一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物及其制备工艺和应用
阅读：834发布：2023-02-10
专利汇可以提供一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物及其制备工艺和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种诱导肝星状细胞凋亡的 蓝莓 酒泥提取物及其制备工艺和应用，属于 生物 技术领域。该发明所述蓝莓酒泥提取物是通过将蓝莓酒泥脱汁、低温干燥、 粉碎 后，采用酶法 超 声波 辅助热 水 浸提，再经三氯乙酸法脱蛋白、 透析 袋脱盐、 超滤 去除大分子物质、减压浓缩、 真空 冷冻干燥 制备而成。本发明所述提取物主要成分为蓝莓花色苷、功能性低聚糖，该提取物在PRMI1640培养基中的浓度达50~250μg/mL时，能够显著抑制肝星状细胞生长，诱导肝星状细胞凋亡。本发明的有益效果在于其既为新型抗肝 纤维 化保健食品的开发提供了思路，又为蓝莓酒泥的高值化利用提供了操作简单、经济高效的新的技术途径。，下面是一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物及其制备工艺和应用专利的具体信息内容。
1.一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其特征在于：是由以下方法制备而成的：
（1）蓝莓酒泥3000rmp/min离心脱汁20min，取沉淀于45℃~50℃烘箱中烘干至水分含量≤2%，用高速粉碎机粉碎后过80目筛，得蓝莓酒泥干粉；
（2）将蓝莓酒泥干粉与水混合，料水比为1:30~1:50( g/mL)，再添加果胶酶HC和纤维素酶，所述果胶酶HC和纤维素酶的添加量占蓝莓酒泥干粉的质量百分比分别为
0.05%~0.08%和0.3%~0.5%，混合均匀后用质量比2%的柠檬酸水溶液调节PH至3，超声提取时间为40~60min，再避光提取1h~1.5h，提取温度为50~70℃，抽滤，收集滤液，滤渣再重复提取一次；合并两次提取的滤液，得蓝莓酒泥粗提液；
（3）蓝莓酒泥粗提液减压浓缩至总体积的0.1~0.5倍，再经冷冻干燥后得蓝莓酒泥粗提粉；
（4）蓝莓酒泥粗提粉与水按10mg／mL的质量体积比混合均匀，再逐滴加入质量比10%的三氯乙酸溶液调节其PH值至3，放置过夜，3000 rmp／min离心20 min，取上清，得脱蛋白液；
（5）脱蛋白液用透析袋脱盐，透析时间为10h，得脱盐液；
（6）使用超滤器通过超滤膜除去脱盐液中的大分子物质，得到超滤液；
（7）超滤液于50℃减压浓缩至0.1~0.5倍体积，再经冷冻干燥后即得蓝莓酒泥提取物。
2. 根据权利要求1所述的一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其特征在于，其制备方法步骤（2）中，所述果胶酶HC和纤维素酶的添加量优选0.05%和0.4%，超声提取时间优选50min，提取温度优选60℃。
3. 根据权利要求1或2所述的一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其特征在于：其制备方法步骤（5）中，所述透析袋的截留分子量为100~500道尔顿，步骤（6）中，所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，超滤压力为0.18MPa。
4.根据权利要求1或2 所述的一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其特征在于：所述蓝莓酒泥提取物中花色苷的含量≥26.32%，低聚糖的含量≥45.25%。
5.根据权利要求3 所述的一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其特征在于：
所述蓝莓酒泥提取物中花色苷的含量≥26.32%，低聚糖的含量≥45.25%。
6.权利要求1-5所述的一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述蓝莓酒泥提取物在抑制肝星状细胞增殖、诱导肝星状细胞凋亡的抗肝纤维化保健食品或药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述蓝莓酒泥提取物在肝星状细胞环境浓度达50~250μg/mL时，抑制肝星状细胞生长、并诱导肝星状细胞凋亡。
