一种苹果多酚乙醇提取物及其制备方法和应用
阅读：531发布：2023-02-06
专利汇可以提供一种苹果多酚乙醇提取物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种苹果多酚 乙醇 提取物，包括 绿原酸 0.8～1.5％，咖啡酸1.0～1.6％，表 儿茶素 0.3～0.8％，5-O-对香豆酰 奎尼酸 3～4％，4-O-对香豆酰奎尼酸5.5～6.5％，对香豆酸0.5～1.0％，1-O-咖啡酰奎尼酸甲酯0.3～1.2％，4-O-对香豆酰奎尼酸甲酯0.3～0.9％，3-羟基根皮素-2′木糖 葡萄糖 苷3.0～4.0％，羟基根皮苷1.2～2.0％，根皮素-2′木糖葡萄糖苷15～18％，根皮素-2′木糖半乳糖苷2.0～3.0％，根皮苷20～26％，根皮素0.2～0.8％。本发明还提供了苹果多酚乙醇提取物的制备方法和应用。本发明具有抑制体重、保护胰岛细胞、降血糖的效果。，下面是一种苹果多酚乙醇提取物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种苹果多酚乙醇提取物，其特征在于，按重量百分比计，所述苹果多酚乙醇提取物包含绿原酸(chlorogenic acid)0.8～1.5％，咖啡酸(caffeic acid acid)1.0～
1.6％，表儿茶素(epicatechin)0.3～0.8％，5-O-对香豆酰奎尼酸(5-O-p-coumaric acyl quinic acid)3～4％,4-O-对香豆酰奎尼酸(4-O-p-coumaric acyl quinic acid)5.5～6.5％，对香豆酸(p-coumaric acid)0.5～1.0％,1-O-咖啡酰奎尼酸甲酯(1-O-Caffeoylquinic acid methyl ester)0.3～1.2％，4-O-对香豆酰奎尼酸甲酯(4-O-p-coumaric acyl quinic acid methyl ester)0.3～0.9％，3-羟基根皮素-2′木糖葡萄糖苷(3-Hydroxyphloretin-2'-xyloglucoside)3.0～4.0％，羟基根皮苷(3-hydroxy phloridzin)1.2～2.0％，根皮素-2′木糖葡萄糖苷(phloretin-2’-xylglucoside)15～
18％，根皮素-2′木糖半乳糖苷(Phloretin-2'-xylogalactoside)2.0～3.0％，根皮苷(phloridzin)20～26％，根皮素(phloretin)0.2～0.8％。
2.如权利要求1所述的苹果多酚乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤为：
1)将6质量份数的苹果多酚溶解分散于80-100质量份数的水中；
2)将步骤1)得到的溶液通过大孔树脂柱色谱层析，以0.3～0.7柱保留体积/小时的流速上样，相继用水、体积比分别为30％、50％以及90％的乙醇水溶液各洗脱4～6柱保留体积，洗脱流速为1～1.5柱保留体积/小时，获得体积比为50％的乙醇水溶液的洗脱液；
3)将所述体积比为50％的乙醇水溶液的洗脱液真空干燥至红色粉末，即得到苹果多酚乙醇提取物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的苹果多酚是通过包括以下步骤的方法制备的：
将苹果洗净、切碎，并浸泡于浓度为0.01g/ml维生素C的水溶液中，破碎后用60％乙醇水溶液60℃浸提2h，每批提取两次，合并提取液，真空浓缩干燥，最后得苹果多酚粗体物。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述大孔树脂为二苯乙烯类大孔树脂，优选地选自HP20、D101、AB-8中的一种。
5.如权利要求2～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述50％乙醇洗脱液在
60℃、真空度低于0.09MPa的条件下减压浓缩至糖度为25～35，然后喷雾干燥并过药筛；
优选地，所述药筛为80～100目药筛。
6.如权利要求1所述的苹果多酚乙醇提取物在制备提高胰岛细胞活性和促进胰岛细胞增殖的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的苹果多酚乙醇提取物在制备保护胰岛细胞抵御氧化损伤的药物中的应用。
8.如权利要求1所述的苹果多酚乙醇提取物在制备预防和/或治疗糖尿病的中的用途。
9.一种用于预防和/或治疗糖尿病的药物组合物，其包含如权利要求1所述的苹果多酚乙醇提取物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上上可接受的辅料和/或其它预防和/或治疗糖尿病的药物。
一种苹果多酚乙醇提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及苹果多酚，特别涉及苹果多酚乙醇提取物的制备方法及其在制备降血糖药物或食品中的应用。
背景技术
