用于进行多能性干细胞的稳定的未分化维持增殖的培养方法
阅读：579发布：2023-01-16
专利汇可以提供用于进行多能性干细胞的稳定的未分化维持增殖的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法等，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，其特征在于，所述培养基添加有选自 乙醇 胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且培养基中基本上不含β‑巯基乙醇的或β‑巯基乙醇的浓度是9μM以下。，下面是用于进行多能性干细胞的稳定的未分化维持增殖的培养方法专利的具体信息内容。
1.用于多能性干细胞的维持未分化地增殖的培养基，其中所述培养基包含：
白蛋白，
选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且小于检测限的量的β-巯基乙醇，且
其中所述培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是11μM～200μM，且
其中所述培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
2.权利要求1所述的培养基，其中所述培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
3.权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
4.用于多能性干细胞的维持未分化地增殖的培养方法，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，其中所述培养基包含：
白蛋白，
选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且小于检测限的量的β-巯基乙醇，且
其中所述培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是11μM～200μM，且
其中所述培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
5.权利要求4所述的方法，其中所述培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
6.权利要求4所述的方法，其中所述培养基还添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
7.权利要求4～6之任一项所述的方法，其中所述培养在无饲养细胞存在下进行。
8.权利要求7所述的方法，其中所述培养使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物进行。
9.权利要求4所述的方法，其中所述培养由单细胞接种进行。
10.权利要求4所述的方法，其中所述多能性干细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或诱导性多能性干细胞(iPS细胞)。
11.用于多能性干细胞的维持未分化地增殖的培养基添加剂，其含：
白蛋白，
选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且小于检测限的量的β-巯基乙醇，且
其中所述培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是11μM～200μM，且
其中所述白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
12.权利要求11所述的培养基添加剂，其中所述白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
13.权利要求11～12之任一项所述的培养基添加剂，其还含有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
14.多能性干细胞增殖用培养基的保存稳定化方法，其包括：
添加白蛋白，
添加选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐，
其中所述培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是11μM～200μM，
其中所述培养基中β-巯基乙醇的量小于检测限，且
其中所述白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
15.权利要求14所述的方法，其中所述白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
用于进行多能性干细胞的稳定的未分化维持增殖的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法等，特别涉及用于使人多能性干细胞在无血清－无饲养层条件下－单接种条件下稳定而未分化维持增殖的培养方法等。【背景技术】
[0002] ES(胚胎干细胞)细胞或iPS(诱导性多能干细胞)细胞等的多能性干细胞由于其优良的增殖性或多分化能力而被期待在再生医疗等中使用。特别是iPS细胞，从制作－得到比较容易，制作时的伦理的制约少，还有移植时的排斥反应的观点，被看作是非常优良的再生医疗的材料。
[0003] 这些多能性干细胞是，以往，在与成纤维细胞等的支持细胞(以下称为饲养细胞)的共培养中，使用含有血清的培养基进行培养。例如，非专利文献1是由山中等的世界首次关于iPS细胞制作的报告，在使用饲养细胞、血清的条件下进行了iPS细胞的建立、维持增殖。另外，这些多能性干细胞是每种细胞一边形成密集的集落一边增殖。如果将集落解离至单一的细胞而接种(以下称为单细胞接种)，则细胞变得不稳定，所以一般是进行维持某程度的大小的集落而接种(以下称为集落接种)。例如，在非专利文献2中公开了，显示在单细胞接种的情况，与集落接种相比，细胞的生长状态易受培养环境的影响的例。即表明，单细胞接种相比集落接种，培养难度更高。
[0004] 为了进行无饲养层培养，有在培养容器底面涂付代替饲养细胞的基质或支架材的必要。作为基质，多使用细胞外基质的成分。在专利文献1显示，层粘连蛋白511的活性片段的作为基质的使用适宜于人ES/iPS细胞的增殖，单细胞接种也可能。
[0005] 在专利文献2及非专利文献3公开了人多能性干细胞用的无血清培养基组成。被称为E8的此组成以DMEM/F12作为基础培养基，加了bFGF或胰岛素等的几种因子的培养基，目前被认为是培养人多能性干细胞时的最小组成。
[0007] 另外，在专利文献4记载了，由含有乙醇胺、2-巯基乙醇、与除去脂肪酸的牛白蛋白复合的油酸、及肝素等的培养基维持灵长类胚胎干细胞的方法等，在专利文献5记载了，含有2-巯基乙醇、2-乙醇胺、及与无脂肪酸牛血清白蛋白复合物化的油酸等的ES细胞培养用培养基。在专利文献6公开了含有人白蛋白、乙醇胺、及β-巯基乙醇等的ES细胞用培养基。
[0008] 在上述专利文献4、5及6记载了作为培养基的必须成分的一定量(依次10μM、10μM、100μM)的2-巯基乙醇(β-巯基乙醇)。另外，在专利文献4中，为了向除去脂肪酸的牛白蛋白负载油酸而添加油酸，作为相对于白蛋白的油酸的量含9.4mg/g。
[0009] 另一方面，至今报告有，硫酸化多糖类有保护生长因子免于分解、变性、失活等的作用。在例如专利文献7公开了角叉菜胶稳定化bFGF，在实施例中记载了含肝素、葡聚糖硫酸、角叉菜胶等的硫酸化多糖类的保护剂保护bFGF免于被水解或热变性。但是，未公开由乙醇胺和硫酸化多糖类的组合的效果。另外，在上述专利文献4中公开了，将乙醇胺和肝素作为一体而含有的培养基，但至今不知各自的详细的效果。
[0010] 【现有技术文献】
[0011] 【专利文献】
[0012] 专利文献1：特开2011-78370号公报
[0013] 专利文献2：国际公开第2012/019122号
[0014] 专利文献3：特开2006-325445号公报
[0015] 专利文献4：特表2009-542247号公报
[0016] 专利文献5：国际公开第2005/063968号
[0017] 专利文献6：美国专利8569061号公报
[0018] 专利文献7：国际公开第92/13526号
[0019] 【非专利文献】
[0020] 非专利文献1：Cell,2006,126,663-76
[0021] 非专利文献2：Nature Communications,2012,3:1236
[0022] 非专利文献3：Nature Methods,2011,8,424-429【发明内容】
[0023] 【发明要解决的技术课题】
[0024] 当特别是以产业水平进行使用多能性干细胞的再生医疗时，上述以往的培养方法中有各种各样的问题。饲养细胞一般使用小鼠胎仔来源成纤维细胞等异种来源细胞，移植后的安全性的问题被指出。另外，在成本方面、细胞的品质管理方面，也是不使用饲养细胞(以下称为无饲养层)培养更好。血清被指出有感染源的问题、及由批间的性能差而培养成绩出偏差的担心。集落接种由于无法进行接种的细胞数的严密的调节，难以管理培养进度，另外，培养结果上发生属人性。想要以产业水平生产再生医疗用的多能性干细胞，有在严密地管理顺序、进度的条件下，由多个作业者进行作业的必要。再者，通常添加到多能性干细胞的培养基的β-巯基乙醇被指定为毒物，从处理的复杂性等的理由优选为不添加到培养基或尽可能减少添加量，对其添加量给多能性干细胞的培养的影响不知其详。从以上的情况，期望与以往的培养方法不同的，由无血清－无饲养层－单细胞接种的多能性干细胞的培养方法的开发。而且，在产业水平，成本是大的问题。从而，不是简单可无血清－无饲养层－单细胞接种培养就行，还得尽可能每单位时间得到的细胞多，才是优选为可进行增殖效率优良的培养。
[0025] 另外本发明人以专利文献1中记载的层粘连蛋白511的活性片段作为基质，使用含E8组成的培养基的以往的培养方法尝试无血清－无饲养层－单细胞接种培养，但无法进行长期间稳定维持培养。需要这样的培养的不稳定性的原因的解明和克服、以及进一步的增殖性能的升高。
[0026] 从而本发明旨在提供用于进行多能性干细胞的未分化维持增殖的手段。再者本发明旨在提供用于在无血清－无饲养层－单细胞接种培养中，稳定并且高效进行多能性干细胞的未分化维持增殖的手段。
[0027] 【解决课题的技术方案】
[0028] 本发明人为达成上述目的而进行锐意探讨的结果，发现饲养细胞释放乙醇胺，乙醇胺促进多能性干细胞的增殖。另外发现，E8在解冻－制备后，引起显著的性能降低，这有由E8的培养的不稳定性的原因的可能性，还有由白蛋白可抑制那样的性能降低。另外发现，白蛋白不仅有培养基稳定化效果，还有增强乙醇胺的上述细胞增殖效果的作用。另外发现，硫酸化糖类，在乙醇胺存在下有增殖促进、培养基稳定化效果。再者，本发明人显示，β-巯基乙醇、及负载到白蛋白的脂肪酸的量给多能性干细胞的未分化维持增殖带来影响。本发明人基于这些见解进行重复再研究的结果，完成了本发明。
[0029] 即本发明如下。
[0030] [1]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，所述培养基的特征在于，添加有选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，培养基中基本上不含β-巯基乙醇的或β-巯基乙醇的浓度是9μM以下。
[0031] [2][1]所述的方法，其中培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是1μM～1000μM。