一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物及其制备工艺
和应用
一、技术领域
[0002] 肝纤维化是危害人类健康的重要疾病之一，迄今为止，仍然没有满意的治疗方法。现代医学认为，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活增殖是形成肝纤维化的关键，抑制HSC的激活对肝纤维化的防治意义重大。肝星状细胞系HSC-T6为SV40转染SD大鼠HSC，其表型活化，可以表达I型胶原、Ⅲ型胶原及与肝纤维化相关的多种信号分子，是研究药物抗肝纤维化效果的最广泛应用的细胞模型。目前，通过食物抑制HSC的活化、增殖，促进其凋亡，从而达到预防和治疗肝纤维化的良好效果已引起国内外学者的广泛关注。
[0003] 蓝莓又名越橘、蓝浆果，属杜鹃花科越橘属，是21世纪功能性保健浆果，被联合国粮农组织(FAO)列为人类五大健康食品之一，具有很高的经济价值和开发前景。蓝莓富含花青素、黄烷醇、酚酸、维生素C等生物活性物质，营养保健功能极高。其中花青素含量在各类蔬菜水果中排名最高，是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂。采用蓝莓汁酿造的蓝莓酒颜色鲜亮、果香浓郁、醇香纯正、风味独特，口味绵长，能最大限度地保留天然蓝莓的营养成分和保健功能因子，长期饮用具有美容养颜、抗氧化、抗炎、抗衰老、保护视网膜、保护心血管、延缓衰老、抗癌、增强免疫力等多种药理保健功效，在国内外市场非常畅销。但是对蓝莓酒酿造过程中产生的副产物蓝莓酒渣、酒泥的研究与开发利用却鲜有报道。
[0004] 蓝莓酒泥是指蓝莓酒在渣液分离后、陈酿过程中产生的沉淀，富含酵母多糖、活性蛋白、蓝莓多酚、花色苷、SOD等活性因子，具有很强的生物保健功能。但是目前80％的蓝莓酒泥是直接排放，造成了严重的环境污染和资源的极度浪费，只有20％的用来发酵成饲料或肥料，其产生的社会、经济效益与其自身可以达到的实际效益相距甚远。因此，高效、经济、高活性的蓝莓酒泥提取物的制备及其在诱导肝星状细胞中的应用，不仅可以为具有防治肝纤维化功能食品的开发提供理论依据，实现蓝莓酒泥的高值化利用，还有利于阐明具有抗氧化活性的植物提取物在逆转肝纤维化进程的作用机理，具有广阔的市场前景。
[0006] 中国专利(申请号CN201110151594.2，公开号CN102321062A)公开了“一种蓝莓酒渣中花青素分离、纯化及检验方法”是采用温浸提取制备蓝莓酒渣花青素。
[0007] 中国专利(申请号CN201310262284.7，公开号CN103289430A)公开了“一种从蓝莓渣中提取纯化花青素的方法”采用酶解辅助提取法提取蓝莓渣中的花青素。
[0008] 江得源等报道了采用蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶、几丁质酶破壁转化废菌体制备甲壳低聚糖的研究(江得源,吕梦圆,石佳仙,等.酶法破壁转化废菌体制备甲壳低聚糖.湖北农业科学,2014,53(10):2404-2407)。
[0009] 刘露等报道了响应面法优化超声波辅助提取山药低聚糖的工艺研究(刘露,张雁,张名位,等.响应面法优化超声波辅助提取山药低聚糖的工艺研究.广东农业科学,2014,41(11):100-105)。
[0010] 但是迄今为止，尚无关于在酶法辅助提取的过程中同时进行超声处理制备既富含蓝莓花色苷又富含功能低聚糖的蓝莓酒泥提取物的文献报道，更没有关于蓝莓酒泥提取物抑制肝星状细胞增殖、诱导肝星状细胞凋亡的文献报道。而本发明在酶法辅助提取的过程中进行超声处理，有利于使酶的活性位点在超声波的空化作用下与底物充分结合，与单独采用超声辅助提取或单独使用酶法辅助提取相比，提取率有了极大的提高，且操作简单、经济实用，具有很大的市场应用价值。三、发明内容
[0011] 发明目的
[0012] 本发明的目的在于提供一种蓝莓酒泥提取物及其制备工艺，该蓝莓酒泥提取物的主要组分包括花色苷和功能性低聚糖，具有很强的生物保健功能。
[0013] 本发明的目的还在于提供一种蓝莓酒泥提取物作为防治肝纤维化的保健食品原料新用途，即蓝莓酒泥提取物在诱导肝星状细胞凋亡中的应用。
[0014] 技术方案
