为了维持生理性生长和肥胖过程中的血糖量正常，胰腺β细胞 增殖是一种重要的适应机制。越来越多的证据表明β细胞质量是动 态的，并且在胰岛素抵抗和妊娠过程中对胰岛素分泌的要求有所增 加，这可能引起β细胞质量迅速而明显的变化。β细胞质量由β细 胞生长(复制)和β细胞死亡(凋亡)之间的平衡来控制，然而， 控制β细胞质量的因素的分子基础仍有待阐明。理解β细胞质量是 如何调控的，对于设计合理途径以在胰岛素抵抗状态下防止胰腺β 细胞损失以及扩充用于1型糖尿病中的移植的β细胞非常重要。
在发育过程中，β细胞由胰腺祖细胞群产生。由祖细胞分化的 β细胞是有丝分裂期后的，直接谱系示踪研究表明祖细胞群在胚胎 形成的整个过程中持续存在，以允许新β细胞的分化。在新生儿期， 新β细胞通过分化的β细胞复制而形成，引起β细胞质量的巨大增 加。除了在需求增加的条件下，成人期β细胞数量几乎没有增加。 在妊娠过程中，在啮齿动物和人类中，均观察到β细胞显著增殖。 这是由于暴露于胎盘催乳素(PL)、催乳素(PRL)和生长激素(GH) 的β细胞减数分裂活性增加。人们对病理性胰岛素抵抗状态下的生 长刺激信号则理解得比较少。
几种胰岛素抵抗和糖尿病的小鼠模型，例如ob/ob和db/db小 鼠或者通过胰岛素受体底物-1(IRS-1)基因失活或胰岛素受体和 IRS-1的双杂合(DH)敲除产生的突变小鼠，表现出显著的胰岛增 殖。相反，IRS2功能的丧失则引起β细胞显著减少和糖尿病。已知 葡萄糖本身刺激β细胞复制，然而，多种上述小鼠模型在出现可检 测的高血糖症之前，其总胰岛质量已经增加了。而且，大多数情况 下，所述增殖反应与高血糖症水平没有关系，暗示可能有不依赖于 葡萄糖的因素促进胰岛生长。
发育过程中的内分泌胰腺生长依赖于多种转录因子，所述转录 因子表现出高度特异的时空表达模式，其控制细胞分化机制。在早 期胰腺发育过程中，内分泌祖细胞的细胞命运决策和分泌祖细胞分 化成产生激素的胰岛细胞，受到特异性转录因子顺序表达的严密调 控。这些因子的表达对于维持成人(成体)生命中的正常胰腺β细 胞功能也非常重要。例如，几种转录因子的突变导致2型糖尿病的 一个亚型，称为青春晚期糖尿病(MODY)，其特征在于常染色体显 性遗传、发病年龄早，且形成具有胰岛素分泌累积性障碍的显著高 血糖症。MODY最常见的形式由编码肝细胞核因子(Tcf1)的基因 突变引起。Tcf1功能丧失的突变小鼠以及转基因小鼠(其表达胰腺 β细胞中天然存在的显性失活形式的人HNF-1(P291fsinsC))，由 于葡萄糖刺激的胰岛素分泌障碍，表现出随年龄累积的高血糖症。 这些小鼠表现出β细胞数量、增殖速率和胰腺胰岛素含量的累积性 减少。这些数据表明Tcf-1靶基因对于维持正常β细胞质量也是必 需的，尽管其身份仍然未知。

在一个具体实施方式中，本发明提供一种分离的核酸，其包含 编码TMEM27蛋白的基因的调控区，其中所述调控区包含至少一 个Tcf1蛋白的高亲和力结合位点。在一个具体实施方式中，所述调 控区具有对应于或同源于SEQ ID NO：10或11的核酸序列。在另一 个具体实施方式中，所述结合位点包含对应于或同源于SEQ ID NO：12、13、14或15的核酸序列。在另一个具体实施方式中，本 发明提供一种细胞，或者在另外一个具体实施方式中，提供包含本 发明核酸的载体。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种分离的多肽，其包 含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小约25kDa，且包 含对应于或同源于SEQ ID NO：16的序列的N-末端片段。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种增加胰腺β细胞质 量的方法，所述方法包括用TMEM27多肽接触胰腺β细胞或可经 诱导变成胰腺β细胞的细胞，且提供有利于β细胞增殖的条件。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种增加胰腺β细胞质 量的方法，所述方法包括用编码TMEM27多肽的核酸接触胰腺β 细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞，且提供有利于所述核酸表 达的条件。