[0032] [3][1]所述的方法，其中培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是5μM～200μM。
[0033] [4][1]～[3]之任一项所述的方法，其中乙醇胺类似物是下式所表示的化合物：
[0034] 【化1】
[0035] X-CH2-CH2-O-Y
[0036] 式中，
[0038] Y表示-P(＝O)(OH)-O-R4、氢原子或羟基的保护基，其中，R4表示-CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6或氢原子，其中，R5及R6相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
[0039] [5][4]所述的方法，其中R1及R2相同或不同，是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基，[0040] R3是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。
[0041] [6][1]～[3]之任一项所述的方法，其中乙醇胺类似物是选自磷酸乙醇胺、单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酰乙醇胺的一种或多种。
[0042] [7][1]～[6]之任一项所述的方法，其中培养基是还添加白蛋白的培养基。
[0043] [8][7]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是0.1g/l～20g/l。
[0044] [9][7]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是1g/l～8g/l。
[0045] [10][7]～[9]之任一项所述的方法，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0046] [11][7]～[10]之任一项所述的方法，其中培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
[0047] [12][7]～[10]之任一项所述的方法，其中培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
[0048] [13][1]～[12]之任一项所述的方法，其中培养基是还添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的培养基。
[0049] [14][13]所述的方法，其中培养基中的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的浓度是1～1000ng/ml。
[0050] [15][13]或[14]所述的方法，其中硫酸化糖类或其药学可容许的盐是平均分子量2,500～7,500的葡聚糖硫酸Na，。
[0051] [16]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，所述培养基的特征在于，添加有选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0052] [17][16]所述的方法，其中培养基中的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的浓度是1～1000ng/ml。
[0053] [18][16]或[17]所述的方法，其中硫酸化糖类或其药学可容许的盐是平均分子量2,500～7,500的葡聚糖硫酸Na。
[0054] [19][16]～[18]之任一项所述的方法，其中培养基是还添加白蛋白的培养基。
[0055] [20][19]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是0.1g/l～20g/l。
[0056] [21][19]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是1g/l～8g/l。
[0057] [22][19]～[21]之任一项所述的方法，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0058] [23][1]～[22]之任一项所述的方法，其中培养在无饲养细胞存在下进行。
[0059] [24][23]所述的方法，其中培养使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物进行。
[0060] [25][23]所述的方法，其中培养使用层粘连蛋白511或其活性片段或基质胶进行。
[0061] [26][1]～[25]之任一项所述的方法，其中培养由单细胞接种进行。
[0062] [27][1]～[26]之任一项所述的方法，其中培养在无血清条件下进行。
[0063] [28][1]～[27]之任一项所述的方法，其中培养基是基本上不含人以外的动物来源成分的培养基。
[0064] [29][1]～[28]之任一项所述的方法，其中多能性干细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或人工多能性干细胞(iPS细胞)。
[0065] [30][1]～[29]之任一项所述的方法，其中多能性干细胞是灵长类来源。
[0066] [31][1]～[30]之任一项所述的方法，其中多能性干细胞是人iPS细胞。
[0067] [32]多能性干细胞增殖用培养基的保存稳定化方法，其包括：添加选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0068] [33][32]所述的方法，其中使用时的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的最终浓度是1～1000ng/ml。
[0069] [34][32]或[33]所述的方法，其还包括添加白蛋白。
[0070] [35][34]所述的方法，其中使用时的白蛋白的最终浓度是0.1g/l～20g/l。
[0071] [36][34]所述的方法，其中使用时的白蛋白的最终浓度是1g/l～8g/l。
[0072] [37][34]～[36]之任一项所述的方法，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0073] [38][34]～[37]之任一项所述的方法，其中白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
[0074] [39][34]～[37]之任一项所述的方法，其中白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
[0075] [40][32]～[39]之任一项所述的方法，其中培养基基本上不含β-巯基乙醇，添加有β-巯基乙醇至最终浓度为9μM以下。
[0076] [41][32]～[40]之任一项所述的方法，其中该培养基是多能性干细胞的未分化维持增殖用。
[0077] [42]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基添加剂，其含选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，基本上不含β-巯基乙醇或含β-巯基乙醇至使用时的浓度为9μM以下。
[0078] [43][42]所述的培养基添加剂，其中乙醇胺类似物是下式所表示的化合物：
[0079] 【化2】
[0080] X-CH2-CH2-O-Y
[0081] 式中，
[0082] X表示R1-N(R2)-或R3-CH＝N-，其中，R1及R2相同或不同，表示氢原子或氨基的保护基；R3-CH表示H-CH或席夫碱型氨基保护基；
[0083] Y表示-P(＝O)(OH)-O-R4、氢原子或羟基的保护基，其中，R4表示-CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6或氢原子，其中，R5及R6相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
[0084] [44][43]所述的培养基添加剂，其中R1及R2相同或不同，是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基，
[0085] R3是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。
[0086] [45][42]～[44]之任一项所述的培养基添加剂，其中乙醇胺类似物是选自磷酸乙醇胺、单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酰乙醇胺的一种或多种。
[0087] [46][42]～[45]之任一项所述的培养基添加剂，其还含有白蛋白。
[0088] [47][46]所述的培养基添加剂，其中使用时的白蛋白的最终浓度是0.1g/l～20g/l。
[0089] [48][46]所述的培养基添加剂，其中使用时的白蛋白的最终浓度是1g/l～8g/l。
[0090] [49][46]～[48]之任一项所述的培养基添加剂，其中白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
[0091] [50][46]～[48]之任一项所述的培养基添加剂，其中白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
[0092] [51][46]～[50]之任一项所述的培养基添加剂，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0093] [52][42]～[51]之任一项所述的培养基添加剂，其还含有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0094] [53][52]所述的培养基添加剂，其中使用时的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的最终浓度是1～1000ng/ml。
[0095] [54][52]或[53]所述的培养基添加剂，其中硫酸化糖类是选自硫酸化单糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化环多醇的至少1种。
[0096] [55][52]～[54]之任一项所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是选自葡聚糖硫酸Na、纤维素SO3Na、黄原胶SO3Na、墨角藻聚糖、藻酸SO3Na、菊粉SO3Na、麦芽七糖SO3Na、水苏糖SO3Na、麦芽三糖SO3Na、麦芽糖醇SO3Na、蔗糖8SO3K、葡萄糖SO3Na、myo-6肌醇SO3K、α-环糊精SO3Na、甘露糖醇SO3Na、木糖醇SO3Na及赤藓糖醇SO3Na的至少1种。
[0097] [56][55]所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是选自葡聚糖硫酸Na、墨角藻聚糖、麦芽七糖SO3Na、麦芽三糖SO3Na、麦芽糖醇SO3Na及蔗糖8SO3K的至少1种。
[0098] [57][52]～[56]之任一项所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是平均分子量2,500～7,500的葡聚糖硫酸Na。
