除掉黏附在绒毛膜上的结缔组织，用含1v/v％P/S的PBS浸3
泡漂洗3次～5次，将漂洗后的绒毛膜用眼科剪剪成约1mm碎块，加入II型胶原酶(酶消化终浓度0.1％)37℃消化90min，并于200rpm振荡。加入培养基500rpm离心5min(去除组织块和胶原酶)，取上清加入培养基2,000rpm离心10min(进一步去除胶原酶)，弃上清，加入培养基
2,000rpm离心10min(更进一步去除胶原酶)，弃上清，加入培养基吹打均；取20μl细胞悬液
6
加入到80μl红细胞裂解液中，室温下裂解5min，计数。调整细胞浓度为1.0×10细胞/ml，接种于T25cm2型细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞
培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养2天～3天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每2-3d全量换液一次；观察细胞贴壁生长至80％～90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞(参见图1)。
[0046] 观察原代hPMSCs细胞贴壁生长至80％～90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10m10.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫
覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入1.0mlFBS中止胰酶消化；
加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下1200rpm离心5min；弃去上清液，加入5ml DMEM重悬细胞，按1∶2～1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代hPMSCs(P1)，待细胞生长至80％～90％汇合时，重复上述操作进行P2～P3代细胞培养扩增。取培养P2～P3代hPMSCs，首先用0.25％的胰蛋白酶消化离心，然后用含1％小
牛血清
白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆标记抗体CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作为同型对照，室温避光孵育10min，利用流式细胞仪检测，FlowJo
软件分析结果。结果显示分离制备所得细胞表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90和CD105均在99％以上，而不表达CD14、CD19、CD34和CD45等表面抗原，结果见图2。由图
2可见，制备所得的胎盘间充质干细胞纯度很高。
[0047] 实施例2胎盘间充质干细胞传代培养、形态学观察及培养基收集
[0048] 取P0～P5代培养细胞，5×104接种于10×10细胞培养皿，37℃、5％CO2，饱和湿度静置培养，使用CN103805562B记载的胎盘间充质干细胞无血清培养基进行培养，每3天换液一次，待hPMSCs细胞汇合度达到85％～90％时，收集培养基上清。分别在P0～P5代细胞汇合度达到85％～90％时进行相差显微镜形态学观察并拍照(参见图3)。如图3所示，倒置相差显微镜下观察，原代培养的PMSCs接种48h后，大部分细胞贴壁，形态为典型成纤维细胞样，6-9d后所有细胞岛汇合成单细胞层铺满全皿，中间散在些透亮圆形杂细胞。P0、P1、P2、P3代均为长梭形，细胞排列紧密，成
旋涡状或放射状生长。而P4和P5代成短梭形或多边形，细胞体积变大，成旋涡状或网状排列。
[0049] 实施例3 exosome的获取
[0050] 提取的细胞培养上清液10ml～20ml，在4℃的环境下，0.22μm滤膜过滤；然后10,000×g离心30min，弃沉淀(去除亚细胞成分)；收集离心上清液按体积1∶1比例分别加入0w/v％、9w/v％、10w/v％、11w/v％、12w/v％和13w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，120,000×g第二次离心75min，所得沉淀即为exosome。
[0051] 用30ml PBS溶液重新悬浮沉淀物，混匀后再以120,000×g离心75min，用1ml PBS溶液悬浮沉淀物提纯的exosome溶液分别装入eppendorf管内，置于-80℃
冰箱内保存备用，进行得率分析参见图5，其中12％PEG的添加组exosome得率最高。
[0052] 实施例4胎盘间充质干细胞来源的exosome心肌细胞修复特异分子表达[0053] 利用exosome的RNA和蛋白抽提试剂盒(invitrogen公司)进行上述所得P0～P5代胎盘间充质干细胞源exosome中的RNA和总蛋白，通过microRNA反转录、实时
荧光定量PCR法检测心肌细胞修复关键表达microRNA分子microRNA15a、microRNA21、microRNA20b，以及western blot检测胎盘间充质干细胞源exosome特异表面蛋白CD63表达
水平，结果参见图4和图7所示，从人胎盘间充质干细胞培养基上清中分离获得的exosome透射电镜下观察大小为40nm～100nm的微囊泡(图4A)，western blotting检测显示，人胎盘间充质源exosome可表达CD63、CD9和CD81标志蛋白分子(图4B)。P0～P5胎盘间充质干细胞源exosome中均microRNA15a、microRNA21、microRNA20b，且P2和P3表达丰度较高(图7)。
[0054] 实施例5胎盘间充质干细胞对心肌细胞增殖的作用影响
[0055] 上述分离获得的P0～P5胎盘间充质干细胞源exosome：心肌细胞培养基为1∶20和1∶10(v/v)进行培养大鼠心肌细胞，设置PBS添加对照组、1∶20exosome添加组、exosome 1∶10添加组，培养24h、48h和72h，分别采用CCK法检测心肌细胞的增殖，结果参见图6。如图6所示，exosome 1∶20添加组、exosome 1∶10添加组在培养24h、48h和72h后均显著促进了心肌细胞的增殖，其中1∶10exosome添加组促进作用优于1∶20exosome添加组。P0～P5胎盘间充质干细胞源exosome对心肌细胞增殖均有促进作用，从24h和48h培养结果显示其中P2和P3代间充质干细胞源exosome对心肌增殖的促进作用最优。