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种改变患者新陈代谢 的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或编码所述TMEM27多肽 的核酸接触胰腺β细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种抑制、遏制或治疗 患者糖尿病的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或编码所述 TMEM27多肽的核酸接触胰腺β细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的 细胞。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种估计患者胰岛质量 的方法，所述方法包括确定所述患者血清中TMEM27浓度的步骤 以及将所述浓度与对照浓度进行比较的步骤。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种用于鉴定与 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包括 在足以促进所述多肽与所述感兴趣分子之间特异性相互作用的条 件下，用感兴趣分子接触TMEM27多肽一段时间，以及鉴定所述 感兴趣分子的步骤。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种增加胰腺β细胞质 量的方法，所述方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触胰腺β 细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞，并提供利于所述核酸表达 的条件。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种改变患者新陈代谢 的方法，所述方法包括用用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触胰腺β 细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种抑制、遏制或治疗 患者糖尿病的方法，所述方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接 触胰腺β细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞。
附图说明
图1表明TMEM27的表达受Tcf1调控。(A)相比野生型小鼠 对照，Tcf1-/-小鼠胰岛中的TMEM27表达降低。用RT-PCR测定表 达水平，GAPDH用作对照。(B)启动子分析在人类调控区(SEQ ID NO：10)和小鼠调控区(SEQ ID NO：11)TMEM27基因上游预 测了两种保守的Tcf结合位点，位于相对于转录起始位点-60和- 117的碱基对。将人类和小鼠启动子序列进行比对，并将Tcf结合 位点用蓝色框起来。第二位点(红框)表示推定的Pdx-1结合位点。 加亮的序列(绿色)表示突变Tcf结合位点的位置。(C)HepG2细 胞中的转录激活分析，该细胞用pcDNA3或pTcf1、pCMV-β-半乳 糖苷酶和利用815bp TMEM27小鼠启动子的萤光素酶报告子基因 进行转染。Tcf结合位点在所述报告载体的启动子序列中单独发生 突变，而MIN6细胞用载体pT271uc-wt、pT271uc-m1或pT271uc-m2 进行转染。将萤光素酶活性相对于β半乳糖苷酶活性进行标准化。 每一个数值均代表8次独立试验的平均值。(D)利用针对Tcf结合 位点1和2的寡核苷酸以及MIN6的总细胞提取物进行的EMSA分 析。竞争物表示50倍过剩、针对结合位点1和2的未标记双链寡 核苷酸。暗色(深色)楔子表示Tcf1与标记32P标记的探针之间的 相互作用，亮色(浅色)楔子表示加入α-Tcf1抗体后该相互作用的 抗体胶移动。Pdx1也结合于位点2，因为该相互作用可以通过抗 -Pdx1抗体而变动。(E)MIN6细胞中的ChIP分析证实了Tcf1与 TMEM27启动子的体内相互作用。通过PCR扩增跨越结合位点1 和2的150bp区域。该相互作用在不表达TMEM27的原代肝细胞 中不存在。用于Tcf1的ChIP通过扩增ApoM启动子内跨越Tcf1 结合位点的区域而进行验证。