[0002] 随着生活水平的提高和老龄人口的急剧增加，慢性病已成为城乡居民死亡的主要原因。目前，我国居民成人超重率为22.8％，肥胖率为7.1％，血脂异常、高血压、糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率分别为18.6％、18.8％、2.6％，特别是近20年内DM患者数增加了近3倍。胰岛β细胞能合成、储存和释放胰岛素，胰岛素在调节物质代谢稳态中具有重要的生理意义。胰岛β细胞损伤可造成胰岛素分泌障碍，引起糖、脂、蛋白质代谢的紊乱，最终导致DM。胰岛素的绝对或相对不足或胰岛素抵抗是DM的主要病理基础，若胰岛素的功能受阻、分泌不足，或两者同时存在缺陷，均可导致血糖增高。因此，对胰岛细胞保护的研究，具有重要的理论和实践意义。胰岛素是预防DM及其并发症的最佳选择。
发明内容
[0003] 本发明目的在于提供一种用于制备降血糖药物或食品的苹果多酚乙醇提取物，研究发现本发明提供的苹果多酚乙醇提取物对H2O2损伤的胰岛细胞的保护作用，从而为糖尿病患者的治疗提供更科学有效的活性物质。
[0004] 本发明提供了一种苹果多酚乙醇提取物，按重量百分比计，所述苹果多酚乙醇提取物包含绿原酸(chlorogenic acid)0.8～1.5％，咖啡酸(caffeic acid acid)1.0～1.6％，表儿茶素(epicatechin)0.3～0.8％，5-O-对香豆酰奎尼酸(5-O-p-coumaric acyl quinic acid)3～4％,4-O-对香豆酰奎尼酸(4-O-p-coumaric acyl quinic acid)5.5～6.5％，对香豆酸(p-coumaric acid)0.5～1.0％,1-O-咖啡酰奎尼酸甲酯(1-O-Caffeoylquinic acid methyl ester)0.3～1.2％，4-O-对香豆酰奎尼酸甲酯(4-O-p-coumaric acyl quinic acid methyl ester)0.3～0.9％，3-羟基根皮素-2′木糖葡萄糖苷(3-Hydroxyphloretin-2'-xyloglucoside)3.0～4.0％，羟基根皮苷(3-hydroxy phloridzin)1.2～2.0％，根皮素-2′木糖葡萄糖苷(phloretin-2’-xylglucoside)15～
18％，根皮素-2′木糖半乳糖苷(Phloretin-2'-xylogalactoside)2.0～3.0％，根皮苷(phloridzin)20～26％，根皮素(phloretin)0.2～0.8％，此外还含有其他不明酚酸类成分(30～38％)。
18％，根皮素-2′木糖半乳糖苷(Phloretin-2'-xylogalactoside)2.0～3.0％，根皮苷(phloridzin)20～26％，根皮素(phloretin)0.2～0.8％，此外还含有其他不明酚酸类成分(30～38％)。
[0005] 本发明还提供了上述苹果多酚乙醇提取物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
[0006] 1)将6质量份数的苹果多酚溶解分散于80-100质量份数的水中；
[0007] 2)将步骤1)得到的溶液通过大孔树脂柱色谱层析，以0.3～0.7柱保留体积/小时(BV/h)的流速上样，相继用水、以及体积比分别为30％、50％和90％的乙醇水溶液各洗脱4～6柱保留体积(BV)，洗脱流速为1～1.5柱保留体积/小时(BV/h)，获得体积比为50％的乙醇水溶液的洗脱液；
[0008] 3)将所述体积比为50％的乙醇水溶液的洗脱液真空干燥至红色粉末，即得到苹果多酚乙醇提取物。
[0009] 在根据本发明的一个实施方式中，步骤1)中所述的苹果多酚是通过包括以下步骤的方法制备的：将苹果洗净、切碎，并浸泡于浓度为0.01g/ml的维生素C的水溶液中，破碎后用体积比为60％的乙醇水溶液60℃下浸提2h，每批提取两次，合并提取液，真空浓缩干燥，最后得苹果多酚。
[0010] 在根据本发明的一个实施方式中，步骤2)中所述大孔树脂为二苯乙烯类大孔树脂，优选地选自HP20、D101或AB-8中的一种。
[0011] 在根据本发明的一个实施方式中，步骤3)中所述体积比为50％的乙醇水溶液的洗脱液以60℃、真空度低于0.09MPa的条件下减压浓缩至糖度为25～35，然后喷雾干燥至红色粉末并过药筛；优选地，所述药筛为80～100目药筛。
[0012] 本发明还提供了所述苹果多酚乙醇提取物在制备提高胰岛细胞活性和促进胰岛细胞增殖的药物中的应用。
[0014] 进一步地，本发明还提供了所述苹果多酚乙醇提取物在制备预防和/或治疗糖尿病的中的用途。
[0015] 另一方面，本发明还包括一种用于预防和/或治疗糖尿病的药物组合物，其包含如上所述的苹果多酚乙醇提取物。优选地，所述药物组合物还包含药学上上可接受的辅料和/或其它预防和/或治疗糖尿病的药物。