[0099] [58][42]～[57]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖在不使用饲养细胞的条件下进行。
[0100] [59][58]所述的培养基添加剂，其中不使用饲养细胞的条件是不使用饲养细胞，使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物的条件。
[0101] [60][58]所述的培养基添加剂，其中不使用饲养细胞的条件是不使用饲养细胞，使用层粘连蛋白511或其活性片段或基质胶的条件。
[0102] [61][42]～[60]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖是由单细胞接种进行的。
[0103] [62][42]～[61]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖是在无血清条件下进行的。
[0104] [63][42]～[62]之任一项所述的培养基添加剂，其中基本上不含人以外的动物来源成分。
[0105] [64][42]～[63]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或人工多能性干细胞(iPS细胞)。
[0106] [65][42]～[64]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是灵长类来源的。
[0107] [66][42]～[65]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是人iPS细胞的。
[0108] [67]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基，其含[42]～[66]之任一项所述的培养基添加剂。
[0109] [68]用于人工多能性干细胞(iPS细胞)的未分化维持增殖的培养方法，其包括在添加有选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的培养基中培养人工多能性干细胞(iPS细胞)的工序。
[0110] [69][68]所述的方法，其中培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是1μM～1000μM。
[0111] [70][68]所述的方法，其中培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度是5μM～200μM。
[0112] [71][68]～[70]之任一项所述的方法，其中乙醇胺类似物是下式所表示的化合物：
[0113] 【化3】
[0114] X-CH2-CH2-O-Y
[0115] 式中，
[0116] X表示R1-N(R2)-或R3-CH＝N-，其中，R1及R2相同或不同，表示氢原子或氨基的保护基；R3-CH表示H-CH或席夫碱型氨基保护基；
[0117] Y表示-P(＝O)(OH)-O-R4、氢原子或羟基的保护基，其中，R4表示-CH2-CH(O-R5)-6 5 6
CH2-O-R或氢原子，其中，R及R相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
CH2-O-R或氢原子，其中，R及R相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
[0118] [72][71]所述的方法，其中R1及R2相同或不同，是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基，[0119] R3是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。
[0120] [73][68]～[72]之任一项所述的方法，其中乙醇胺类似物是选自磷酸乙醇胺、单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酰乙醇胺的一种或多种。
[0121] [74][68]～[73]之任一项所述的方法，其中培养基是还添加白蛋白的培养基。
[0122] [75][74]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是0.1g/l～20g/l。
[0123] [76][74]所述的方法，其中培养基中的白蛋白的浓度是1g/l～8g/l。
[0124] [77][74]～[76]之任一项所述的方法，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0125] [78][74]～[77]之任一项所述的方法，其中培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
[0126] [79][74]～[77]之任一项所述的方法，其中培养基中的白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
[0127] [80][68]～[79]之任一项所述的方法，其中培养在无饲养细胞存在下进行。
[0128] [81][80]所述的方法，其中培养使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物进行。
[0129] [82][80]所述的方法，其中培养使用层粘连蛋白511或其活性片段或基质胶进行。
[0130] [83][68]～[82]之任一项所述的方法，其中培养由单细胞接种进行。
[0131] [84][68]～[83]之任一项所述的方法，其中培养在无血清条件下进行。
[0132] [85][68]～[84]之任一项所述的方法，其中培养基是基本上不含人以外的动物来源成分的培养基。
[0133] [86][68]～[85]之任一项所述的方法，其中人工多能性干细胞是灵长类来源的。
[0134] [87][68]～[86]之任一项所述的方法，其中人工多能性干细胞是人iPS细胞的。
[0135] [88]多能性干细胞增殖用培养基的保存稳定化方法，其包括添加选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种。
[0136] [89][88]所述的方法，其还包括添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0137] [90][89]所述的方法，其中使用时的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的最终浓度是1～1000ng/ml。
[0138] [91][88]～[90]之任一项所述的方法，其还包括添加白蛋白。
[0139] [92][91]所述的方法，其中使用时的白蛋白的最终浓度是0.1g/l～20g/l。
[0140] [93][91]所述的方法，其中使用时的白蛋白的最终浓度是1g/l～8g/l。
[0141] [94][91]～[93]之任一项所述的方法，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0142] [95][91]～[94]之任一项所述的方法，其中白蛋白的脂肪酸负载量是9mg/g以下。
[0143] [96][91]～[94]之任一项所述的方法，其中白蛋白的脂肪酸负载量是2.2mg/g以下。
[0144] [97][88]～[96]之任一项所述的方法，其中培养基基本上不含β-巯基乙醇，或者添加有β-巯基乙醇至最终浓度为9μM以下。
[0145] [98][88]～[97]之任一项所述的方法，其中该培养基是多能性干细胞的未分化维持增殖用的。
[0146] [99]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基添加剂，其含选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种。
[0147] [100][99]所述的培养基添加剂，其中乙醇胺类似物是下式所表示的化合物：
[0148] 【化4】
[0149] X-CH2-CH2-O-Y
[0150] 式中，
[0151] X表示R1-N(R2)-或R3-CH＝N-，其中，R1及R2相同或不同，表示氢原子或氨基的保护基；R3-CH表示H-CH或席夫碱型氨基保护基；
[0152] Y表示-P(＝O)(OH)-O-R4、氢原子或羟基的保护基，其中，R4表示-CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6或氢原子，其中，R5及R6相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
[0153] [101][100]所述的培养基添加剂，其中R1及R2相同或不同，是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基，
[0154] R3是氢原子、卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。
[0155] [102][99]～[101]之任一项所述的培养基添加剂，其中乙醇胺类似物是选自磷酸乙醇胺、单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酰乙醇胺的一种或多种。
[0156] [103][99]～[102]之任一项所述的培养基添加剂，其还含有白蛋白。
[0157] [104][103]所述的培养基添加剂，其中白蛋白是从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0158] [105][99]～[104]之任一项所述的培养基添加剂，其还含有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0159] [106][105]所述的培养基添加剂，其中使用时的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的最终浓度是1～1000ng/ml。
[0160] [107][105]或[106]所述的培养基添加剂，其中硫酸化糖类是选自硫酸化单糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化环多醇的至少1种。
[0161] [108][105]～[107]之任一项所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是选自葡聚糖硫酸Na、纤维素SO3Na、黄原胶SO3Na、墨角藻聚糖、藻酸SO3Na、菊粉SO3Na、麦芽七糖SO3Na、水苏糖SO3Na、麦芽三糖SO3Na、麦芽糖醇SO3Na、蔗糖8SO3K、葡萄糖SO3Na、myo-6肌醇SO3K、α-环糊精SO3Na、甘露糖醇SO3Na、木糖醇SO3Na及赤藓糖醇SO3Na的至少1种。
[0162] [109][108]所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是选自葡聚糖硫酸Na、墨角藻聚糖、麦芽七糖SO3Na、麦芽三糖SO3Na、麦芽糖醇SO3Na及蔗糖8SO3K的至少1种。
[0163] [110][105]～[109]之任一项所述的培养基添加剂，其中上述硫酸化糖类或其药学可容许的盐是平均分子量2,500～7,500的葡聚糖硫酸Na。
[0164] [111][99]～[110]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖在不使用饲养细胞的条件下进行。
