一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应用
阅读：406发布：2023-02-04
专利汇可以提供一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种低 糖化 突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)及其表达、纯化方法。该低糖化突变体干扰素-λ1是将IFN-λ1成熟肽序列中N46位的Asn置换为Gln后得到的 蛋白质 。本发明实现了阻断毕赤 酵母 对IFN-λ1的N-糖基化位点的高甘露糖修饰过程，使IFN-λ1-Nm基因在嗜甲醇酵母中高效分泌性地正确表达，表达的重组IFN-λ1-Nm蛋白均一性明显提高，表达 水 平大于65mg/L，表达的重组蛋白经两步柱层析纯化后纯度大于98％，低糖化修饰的重组IFN-λ1-Nm蛋白具有和原嗜甲醇酵母表达的野生型IFN-λ1相同的 生物 学活性，同时具有较好的安全性。本发明为高效、大量、低成本生产具有生物活性且均一性好的低糖化修饰的IFN-λ1提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。，下面是一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种低糖化突变体干扰素-λ1，是将IFN-λ1成熟肽序列中Asn-Xaa-Ser46NWS48位的Asn置换为谷氨酰胺Gln后得到的蛋白质，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述低糖化突变体干扰素-λ1为均一化的蛋白。
2.编码权利要求1所述低糖化突变体干扰素-λ1的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
4.一种权利要求1所述低糖化突变体干扰素-λ1的专用表达载体，是含有低糖化突变体干扰素-λ1基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体；所述低糖化突变体干扰素-λ1基因表达单元自上游至下游包括醇氧化酶AOX的启动子、α因子的前导肽α-F编码序列、编码181个氨基酸残基的成熟肽低糖化突变体干扰素-λ1的基因序列以及醇氧化酶AOX的终止子。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述低糖化突变体干扰素-λ1基因表达单元在载体中的拷贝数为6；用于构建所述含有低糖化突变体干扰素-λ1基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体为适于外源基因表达的嗜甲醇酵母表达载体pAO815；以pAO815为出发载体，构建的含有6个拷贝的低糖化突变体干扰素-λ1基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体命名pA-6IFNλ1-Nm。
6.一种表达权利要求1所述低糖化突变体干扰素-λ1的专用工程菌，是将权利要求4或5所述的低糖化突变体干扰素-λ1的专用表达载体导入嗜甲醇酵母中得到的。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述嗜甲醇酵母为适于蛋白表达的嗜甲醇酵母菌株GS115；以嗜甲醇酵母菌株GS115为出发菌株，构建的转化有pA-6IFNλ1-Nm的重组嗜甲醇酵母菌株命名为GS115/pA-6IFNλ1-Nm。
8.一种权利要求1所述低糖化突变体干扰素-λ1的表达和纯化方法，是发酵权利要求6或7所述的低糖化突变体干扰素-λ1的专用表达工程菌，经诱导表达后，对发酵液进行纯化，得到均一化的低糖化突变体干扰素-λ1；所述发酵重组嗜甲醇酵母时加入诱导剂甲醇的体积浓度为0.5％；对表达产物进行纯化的方法为强阳离子交换层析和凝胶过滤层析的两步柱层析法。
9.根据权利要求8所述的表达和纯化方法，其特征在于：所述纯化方法具体为：纯化的第一步为阳离子交换层析，缓冲液A为pH7.0的50mM PBS，缓冲液B为50mM PBS、1M NaCl、pH7.0；层析柱为SP Sepharose Fast Flow，将诱导表达的培养上清加入5倍体积的缓冲液A稀释后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱上，洗脱采用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱，收集洗脱峰；纯化的第二步是将阳离子交换层析后的洗脱峰浓缩并进行凝胶过滤层析，缓冲液为50mM PBS、150mM NaCl、pH7.0，层析柱为Superdex75，Hiload16/60预装柱。
10.权利要求1所述的低糖化突变体干扰素-λ1在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应
用
技术领域
背景技术
[0002] IFN-λs是最新发现的一类具有抗病毒活性的干扰素样细胞因子，包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因结构上与IL-10家族十分相似，而在氨基酸组成和功能方面与I型IFN更为接近，在IL-10家族和I型IFN之间建立了进化上的联系。IFN-λs，尤其是IFN-λ1，具有开发成广谱抗病毒药物、抗肿瘤药物及增强免疫力药物的潜在价值。