[0016] 苹果多酚组分具有调节血糖的作用，但是，尚无苹果多酚乙醇提取物对胰岛细胞保护方面的作用机制的文献报道。本发明的发明人发现苹果多酚的体积比50％的乙醇水溶液的提取物(AP-50)对H2O2损伤的胰岛细胞的保护作用，尤其是对胰岛β细胞具有保护作用。对于多次给予链脲佐菌素(multiple low-dose streptozotocin,MLDS)诱导的糖尿病模型，AP-50提取物可抑制小鼠体重增长，并有剂量依赖性。口服葡萄糖耐量实验与口服淀粉耐量实验，表明AP-50提取物可以改善进餐后血糖，且具有剂量依赖性。AP-50提取物对MLDS诱导的糖尿病小鼠有促进胰岛素分泌的作用，且其作用明显优于苹果多酚。留取肾脏HE染色，发现AP-50提取物对MLDS诱导的糖尿病小鼠的肾损伤有一定的保护作用。综上所述，本发明的苹果多酚乙醇提取物可以通过抑制体重增加，保护胰岛细胞，促进体内胰岛素分泌等方面发挥降血糖功效。附图说明
[0017] 图1苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物对胰岛RIN-m5Fβ细胞的促增殖作用的柱形图。其中，注:“*”表示与空白对照组相比，p<0.05；“**”表示与空白对照组相比，p<0.01。
[0018] 图2A和图2B是苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物对H2O2损伤胰岛RIN-m5Fβ细胞的保护作用的柱形图。其中，与空白对照组比较，**：P<0.01,*：P<0.05。
[0019] 图3A是本发明的苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提物物的蛋白相对含量柱状图。
[0020] 图3B是Western blotting分析H2O2损伤胰岛RIN-m5Fβ细胞后Akt、caspase-3蛋白的表达情况。
[0021] 图4是通过AO/EB染色观察本发明的苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物对细胞形态的影响。其中A为苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物(50μg/ml)组；B为苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物(10μg/ml)组；C为苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提物(2μg/ml)组；D为苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物(0.4μg/ml)组；E为阴性对照组；F为空白对照组。
[0022] 图5是对本发明的苹果多酚的体积比为50％的乙醇水溶液的提取物的成分进行分析的HPLC图谱。
[0023] 图6为苹果多酚及其提取物对糖尿病小鼠模型体重的影响。
[0024] 图7为苹果多酚及其提取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响。
[0025] 图8为苹果多酚及其提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响。
[0026] 图9为苹果多酚及其提取物对糖尿病小鼠口服淀粉耐量的影响。
[0027] 图10为AP-50提取物对糖尿病小鼠胰岛素的影响。
[0028] 图11为AP-50提取物对糖尿病小鼠肾脏指数变化的影响。
[0029] 图12为AP-50提取物对糖尿病小鼠肾脏病理变化的影响。
具体实施方式
[0030] 为了更好地说明本发明的技术方案，现结合附图和实施例进一步阐述本发明，应当理解，本发明的具体实施例仅是用于说明目的，而非对本发明的限制。
[0031] 实施例1苹果多酚的提取方法
[0032] 本发明使用的苹果多酚购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司(批号：1310019-14，多酚，81.8％；绿原酸，15.3％；原花青素B2，6.36％；根皮苷，5.12％)。苹果多酚也可以通过下述方法提取获得：
[0033] 将苹果洗净、切碎，称取50Kg浸泡于浓度为0.01g/ml的维生素C的水溶液中，破碎后用体积比为60％和乙醇水溶液60℃浸提2h，每批提取两次，合并提取液，真空浓缩干燥，最后得苹果多酚粗体物200g(经Folin-Ciocalteu比色法检测，总多酚含量占提取物总量的80％)。
[0034] 实施例2苹果多酚醇提物的制备
[0035] 将6质量分数的苹果多酚(多酚，81.8％；绿原酸，15.3％；原花青素B2，6.36％；根皮苷，5.12％；批号：1310019-14，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司)。用80～