[0015] 本发明通过如下技术方案实现：
[0016] 一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物及其制备工艺，包括如下步骤：
[0017] (1)蓝莓酒泥3000rmp/min离心脱汁20min，取沉淀于45℃～50℃烘箱中烘干至水分含量≤2％，用高速粉碎机粉碎后过80目筛，得蓝莓酒泥干粉；
[0018] (2)将蓝莓酒泥干粉与水混合，料水比为1:30～1:50(g/mL)，再添加果胶酶HC和纤维素酶，所述果胶酶HC和纤维素酶的添加量占蓝莓酒泥干粉的质量百分比分别为0.05％～0.08％和0.3％～0.5％，混合均匀后用质量比2％的柠檬酸水溶液调节PH至3，超声提取时间为40～60min，再避光提取1h～1.5h，提取温度为50～70℃，抽滤，收集滤液，滤渣再重复提取一次；合并两次提取的滤液，得蓝莓酒泥粗提液；
[0019] (3)蓝莓酒泥粗提液减压浓缩至总体积的0.1～0.5倍，再经冷冻干燥后得蓝莓酒泥粗提粉；
[0020] (4)蓝莓酒泥粗提粉与水按10mg/mL的质量体积比混合均匀，再逐滴加入质量比10％的三氯乙酸溶液调节其PH值至3，放置过夜，3000rmp/min离心20min，取上清，得脱蛋白液；
[0021] (5)脱蛋白液用透析袋脱盐，透析时间为10h，得脱盐液；
[0022] (6)使用超滤器通过超滤膜除去脱盐液中的大分子物质，得到超滤液；
[0023] (7)超滤液于50℃减压浓缩至0.1～0.5倍体积，再经冷冻干燥后即得蓝莓酒泥提取物。
[0024] 步骤(2)中，所述果胶酶HC和纤维素酶的添加量优选0.05％和0.4％。
[0025] 步骤(2)中，所述料水比为1:30～1:50(g/mL)，优选1:30(g/mL)，超声提取时间为40～60min，优选50min，避光提取1h～1.5h时，提取温度为50～70℃，优选60℃。
[0026] 步骤(5)中，所述透析袋的截留分子量为100～500道尔顿。
[0027] 步骤(6)中，所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，超滤压力为0.18MPa。
[0028] 本发明所述蓝莓酒泥提取物产品中花色苷的含量≥26.32％，低聚糖的含量≥45.25％。
[0029] 一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物的应用，可应用于制备抑制肝星状细胞增殖、诱导肝星状细胞凋亡的对肝纤维化具有防治效果的保健食品。所述蓝莓酒泥提取物在肝星状细胞环境浓度达50～250μg/mL时，抑制肝星状细胞生长、并诱导肝星状细胞凋亡。
[0030] 本发明的优点和积极效果在于：
[0031] 1.本发明采用蓝莓酒加工副产物，即蓝莓酒泥为原料制备一种诱导肝星状细胞凋亡的蓝莓酒泥提取物，其原料来源广泛、属于废物利用，一方面可以避免直接排放酒泥造成的环境污染，另一方面还极大的提高了蓝莓资源的综合利用率。
[0032] 2.本蓝莓酒泥提取物在制备时，用水提法取代了常规的有机溶剂提取法，并采用了透析袋脱盐、超滤技术对提取物进行初步纯化，不仅有效解决了提取物中有机溶剂的残留问题，还克服了柱层析操作复杂、不利于工业化生产等缺点，具有效率高、操作简单、成本低廉等优点，具有极大的商业开发价值。
[0033] 3.本发明采用酶法超声辅助法提取蓝莓酒泥中的有效成分，检测蓝莓酒泥提取物中花色苷的含量≥26.32％，低聚糖的含量≥45.25％。不仅使酶在超声波的空化作用下保持了较高的酶活，极大地提高了酶解效率和花色苷的提取率，而且还使得酒泥中的多糖物质进一步降解为具有更强功能的低聚糖，使得本发明所述蓝莓酒泥提取物具有了更强的生理保健功能。
[0034] 4.本发明受中药多维组合药物可协同发挥疗效的启发，改变了以往单独提取花色苷或多糖等单一组分的思路，联合提取蓝莓酒泥中的活性物质，为蓝莓酒泥的开发利用提供了一条新的技术途径。
[0035] 5.本发明制备的蓝莓酒泥提取物可显著抑制肝星状细胞增殖，具有良好的肝星状细胞凋亡诱导活性，细胞在含50～250μg/mL蓝莓酒泥提取物的PRMI 1640培养基环境中培养24h时，细胞的生长抑制率达19.34％～67.66％，细胞凋亡率达14.23％～65.32％。因此，将此蓝莓酒泥提取物作为保健食品原料，有利于在肝纤维化的防治中发挥重要作用。
附图说明
附图说明