[0003] 干扰素(interferon，IFN)是人类最早认识的细胞因子，早在1957年Isaacs和Lindenmann就从感染流感病毒的鸡胚中发现了一种具有抗病毒活性的蛋白质，将其称之为interferon并一直沿用至今[Isaacs A.& lindenmann J.(1957)Virus interference.I.The interferon.Proc R Soc Lond B Biol Sci.147(927)：258-267]。在那以后的许多年里，干扰素只是作为病毒复制的抑制物而为人所知。后来，越来越多的证据表明IFNs实际上是一类多效因子，除了具有强大的广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞增殖、调节细胞分化和免疫调节等多种功能。人类IFNs包括I型IFN家族和II型IFN家族，以及一个新发现的IFN-λs家族。II型IFN家族仅有IFN-γ一个成员，基因位于12号染色体，IFN-γ与受体IFN-γR结合，其功能主要是免疫调节。I型IFN家族包括至少13种IFN-α非等位基因，编码13种亚型的IFN-α，1个IFN-β基因，1个IFN-ω基因，各编码一种IFN，以及了解尚少的IFN-κ和IFN-ε[Lafleur D.W.，Nardelli B.，Tsareva T.，Mather D.，Feng P.，Semenuk M.，Taylor K.，Buergin M.，Chinchilla D.，Roshke V.，Chen G.，Ruben S.M.，Pitha P.M.，Coleman T.A.& Moore P.A.(2001)Interferon-kappa，a novel type I interferon expressed in human keratinocytes.J Biol Chem.276(43)：39765-39771]。所有I型IFN基因均位于9号染色体，没有内含子，并且所编码蛋白全部使用同一种受体IFN-αβR。鼠类有一种称为limitin的I型IFN，现在命名为IFN-ζ，至今在人类还没有发现其对应物[Oritani K.，Medina K.L.，Tomiyama Y.，Ishikawa J.，Okajima Y.，Ogawa M.，Yokota T.，Aoyama K.，Takahashi I.，Kincade P.W.& Matsuzawa Y.(2000)Limitin：An interferon-like cytokine that preferentially influences B-lymphocyte precursors.Nat Med.6(6)：659-666.]。在反刍动物和猪体内还分别存在一种称为滋养层IFN的I型IFN，即IFN-τ和IFN-δ，其功能主要跟这类动物的受孕有关[Kontsek P.，Karayianni-Vasconcelos G.& Kontsekova E.(2003)The human interferon system：characterization and classification after discovery of novel members.Acta Virol.；47(4)：201-215]。
[0004] 2003年，美国的两个研究小组同时报道了一个全新的IFN家族，即IFN-λs，分类定为III型IFN[Sheppard P.，Kindsvogel W.，Xu W.，Henderson K.，Schlutsmeyer S.，Whitmore T.E.，Kuestner R.，Garrigues U.，Birks C.，Roraback J.，Ostrander C.，Dong D.，Shin J.，Presnell S.，Fox B.，Haldeman B.，Cooper E.，Taft D.，Gilbert T.，Grant F.J.，Tackett M.，Krivan W.，McKnight G.，Clegg C.，Foster D.& Klucher K.M.(2003)IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol.4(1)，63-68；Kotenkol S.V.，Gallagher G.，Baurin V.V.，Lewis-Antes A.，Shen M.，Shah N.K.，Langer J.A.，Sheikh F.，Dickensheets H.，Donnelly R.P.(2003)IFN-λs mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nature immunology.4(1)：69-77)；Bartlett N.W.，Buttigieg K.，Kotenko S.V.& Smith G.L.(2005)Murine interferon lambdas (type III interferons)exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model.J Gen Virol.86(6)：
1589-1596]。IFN-λ包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。其中IFN-λ2和IFN-λ3由同一个基因编码，氨基酸残基序列的相似性达96％，IFN-λ2和IFN-λ1残基序列的同源性也可达81％。同I型IFN不同，IFN-λ基因位于19号染色体，基因中含有多个内含子，其基因结构与IL-10家族成员十分相似，而与IFN-α相差甚远，因此IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3又分别被命名为IL-29、IL-28A和IL-28B。尽管IFN-λs在结构上与IFN-α明显不同，三种IFN-λs也只有15-19％的氨基酸与IFN-α相同，但IFN-λs在功能上与IFN-α十分相似，可被病毒和双链RNA诱生，对水泡性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)等病毒具有较强的抑制作用[Bobek M.D.，Boyd B.S.& Chisari F.V.(2005)Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication.J Virol.79(6)：3851-3854]。