[0165] [112][111]所述的培养基添加剂，其中不使用饲养细胞的条件是不使用饲养细胞，使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物的条件。
[0166] [113][111]所述的培养基添加剂，其中不使用饲养细胞的条件是不使用饲养细胞，使用层粘连蛋白511或其活性片段或基质胶的条件。
[0167] [114][99]～[113]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖由单细胞接种进行。
[0168] [115][99]～[114]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞的未分化维持增殖在无血清条件下进行。
[0169] [116][99]～[115]之任一项所述的培养基添加剂，其中基本上不含人以外的动物来源成分。
[0170] [117][99]～[116]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是胚胎干细胞(ES细胞)或人工多能性干细胞(iPS细胞)。
[0171] [118][99]～[117]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是灵长类来源的。
[0172] [119][99]～[118]之任一项所述的培养基添加剂，其中多能性干细胞是人iPS细胞。
[0173] [120]用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基，其含[99]～[119]之任一项所述的培养基添加剂。
[0174] 【发明效果】
[0176] 【图1】是显示由白蛋白的在4℃保存条件下的培养基稳定化效果的图。
[0177] 【图2】是显示乙醇胺的细胞增殖促进效果及与白蛋白的组合效果的图。
[0178] 【图3】是以累积活细胞增加率(倍)显示由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合的细胞增殖促进效果的图。
[0179] 【图4】是显示将在向E8最小组成培养基添加白蛋白、乙醇胺、葡聚糖硫酸钠的培养基的长期培养后的iPS细胞的集落碱性磷酸酶染色的结果的图。
[0180] 【图5】是显示作为基底膜基质使用基质胶的培养中的乙醇胺的细胞增殖促进效果的图。
[0181] 【图6】是显示通过向含白蛋白及乙醇胺的培养基添加葡聚糖硫酸钠，可在iPS细胞的培养中省略培养基更换的图。
[0182] 【图7】是显示由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合的在常温保存条件下的培养基稳定化效果的图。
[0183] 【图8】是显示O-磷酰乙醇胺的细胞增殖促进效果的图。
[0184] 【图9】是显示2-(甲基氨基)乙醇的细胞增殖促进效果的图。
[0185] 【图10】是显示2-二甲基氨基乙醇的细胞增殖促进效果的图。
[0186] 【图11】是显示乙醇胺盐酸盐的细胞增殖促进效果的图。
[0187] 【图12】是显示伴随白蛋白的油酸负载量的增加的细胞增殖抑制效果的图。
[0188] 【实施方式】
[0189] 【用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法】
[0190] 本发明提供用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法(以下也称为本发明的培养方法)，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，所述培养基的特征在于，添加有选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，培养基中基本上不含β-巯基乙醇的或β-巯基乙醇的浓度是9μM以下。
[0191] 本发明基于，新发现饲养细胞释放乙醇胺，发现通过向无饲养层的培养添加乙醇胺也可促进多能性干细胞的未分化维持增殖。饲养细胞一般使用异种来源细胞，另外也知由饲养细胞来源的病毒的感染例。从而，本发明可解决这些的问题，在再生医疗的领域极其有用。
[0192] 另外，本发明基于发现，即使减小培养基中的β-巯基乙醇的浓度，也可良好地进行多能性干细胞的未分化维持增殖。在本发明的培养方法中，优选为培养基中基本上不含β-巯基乙醇或完全不含。即使在培养基中含β-巯基乙醇时，其浓度优选为是9μM以下。
[0194] 在本发明中，“多能性干细胞”是指有自身复制能力及分化/增殖能力的未成熟的细胞，有可分化为构成活体的全部的组织或细胞的能力的细胞。作为多能性干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能性干细胞(iPS细胞)等。通过培养通过核移植体细胞的核而制作的初期胚而建立的干细胞也包括在多能性干细胞内(Nature，385,810(1997)；Science，280,1256(1998)；Nature Biotechnology，17,456(1999)；Nature，394,369(1998)；Nature Genetics，22,127(1999)；
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96,14984(1999)；Nature Genetics，24,109(2000))。再有，在本发明的多能性干细胞中，不包括复能性干细胞(multipotent stem cell)。复能性干细胞是指，不是全部的种类，但有可分化为多种组织或细胞的能力的细胞，包括间质干细胞等的成体干细胞。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96,14984(1999)；Nature Genetics，24,109(2000))。再有，在本发明的多能性干细胞中，不包括复能性干细胞(multipotent stem cell)。复能性干细胞是指，不是全部的种类，但有可分化为多种组织或细胞的能力的细胞，包括间质干细胞等的成体干细胞。
[0195] 本发明的培养方法可适宜地用于任何多能性干细胞，但优选为，在胚胎干细胞(ES细胞)或用于人工多能性干细胞(iPS细胞)的未分化维持增殖中使用。
[0196] 另外，本发明的培养方法可适宜地用于任何动物来源的多能性干细胞。可使用本发明的培养基培养的多能性干细胞，例如，是小鼠、大鼠、仓鼠、猪鼠等的啮齿类、兔等的兔目、猪、牛、山羊、马、绵羊等的有蹄目、狗、猫等的猫目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类等来源的多能性干细胞，优选为灵长类来源的多能性干细胞。在再生医疗中使用时优选为人iPS细胞。
[0197] 在本发明中，多能性干细胞的“未分化维持增殖”是指，多能性干细胞在维持多分化能力的情况下在未分化状态下增殖。即，本发明的培养方法也可说成是将多能性干细胞维持多分化能力的情况下在未分化状态下增殖的方法。多能性干细胞维持在未分化状态，如后述的实施例所示，通过进行碱性磷酸酶染色来确认。染色的细胞被评价为维持在未分化状态。
[0198] 本发明中使用的“乙醇胺”(也称为2-氨基乙醇、单乙醇胺)可为从天然物或其加工品单离－纯化的，也可为合成品。乙醇胺可使环氧乙烷和氨反应而制造。另外乙醇胺也可为使用溶剂提取、各种层析等的公知的技术从天然物或其加工品单离－纯化的。乙醇胺可为市售品，例如，可从Sigma-Aldrich公司等得到。
[0199] 作为本发明中使用的“乙醇胺类似物”，
[0200] 可举出下式所表示的化合物：
[0201] 【化5】
[0202] X-CH2-CH2-O-Y
[0203] 式中，
[0204] X表示R1-N(R2)-或R3-CH＝N-，其中，R1及R2相同或不同，表示氢原子或氨基的保护基；R3-CH表示H-CH或席夫碱型氨基保护基；
[0205] Y表示-P(＝O)(OH)-O-R4、氢原子或羟基的保护基，其中，R4表示-CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6或氢原子，其中，R5及R6相同或不同，表示碳原子数2～30的酰基或氢原子。
[0206] 对“氨基的保护基”而言，可参照例如，Green等，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Edition，1999，John Wiley&Sons，Inc.等的书籍，可选择适宜的保护基导入及除去。作为“氨基的保护基”，可举出卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。再者，也可举出为了药物前体化而可与氨基结合的脱离基。
[0207] “卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
[0208] 作为“芳基”，例如，可举出苯基、1-萘基、2-萘基等。
[0209] 作为“碳原子数2～30的酰基”，可举出饱和羧酸酰基及不饱和羧酸酰基。作为饱和羧酸酰基，可举出乙酰(乙酰)、丙酰、丁酰、戊酰、已酰、庚酰、辛酰、壬酰、癸酰、十一酰、十二酰、十三酰、十四酰、十五酰、十六酰、十七酰、十八酰、十九酰、二十酰、二十酰、二十一酰、二十一酰、二十二酰、二十三酰、二十四酰、二十五酰、二十六酰、二十七酰、二十八酰、二十九酰及三十酰等。作为不饱和羧酸酰基，可举出丙烯酰、甲基丙烯酰、巴豆酰、异巴豆酰、丁烯酰、丁二烯酰、戊烯酰、己烯酰、庚烯酰、辛烯酰、壬烯酰、癸烯酰、十一烯酰、十二烯酰、十四烯酰、油烯酰、反油烯酰、环戊酰、环已酰、环庚酰、甲基环戊酰、甲基环已酰、甲基环庚酰、环戊烯酰、2,4-环戊二烯酰、环己烯酰、2,4-环己二烯酰、环庚烯酰、甲基环戊烯酰、甲基环己烯酰及甲基环庚烯酰等。
[0210] “碳原子数1～6的烷基”是指碳原子数1～6的直链或分枝烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、n-戊基、异戊基、叔-戊基、NEO戊基、2-戊基、3-戊基、n-己基、2-己基等。
[0211] “碳原子数1～6的烷氧基”是指碳原子数1～6的直链或分枝烷氧基，具体而言，可举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊基氧基、己基氧基、甲氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、甲氧基丙氧基、乙氧基乙氧基、乙氧基丙氧基等。
[0212] “碳原子数1～6的羟基烷基”是指烷基中的氢原子之一部分被羟基取代的，碳原子数1～6的直链或分枝羟基烷基，具体而言，可举出羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基、2-羟基-2-甲基丙基、4-羟丁基、3-羟丁基、2-羟丁基等。
[0213] “碳原子数1～6的卤烷基”是指烷基中的氢原子之一部分被卤素原子取代的，碳原子数1～6的直链或分岐卤烷基，卤素原子是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。具体而言，可举出三氟甲基、氯甲基、溴甲基、二氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3-氯丙基或3-碘丙基等。