[0036] 图1为超声时间对蓝莓酒泥花色苷和低聚糖提取率的影响
[0037] 图2为液料比对蓝莓酒泥花色苷和低聚糖提取率的影响
[0038] 图3为提取温度对蓝莓酒泥花色苷和低聚糖提取率的影响
[0039] 图4为蓝莓酒泥提取物对DPPH自由基的清除能力
[0040] 图5为蓝莓酒泥提取物抗超氧阴离子自由基的能力
[0041] 图6为蓝莓酒泥提取物对羟自由基的抑制率
[0042] 图7蓝莓酒泥提取物对HSC-T6生长的抑制作用
[0044] 图9蓝莓酒泥提取物对HSC-T6凋亡率的影响
[0045] 图10蓝莓酒泥提取物对HSC-T6活性氧自由基的影响
[0046] 图11蓝莓酒泥提取物对HSC-T6脂质过氧化产物MDA影响
具体实施方式
[0047] 通过以下蓝莓酒泥提取物制备工艺实施例和效果试验例，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。若无特殊说明，下述实施例中所用的技术方法均为常规方法；下述实施例中所用试验材料，均为常规化学试剂和生化试剂。
[0048] 实施例1蓝莓酒泥提取物的制备工艺
[0049] 本发明所述蓝莓酒泥制备工艺，包括以下步骤：
[0050] (1)蓝莓酒泥(句容万山红遍生物科技有限公司提供)3000rmp/min离心脱汁20min后，取沉淀于45℃烘箱中烘干至水分含量≤2％，用高速粉碎机粉碎后过80目筛；
[0051] (2)取过筛后的干粉1kg，按不同的质量体积比(g/mL)加水混合，再添加占干粉质量0.05％的果胶酶HC(LALLZYME HC，购于上海杰兔商贸有限公司，含多聚半乳糖醛酸酶质量比62％，含果胶酯酶质量比34％，含果胶裂解酶质量比4％)和0.4％的纤维素酶(宁夏和氏璧生物技术有限公司)，混合均匀后用2％的柠檬酸水溶液调节PH至3，放入超声波清洗器中，于超声功率500W条件下超声处理不同时间后，再避光于不同温度下提取1h，抽滤，收集滤液，滤渣再重复提取一次。合并两次提取的滤液。以花色苷提取率和低聚糖提取率为指标，设计单因素试验，确定料液比、提取时间、提取温度的适宜范围。其具体的单因素试验设计见表1。
[0052] 表1 单因素实验设计
[0053]
[0054] 根据图1～图3单因素试验结果，再结合经济成本，能够确定蓝莓酒泥提取物适宜的提取条件范围为：超声时间40～60min、料液比1:30～1:50(g/mL)、提取温度50～70℃。
[0055] 确定适宜的提取条件后，以料液比、超声时间、提取温度为因素，又采用了L9(34)正交试验设计方案，以低聚糖提取率和花色苷提取率为考察指标，进一步优化提取工艺。其试验设计方案和结果如表2和表3。
[0056] 表2 L9(34)正交试验因素与水平表
[0057]
[0058] 表3 正交实验结果及直观分析结果
[0059]
[0060] 由表3极差分析结果可见：影响低聚糖提取率的主要因素是B(超声时间)和C(提取温度)，其次是A(料液比)，各因素对低聚糖提取率影响的主次顺次是B＝C＞A，最优组合为A3B2C3；影响花色苷提取率的主要因素是B(超声时间)，其次是C(提取温度)，A(料液比)的影响最小，各因素对花色苷提取率影响的主次顺次是B＞C＞A，最优组合为A2B2C2。
[0061] 因2个组合均不在正交表安排的试验中，故需按照上述工艺条件对2个组合平行做3次验证试验，结果发现，按照A2B2C2组合进行提取时，低聚糖和花色苷的提取率均最高，分别达14.28mg/g和6.16mg/g。该结果与表2中的2号组合A1B2C2的低聚糖14.24％、花色苷6.13并无显著差异，考虑到料液比过大会增加后续浓缩成本，从经济节能的角度综合考虑，确定将A1B2C2确定为最佳组合。
[0062] 因此，蓝莓酒泥提取物酶法超声辅助最佳提取工艺为：干粉与水按料液比1:30混合，再添加占干粉质量0.05％的果胶酶HC和0.4％的纤维素酶，用1％的柠檬酸水溶液调节PH至3，于超声功率500W条件下超声提取时间50min、超声提取后于60℃下避光提取1h。在此条件下，进行三次平行试验，提取物中蓝莓酒泥花色苷提取率最高达6.12mg/g，低聚糖提取率为14.24mg/g。
[0063] (3)在上述最佳提取工艺条件下提取2次后，合并滤液，减压浓缩至总体积的0.2倍，再进行冷冻干燥，得蓝莓酒泥粗提粉；