1589-1596]。IFN-λ包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。其中IFN-λ2和IFN-λ3由同一个基因编码，氨基酸残基序列的相似性达96％，IFN-λ2和IFN-λ1残基序列的同源性也可达81％。同I型IFN不同，IFN-λ基因位于19号染色体，基因中含有多个内含子，其基因结构与IL-10家族成员十分相似，而与IFN-α相差甚远，因此IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3又分别被命名为IL-29、IL-28A和IL-28B。尽管IFN-λs在结构上与IFN-α明显不同，三种IFN-λs也只有15-19％的氨基酸与IFN-α相同，但IFN-λs在功能上与IFN-α十分相似，可被病毒和双链RNA诱生，对水泡性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)等病毒具有较强的抑制作用[Bobek M.D.，Boyd B.S.& Chisari F.V.(2005)Lambda interferon inhibits hepatitis B and C virus replication.J Virol.79(6)：3851-3854]。
[0005] 三种IFN-λs使用同一种与IFN-αβR完全不同的受体IFN-λR，和IFN-αβR同属于II型细胞因子受体家族(Class II cytokine receptor family，CRF2)。IFN-λR由大小两个亚基构成，即大亚基IL-28Rα，是配基结合亚基，决定了受体与IFN-λ结合的特异性；小亚基IL-10βR是辅助亚基。与广泛表达的I型IFN受体不同，IFN-λ受体的表达有细胞特异性，主要表达于上皮细胞表面，例如在肝脏中的所有细胞都表达IFN-α的受体，而IFN-λ的受体只在肝细胞表达。同样在外周血淋巴细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞和单核细胞等都广泛表达IFN-α受体，但是除了B淋巴细胞外在造血细胞(hemotopoietic cells)中没有检测到IFN-λ受体的表达[MuirA.J.，Shiffman M.L.，Zaman A.，Yoffe B.，de la Torre A.，Flamm S.，Gordon S.C.，Marotta P.，Vierling J.M.，Lopez-Talavera J.C.，Byrnes-Blake K.，Fontana D.，Freeman J.，Gray T.，Hausman D.，Hunder N.N.，Lawitz E.(2010)Phase 1b study of pegylated interferon lambda 1 with or without ribavirin in patients with chronic genotype 1 hepatitis C virus infection.Hepatology.52(3)：822-32.]。同所有类型的干扰素受体复合物相似，IFN-λR通过JAK-STAT(Janus kinases-signal transducers and activators of transcription)通路传递配基信号。与IFN-α相似，IFN-λR主要激活STAT1和STAT2，同时IFN-λR还可大量激活STAT3、STAT4和STAT5。与目前临床上普遍应用的IFN-α相比，由于IFN-λR分布及作用的特点，使IFN-λs能够成为一种新型的免疫生物制剂，在发挥生物活性的同时有效地减少发热、抑郁及骨髓抑制等副作用。
[0006] 嗜甲醇酵母-毕赤酵母(Pichia pastoris)兼具原核和真核表达系统的许多优点，安全，经济，操作简单，与哺乳动物细胞相比，更易于通过高密度发酵进行重组外源蛋白的高表达；同时可以通过特异的信号肽引导形成可溶性分泌表达，使重组外源蛋白形成正确折叠；毕赤酵母还具有对外源蛋白进行翻译后修饰的功能，如糖基化、磷酸化修饰等，表达的重组蛋白往往具有很好的生物活性。尽管毕赤酵母表达系统具有明显优势，然而其对糖蛋白进行糖基化修饰的类型与人和其它哺乳动物细胞存在差异。毕赤酵母细胞和哺乳动物细胞进行N-糖基化修饰的初始阶段是相同的，都是在细胞的内质网经过对蛋白质肽链序列中Ash-Xaa-Ser/Thr结构的Ash(天冬酰胺)酰胺基团的一系列修饰，形成寡糖核心Man8GlcNAc2结构。当含有Man8GlcNAc2的糖蛋白进入高尔基体后，由于人的高尔基体含有几种α-1，2-甘露糖苷酶(IA、IB和IC)，可以去除3个甘露糖(Man)形成复杂的N-糖苷链前体Man5GlcNAc2结构。而在毕赤酵母细胞的高尔基体内，则在α-1，6-甘露糖转移酶的作用下，在Man8GlcNAc2上添加甘露糖，形成了含有高甘露糖(Man9-14)结构的异质性N-糖苷链的糖蛋白。某些糖蛋白的这种非人源糖基化修饰可能会增加免疫原性，与人体细胞膜表面的甘露糖受体结合产生免疫反应，有些还可能改变糖蛋白的功能和特性，限制了毕赤酵母表达的重组糖蛋白在治疗中的应用[Hamilton S.R.，Bobrowicz P.，Bobrowicz B.