[0214] “碳原子数1～6的卤烷氧基”是指烷氧基中的氢原子之一部分被卤素原子取代的，碳原子数1～6的直链或分岐卤烷氧基，具体而言，可举出三氟甲氧基、五氟乙氧基、2-氯乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、七氟-n-丙氧基、七氟-i-丙氧基、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙氧基、3-氟-n-丙氧基、1-氯环丙氧基、2-溴环丙氧基、3,3,4,4,4-五氟-2-丁氧基、九氟-n-丁氧基、九氟-2-丁氧基、5,5,5-三氟-n-戊基氧基、4,4,5,5,5-五氟-2-戊基氧基、3-氯-n-戊基氧基、4-溴-2-戊基氧基、4-氯丁基氧基、2-碘-n-丙基氧基等。
[0215] “碳原子数1～6的卤羟基烷基”是指羟基烷基中的氢原子之一部分被卤素原子取代的，碳原子数1～6的直链或分岐卤羟基烷基，具体而言，可举出二氟羟甲基、1,1-二氟-2-羟乙基、2,2-二氟-2-羟乙基、1,1,2,2-四氟-2-羟乙基等。
[0216] “为了药物前体化而可与氨基结合的脱离基”中的“药物前体化”是指，其自身是本发明的效果小或不发挥，但变换对象化合物至在培养基中及/或在培养中脱离基脱离而发挥本发明的效果，发挥本发明的效果的化合物中的氨基和脱离基之间形成暂时的结合至在培养基中及/或在培养中脱离基脱离。
[0217] 作为“为了药物前体化而可与氨基结合的脱离基”，只要是有机合成化学领域中使用的，就不特别限定，但例如，可举出卤素原子(例、氯原子、溴原子、碘原子等)、磺酰氧基(例、甲磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、苯磺酰氧基、p-甲苯磺酰氧基等)等。
[0218] R3-CH是席夫碱型氨基保护基的时，R3是卤素原子、羟基、芳基、碳原子数2～30的酰基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、碳原子数1～6的羟基烷基、碳原子数1～6的卤烷基、碳原子数1～6的卤烷氧基或碳原子数1～6的卤羟基烷基。
[0219] “羟基的保护基”只要是有机合成化学领域中使用的羟基的保护基，就不特别限定，但例如，可举出碳原子数1～6的烷基(例、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔-丁基)、苯基、三苯甲基、碳原子数7～10的芳烷基(例、苄基、p-甲氧基苄基)、甲酰基、碳原子数1～6的烷基-羰基(例、乙酰、丙酰)、苯甲酰基、碳原子数7～10的芳烷基-羰基(例、苄基羰基)、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基、2-四氢呋喃基、取代甲硅烷基(例、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、二甲基苯基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二乙基甲硅烷基)、碳原子数2～6的烯基(例、1-烯丙基)等。再者，也可举出为了药物前体化而可与羟基结合的脱离基。
[0220] “为了药物前体化而可与羟基结合的脱离基”中的“药物前体化”是指其自身是本发明的效果小或不发挥，但变换对象化合物至在培养基中及/或在培养中脱离基脱离而发挥本发明的效果，发挥本发明的效果的化合物中的羟基和脱离基之间形成暂时的结合至在培养基中及/或在培养中脱离基脱离。
[0221] 作为“为了药物前体化而可与羟基结合的脱离基”只要是有机合成化学领域中使用的，就不特别限定，但例如，可举出卤素原子(例、氯原子、溴原子、碘原子等)、磺酰氧基(例、甲磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、苯磺酰氧基、p-甲苯磺酰氧基等)等。
[0222] 乙醇胺类似物优选为选自磷酸乙醇胺(别名磷酰乙醇胺)、单甲基乙醇胺、二甲基乙醇胺、N-酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、及溶血磷脂酰乙醇胺的一种或多种。
[0223] 在本发明中也可使用的乙醇胺及/或乙醇胺类似物是药学可容许的盐的形态。作为涉及的盐，例如，对于化合物中存在羧基等的酸性基时的酸性基，可举出铵盐、钠、钾等的碱金属和的盐、钙、镁等的碱土金属的盐、铝盐、锌盐、三乙基胺、吗啉、哌啶、二环己基胺等的有机胺和的盐、精氨酸、赖氨酸等的碱性氨基酸的盐。对于化合物中存在碱性基时的碱性基，可举出与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸等的无机酸和的盐、醋酸、三氟醋酸、柠檬酸、安息香酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、单宁酸、酪酸、羟苄基苯甲酸、双羟萘酸、庚酸、癸烷酸、茶氯酸、水杨酸、乳酸、草酸、苦杏仁酸、苹果酸等的有机羧酸的盐、甲磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸等的有机磺酸的盐。特别优选为是盐酸盐。
[0224] 培养基中的乙醇胺及/或乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的最终浓度(使用时的浓度)只要在无饲养层的条件下，可作用于多能性干细胞的未分化维持增殖的促进，就可设定成任意的范围。可根据其种类而不同，但通常是1μM～1000μM、优选为5μM～200μM、或者11μM～200μM。如呆不足1μM，则有促进多能性干细胞的未分化维持增殖的效果变弱的倾向。另外超1000μM的，则有引起多能性干细胞的增殖抑制的情况。培养基中的选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的浓度通常是1μM～1000μM、优选为5μM～200μM、或者11μM～200μM。在使用多种时，设定成它们的合计量在上述范围内，但可随种数适宜增减。
[0225] 在本发明中，选自乙醇胺及/或乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种“在无饲养层的条件下，在多能性干细胞的未分化维持增殖的促进中发挥作用”是指，除了不含有乙醇胺及/或乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐以外，在相同的条件下，以饲养细胞的非存在下培养的多能性干细胞的细胞数作为基准(100％)，使培养基中含有选自乙醇胺及/或乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种时，得到超100％的细胞数。是否在无饲养层的条件下，在多能性干细胞的未分化维持增殖的促进中发挥作用可使用实施例中记载的方法等的公知的细胞增殖系的方法评价。
[0226] β-巯基乙醇是浓度高，则被担心有毒性。从而，本发明中使用的，β-巯基乙醇的浓度作为使用时的最终浓度是9μM以下。更优选为7μM以下，再优选为5μM以下。更优选为基本上不含β-巯基乙醇或完全不含。在本申请发明中，即使基本上不含β-巯基乙醇，多能性干细胞也可稳定地未分化维持增殖。
[0227] “基本上不含β-巯基乙醇”的定义以上述为准。
[0228] 本发明中使用的培养基也可为还添加有白蛋白的培养基。由白蛋白的添加，在得到培养基的保存稳定化效果的同时，由乙醇胺的多能性干细胞的未分化维持增殖的促进效果被增强。
[0229] 其中，培养基的“保存稳定化”是指培养基的保存时(通常、-80℃左右～40℃左右)及使用时的培养基的经时劣化被缓和。本发明中的“培养基的劣化”是指使多能性干细胞未分化维持增殖的功能降低，其程度，如后述的实施例中记载，可通过将多能性干细胞在所述培养基中培养指定期间后，测定细胞数来评价。以使用刚制备好的培养基时作为基准，培养后的细胞数越少，培养基被评价为越劣化。
[0230] 本发明中使用的白蛋白是动物来源的血清白蛋白。作为动物，例如，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、猪鼠等的啮齿类及兔等的实验动物、狗及猫等的宠物、牛、猪、山羊、马及绵羊等的家畜、人、猴、猩猩及黑猩猩等的灵长类等，不特别限定。培养再生医疗中使用的细胞时，本发明中使用的白蛋白是优选为人白蛋白。再有，“动物来源”是指白蛋白的氨基酸序列是动物的。
[0231] 本发明中使用的白蛋白可为从动物的活体样品(例如血液、血浆、血清等)单离－纯化的，也可为由基因重组技术制造而单离－纯化的。白蛋白的制备方法是公知的。另外白蛋白可为市售品，例如，可从Sigma-Aldrich公司等得到。
[0232] 本发明中使用的白蛋白优选为从动物(包括人)的血浆或由基因重组技术得到的白蛋白。
[0233] 本发明中使用的白蛋白是，其脂肪酸负载量优选为9mg/g以下，更优选为7mg/g以下，再优选为2.2mg/g以下。
[0234] 在本发明中，在使用添加有白蛋白的培养基时，培养基中的白蛋白的最终浓度(使用时的浓度)只要得到培养基的稳定化效果，并且增强由选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的多能性干细胞的未分化维持增殖的促进效果，就不特别限定，通常是0.1g/l～20g/l、优选为1g/l～8g/l。
[0235] 本发明中使用的培养基也可为还添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的培养基。通过将硫酸化糖类与乙醇胺组合而添加到培养基，在得到培养基的稳定化效果的同时，由乙醇胺的多能性干细胞的未分化维持增殖的促进效果被增强。硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐也可根据期望使用多种。
[0236] 在本发明中，“硫酸化糖类”是糖类的硫酸化物。作为“糖类”，只要是现有技术领域公知的，就不特别限定，另外也可为新颖的。糖类可为天然物，也可为合成品。向本发明的培养基添加的硫酸化糖类优选为硫酸化单糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇或硫酸化环多醇。
[0237] “单糖”可为现有技术领域公知的，也可为新颖的。构成糖的碳的数不限定，例如，可为四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等之任何。作为单糖，具体而言，可举出例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、塔罗糖、艾杜糖、阿卓糖、阿洛糖、古洛糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、果糖、核糖、脱氧核糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等。硫酸化单糖是这些的单糖的硫酸化物。
[0238] “二糖”是上述单糖二分子由糖苷键结合而成一分子的糖，可为现有技术领域公知的，也可为新颖的。糖苷键的样式不特别限定，可为α-1,2键、β-1,2键、α-1,3键、β-1,3键、α-1,4键、β-1,4键、α-1,5键、β-1,5键、α-1,6键、β-1,6键、α-1,α-1键、α-1,β-1键、α-1,β-2键等之任何。作为二糖，具体而言，可举出例如蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖醇等。硫酸化二糖是这些的二糖的硫酸化物。