[0064] 将冷冻干燥的蓝莓酒泥粗提物干粉配置成不同浓度的水溶液，进一步检测其抗氧化功能，由图4～图6可见，此蓝莓酒泥粗提粉具有良好的抗氧化活性，浓度为1.6mg/mL的蓝莓酒泥粗提取物溶液对DPPH自由基清除率达81.7％，抗超氧阴离子自由基能力达220.98U/L，羟自由基抑制率达79.06％。
[0065] (4)将蓝莓酒泥粗提粉与水按10mg/mL的质量体积比混合均匀，再逐滴加入10％的三氯乙酸溶液调节其PH值至3，放置过夜，3000rmp/min离心20min，取上清，去除蛋白沉淀,得到脱蛋白液；
[0066] (5)除蛋白后的上清液用截留分子量为100～500道尔顿的透析袋脱盐，透析时间为10h；
[0067] 具体为：将透析袋一端用夹子夹紧，将脱蛋白液经0.45μm滤器过滤后置于夹好的透析袋中，装液量不超过透析袋容积的2/3，将袋开口处用夹子密封，用双蒸水作透析介质，每隔2小时更换一次双蒸水，持续透析10h即可得到脱盐液。
[0068] (6)脱盐液通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜除去其中的大分子物质，得超滤液。超滤压力为0.18MPa。
[0069] (7)超滤液于50℃减压浓缩至0.2倍体积，再经冷冻干燥后即得蓝莓酒泥提取物。
[0070] 检测蓝莓酒泥提取物中花青素的含量为26.32％，低聚糖的含量为45.25％。
[0071] 实施例2蓝莓酒泥提取物对肝星状细胞(HSC-T6)生长的抑制作用和凋亡诱导作用
[0072] (1)MTT比色法检测蓝莓酒泥提取物对HSC-T6S生长的抑制作用
[0073] 取实施例1制备的蓝莓酒泥提取物，分别将其溶于10％胎牛血清的PRMI1640完全培养基(Gbico公司产品)中，使蓝莓酒泥提取物在培养基溶液中的浓度分别为50、100、150、200、250μg/mL，经水系0.22μm滤器过滤后，备用。
[0074] 大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞株(购自上海拜力生物工程有限公司)，用含10％胎牛血清的1640培养液于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件的培养箱中培养至对数生长期，4
胰酶消化后制成单细胞悬液，调整其密度为5×10/mL，接种于96孔板，置于培养箱中培养
24h，待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h后，弃去上清；
胰酶消化后制成单细胞悬液，调整其密度为5×10/mL，接种于96孔板，置于培养箱中培养
24h，待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h后，弃去上清；
[0075] 分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL的蓝莓酒泥提取物溶液的培养基200μL，并设置等体积只加入含10％胎牛血清的1640培养液的空白对照组和调零组(无细胞，只加入含10％胎牛血清的1640培养液)，分别培养24h、48h、72h。结束前4h每孔加入5mg/mL MTT溶液20uL，继续培养4h后吸去上清，每孔加入150uL二甲基亚砜(DMSO)，避光振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光值(OD值)。并按下列公式计算抑制率：抑制率(％)＝[1－(实验OD值-调零OD值)/(对照组OD值-调零OD值)]×100％。实验重复3次。实验结果见图5。
[0076] 根据图7所示MTT检测结果显示：用含50、100、150、200、250μg/mL蓝莓酒泥提取物的PRMI 1640完全培养基溶液培养细胞24h时，细胞的生长抑制率达19.34％～67.66％，48h时细胞的生长抑制率达32.59％～84.37％，72h时细胞的生长抑制率达
47.91％～91.49％。表明蓝莓酒泥提取物能明显抑制细胞生长，其抑制作用随蓝莓酒泥提取物在培养基溶液中浓度的提高和时间的延长而增强。
47.91％～91.49％。表明蓝莓酒泥提取物能明显抑制细胞生长，其抑制作用随蓝莓酒泥提取物在培养基溶液中浓度的提高和时间的延长而增强。
[0077] (2)蓝莓酒泥提取物对HSC-T6凋亡的诱导作用
[0078] 1.荧光染色法(Hoechst33258染液)观察HSC-T6凋亡情况