，Davidson R.C.，Li H.，Mitchell T.，Nett J.H.，Rausch S.，Stadheim T.A.，Wischnewski H.，Wildt S.，Gerngross T.U.(2003)Production of Complex Human Glycoproteins in Yeast.Science，301：1244-46.Daly R.and Hearn M.T.W.(2005).Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris：a useful experimental tool in protein engineering and production.J.Mol.Recognit.18：119-138]。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种具有生物活性的、缺失了N-糖基化位点的低糖化突变体干扰素-λ1。
[0008] 本发明所提供的低糖化突变体干扰素-λ1，是将IFN-λ1成熟肽序列中Asn-Xaa-Ser(46NWS48)N46位的Asn置换为Gln(谷氨酰胺，将该突变命名为N46Q)后得到的蛋白质，命名为IFN-λ1-Nm，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
[0009] 序列表中的SEQ ID No.1由181个氨基酸残基组成，自N端第46位氨基酸残基为突变位点。
[0010] 编码上述低糖化突变体干扰素-λ1的基因(IFN-λ1-Nm)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
[0011] 序列表中的SEQ ID No.2由543个碱基组成，编码序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白，其中自5’端第136-138位碱基为突变位点。
[0012] 含有本发明基因IFN-λ1-Nm的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0013] 所述IFN-λ1-Nm的专用表达载体，是含有IFN-λ1-Nm基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体；所述IFN-λ1-Nm基因表达单元自上游至下游包括醇氧化酶(AOX)的启动子、α因子的前导肽(α-factor，α-F)编码序列、编码成熟肽IFN-λ1-Nm181个氨基酸残基的基因序列以及醇氧化酶(AOX)的终止子。
[0014] 为提高基因的表达效率，所述IFN-λ1-Nm基因表达单元在载体中的拷贝数优选为6。
[0015] 用于构建所述含有IFN-λ1-Nm基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体可为任意一种适于外源基因表达的嗜甲醇酵母表达载体，如pAO815等。以pAO815为出发载体，构建的含有6个拷贝的IFN-λ1-Nm基因表达单元的嗜甲醇酵母表达载体为pA-6IFNλ1-Nm。
[0016] 本发明还提供了一种表达IFN-λ1-Nm的专用工程菌。
[0017] 本发明所提供的表达IFN-λ1-Nm的专用工程菌，是将上述IFN-λ1-Nm的专用表达载体导入嗜甲醇酵母中得到的。
[0018] 所述嗜甲醇酵母可为任意适于蛋白表达的嗜甲醇酵母菌株，如嗜甲醇酵母菌株GS115等。以嗜甲醇酵母菌株GS115为出发菌株，构建的转化有pA-6IFNλ1-Nm的重组嗜甲醇酵母菌株命名为GS115/pA-6IFNλ1-Nm。
[0019] 本发明的再一目的是提供一种IFN-λ1-Nm的表达和纯化方法。
[0020] 本发明所提供的IFN-λ1-Nm的表达方法，是发酵上述IFN-λ1-Nm的专用表达工程菌，经诱导表达后，对发酵液进行纯化，得到均一化的IFN-λ1-Nm。
[0021] 所述发酵重组嗜甲醇酵母时所加入诱导剂甲醇的浓度优选为0.5％(体积百分比浓度)；对表达产物进行纯化的方法可为强阳离子交换层析和凝胶过滤层析的两步柱层析法。
[0022] 所述纯化方法具体为：纯化的第一步为阳离子交换层析，缓冲液A为50mM PBS(pH7.0)，缓冲液B为50mM PBS、1M NaCl、pH7.0；层析柱为SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司产品)，将诱导表达的培养上清加入5倍体积的缓冲液A稀释后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱上，洗脱采用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱，收集洗脱峰；纯化的第二步是将阳离子交换层析后的洗脱峰浓缩并进行凝胶过滤层析，缓冲液为50mM PBS、150mM NaCl、pH7.0，层析柱为Superdex 75，Hiload16/60预装柱(GE Healthcare Life Sciences公司产品)。
[0023] 本发明提供了一种具有生物活性的、缺失了N-糖基化位点的低糖化突变体干扰素-λ1。本发明提供的毕赤酵母N-糖基化修饰的改造方法是定点突变的方法，即在不影响IFN-λ1活性的情况下，利用定点突变的方法改变IFN-λ1氨基酸序列中的N-糖基化位点，阻断该重组蛋白在毕赤酵母诱导表达过程中N-糖基化位点的高甘露糖修饰过程。本发明实现了阻断毕赤酵母对IFN-λ1的N-糖基化位点的高甘露糖修饰过程，使IFN-λ1-Nm基因在嗜甲醇酵母中高效分泌性地正确表达，表达蛋白的均一性明显提高，表达水平大于65mg/L，表达的重组蛋白经两步柱层析纯化，其纯度大于98％，低糖化修饰的重组IFN-λ1-Nm蛋白具有和原嗜甲醇酵母表达的野生型IFN-λ1相同的生物学活性。本发明为高效、大量、低成本生产具有生物活性且均一性好的低糖化修饰的IFN-λ1提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