100的质量份数的水进行溶解分散，进行大孔树脂柱色谱层析，采用的树脂有HP 20、D101、AB-8等二苯乙烯类大孔树脂。树脂层析柱的上样流速为0.3～0.7BV/h，然后树脂柱用水、体积比分别为30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液和90％乙醇水溶液各洗脱4～6BV(柱保留体积)，洗脱流速分别1～1.5BV/h，30％乙醇水溶液洗脱部位、50％乙醇水溶液洗脱部分和90％乙醇水溶液洗脱部位分别收集后各自在温度60度，真空度为低于0.09MPa进行减压浓缩至糖度为25-35，进行喷雾干燥，产品过80-100目药筛，得到苹果多酚30％醇提物(AP-30)、50％醇提物(AP-50)和90％醇提物(AP-90)。
100的质量份数的水进行溶解分散，进行大孔树脂柱色谱层析，采用的树脂有HP 20、D101、AB-8等二苯乙烯类大孔树脂。树脂层析柱的上样流速为0.3～0.7BV/h，然后树脂柱用水、体积比分别为30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液和90％乙醇水溶液各洗脱4～6BV(柱保留体积)，洗脱流速分别1～1.5BV/h，30％乙醇水溶液洗脱部位、50％乙醇水溶液洗脱部分和90％乙醇水溶液洗脱部位分别收集后各自在温度60度，真空度为低于0.09MPa进行减压浓缩至糖度为25-35，进行喷雾干燥，产品过80-100目药筛，得到苹果多酚30％醇提物(AP-30)、50％醇提物(AP-50)和90％醇提物(AP-90)。
[0036] 实施例3苹果多酚体积比为50％的乙醇水溶液提物物的活性确定
[0037] 1、仪器与材料
[0038] 低速自动平衡离心机(河北省安新县离心机厂)，Model 680酶标仪(Bio-RAD公司)，恒温培养箱(常州朗越仪器制造有限公司)，FA1204B型电子天平(上海爱朗公司)，微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器厂)，电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)，4℃离心机3-30K型(Sigma)，荧光显微镜CKX41型(OLYMPUS)，DYY-4C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。
[0039] RIN-m5F胰岛β细胞(由中国科学院中国协和医科大学药物研究所提供)，苹果多酚(多酚，81.8％；绿原酸，15.3％；原花青素B2，6.36％；根皮苷，5.12％；批号：1310019-14，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司)，RPMI 1640培养液(北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(浙江四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，PBS(北京索莱宝科技有限公司)，MTT(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，AO/EB双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司)，30％H2O2溶液(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限责任公司)
[0040] MTT法测苹果多酚50％醇提物对胰岛RIN-m5Fβ细胞增殖作用
[0041] 胰岛RIN-m5Fβ细胞用含10％胎牛血清的RIPM培养液培养，在培养瓶中长满至4
单层后，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1.0×10个细胞接种于96孔板中，每孔加100μL，并设不含药物的空白调零孔，在5％CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养
24h后，每孔分别加100μl不同浓度苹果多酚、苹果多酚30％醇提物、50％醇提物和90％醇提物的样品溶液，每个浓度设置3个平行孔，培养24h后倒置显微镜拍片观察。然后每孔加入浓度为5mg/L的MTT 20μl，常规孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物溶解充分均匀，用酶标仪490nm处比色，测其各自的OD值，计算细胞增殖率，实验结果重复三次。
单层后，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1.0×10个细胞接种于96孔板中，每孔加100μL，并设不含药物的空白调零孔，在5％CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养
24h后，每孔分别加100μl不同浓度苹果多酚、苹果多酚30％醇提物、50％醇提物和90％醇提物的样品溶液，每个浓度设置3个平行孔，培养24h后倒置显微镜拍片观察。然后每孔加入浓度为5mg/L的MTT 20μl，常规孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物溶解充分均匀，用酶标仪490nm处比色，测其各自的OD值，计算细胞增殖率，实验结果重复三次。