[0239] 多糖是上述单糖三分子以上由糖苷键结合而成一分子的糖，可为现有技术领域公知的，也可为新颖的。多糖可由上述糖类的中仅一种构成，也可由两种类以上组合构成。多糖也可为直链状、分支状及环状之任何。作为多糖，例如，可举出直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、葡聚糖、麦芽七糖、水苏糖、麦芽三糖、出芽短梗孢糖、纤维素及其衍生物(例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等)、昆布糖、凝胶多糖、愈伤葡聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖木聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、壳多糖、壳聚糖、木糖葡聚糖、果胶酸及果胶、藻酸、阿拉伯半乳聚糖、葡萄糖胺葡聚糖(例如葡聚糖硫酸、乙酰肝素硫酸、肝素、透明质酸、软骨素4-硫酸、软骨素6-硫酸、皮肤素硫酸、角质素硫酸等)、瓜尔胶、黄原胶、墨角藻聚糖、菊粉等。
硫酸化多糖是这些的多糖的硫酸化物，对于上述糖类之中已经硫酸化的(例如，葡聚糖硫酸、乙酰肝素硫酸、肝素、软骨素4-硫酸、软骨素6-硫酸、皮肤素硫酸、角质素硫酸、墨角藻聚糖等)，也包括所述糖类自体。作为硫酸化多糖，优选为葡聚糖硫酸、纤维素的硫酸化物(即，纤维素SO3H)、黄原胶的硫酸化物(即，黄原胶SO3H)、墨角藻聚糖、藻酸的硫酸化物(即，藻酸SO3H)、菊粉的硫酸化物(即，菊粉SO3H)、α-环糊精的硫酸化物(即，α-环糊精SO3H)、麦芽七糖的硫酸化物(即，麦芽七糖SO3H)、水苏糖的硫酸化物(即，水苏糖SO3H)及麦芽三糖的硫酸化物(即，麦芽三糖SO3H)，特别优选为葡聚糖硫酸。
硫酸化多糖是这些的多糖的硫酸化物，对于上述糖类之中已经硫酸化的(例如，葡聚糖硫酸、乙酰肝素硫酸、肝素、软骨素4-硫酸、软骨素6-硫酸、皮肤素硫酸、角质素硫酸、墨角藻聚糖等)，也包括所述糖类自体。作为硫酸化多糖，优选为葡聚糖硫酸、纤维素的硫酸化物(即，纤维素SO3H)、黄原胶的硫酸化物(即，黄原胶SO3H)、墨角藻聚糖、藻酸的硫酸化物(即，藻酸SO3H)、菊粉的硫酸化物(即，菊粉SO3H)、α-环糊精的硫酸化物(即，α-环糊精SO3H)、麦芽七糖的硫酸化物(即，麦芽七糖SO3H)、水苏糖的硫酸化物(即，水苏糖SO3H)及麦芽三糖的硫酸化物(即，麦芽三糖SO3H)，特别优选为葡聚糖硫酸。
[0240] “糖醇”是上述单糖的羰基被还原而生成的化合物，可为现有技术领域公知的，也可为新颖的。作为糖醇，例如，可举出甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、庚七醇、鳄梨糖醇等，优选为赤藓糖醇、木糖醇及甘露糖醇。硫酸化糖醇是这些的糖醇的硫酸化物。
[0241] “环多醇”是聚羟基环链烷，也被称为环状糖醇或环醇。环多醇可为现有技术领域公知的，也可为新颖的。另外，在环多醇中已知多种异构体，也可为任何的异构体。构成环的碳的数不特别限定，但优选为六员环。作为环多醇，例如，可举出肌醇(1,2,3,4,5,6-环己六醇)、肌醇的衍生物(将羟基用氨基、酮基、羧基等取代的衍生物)等。硫酸化环多醇是这些的环多醇的硫酸化物。
[0242] 在本发明中也可向培养基添加的硫酸化糖类是药学可容许的盐的形态。作为涉及的盐，可举出硫酸化糖类中存在的硫酸基等和碱基的盐。具体而言，钠盐、钾盐等的碱金属盐；钙盐、镁盐等的碱土金属盐；铝盐、铵盐等的无机碱盐；可举出与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己基胺、二环己基胺、N,N’-二苄基乙二胺等的有机碱盐，可从游离体由常规方法制备。作为硫酸化糖类的药学可容许的盐，优选为硫酸基的钠盐或钾盐，例如，可举出蔗糖8SO3K、葡聚糖硫酸Na(分子量5,000、25,000、50万等)、纤维素SO3Na、黄原胶SO3Na、藻酸SO3Na、菊粉SO3Na、α-环糊精SO3Na、赤藓糖醇SO3Na、甘露糖醇SO3Na、肌-肌醇6SO3K等，特别优选为葡聚糖硫酸Na。
[0243] 在本发明中，使用添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的培养基时，培养基中的硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的最终浓度(使用时的浓度)只要得到培养基的稳定化效果，并且增强由选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种的多能性干细胞的未分化维持增殖的促进效果，就不特别限定，通常是1～1000ng/ml、优选为10～250ng/ml。在使用多种时，设定成它们的合计量在上述范围内，可随种类适宜增减。
[0244] 硫酸化糖类或其药学可容许的盐的平均分子量不特别限定，根据采用的硫酸化糖类的种类和盐的种类而不同，通常是50～100万、优选为100～70万、更优选为300～50万、最优选为500～10万。平均分子量超100万，则有由一定浓度以上的添加而被看作由毒性或细胞粘接抑制等所致的细胞增殖抑制的倾向。平均分子量可使用凝胶渗透层析等测定。
[0245] 例如，作为葡聚糖硫酸Na的平均分子量，通常是1000～70万、优选为1000～30万、更优选为1000～10万、最优选为2,500～7,500。
[0246] 本发明中使用的培养基可含血清，也可不含，但从培养再生医疗中使用的细胞时，血清成为病毒感染源的可能性、由批间的性能差而有培养结果发生偏差的可能性等来看，优选为在无血清条件下进行培养。
[0247] 本发明中使用的培养基可含与培养的细胞不同的种来源的成分，也可不含，但从培养再生医疗中使用的人的细胞时，移植后的安全性的观点来看，优选为不含人以外的动物来源的成分。
[0248] 作为本发明中使用的基础培养基，根据多能性干细胞的种类可使用公知的，只要不抑制多能性干细胞的未分化维持增殖，就不特别限定，但可举出例如DMEM、EMEM、IMDM(Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基)、GMEM(Glasgow氏MEM)、RPMI-1640、α-MEM、Ham氏培养基F-12、Ham氏培养基F-10、Ham氏培养基F12K、培养基199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy氏5A、Leibovitz氏L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth氏MB752/1、CMRL-1066、Williams'培养基E、Brinster氏BMOC-3培养基、E8培养基(Nature Methods，2011,8,424-429)、及这些的混合培养基等。另外，也可使用改变为多能性干细胞培养用的培养基，或上述基础培养基和其他培养基的混合物等。
[0249] 本发明中使用的培养基可再含公知的添加物。作为添加物，只要不抑制多能性干细胞的未分化维持增殖，就不特别限定，可举出例如生长因子(例如胰岛素等)、铁源(例如转铁蛋白等)、聚胺类(例如腐胺等)、矿物(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如硫代二醇酸钠)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、类固醇(例如β-雌二醇、黄体酮等)、抗生物质(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。另外，也可适宜含一直以来多能性干细胞的培养中使用的添加物。添加物优选以各自公知的浓度范围内含。
[0250] 在本发明的培养方法中，可使用饲养细胞，也可不使用。培养再生医疗中使用的细胞时，从移植后的安全性的观点来看，优选为不使用饲养细胞(无饲养层)。不被任何理论约束，本发明的培养方法，由于通常将从饲养细胞分泌到培养基中的乙醇胺添加到培养基，从而在无饲养细胞存在下也可促进多能性干细胞的未分化维持增殖。
[0251] 不使用饲养细胞时，优选为使用细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物进行培养。
[0252] 细胞外基质只要是以改善培养器的表面和细胞的粘接的目的在细胞的培养中通常使用的，就不特别限，例如，可使用层粘连蛋白(层粘连蛋白511、层粘连蛋白332等)、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、粘接胺等的公知的。另外细胞外基质的活性片段只要是有与该细胞外基质同等的细胞粘接活性的片段即可，这些也可使用公知的。例如，可举出特开2011-78370号公报中公开的层粘连蛋白511的E8片段、层粘连蛋白332的E8片段等。细胞外基质及其活性片段可为市售品，例如，可从(Life Technologies、BDFalcon、BioLamina)等得到。这些的细胞外基质及其活性片段也可组合2种以上使用。另外也可使用从过量产生基底膜的小鼠EHS肉瘤提取、纯化的、作为含蛋白质或多糖类的复杂的基底膜成分的混合物的基质胶(商品名)。将细胞外基质及其活性片段悬浮于适当的溶液中，涂布到对于培养细胞适宜的容器即可。
[0253] 模拟细胞外基质的功能的人工物只要是细胞的培养中通常使用的，就不特别限定，例如，可使用康宁公司的Synthemax(注册商标)或Ultra Web(注册商标)、Sigma-Aldrich公司的Hy-STEM系列、聚赖氨酸、聚鸟氨酸等的公知的。
[0254] 本发明中使用的细胞外基质或其活性片段、或者模拟它们的功能的人工物是优选为基质胶、或者层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的活性片段，更优选为层粘连蛋白511的活性片段(即，层粘连蛋白511的E8片段)。
[0255] 在本发明的培养方法中，细胞接种方法不特别限定，集落接种也可为单细胞接种，但为了以产业水平制造再生医疗用的多能性干细胞，有在严密管理顺序及进度的条件下，由多个作业者进行作业的必要。因此，优选为接种的细胞数的严密的调节可能的单细胞接种。
[0256] 进行单细胞接种时，将多能性干细胞的集落解离至单一的细胞后，接种到培养基中。单细胞接种由公知的方法进行即可。例如，用细胞剥离液(胰蛋白酶溶液等)使细胞间粘接、细胞-基质间粘接变弱后，用刮具(IWAKI公司、9000-220等)等将细胞自基质剥下(在此状态下细胞在形成细胞块的状态下悬浮于溶液中，不是完全的单细胞)、其后由移液器吸吐使细胞解离为单细胞之后，接种到培养基即可。在接种时，为了多能性干细胞的生存，优选将Y-27632(NACALAI TESQUE公司：08945-84)等的ROCK抑制剂添加到培养基。ROCK抑制剂由于在接种的次日往后，对于多能性干细胞的增殖不是必要的，所以优选自培养基除去。
[0257] 其他培养条件可适宜设定。例如，培养温度虽不特别限定，但约30～40℃、可优选为约37℃。CO2浓度可为约1～10％、优选为约2～5％。氧分压可为1～10％。
[0258] 在细胞培养中，由培养基成分的劣化、从细胞排出的废旧物的蓄积等的理由，培养中有必要培养基更换，但在本发明的培养方法中，如实施例所示，也可省略培养基更换。例如，可不进行培养基更换而连续培养4天以上(4天、5天、6天等)多能性干细胞。
[0259] 在一实施方式中，本发明提供用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养方法，其包括在培养基中培养多能性干细胞的工序，其中培养基的特征在于，添加有选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且添加有硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。该培养方法中的乙醇胺、乙醇胺类似物及这些的药学可容许的盐、以及硫酸化糖类及其药学可容许的盐的定义与上述同样，这些的使用浓度也以上述为准。另外，关于所述培养方法的其他条件也与上述同样。
[0260] 【多能性干细胞增殖用培养基的保存稳定化方法】