图2表明TMEM27在发育过程中的小鼠胰腺中表达。用抗 Col-4、抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体对来自小鼠发育过程指定时间 点的石蜡包埋胰腺组织进行免疫荧光。
图3表明TMEM27是N-糖基化蛋白且形成二聚体。(A)将 MIN6细胞与量不断增加的衣霉素一起孵育，衣霉素在天(门)冬 酰胺残基抑制糖基化作用。仅向细胞加入DMSO则无效应。(B) 将MIN6细胞的上清与N-聚糖酶一起孵育。Western印迹中的分子 量变动表示所述酶从分泌的TMEM27去除了糖部分。分泌蛋白用 抗Col-3抗体进行检测。(C)将MIN6细胞裂解物与PBS或交联剂 DTBP和BMH一起孵育。非还原条件下的SDS-PAGE和利用抗 Col-4抗体的免疫印迹显示有一个条带的分子量为全长TMEM27分 子量的2倍。在还原条件下，在PBS和DTBP处理的细胞裂解物中 则仅检测到单体。相反，由于BMH交联不可逆，所以在BMH处 理的样品中，二聚体持续存在。
图4表明TMEM27从胰岛的β细胞上切割并分泌。(A)在 MIN6细胞的Western印迹中，抗Col-4抗体检测到TMEM27的两 个条带。在过表达pTMEM27.V5-His的细胞中，25kDa条带变得更 加丰富。(B)来自(A)的细胞裂解物的免疫印迹用抗α-V5抗体 进行检测。在pTMEM27.V5-His转染的细胞中，抗V5抗原表位的 抗体也检测到两种条带，在pcDNA3转染的细胞中则未检测到。 (C)表示细胞系用pcDNA3或pTMEM27进行转染，用抗Col-4 在细胞裂解物的Western印迹中检测到了全长蛋白。用抗Col-3则 仅在MIN6细胞的上清中检测到分泌蛋白。全长蛋白表达增加仅引 起MIN6细胞中分泌蛋白的量增加。(D)分离小鼠胰岛并孵育72 小时。收集上清并将胰岛转移至裂解缓冲液中。在裂解物的Western 印迹中用抗Col-4检测到全长蛋白，在用相同体积上清上样的进行 的Western印迹中则用抗Col-3检测到分泌蛋白。(E)MIN6细胞用 针对GFP或TMEM27的siRNA进行电穿孔。在用si-TMEM27#1 和#2进行电穿孔的细胞中，于电穿孔后48小时用抗Col-4检测到 TMEM27蛋白水平的降低。用来自相同细胞、体积相等的上清进行 SDS-PAGE，用抗Col-3检测到分泌蛋白的水平降低。(F)MIN6细 胞用pcDNA3、pTMEM27或pTMEM27-HA进行电穿孔。通过利用 抗Col-4抗体的细胞裂解物进行Western印迹，检测到TMEM27过 表达。来自相同细胞的上清用抗HA抗原表位的抗体进行Western 印迹。
图5表明TMEM27定位于胰腺β细胞的小囊泡中和细胞膜上。 (A)将MIN6细胞用0.01％皂角甙进行透化并用抗Col-4抗体进行 染色。利用抗Col-3抗体进行免疫荧光显微镜检查，给出了类似结 果。(B)用抗Col-4抗体对MIN6细胞进行电子显微镜检查，将 TMEM27定位于小囊泡中。轭合于10nm金颗粒的IgG用于检测所 述抗体。(C)利用与(B)中相同的方法，在与细胞膜融合过程中 检测到包含TMEM27的小囊泡。
图6表明TMEM27增加β细胞的体外复制。(A)在从ob/ob 小鼠和野生型小鼠对照分离的胰岛中，用半定量RT-PCR测定 TMEM27的表达水平。GAPDH用作上样对照。(B)在从转基因 aP-Srebplc小鼠及其野生型小鼠(同窝出生仔)对照中，如上测定 TMEM27的表达水平。(C)从野生型和ob/ob小鼠分离的胰岛数量 和大小匹配，并在相同体积的培养基中孵育72小时。用抗Col-3 检测分泌蛋白。(D)MIN6细胞用针对萤光素酶或TMEM27的 siRNA进行电穿孔。摄制20倍放大的细胞代表图像。电穿孔后48 小时，将细胞用胰蛋白酶进行处理、用锥虫蓝染色并用血细胞计数 器进行计数。每一个数值均代表6次独立实验的平均值。(E)MIN6 细胞用pcDNA3或pTMEM27进行电穿孔，如上重复实验。(F) MIN6细胞如所指定的进行电穿孔，通过[3H]胸苷掺入来测量细胞的 复制。