[0042] 结果如表1所示，显示苹果多酚和苹果多酚50％乙醇提物有效促进胰岛细胞增殖，且苹果多酚50％乙醇提物作用优于苹果多酚，具有显著性差异(P<0.05)。
[0043] 表1苹果多酚各极性部位对胰岛细胞促增殖作用比较
[0044]
[0045]
[0046] 实施例4动物模型试验确定AP-50的降血糖作用效果
[0047] 苹果多酚降血糖有效部位的确定
[0048] 建立多次低剂量链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型：ICR小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(40mg·Kg-1)，一周后血糖大于200mg·dL-1的动物为造模成功
[0049] 分组与给药：将合格的小鼠随机分为4组：苹果多酚：AP 30组，AP50组，AP 90组-1(灌胃给药，各组药物给药剂量为1.5g·Kg ·d)；糖尿病模型对照组(ig等体积的蒸馏水)，连续给药7天。
[0050] 血糖的测定：最后一次给药2小时后，从小鼠尾静脉取血0.2ml，待血液凝固析出血清后，3500r·min-1离心15min，取血清10μl，按葡萄糖试剂盒的GOD-POD法测空腹血糖值。结果见表2。
[0051] 表2苹果多酚各极性部位对STZ诱导的糖尿病鼠的影响
[0052]
[0053] 由结果可知，与对照组对比，苹果多酚AP90组血糖值升高，苹果多酚AP30组血糖值略有降低，苹果多酚AP 50组和苹果多酚组的血糖值都明显下降，有显著性差异(P＜0.05)，说明苹果多酚AP 50在给药2h后对小剂量链脲菌素诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠具有很好的降血糖作用，苹果多酚AP 50组作用效果优于苹果多酚组，说明通过分离后，活性成分集中在AP-50中。
[0054] 实施例5苹果多酚50％醇提物对胰岛细胞促增殖作用
[0055] 1、仪器与材料
[0056] 低速自动平衡离心机(河北省安新县离心机厂)，Model 680酶标仪(Bio-RAD公司)，恒温培养箱(常州朗越仪器制造有限公司)，FA1204B型电子天平(上海爱朗公司)，微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器厂)，电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)，4℃离心机3-30K型(Sigma)，荧光显微镜CKX41型(OLYMPUS)，DYY-4C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。
[0057] 胰岛RIN-m5Fβ细胞(由中国科学院中国协和医科大学药物研究所提供)，苹果多酚(多酚，81.8％；绿原酸，15.3％；原花青素B2，6.36％；根皮苷，5.12％；批号：1310019-14，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司)，RPMI 1640培养液(北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(浙江四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，PBS(北京索莱宝科技有限公司)，MTT(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，AO/EB双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司)，30％H2O2溶液(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限责任公司)
[0058] 2、实验方法
[0059] 2.1根据实施例2记载的方法制备苹果多酚50％醇提物
[0060] 2.2MTT法测苹果多酚50％醇提物对胰岛RIN-m5Fβ细胞增殖作用
[0061] 胰岛RIN-m5Fβ细胞用含10％胎牛血清的RIPM培养液培养，在培养瓶中长满至4
单层后，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1.0×10个细胞接种于96孔板中，每孔加100μL，并设不含药物的空白调零孔，在5％CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养
24h后，每孔加100μl不同浓度苹果多酚50％醇提物的样品溶液，每个浓度设置3个平行孔，培养24h后倒置显微镜拍片观察。然后每孔加入浓度为5mg/L的MTT 20μl，常规孵育
4h。吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物溶解充分均匀，用酶标仪490nm处比色，测其各自的OD值，计算细胞增殖率，实验结果重复三次。