[0025] 图1为IFN-λ1-Nm基因片段的核苷酸序列分析结果
[0026] 图2为携带IFN-λ1-Nm基因表达单元的重组嗜甲醇酵母表达载体的限制性内切酶鉴定结果
[0027] 图3为GS115/pA-6IFNλ1-Nm发酵产物的SDS-PAGE和Western blotting检测结果
[0028] 图4为GS115/pA-6IFNλ1-Nm发酵及纯化产物的SDS凝胶高碘酸希夫碱法(PAS，periodic acid-Schiffs base method)染色结果
[0029] 图5为IFN-λ1-Nm生物活性检测结果
具体实施方式
[0030] 发明人研究中发现，已知IFN-λ1成熟肽的氨基酸序列中含有一个Asn-Xaa-Ser(46NWS48)结构的N-糖基化位点。在毕赤酵母中表达重组人IFN-λ1，可以在甘露糖转移酶的作用下，形成非均一的高甘露糖修饰的IFN-λ1产物，不仅给重组蛋白的分离和纯化带来困难，亦有可能增加重组蛋白的免疫原性。本发明通过对N-糖基化修饰的改造，使IFN-λ1在毕赤酵母中表达产生低糖化修饰的均一产物，提供了这种低糖化修饰的IFN-λ1的表达及纯化的方法，同时证明这种低糖化修饰的IFN-λ1仍然具有完好生物学活性及安全性。
[0031] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0033] 实施例1、本发明低糖化突变体干扰素-λ1基因(IFN-λ1-Nm)的获得[0034] 利用重叠延伸PCR技术对IFN-λ1基因片段的N-糖基化位点进行定点突变，将IFN-λ1基因片段中Asn的密码子序列aac置换成Gln的密码子序列caa，使IFN-λ的氨基酸序列中的46NWS48变为46QWS48，所用引物序列为：IFNλ1-Nm-F：
[0035] 5’-CAAGCTGAAA TGGAGTTGCA-3’ 和 IFNλ1-Nm-R：5’-TGCAACTCCATTTCAGCTTG-3’，小写斜体加黑碱基为Gln的密码子。
[0036] 以pA-αF-IFNλ120质粒为模板(该质粒的构建过程在专利权人为中国医学科学院基础医学研究所，专利号ZL 200510115720.3的发明专利中有详尽的描述)，第一轮PCR分别使用两对引物进行两个目的片段扩增，第一个片段用引物αFactor-F：5’-GGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATTTTT-3’，带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点和IFNλ1-Nm-R，第二个片段用引物IFNλ1-Nm-F和IFN-λ1-R1：5’-CGGAATTCGTGGGGTGTCAGGTGGACTCAG-3’，带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点。将两个目的片段等量(各50ng)混合，在含有dNTP 100μM、Taq DNA聚合酶2.5u/50μl的反应体系中，先经94℃1min，48℃1min，72℃1min，共5个循环的复性及延伸反应后，在反应体系内加入引物αFactor-F和IFN-λ1-R1各0.25μM，然后再以94℃40s，55℃40s，72℃1min的程序循环
25次。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了长度约为818bp的基因片段(该片段从N端起依次为EcoR I酶切位点-Kozak序列-α因子前导肽的编码序列-543bp的IFN-λ1-Nm基因序列-终止密码子-EcoR I位点)，回收并纯化该基因片段，将该基因片段克隆入pUC19质粒中得到重组质粒pUC-IFN-λ1-Nm，经DNA序列分析验证IFN-λ1的N-糖基化位点已完成了Q46对N46的置换，DNA序列分析结果如图1所示(方框中为突变的碱基序列)，与预期结构一致，测序结果表明经扩增获得了序列正确的低糖化突变体干扰素-λ1基因(IFN-λ1-Nm)，该基因具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，由543个碱基组成，自5’端第136-138位碱基为突变位点，编码序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白。
25次。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了长度约为818bp的基因片段(该片段从N端起依次为EcoR I酶切位点-Kozak序列-α因子前导肽的编码序列-543bp的IFN-λ1-Nm基因序列-终止密码子-EcoR I位点)，回收并纯化该基因片段，将该基因片段克隆入pUC19质粒中得到重组质粒pUC-IFN-λ1-Nm，经DNA序列分析验证IFN-λ1的N-糖基化位点已完成了Q46对N46的置换，DNA序列分析结果如图1所示(方框中为突变的碱基序列)，与预期结构一致，测序结果表明经扩增获得了序列正确的低糖化突变体干扰素-λ1基因(IFN-λ1-Nm)，该基因具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，由543个碱基组成，自5’端第136-138位碱基为突变位点，编码序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白。