[0079] 取对数生长期的HSC-T6细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，用含10％胎牛血清的5
1640培养基调整细胞密度为2.5×10 个/mL，每孔2mL接种于6孔板，置于培养箱中培养
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL的蓝莓酒泥提取物溶液的培养基2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；24h后弃上清，加入0.5mL固定液于4℃下过夜固定；去固定液，加入PBS溶液1mL，置于摇床清洗2次，每次3min；充分弃去PBS后加入
0.5mLHoechst33258染色液(碧云天生物技术研究所)，置于摇床避光染色5min；充分弃去染色液后，加入1mLPBS充分清洗2次，弃去上清，滴一滴抗荧光淬灭液后于孔板底部轻盖一盖玻片，于避光条件下使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况。结果见图8。
1640培养基调整细胞密度为2.5×10 个/mL，每孔2mL接种于6孔板，置于培养箱中培养
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL的蓝莓酒泥提取物溶液的培养基2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；24h后弃上清，加入0.5mL固定液于4℃下过夜固定；去固定液，加入PBS溶液1mL，置于摇床清洗2次，每次3min；充分弃去PBS后加入
0.5mLHoechst33258染色液(碧云天生物技术研究所)，置于摇床避光染色5min；充分弃去染色液后，加入1mLPBS充分清洗2次，弃去上清，滴一滴抗荧光淬灭液后于孔板底部轻盖一盖玻片，于避光条件下使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况。结果见图8。
[0080] 由图8可以看出：荧光染色后，未经蓝莓酒泥提取物处理的阴性对照组的细胞形态均一，发出均匀淡蓝色荧光，为正常活细胞。而各蓝莓酒泥提取物处理组的部分细胞着色不均匀呈致密浓染、或出现细胞核固缩、断裂等典型凋亡特征。且随着蓝莓酒泥提取物浓度增大，贴壁细胞逐渐减少、颜色发白的凋亡的细胞数量增加。
[0081] 2.流式细胞仪检测HSC-T6凋亡率
[0082] 取对数生长期的HSC-T6细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，用含10％胎牛血清的5
1640培养基调整细胞密度为2.5×10 个/mL，每孔2mL接种于6孔板，置于培养箱中培养
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL蓝莓酒泥提取物的培养基溶液2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；24h后弃上清，胰酶消化后制成单细胞悬液，使用预冷PBS(4℃)清洗2次，1000r/min离心5min，去弃去上清，按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒操作指南(美国BD公司)，加入0.5μL Annexin V-FITC结合液、5μL Annexin V-FITC染液和10μL碘化丙啶(PI)染色液，旋涡振荡，使细胞与试剂充分混合制成悬液，室温避光孵育15min，立即用流式细胞仪检测(美国BD公司)。
1640培养基调整细胞密度为2.5×10 个/mL，每孔2mL接种于6孔板，置于培养箱中培养
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL蓝莓酒泥提取物的培养基溶液2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；24h后弃上清，胰酶消化后制成单细胞悬液，使用预冷PBS(4℃)清洗2次，1000r/min离心5min，去弃去上清，按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒操作指南(美国BD公司)，加入0.5μL Annexin V-FITC结合液、5μL Annexin V-FITC染液和10μL碘化丙啶(PI)染色液，旋涡振荡，使细胞与试剂充分混合制成悬液，室温避光孵育15min，立即用流式细胞仪检测(美国BD公司)。