单层后，2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1.0×10个细胞接种于96孔板中，每孔加100μL，并设不含药物的空白调零孔，在5％CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养
24h后，每孔加100μl不同浓度苹果多酚50％醇提物的样品溶液，每个浓度设置3个平行孔，培养24h后倒置显微镜拍片观察。然后每孔加入浓度为5mg/L的MTT 20μl，常规孵育
4h。吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物溶解充分均匀，用酶标仪490nm处比色，测其各自的OD值，计算细胞增殖率，实验结果重复三次。
[0062] 2.3苹果多酚50％醇提物对H2O2作用下胰岛RIN-m5Fβ细胞保护作用
[0063] 胰岛RIN-m5Fβ细胞接种于96孔板方法同上，加入不同浓度苹果多酚50％醇提物的培养液后，培养24h后，每孔加入100uM H2O2，并设不含药物但加H2O2的阴性对照组，在5％CO2、37℃饱和湿度的恒温培养箱中培养24h后，然后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，常规孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物溶解充分均匀，用酶标仪490nm处比色，测其各自的OD值，计算细胞活力，实验结果重复三次。
[0064] 2.4苹果多酚50％醇提物对100μM H2O2诱导的胰岛RIN-m5Fβ细胞凋亡的影响[0065] 胰岛RIN-m5Fβ细胞接种于6孔板方法同上，只是每孔加4.0×105个胰岛RIN-m5Fβ细胞，加入不同浓度苹果多酚50％醇提物培养24h后，每孔加入100μM H2O22ml，并设不含药物但加H2O2的阴性对照组，在5％CO2、37℃，饱和湿度的恒温培养箱中培养24h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。收集细胞，细胞经多肽处理24h后，用于提取蛋白，进行western blot，分析细胞中与凋亡密切相关的Akt和caspase-3的变化。
[0066] 2.5AO/EB双染检测胰岛RIN-m5Fβ细胞凋亡
[0067] 胰岛RIN-m5Fβ细胞接种于24孔板处理方法同上，取100μL试剂C加900μL无5
菌去离子水稀释，混均即成染色缓冲液，收集样本细胞，细胞数量1.5.×10个，用PBS洗涤细胞两次，用500μL染色缓冲液将细胞重悬，加入5μL AO染色液A，加入5μL EB染色液B，轻轻混均后4℃避光孵育20min，用PBS洗涤细胞，用荧光显微镜488nm激发波长下观察细胞形态、拍照。
菌去离子水稀释，混均即成染色缓冲液，收集样本细胞，细胞数量1.5.×10个，用PBS洗涤细胞两次，用500μL染色缓冲液将细胞重悬，加入5μL AO染色液A，加入5μL EB染色液B，轻轻混均后4℃避光孵育20min，用PBS洗涤细胞，用荧光显微镜488nm激发波长下观察细胞形态、拍照。
[0068] 2.6统计学处理
[0070] 3、结果
[0071] 3.1苹果多酚50％醇提物对胰岛RIN-m5Fβ细胞增殖作用
[0072] 如图1所示，经苹果多酚50％醇提物作用后，胰岛RIN-m5Fβ细胞活性(ODMTT值)显著增加，苹果多酚50％醇提物组(50、10、2、0.4、0.08μg/ml)均能够显著促进胰岛RIN-m5Fβ细胞增殖，且呈浓度依赖性(图1)，说明苹果多酚50％醇提物对胰岛RIN-m5Fβ细胞有很好的保护作用。
[0073] 3.2苹果多酚50％醇提物对H2O2损伤胰岛RIN-m5Fβ细胞保护作用
[0074] 由图2可见，经H2O2损伤细胞的阴性对照组与空白组比较胰岛RIN-m5Fβ细胞活性(ODMTT值)显著下降，苹果多酚50％醇提物组(50、10、2、0.4、0.08μg/ml)与阴性对照组比较均能够显著保护胰岛RIN-m5Fβ细胞，说明苹果多酚50％醇提物对H2O2损伤胰岛RIN-m5Fβ细胞有很好的保护作用。
[0075] 3.3苹果多酚50％醇提物对100μM H2O2诱导的胰岛RIN-m5Fβ细胞凋亡的影响[0076] 用Western blotting法检测苹果多酚50％醇提物对H2O2损伤胰岛RIN-m5Fβ细胞Akt蛋白水平的增加、caspase-3蛋白水平的降低。检测结果(如图3A、图3B所示)表明，苹果多酚50％醇提物与阴性对照比较Akt蛋白表达水平(p<0.01)，苹果多酚50％醇提物与阴性对照比较caspase-3蛋白表达水平(p<0.05)。
[0077] 3.4苹果多酚50％醇提物对AO/EB染色下细胞形态的影响