[0261] 本发明另外提供多能性干细胞增殖用培养基的保存稳定化方法(以下也称为本发明的稳定化方法)，其包括添加选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且，添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。
[0262] 在本发明中，培养基的“保存稳定化”是指培养基的保存时(通常、-80℃左右～40℃)的培养基的经时劣化被缓和。其中“培养基的劣化”是指使多能性干细胞未分化维持增殖的功能降低，其程度，如后述的实施例中记载，可通过将多能性干细胞在所述培养基中培养指定期间后，测定细胞数来评价。以使用刚制备好的培养基时作为基准，培养后的细胞数越少，培养基被评价为越劣化。
[0263] 本发明中的多能性干细胞增殖用培养基与上述本发明的培养方法中使用的培养基同样，优选为多能性干细胞的未分化维持增殖用培养基。
[0264] 为了培养基的保存稳定化添加到培养基的，乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐与上述本发明的培养方法中使用的样。向培养基中的添加浓度也与上述本发明的培养方法中的添加浓度同样。通过向培养基添加乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐，可稳定化添加后的培养基。
[0265] 本发明的稳定化方法再包括添加硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐的工序。硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐与上述本发明的培养方法中使用的同样。向培养基中的添加浓度也与上述本发明的培养方法中的添加浓度同样。通过将选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种和硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐组合而添加到培养基，再提高培养基的稳定性是可能的。
[0266] 由本发明，培养基制备后，例如在常温(通常15～25℃左右)保存至8天左右时，可缓和培养基的劣化。因此，相比以往更长期间保存培养基成为可能，本发明在多能性干细胞的制造等中有用。
[0267] 【用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基添加剂】
[0268] 上述本发明的培养方法中添加到基础培养基的成分可作为培养基添加剂。即，本发明提供用于多能性干细胞的未分化维持增殖的培养基添加剂(以下也称为本发明的培养基添加剂)，其含选自乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的至少1种，并且基本上不含β-巯基乙醇或含β-巯基乙醇至使用时的浓度为9μM以下。
[0269] 乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐与在上述本发明的培养方法中使用的同样。
[0270] 本发明的培养基添加剂的向培养基的添加量只要是在使用制备后的培养基在无饲养层的条件下培养时，可在多能性干细胞的未分化维持增殖的促进中发挥作用，就可设定成任意的范围，但添加至培养基中的乙醇胺及乙醇胺类似物以及它们的药学可容许的盐的最终浓度通常是1μM～1000μM、优选为5μM～200μM、或者11μM～200μM即可。
[0271] β-巯基乙醇是如果其浓度高，则被担心有毒性。从而，本发明中使用的β-巯基乙醇的浓度作为使用时的最终浓度是9μM以下。更优选为7μM以下，再优选为5μM以下。还有优选为基本上不含β-巯基乙醇或完全不含。在本申请发明中，即使基本上不含β-巯基乙醇，多能性干细胞也可进行稳定的未分化维持增殖。
[0272] “基本上不含β-巯基乙醇”的定义以上述为准。
[0273] 本发明的培养基添加剂可再含白蛋白、硫酸化糖类及/或其药学可容许的盐。这些与上述本发明的培养方法中使用的同样。
[0274] 本发明的培养基添加剂，根据需要，也可含上述成分以外的其他成分。作为其他成分，可举出培养基的制备时通常使用的添加物，不特别限制，例如，可举出上述本发明的制造方法中使用的培养基中含的添加物。
[0275] 本发明的培养基添加剂可含与培养的细胞不同的种来源的成分，也可不含，在培养再生医疗中使用的人的细胞时，优选为不含人以外的动物来源的成分。
[0276] 通过使用本发明的培养基添加剂，可制备在无血清－无饲养层－单细胞接种培养中也可长期间稳定而未分化维持增殖的培养基。
[0277] 以下，由实施例再详细地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。【实施例】
[0278] 在以下的实施例中，评价由各种被验化合物的人多能性干细胞的增殖效果。作为人多能性干细胞，在无特别言及时，使用从iPSAcademia日本公司购入的人工多能性干细胞(iPS细胞)201B7株。细胞培养使用包被基底膜基质的培养容器(日本Becton Dickinson公司、Falcon培养培养皿或Falcon培养板)，在5％CO2/37℃的条件下进行。
[0279] 向被认为目前用于培养人多能性干细胞的最小组成的“E8”组成(被Nature Methods，2011,8,424-429公开)的培养基以指定的浓度添加各种被验化合物，通过在培养中使用，探讨其效果。培养基使用作为含“E8”组成的Essential 8(Life Technologies公司：A14666SA)制备，或使用调合成同等的组成的制备。
[0280] 【参考例1：白蛋白的培养基稳定化效果】
[0281] 以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)，在制备后立即在培养中使用时和制备后于4℃置3周之后使用时，通过探讨培养后的细胞数来探讨白蛋白的效果。培养期间是1周。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的，含层粘连蛋白511的活性结构域的片段每1孔包被5μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。活细胞数测定用锥虫蓝(Life Technologies公司：15250-061)染色和血细胞计算盘进行。
[0282] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图1。在制备后立即使用时，在白蛋白添加有和无时显示同等的细胞增殖。在使用制备后经过3周的培养基时，在未添加白蛋白的培养基中几乎见不到细胞增殖，与此相比，在添加白蛋白培养基中，确认明确的细胞增殖。从以上的结果知，通过将E8最小组成培养基在通常使用(保存)条件下置3周，引起显著的性能降低，但通过添加白蛋白，可改善那样的劣化现象。从而知，白蛋白贡献于在4℃储存的培养基的稳定化。
[0283] 【实施例1：乙醇胺的增殖促进效果及与白蛋白的组合效果】
[0284] 添加乙醇胺(SIGMA-ALDRICH公司：E0135)至最终浓度成6、30、150、750或3,750μM，制备后立即在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨乙醇胺的效果。培养期间设为1周。另外，为了探讨与白蛋白的组合的效果，向上述乙醇胺添加培养基，再以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)，也进行同样的探讨。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的，含层粘连蛋白511的活性结构域的片段向每1孔包被5μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。活细胞数测定用锥虫蓝(Life Technologies公司：15250-061)染色和血细胞计算盘进行。
[0285] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图2。值作为相对于乙醇胺未添加组(0μM)的平均值的相对值表示。知在乙醇胺，在较宽的浓度域有增殖促进效果。知在高浓度域，相反呈现增殖抑制效果。得知由与白蛋白的组合，乙醇胺的增殖促进效果更增强，在高浓度域也难以呈现增殖抑制效果，显示增殖促进效果。
[0286] 【实施例2：葡聚糖硫酸的效果】
[0287] 向添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)(最终浓度2.6g/l)的培养基单独添加乙醇胺(最终浓度30μM)、再向该培养基添加葡聚糖硫酸钠(和光纯药、最终浓度50ng/ml)，验证由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合的进一步增殖促进效果。进行约3周的培养，其间进行2次继代，算出在全培养期间的累积活细胞增加率。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的，含层粘连蛋白511的活性结构域的片段向每1孔包被5μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。继代时用TrypLETM Select(Life Technologies公司：12563-011)剥离细胞，再向Y-27632添加培养基接种13,000个的活细胞，其次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。活细胞数测定用锥虫蓝(Life Technologies公司：15250-061)染色和血细胞计算盘进行。
[0288] 将在每各培养基中进行连续3次实验的结果的平均值示于图3。得知，相比乙醇胺单独添加的情况，与葡聚糖硫酸钠组合时，细胞增加率更高。
[0289] 另外，在增加率最高的，添加乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的两者的培养基中进行约一个月的培养之后，进行碱性磷酸酶染色，进行未分化能维持的确认。将使用碱性磷酸酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司：86-R)染色的结果示于图4。全体孔的iPS细胞的集落被染色。由此确认，通过在向E8最小组成培养基添加白蛋白、乙醇胺、葡聚糖硫酸钠的培养基中的长期培养，iPS细胞在维持未分化能力的状态下增殖。
[0290] 【实施例3：乙醇胺的增殖促进效果-使用基质胶的培养的结果】
[0291] 添加乙醇胺(SIGMA-ALDRICH公司：E0135)至最终浓度成6、30、150、750或3,750μM，制备后立即在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨乙醇胺的效果。培养期间设为8天。向每1孔单细胞接种100,000个的细胞。作为基底膜基质，包被基质胶(日本Becton Dickinson公司)。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。
[0292] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图5。与实施例1同样地，得到示乙醇胺在宽的浓度域发挥增殖促进效果的结果。从而知，乙醇胺的增殖促进效果不限于使用层粘连蛋白511的培养。
[0293] 【实施例4：乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合效果-使用基质胶的培养的结果】