[0037] 实施例2、IFN-λ1-Nm专用表达载体pA-6IFNλ1-Nm的构建
[0038] 用限制性内切酶EcoR I消化质粒pUC-IFN-λ1-Nm，回收约818bp的插入片段，与经EcoR I线性化的pAO815质粒载体(购自Invitrogen公司)连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，提质粒，得到重组质粒pA-IFNλ1-Nm，对质粒用EcoR I和Pst I进行酶切验证后再进行测序验证，验证结果表明获得了IFN-λ1-Nm基因插入位置、方向及序列(与序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列相符)均正确的重组嗜甲醇酵母表达载体，该表达载体含有IFN-λ1-Nm基因表达单元，即自上游至下游包括醇氧化酶(AOX)的启动子、α因子的前导肽的编码序列、编码成熟肽IFN-λ1-Nm181个氨基酸残基的基因序列以及醇氧化酶(AOX)的终止子。
[0039] 利用限制性内切酶BamH I和Bgl II将含有IFN-λ1-Nm基因表达单元(自上游至下游包括醇氧化酶(AOX)的启动子、α因子前导肽的编码序列、编码成熟肽IFN-λ1-Nm181个氨基酸残基的基因序列以及AOX终止子)-从载体pA-IFNλ1-Nm上切下，回收约2.09kb的片段，与用BamH I线性化的载体pA-IFN-λ1-Nm连接，转化大肠杆菌DH5α，用BamH I和Bgl II双酶切鉴定并获得表达单元片段正向插入的重组克隆，得到含有2个表达单元串联的重组质粒pA-2IFNλ1-Nm。用BamH I线性化pA-2IFNλ1-Nm质粒，与2.09kb的表达单元基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选并得到含有3个表达单元串联的重组质粒pA-3IFNλ1-Nm。用同样的方法在pA-3IFNλ1-Nm的基础上，回收约6.28kb的3拷贝表达单元，与用BamH I线性化的载体pA-3IFNλ1-Nm连接，鉴定并得到含有6个IFN-λ1-Nm基因表达单元串联的重组嗜甲醇酵母表达载体，命名为pA-6IFNλ1-Nm。在上述载体构建过程中酶切鉴定结果如图2所示(泳道1为pA-IFNλ1-Nm/EcoR I，箭头所示为818bp插入片段；泳道2为DNA分子量标记物DL2000plus，片段大小依次为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，
1000bp和750bp；泳道3为pA-IFNλ1-Nm/Pst I，箭头所示为1.8kb插入片段；泳道4为DNA分子量标记物λDNA/Hind III，片段大小依次为23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb和
2.0kb；泳道5为pA-IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有1个表达单元的2.09kb片段；泳道6为pA-2IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为重叠的两个片段，包括含有2个表达单元串联的4.18kb及载体固有的4.0kb片段；泳道7为pA-3IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有3个表达单元串联的6.28kb片段；泳道8为pA-6IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有6个表达单元串联的12.57kb片段)。
1000bp和750bp；泳道3为pA-IFNλ1-Nm/Pst I，箭头所示为1.8kb插入片段；泳道4为DNA分子量标记物λDNA/Hind III，片段大小依次为23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb和
2.0kb；泳道5为pA-IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有1个表达单元的2.09kb片段；泳道6为pA-2IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为重叠的两个片段，包括含有2个表达单元串联的4.18kb及载体固有的4.0kb片段；泳道7为pA-3IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有3个表达单元串联的6.28kb片段；泳道8为pA-6IFNλ1-Nm/BamH I+Bgl II，箭头所示为含有6个表达单元串联的12.57kb片段)。
[0040] 实施例3、IFN-λ1-Nm的转化、表达和纯化。
[0041] 一、转化嗜甲醇酵母
[0042] 取质粒pA-6IFNλ1-Nm 10μg，用限制性内切酶Sal I消化，以电穿孔转化法转化5
嗜甲醇酵母菌种GS115，转化菌涂布于MD培养基(1.34％YNB，4×10％生物素，2％葡萄糖)上30℃培养4-6天，筛选得到用于表达低糖化突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)的重组酵母菌株，命名为GS115/pA-6IFNλ1-Nm。
嗜甲醇酵母菌种GS115，转化菌涂布于MD培养基(1.34％YNB，4×10％生物素，2％葡萄糖)上30℃培养4-6天，筛选得到用于表达低糖化突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)的重组酵母菌株，命名为GS115/pA-6IFNλ1-Nm。