[0078] 如图4所示，显示了苹果多酚50％乙醇提物对RIN-m5Fβ胰岛细胞受到H2O2损伤的保护作用。细胞在给予不同浓度的AP-50提取物共同培育24h后，加入H2O2处理24h后用AO/EB双染，在荧光显微镜下观察，(A)为空白对照组，细胞核边缘整齐，荧光均匀；(B)H2O2处理对照组细胞核致密浓染，或有明显的碎片，荧光染色发橘黄，呈现典型的凋亡学形态改变；(C)AP-50提取物组(给药量为50μg/mL)；(D)AP-50提取物组(给药量为10μg/mL)；(E)AP-50提取物组(给药量为2μg/mL)；(F)AP-50提取物组(给药量为0.4μg/mL)。给予苹果多酚50％醇提物处理组的细胞较H2O2处理对照组，细胞核形态有所改善，凋亡细胞明显减少，正常细胞明显增多，显示了不同程度的细胞保护作用，且呈现量效依赖关系，说明其对于过氧化氢损伤的胰岛细胞具有细胞保护作用。
[0079] 4、讨论
[0080] 本发明中，一定浓度的苹果多酚50％醇提物干预后可提高H2O2诱导的胰岛RIN-m5F细胞活性，并且对正常胰岛RIN-m5F细胞活性和增殖有明显作用。随着苹果多酚50％醇提物浓度的增加，胰岛RIN-m5F细胞Akt基因的表达逐渐增加，而caspase-3基因的表达逐渐降低，说明苹果多酚50％醇提物的抗凋亡作用缘于其对凋亡相关基因的调控作用。由此可见，一定浓度的苹果多酚50％醇提物能保护胰岛RIN-m5F细胞抵御氧化损伤。
[0081] 综上所述，氧化损伤是糖尿病的重要病理机制，氧化损伤可导致胰岛细胞凋亡，苹果多酚50％醇提物对体外RIN-m5F细胞的氧化损伤有保护作用，与提高Akt基因，降低caspase-3基因有关，将有助于糖尿病包括自身免疫性糖尿病的治疗药物的开发。
[0082] 实施例6苹果多酚AP 50组和苹果多酚组降血糖作用比较
[0083] 1.糖尿病模型的建立：
[0084] 建立多次低剂量链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠模型：ICR小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(40mg·Kg-1)，一周后血糖大于200mg·dL-1的动物为造模成功
[0085] 2.糖尿病小鼠模型实验分组与给药
[0086] 给药将造模成功的小鼠随机分为6组(每组8只)：苹果多酚组(AP,苹果多酚给药剂量为1.5g/kg·d)；AP-50提取物高剂量组(1.2g/kg(AP-50),AP-50提取物高剂量为1.2g/kg·d)；AP-50提取物中剂量组(0.8g/kg(AP-50),AP-50提取物中剂量为800mg/kg·d)；AP-50提取物低剂量组(0.4g/kg(AP-50),AP-50提取物低剂量为400mg/kg·d)；阳性药二甲双胍组(metformin,MET,二甲双胍给药剂量为250mg/kg·d)；糖尿病模型对照组(diabetic control,DBC,等体积的蒸馏水)，并选择同一批次的小鼠作为空白对照组(normal control,NC)给予等体积的蒸馏水。
[0087] 3.试验结果
[0088] 3.1实验动物体重的变化
[0089] 记录小鼠的体重变化，发现苹果多酚有抑制体重(body weight,BW)的作用。如图6所示，与空白对照组、模型对照组比较，苹果多酚、AP-50提取物有减轻体重的作用。苹果多酚组，开始一周内，体重迅速下降，然后维持于较低的水平，AP-50提取物高、中剂量组，开始时，体重迅速下降，然后略有回升，维持于一稳定水平。而二甲双胍阳性药组没有减轻体重的作用。整体结果显示AP-50高剂量组给药量低于苹果多酚组，且药效优于苹果多酚组。
[0090] 3.2AP-50提取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
[0091] 给药一周后，检测空腹血糖。由图7显示，与模型对照组比较，空白对照组糖尿病ICR小鼠血糖有显著性差异，说明糖尿病ICR小鼠造模成功。与模型对照组相比，苹果多酚组、AP-50提取物高、中、低剂量组、二甲双胍组血糖值明显下降，有显著性差异(P＜0.01or0.05)，说明二甲双胍、苹果多酚组、AP-50提取物高、中、低剂量组在给药2h后对低剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病ICR鼠具有良好的降血糖作用，并且AP-50提取物有剂量依赖性。
在0h时，二甲双胍、苹果多酚组、AP-50提取物高、中剂量组血糖与模型对照组相比显著降低，说明二甲双胍、苹果多酚组、AP-50提取物高、中剂量组对口腹血糖也有改善作用，而且AP-50提取物高剂量组(1.2g/Kg)和苹果多酚组(1.5g/kg)的作用相当，说明AP-50提取物作用优于苹果多酚组。
在0h时，二甲双胍、苹果多酚组、AP-50提取物高、中剂量组血糖与模型对照组相比显著降低，说明二甲双胍、苹果多酚组、AP-50提取物高、中剂量组对口腹血糖也有改善作用，而且AP-50提取物高剂量组(1.2g/Kg)和苹果多酚组(1.5g/kg)的作用相当，说明AP-50提取物作用优于苹果多酚组。
[0092] 3.3AP-50提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