图7表明，响应于胰腺β细胞中TMEM27表达增加而出现胰 岛质量增加。(A)在从RIP-TMEM27转基因小鼠和野生型小鼠对 照分离的胰岛Western印迹中，用抗Col-4检测到TMEM27表达增 加。(B)将来自转基因和对照动物(n＝3)的整个胰腺在石蜡中包 埋，并针对胰岛素进行染色。图像代表每一种基因型在5倍放大的 图示。(C)利用Metamorph软件对7μm切片中的胰岛素染色进行 定量。对每一个胰腺，均在距离大于200μm的切片中定量至少50 个胰岛。(D)将整个胰腺从转基因和野生型小鼠(n＝3)上分离， 并在酸/乙醇中均质化。胰岛素含量相对于每个胰腺重量进行标准 化。
图8表明TMEM27可以是丝氨酸和/或金属蛋白酶的底物。相 比于与佛波酯佛波(12-)-肉豆蔻酸(-13-)乙酸(PMA)或与BB94+PMA 一起孵育的MIN6细胞，与丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂BB94 一起孵育的MIN6细胞具有较低水平抗体识别的已切割N末端。用 抗V5(其标记TMEM27的C末端)抗体检测的细胞，在所有小组 中均表现出可比较的条带。

在接下来的详细描述中，为了提供对本发明的彻底理解，列出 了大量特殊细节。然而，本领域的技术人员能理解本发明可以在无 这些特殊细节的情况下实施。在其他实例中，为了使本发明清楚， 未对公知的方法、步骤和组分进行详细描述。
在一个具体实施方式中，本发明提供一种胰腺β细胞特异蛋白， 其参与β细胞增殖和胰岛素分泌。
如本文所述，MODY常见形式由编码肝细胞核因子(Tcf1)的 基因突变引起。胰腺β细胞中Tcf1功能丧失的突变小鼠，由于葡萄 糖刺激的胰岛素分泌障碍，表现出随年龄累积的高血糖症。所述小 鼠表现出β细胞数量、增殖速率和胰腺胰岛素含量的累积性减少， 表明Tcf1靶细胞对于维持正常β细胞质量也是必需的。Tcf1是 TMEM27转录的直接激活剂，如本文中所证实的。本文中显示在胰 腺发育过程中TMEM27在激素阳性细胞中表达，在成熟胰腺中则 限于胰腺β细胞中表达。已表明TMEM27是一种糖蛋白，在胰腺 中特异性切割并由β细胞释放，且是体外和体内β细胞复制的刺激 剂。
在一个具体实施方式中，本发明提供一种分离的核酸，其包含 编码TMEM27蛋白的基因的调控区，其中所述调控区包含Tcf1蛋 白的至少一个高亲和力结合位点。
在一个具体实施方式中，术语“调控区”指的是启动子，其是 一种DNA序列，在一个具体实施方式中，其位于编码序列的上游， 对于基因的基础转录和/或调控转录非常重要。
在一个具体实施方式中，该启动子是内源性启动子，包含Tcf1 蛋白的至少一个高亲和力结合位点。在一个具体实施方式中，该启 动子是内源性启动子的突变体，其包含至少一个Tcf1蛋白的高亲和 力结合位点。该启动子序列中的突变可以增强Tcf1结合，或者在另 一个具体实施方式中延迟Tcf1解离，或者在另一个具体实施方式 中，通过任何途径改变Tcf1与TMEM27启动子的结合，从而影响 其转录。在另一个具体实施方式中，将根据得到的TMEM27表达 水平来评估这些突变体的启动子强度。
在一个具体实施方式中，该调控区具有对应于或同源于SEQ ID NO：10或11的核酸序列。
用于本发明中的核酸可以通过本领域中公知的任何合成或重 组方法而生成。核酸还可以利用本领域中已知的技术经修饰而改变 生物物理学或生物学特性。例如，该核酸可以经修饰增加其对核酸 酶的稳定性(例如，“末端加帽”)，或改良其亲油性、溶解度或对 互补序列的结合亲和力。这些核酸可以包含载体、表达盒、启动子 序列、感兴趣基因或其任何组合。
根据本发明所述的DNA也可以通过本领域中已知的方法化学 合成。例如，所述DNA可以通过本领域中已知的方法全部或部分 从四种核苷酸化学合成。这些方法包括Caruthers(1985)中描述的方 法。DNA也可以通过制备重叠的双链寡核苷酸、填补空缺并将末 端连接在一起而合成(通常参见：Sambrook et al.(1989)和Glover et al.(1995))。表达该蛋白功能性同系物的DNA可以通过位点指导 (Site-directed)的诱变作用由野生型DNA制备而得到(见例如 Zoller et al.(1982)；Zoller(1983)；和Zoller(1984)；McPherson(1991))。 得到的DNA可以通过本领域中已知的方法而扩增。一个恰当的方 法是在Saiki et al.(1988)、Mullis et al.、美国专利第1,683,195号和 Sambrook et al.(1989)中描述的聚合酶链式反应(PCR)法。