[0083] 由检测结果图9可知，蓝莓酒泥提取物可显著诱导细胞凋亡，随着提取物溶液浓度的增大，细胞凋亡率逐渐上升，细胞在蓝莓酒泥提取物浓度为50、100、150、200、250、250μg/mL的(PRMI 1640培养基)环境中培养24h，细胞的凋亡率分别达14.23％、
19.44％、30.98％、49.31％、65.32％，与没有添加蓝莓酒泥提取物的对照相凋亡率7.96％相比，均有显著提高。
19.44％、30.98％、49.31％、65.32％，与没有添加蓝莓酒泥提取物的对照相凋亡率7.96％相比，均有显著提高。
[0084] (3)HSC-T6细胞内ROS、MDA水平检测
[0085] 取对数生长期的HSC-T6细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，用含10％胎牛血清的1640培养基调整细胞密度为2.5×105个/mL，每孔2mL接种于6孔板，置于培养箱中培养
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL的蓝莓酒泥提取物溶液的培养基2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；染色过程均于避光条件下进行，向每孔加入用PBS稀释为10μM的H2DCFDA工作液(南京凯基生物科技发展有限公司)1mL，置于培养箱中孵育
20min；30min后弃去上清，加入于37℃预热后的无血清1640培养基1mL，在培养箱中孵育
30min，弃去上清后，再用预热无血清培养基清洗两次，滴一滴抗荧光淬灭液后于孔板底部轻盖一盖玻片，于避光条件下使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况。细胞内氧自由基含量越高，DCF氧化程度越强，绿色荧光发射水平也越强。
24h；待细胞贴壁后换无血清培养基继续孵育12h，去上清，再分别加入配制好的含不同浓度50、100、150、200、250μg/mL的蓝莓酒泥提取物溶液的培养基2mL，以含10％胎牛血清的1640培养基为空白对照，培养24h；染色过程均于避光条件下进行，向每孔加入用PBS稀释为10μM的H2DCFDA工作液(南京凯基生物科技发展有限公司)1mL，置于培养箱中孵育
20min；30min后弃去上清，加入于37℃预热后的无血清1640培养基1mL，在培养箱中孵育
30min，弃去上清后，再用预热无血清培养基清洗两次，滴一滴抗荧光淬灭液后于孔板底部轻盖一盖玻片，于避光条件下使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况。细胞内氧自由基含量越高，DCF氧化程度越强，绿色荧光发射水平也越强。
[0086] 由图10可知：随着蓝莓酒泥提取物溶液浓度增大，荧光发射光而产生的绿色光点亮度不断提高，表明HSC-T6细胞中活性氧水平增高。
[0087] 按照南京建成生物工程研究所生产的MDA测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书进一步检测细胞内脂质过氧化产物MDA的水平，由结果图11可知，HSC-T6细胞内MDA水平也随蓝莓酒泥提取物溶液浓度的增大而提高，细胞在蓝莓酒泥提取物浓度为50～250μg/mL的PRMI 1640培养基环境中培养24h时，细胞内MDA水平在13.60～54.29nmoL/mg prot.，而对照组细胞内的MDA水平仅为11.15nmoL/mg prot.，与蓝莓酒泥提取物处理组相比，有明显的降低。
[0088] 说明蓝莓酒泥提取物通过促进HSC-T6细胞氧化损伤从而诱导其凋亡。
[0089] 综上所述，本发明通过MTT法检测细胞增殖抑制率、流失细胞仪检测凋亡率、荧光显微镜观察凋亡现象，以及试剂盒检测ROS和MDA水平，结果证实了蓝莓酒泥提取物具有抑制HSC-T6细胞增殖、并诱导其凋亡、促进细胞造成氧化损伤的作用。因此，能够应用于制备抑制肝星状细胞增殖、诱导肝星状细胞凋亡的抗肝纤维化保健食品。
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