[0043] 二、低糖化突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)的表达
[0044] 接种单克隆GS115/pA-6IFNλ1-Nm重组酵母菌株于10mL BMG培养基(100mM磷酸5
钾，pH6.0，1.34％YNB，4×10％生物素，10％甘油)中，30℃振荡培养24h后转接至100mL BMG培养基中继续培养24h，离心收集菌体，重悬于500mL BMMY培养基(100mM磷酸钾，
5
pH6.0，1.34％YNB，4×10％生物素，1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇)中30℃振荡培养，进行诱导表达，每24h少量取样并补加甲醇至终浓度为0.5％以维持诱导，96h终止培养，离心去除酵母菌体，收集保留培养上清，用于进一步的鉴定及纯化。
钾，pH6.0，1.34％YNB，4×10％生物素，10％甘油)中，30℃振荡培养24h后转接至100mL BMG培养基中继续培养24h，离心收集菌体，重悬于500mL BMMY培养基(100mM磷酸钾，
5
pH6.0，1.34％YNB，4×10％生物素，1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇)中30℃振荡培养，进行诱导表达，每24h少量取样并补加甲醇至终浓度为0.5％以维持诱导，96h终止培养，离心去除酵母菌体，收集保留培养上清，用于进一步的鉴定及纯化。
[0045] 对表达产物进行15％SDS-PAGE和Western blotting[一抗为羊抗人IFN-λ1多克隆抗体(R&D公司产品)，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)]检测，结果如图3所示(A：SDS-PAGE电泳检测结果，泳道M为蛋白质分子量标记，片段大小依次为118kD，90kD，49kD，35kD，26kD和19kD；泳道1-4为诱导表达的IFN-λ1-Nm蛋白，依次为诱导24h，48h，72h和96h；泳道5为原嗜甲醇酵母表达的野生型IFN-λ1蛋白，箭头所示为高甘露糖修饰的IFN-λ1；B：Western blotting检测结果，上样顺序同图A)，可以看出在毕赤酵母中表达的野生型人IFN-λ1，在甘露糖转移酶的作用下，形成非均一的高甘露糖修饰的IFN-λ1产物，这将给重组蛋白的分离和纯化带来困难，而本发明经突变的低糖化突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)未产生箭头所示的高甘露糖修饰的IFN-λ1，将便于分离和纯化。
[0046] 三、低糖化突变体干扰素-λ1(IFN-λ1-Nm)的纯化
[0047] IFN-λ1-Nm蛋白纯化的第一步为阳离子交换层析，缓冲液A为50mM PBS(pH7.0)，缓冲液B为50mM PBS，1M NaCl，pH7.0；层析柱为SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司产品)。诱导表达的培养上清加入5倍体积的缓冲液A稀释后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱上，洗脱采用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱，收集洗脱峰。纯化的第二步是将阳离子交换层析后的洗脱峰浓缩并进行凝胶过滤层析，缓冲液为50mM PBS，150mM NaCl，pH7.0，层析柱为Superdex 75，Hiload 16/60预装柱(GE Healthcare Life Sciences公司产品)。
[0048] 对GS115/pA-6IFNλ1-Nm发酵及纯化产物进行PAS染色检测。PAS染色的原理是利用高碘酸溶液处理含有蛋白的凝胶，该溶液会氧化糖蛋白的顺式二元醇基团。所形成的醛基基团可以与所提供的酸性品红试剂形成希夫碱键并产生品红色的条带从而得到检测。PAS染色参照常规方法进行，结果如图4所示(泳道1为原嗜甲醇酵母表达的野生型IFN-λ1产物；泳道2为IFN-λ1-Nm表达产物；泳道3为野生型IFN-λ1经阳离子交换层析的洗脱产物；泳道4为IFN-λ1-Nm经阳离子交换层析的洗脱产物；泳道5为野生型IFN-λ1经凝胶过滤层析的洗脱产物；泳道6为IFN-λ1-Nm经凝胶过滤层析的洗脱产物，箭头所示为高甘露糖修饰的PAS染色产生的红色条带)。从图中可以看出，经过对IFN-λ1基因N-糖基化位点的改造后，表达产物中高甘露糖修饰的蛋白条带消失(泳道2)，提高了表达产物的均一性，表达水平大于65mg/L。与原嗜甲醇酵母表达的野生型IFN-λ1相比，一步阳离子交换层析即可有效地去除杂蛋白(泳道4)，而野生型IFN-λ1还有部分高甘露糖修饰的产物残留(泳道3)；经过两步柱层析纯化后，得到了纯度较高的重组人IFN-λ1-Nm，蛋白纯度大于98％，与野生型IFN-λ1相比(泳道5)，IFN-λ1-Nm蛋白的均一性也有明显提高(泳道6)。
[0049] 实施例4、重组人IFN-λ1-Nm生物活性检测。
[0050] 干扰素与细胞表面特异受体结合后，启动信号级联反应，导致干扰素刺激基因因子(ISGF，IFN-stimulated gene factor)进入细胞核与干扰素刺激反应元件(ISRE，IFN-stimulated response element)相互作用，从而调节基因的转录，最终产生干扰素介导的抗病毒、抗肿瘤细胞增殖以及免疫调节的生物学效应[Williams BR.(1991)Transcriptional regulation of interferon-stimulated genes.Eur J Biochem.200(1)：1-11]。以ISRE组装的报告基因质粒，通过检测ISRE转录活性水平可以5