在另一个具体实施方式中，该Tcf1结合位点包含对应于或同源 于SEQ ID NO：12、13、14或15的核酸序列。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种包含本发明核酸的 细胞，或者在另外一个具体实施方式中，提供包含本发明核酸的载 体。
在一个具体实施方式中，术语“载体”指的是包含感兴趣序列 (其已经在该载体内亚克隆)的核酸构建体。
为了产生根据本发明所述的载体，编码TMEM27调控区的多 核苷酸，(在一些具体实施方式中，为TMEM27的编码区，而在一 些具体实施方式中为其他感兴趣序列)可以连接入市售的表达载体 系统中，所述表达载体系统适于转导/转化真核或原核细胞以指导被 转导/转化的细胞内重组产物的表达。应该理解，为了取代、复制或 突变现存的启动子或增强子序列和/或引入任何其他多核苷酸序列， 例如编码其他选择标记物的序列或编码报告子基因的序列，可以很 容易通过通常使用的重组技术而改良这些市售载体系统。
在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的载体可以进一步 包括恰当的可选择标记物。该载体可以进一步包括复制起始点，而 且可以是穿梭载体，其既可以在原核细胞又可以在真核细胞中繁 殖，或者该载体可以经构建促进其在选择微生物基因组内整合。在 其他具体实施方式中，该载体可以为例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘 粒、噬菌体、病毒或人工染色体。在另一个具体实施方式中，本发 明提供包含本发明所述核酸和载体的脂质体。用于制备这种脂质体 的方法在本领域中是公知的，正如在例如WO 96/18372、WO 93/24640、Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691、Rose美国专利第5,279,833号；WO 91/06309，以及 Feigner et al.(1987)Proc.Natl.Acid.Sci.USA 84：7413-7414)中所描述 的。
在另一个具体实施方式中，本发明提供分离的多肽，包含 TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小约25kDa，且包含 对应于或同源于下述序列的N末端片段： MLWLLFFLVTAIHAELCQPGAENAFKVRLSIRTALGDKAYAWDT NEEYLFKAMVAFSMRKVPNREATEISHVLLCNVTQRVSFWFVV TDPSKNHTLPAVEVQSAIRMNKNRINNAFFLNDQTLEFLKIPSTL APPMDPSVPIWIIIFGVIFCIIIVAIALLILSGIWQRRRKNKEPSEVD DAEDKCENMITIENGIPSDPLDMKGGHINDAFMTEDERLTPL(SE Q ID NO：16)。在一个具体实施方式中，该分泌形式包含142个氨基 酸。在另一个具体实施方式中该分泌形式包含N末端的100个氨基 酸，或者在另一个具体实施方式中包含N末端的105个氨基酸，或 者在另一个具体实施方式中包含N末端的110个氨基酸，或者在另 一个具体实施方式中包含N末端的115个氨基酸，或者在另一个具 体实施方式中包含N末端的120个氨基酸，或者在另一个具体实施 方式中包含N末端的125个氨基酸，或者在另一个具体实施方式中 包含N末端的130个氨基酸，或者在另一个具体实施方式中包含N 末端的135个氨基酸，或者在另一个具体实施方式中包含N末端的 140个氨基酸，或者在另一个具体实施方式中包含N末端的122个 氨基酸，或者在另一个具体实施方式中包含N末端的127个氨基酸， 或者在另一个具体实施方式中包含N末端的117个氨基酸，或者在 另一个具体实施方式中包含N末端的108个氨基酸。
在一个具体实施方式中，TMEM27蛋白具有的序列对应于或同 源于一个NCBI’s Entrez蛋白质数据库中披露的序列，具有下列登 陆号：NP_065651、AAH50606、AAH15099、XP_416821、AAH49912 或者AAH14317。在一个具体实施方式中，本发明所述的多肽包含 的氨基酸对应于TMEM27蛋白1-142位置的氨基酸，或者在另一个 具体实施方式中对应于其N末端片段，或者在另一个具体实施方式 中，对应于其同系物。