[0294] 【(1)在含白蛋白的培养基的效果】
[0295] 各自制备在Essential8中含人血清来源白蛋白(最终浓度2.6g/l)及乙醇胺(最终浓度30μM)的培养基(对照)、以及向其添加葡聚糖硫酸钠至成指定的浓度的培养基，验证乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合效果。培养期间设为6～12天。单细胞接种时，向包被基质胶的12孔培养板在每1孔接种40,000个的细胞。在接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度
10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。在集落状态下接种时，向包被基质胶的6孔培养板在每1孔接种成为原来的培养的2.5～3.5倍稀释的细胞。此时，不向接种时使用的培养基添加Y-27632。每2～3天进行培养基更换。
10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。在集落状态下接种时，向包被基质胶的6孔培养板在每1孔接种成为原来的培养的2.5～3.5倍稀释的细胞。此时，不向接种时使用的培养基添加Y-27632。每2～3天进行培养基更换。
[0296] 细胞增殖的评价基准如下。
[0297] ◎：细胞数相对于对照的细胞数是120％以上
[0298] ○：细胞数相对于对照的细胞数是不足100％以上120％
[0299] -：细胞数相对于对照的细胞数是不足50％以上100％
[0300] ×：细胞数相对于对照的细胞数是50％以下
[0301] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果示于表1。在添加葡聚糖硫酸钠的一方见到高的细胞增殖。从而知，由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合的细胞增殖促进效果也不限于使用层粘连蛋白511的培养。另外，在集落状态下接种的时也显示本效果，得知不限于单细胞接种时。
[0302] 【表1】
[0303]
[0304] 【(2)可省略培养基更换的效果】
[0305] 在上述(1)的评价中，不用添加葡聚糖硫酸钠(最终浓度10ng/ml)的培养基进行培养基更换而进行培养，通过将乙醇胺和葡聚糖硫酸钠组合而添加到培养基来验证是否可省略培养基更换。培养期间设为6天。
[0306] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果示于图6。不进行培养基更换时，在添加葡聚糖硫酸钠的一方见到高的细胞增殖。其效果与用不含葡聚糖硫酸钠的培养基培养基更换的情况接近。从而知，由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合，有可省略培养基更换的效果。
[0307] 【(3)不含白蛋白在的培养基的稳定化效果】
[0308] 各自制备向Essential8单独添加乙醇胺(最终浓度30μM)的培养基、添加乙醇胺(最终浓度30μM)及葡聚糖硫酸钠(和光纯药、最终浓度50ng/ml)的培养基、单独添加人血清来源白蛋白(最终浓度2.6g/l)的培养基，验证由乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合的培养基稳定化效果。制备各培养基后在常温放置8天后，在培养中使用。培养期间设为8天。向包被基质胶的6孔培养板在每1孔单细胞接种100,000个的细胞。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。
[0309] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图7。添加乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的两者时的效果与添加白蛋白时等同。从而知，乙醇胺和葡聚糖硫酸钠的组合，除了有在常温的培养基的稳定化效果，还有可代替或削减培养基中广泛使用的白蛋白的可能性。
[0310] 【实施例5：乙醇胺类似物的效果】
[0311] 【(1)O-磷酰乙醇胺(别名磷酸乙醇胺)的效果】
[0312] 向以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)的培养基添加O-磷酰乙醇胺(SIGMA-ALDRICH公司：P0503-25G)至最终浓度成6、30、150或750μM，制备次日起在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨O-磷酰乙醇胺的效果。培养期间设为1周。每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，每1孔包被4.8μg由大阪大学购入的，含层粘连蛋白511的活性结构域的片段。在接种时使用的培养基中添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后在不添加Y-27632的培养基中培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
[0313] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图8。值作为相对于O-磷酰乙醇胺未添加组(0μM)的平均值的相对值表示。知在O-磷酰乙醇胺中在比较宽范围的浓度域有增殖促进效果。
[0314] 【(2)2-(甲基氨基)乙醇的效果】
[0315] 向以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)的培养基添加2-(甲基氨基)乙醇(SIGMA-ALDRICH公司：471445-25ML)至最终浓度成6、30、150或750μM，制备次日起在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨2-(甲基氨基)乙醇的效果。培养期间设为1周。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的含层粘连蛋白511的活性结构域的片段在每1孔包被4.8μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-
27632的培养基而进行培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
27632的培养基而进行培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
[0316] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图9。值作为相对于2-(甲基氨基)乙醇未添加组(0μM)的平均值的相对值表示。得知，在2-(甲基氨基)乙醇中，在比较宽范围的浓度域有增殖促进效果。
[0317] 【(3)2-二甲基氨基乙醇的效果】
[0318] 向以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)的培养基添加2-二甲基氨基乙醇(SIGMA-ALDRICH公司：471453-100ML)至最终浓度成6、30、150或750μM，制备次日起在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨2-二甲基氨基乙醇的效果。培养期间设为1周。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的含层粘连蛋白511的活性结构域的片段在每1孔包被4.8μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-
27632的培养基而进行培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
27632的培养基而进行培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
[0319] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图10。值作为相对于2-二甲基氨基乙醇未添加组(0μM)的平均值的相对值表示。得知，在2-二甲基氨基乙醇中，在比较宽范围的浓度域显示增殖促进效果，但在高浓度域呈现增殖抑制效果。
[0320] 【(4)乙醇胺盐酸盐的效果】
[0321] 向以最终浓度2.6g/l添加人血清来源白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司：A1887)的培养基添加乙醇胺盐酸盐(东京化成公司：A0298)至最终浓度成6、30、150或750μM，制备次日起在培养中使用，通过探讨培养后细胞数来探讨乙醇胺盐酸盐的效果。培养期间设为1周。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的含层粘连蛋白511的活性结构域的片段在每1孔包被4.8μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。
活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
[0322] 将在每各培养基中连续进行3次实验的结果的平均值示于图11。值作为相对于乙醇胺盐酸盐未添加组(0μM)的平均值的相对值表示。得知，在乙醇胺盐酸盐中，在比较宽范围的浓度域有增殖促进效果。
[0323] 【实施例6：油酸的影响】
[0324] 向人血清白蛋白(Nova Biologics公司)的生理盐水溶液(25％)40ml加40ml磷酸缓冲液(pH7.2)。再将预先于200℃加热30分钟的活性炭(5g、和光纯药公司制)用磷酸缓冲液20ml悬浮的液加至100ml。于4℃搅拌3小时后，于4℃以11,900rpm离心分离20分钟。将沉降的活性炭倾倒除去，将反应液用0.22μm的注射器滤器过滤。如此得到脱脂肪酸处理的人血清白蛋白。接下来，通过向得到的脱脂肪酸处理的人血清白蛋白添加油酸，制备人血清来源白蛋白至脂肪酸负载量成2.2、6.5、21.7mg/g，将各白蛋白向培养基添加至最终浓度成2.6g/l(此时的培养基中的油酸的最终浓度各自成20、60、200μM)。在各培养基添加乙醇胺(最终浓度30μM)。使用各培养基将细胞培养1周，通过确认培养后的细胞数来探讨油酸的影响。向每1孔单细胞接种13,000个的活细胞。作为基底膜基质，将从大阪大学购入的含层粘连蛋白511的活性结构域的片段在每1孔包被4.8μg。向接种时使用的培养基添加Y-27632(最终浓度10μM、NACALAI TESQUE公司：08945-84)。次日往后不添加Y-27632的培养基而进行培养。活细胞数测定使用生死细胞自动分析仪ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER公司)进行。
[0325] 将使用各培养基培养的结果示于图12。得知，伴随白蛋白的油酸负载量增加而细胞增殖被抑制。
[0326] 【工业实用性】
[0327] 由本发明因为可使多能性干细胞稳定有效增殖，可在无血清－无饲养层－单细胞接种培养中也长期间稳定而未分化维持增殖，从而在再生医疗等的领域中有用。
[0328] 本申请以在日本申请的特愿2013-016592(申请日：2013年1月31日)作为基础，其内容全部包含在本说明书中。
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