反应干扰素的生物活性。以对数生长期的293T细胞，2×10个/孔接种于6孔板中，5％CO2、37℃培养8-12h，转染pISRE-TA-luc 5ug(上海碧云天生物技术有限公司)和pRL-SV40
0.1ug(Promega，内对照)质粒，5％CO2，37℃孵育24小时后，更换成无血清培养基2-4h；分别给予IFN-λ1和IFN-λ1-Nm 200ng/mL刺激，8小时后收集细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)检测报告基因水平。结果如图5(A)所示，IFN-λ1-Nm对ISRE的转录激活活性与IFN-λ1没有明显差异。
反应干扰素的生物活性。以对数生长期的293T细胞，2×10个/孔接种于6孔板中，5％CO2、37℃培养8-12h，转染pISRE-TA-luc 5ug(上海碧云天生物技术有限公司)和pRL-SV40
0.1ug(Promega，内对照)质粒，5％CO2，37℃孵育24小时后，更换成无血清培养基2-4h；分别给予IFN-λ1和IFN-λ1-Nm 200ng/mL刺激，8小时后收集细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)检测报告基因水平。结果如图5(A)所示，IFN-λ1-Nm对ISRE的转录激活活性与IFN-λ1没有明显差异。
[0051] IFN-λ1的生物活性之一是抑制肿瘤细胞增殖。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，是一种黄颜色的染料。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于生物活性因子的活3
性检测。收集对数生长期的HepG2细胞(肝癌细胞株)，以6×10个/孔接种96孔板，每孔加入100μl，5％CO2、37℃孵育8-12h。给予IFN-λ1和IFN-λ1-Nm刺激时，刺激物浓度为100、200、500和1000ng/mL，每个浓度设5个平行孔，加入量为每孔100μl，继续5％CO2，
37℃孵育72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，再培养4h，小心吸去孔内培养基，每孔加入150μl DMSO，低速振荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。结果如图5(B)所示，与IFN-λ1比较，IFN-λ1-Nm抑制HepG2细胞增殖的活性没有明显差异。上述两个实验表明低糖化突变体IFN-λ1仍然具有完好的抑制肿瘤细胞增殖生物学活性。
性检测。收集对数生长期的HepG2细胞(肝癌细胞株)，以6×10个/孔接种96孔板，每孔加入100μl，5％CO2、37℃孵育8-12h。给予IFN-λ1和IFN-λ1-Nm刺激时，刺激物浓度为100、200、500和1000ng/mL，每个浓度设5个平行孔，加入量为每孔100μl，继续5％CO2，
37℃孵育72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，再培养4h，小心吸去孔内培养基，每孔加入150μl DMSO，低速振荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。结果如图5(B)所示，与IFN-λ1比较，IFN-λ1-Nm抑制HepG2细胞增殖的活性没有明显差异。上述两个实验表明低糖化突变体IFN-λ1仍然具有完好的抑制肿瘤细胞增殖生物学活性。
[0052] 实施例5、重组人IFN-λ1-Nm急性毒性实验
[0053] 实验用昆明小白鼠，20g±，雌性(购自军事医学科学院实验动物所)，按SPF级(无特殊病原体)动物要求饲养。给药途径为腹腔注射，1次给药后连续观察14天，记录死亡率和体重变化。实验设计分组：10只/组，最大给药剂量：10mg/kg，2倍稀释递减，最低剂量组为1.25mg/kg，共4组。实验结果见表1：
[0054] 表1重组人IFN-λ1-Nm急性毒性实验结果
[0055]
[0056] 四个剂量组的所有小鼠体重增长正常，未见明显毒副作用症状，无死亡，表明在现有剂量范围内，即使重组IFN-λ1-Nm的一次性给药剂量达到10mg/kg，亦未能达到药物的最大耐受剂量。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-12 | 1042 |
| 用于抗原特异性T细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 501 |
| 皮肤角质干细胞增殖用组合物 | 2020-05-13 | 692 |
| 细胞增殖因子Fwap10576 | 2020-05-11 | 981 |
| 检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法 | 2020-05-12 | 77 |
| 细胞增殖袋及细胞增殖装置 | 2020-05-11 | 302 |
| 细胞增殖剂 | 2020-05-11 | 875 |
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 116 |
| 抑制EGFR导致的癌症中细胞增殖的方法 | 2020-05-13 | 646 |
| 上皮系细胞增殖促进剂 | 2020-05-12 | 293 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