[0093] 连续给药14天，口服糖耐量实验检测血糖。由图8可见，糖负荷后，模型对照组ICR鼠的血糖值在糖负荷后血糖迅速升高，而AP-50提取物高、中、低剂量组、苹果多酚组、二甲双胍组血糖升高趋势缓慢(P＜0.01or 0.05)，表现出明显的抑制血糖上升的作用，具有良好的降血糖作用，说明AP-50提取物、苹果多酚、二甲双胍可改善葡萄糖负荷后血糖，具有调节糖耐量的作用，从图8中也可以清楚观察到AP-50提取物作用优于苹果多酚。
[0094] 3.4AP-50提取物对糖尿病小鼠口服淀粉耐量的影响
[0095] 连续给药21天，口服淀粉耐量实验检测血糖。由图9可见，淀粉负荷后，模型对照组糖尿病ICR小鼠的血糖值在淀粉负荷后血糖迅速升高，而AP-50提取物高、中、低剂量组、苹果多酚组、二甲双胍组血糖升高趋势缓慢，表现出明显的抑制血糖上升的作用，具有良好的降血糖作用，说明AP-50提取物、苹果多酚、二甲双胍可改善餐后血糖,具有调节糖耐量的作用，也可以清楚观察到AP-50提取物作用优于苹果多酚。
[0096] 3.5AP-50提取物对糖尿病小鼠胰岛素的影响
[0097] 胰岛素是人体中唯一降低血糖的激素，胰岛素水平的高低与血糖水平有直接的关系，因此检测血清中的胰岛素。如图10所示，与空白组相比，模型组胰岛素水平显著降低，说明链脲佐菌素损伤了胰岛β细胞。而二甲双胍组、苹果多酚组、AP-50提取物高、中剂量胰岛素水平与模型组相比有所升高，说明苹果多酚、AP-50提取物对胰岛细胞有一定的保护作用，且作用优于苹果多酚。
[0098] 3.6AP-50提取物对糖尿病小鼠肾脏指数及肾脏病理变化的影响
[0099] 糖尿病患者多并发症如肾病、视网膜病变、心血管疾病等。因此连续给药四十天后，处死小鼠时取心、肝、脾、胰腺、肾脏称重，观测糖尿病小鼠的并发症状况。如图11所示，统计数据发现，二甲双胍、苹果多酚、AP-50提取物对肾脏有一定的保护作用，且AP-50提取物对肾脏的保护作用呈剂量依赖性。
[0100] 取糖尿病小鼠肾脏、胰腺组织HE染色，观察其病理情况，结果如图12所示，与正常小鼠肾脏相比，模型组的肾组织切片，发现肾小球固缩，体积小，结构不清，远曲管，近曲管结构尚清晰，间质可见炎细胞浸润，小血管内可见充血。而相比于模型组，AP-50提取物高、中剂量组的肾组织切片的肾小球结构清晰、饱满，肾小管结构清晰，接近正常，未见间质内明显炎细胞浸润和充血。AP-50提取物低剂量组的肾组织切片的改善作用不明显。
[0101] 实施例7苹果多酚50％醇提物的成分组成鉴别
[0102] 通过HPLC系统(日本岛津科学仪器公司)分析了AP50的化学成分，配置二极管阵列检测器(DAD)。检测波长280nm，上样前样品由0.45μm的微孔滤膜过滤。以1.0ml/min的流量，在30℃将10μl的样品通过C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)分离。流动相由溶剂A和溶剂B组成，溶剂A为体积比为2％的乙酸水溶液，溶剂B由80％体积的乙腈与20％的溶剂A混匀而成。流动相的渐变过程如表3所示。
[0103] 表3流动相梯度表
[0104]
[0105]
[0106] 本发明的苹果多酚50％醇提物的成分组成鉴别结果如下：
[0107] 本发明的苹果多酚50％醇提物的吸收峰如图5所示，其中，峰1为绿原酸(chlorogenic acid)0.8～1.5％，峰2为咖啡酸(caffeic acid acid)1.0～1.6％，3为表儿茶素(epicatechin)0.3～0.8％，峰4为5-O-对香豆酰奎尼酸(5-O-p-coumaric acyl quinic acid)3～4％,峰5为4-O-对香豆酰奎尼酸(4-O-p-coumaric acyl quinic acid)5.5～6.5％,峰6为对香豆酸(p-coumaric acid)0.5～1.0％,峰7为1-O-咖啡酰奎尼酸甲酯(1-O-Caffeoylquinic acid methyl ester)0.3～1.2％，峰8为4-O-对香豆酰奎尼酸甲酯(4-O-p-coumaric acyl quinic acid methyl ester)0.3～0.9％，峰9为3-羟基根皮素-2′木糖葡萄糖苷(3-Hydroxyphloretin-2'-xyloglucoside)3.0～4.0％，峰10为羟基根皮苷(3-hydroxy phloridzin)1.2～2.0％,峰11为根皮素-2′木糖葡萄糖苷(phloretin-2’-xylglucoside)15～18％,峰12为根皮素-2′木糖半乳糖苷(Phloretin-2'-xylogalactoside)2.0～3.0％，峰13为根皮苷(phloridzin)20～26％,峰14为根皮素(phloretin)0.2～0.8％，此外还含有其他不明酚酸类成分(30～38％)。
[0108] 尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改进、修饰和变化，而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。
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