在一个具体实施方式中，任何情况下，术语“同源性”、“同系 物”或“同源的”均表示所提到的序列，无论是氨基酸序列还是核 酸序列，均表现出与指定序列至少70％的一致性。在另一个具体实 施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少72％ 的一致性。在另一个具体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列 表现出与指定序列至少75％的一致性。在另一个具体实施方式中， 所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少77％的一致性。 在另一个具体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指 定序列至少80％的一致性。在另一个具体实施方式中，所述氨基酸 序列或核酸序列表现出与指定序列至少82％的一致性。在另一个具 体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少 85％的一致性。在另一个具体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸 序列表现出与指定序列至少87％的一致性。在另一个具体实施方式 中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少90％的一致 性。在另一个具体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出 与指定序列至少92％的一致性。在另一个具体实施方式中，所述氨 基酸序列或核酸序列表现出与指定序列至少95％的一致性。在另一 个具体实施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表现出与指定序列 95％-100％的一致性。类似地，如在本文中使用的，提到与一个特 定序列的一致性既包括直接对应，也包括与该序列的同源性，如在 本文中所定义的。
在一个具体实施方式中，术语“多肽”指的是蛋白，在另一个 具体实施方式中指的是蛋白片段，或者在另一个具体实施方式中指 的是一串氨基酸。在一个具体实施方式中，在提到本发明的任何多 肽时，提到“肽”或“多肽”，其意思既包括天然肽(降解产物、 合成肽或重组肽)以及拟肽(通常是合成肽)，例如类肽和半类肽， 其为肽类似物，可能含有(例如)修饰使得所述肽在体内更加稳定 或者更易于渗入细胞内。这种修饰包括但不限于N末端、C末端或 肽键修饰，后者包括但不限于主链修饰和残基修饰，每一种均代表 本发明一个另外的具体实施方式。用于制备拟肽化合物的方法是本 领域中公知，且在例如Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中进行了详细说明。
应该理解，通过任何途径得到的天然或合成的任何氨基酸序 列，只要表现出与本文中所描述多肽的序列、结构或功能同源性， 均认为是本发明的一部分。
在一个具体实施方式中，在提到任何核酸序列时，术语“同源 性”均表示候选序列中的核苷酸与相应的天然核酸序列核苷酸一致 的百分比。
同源性可以利用本领域中详细描述的方法通过用于序列比对 的计算机算法来确定。例如，核酸或氨基酸序列同源性的计算机算 法分析可以包括利用任何数量的可用软件包，如BLAST、DOMAIN、 BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和 TREMBL包。
另一种确定核酸同源性的方法是通过确定候选序列的杂交作 用，其方法在本领域中已经详细描述过(见例如“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，and Higgins S.，Eds.(1985)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(Volumesl-3)Cold Spring Harbor Press，N.Y.；以及Ausubel et al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.)。例如，对编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补 物，杂交方法可以在中度到严格条件下实施。杂交条件为例如在一 种溶液中42℃孵育过夜，该溶液中含有：10-20％甲酰胺、5×SSC (150mM NaCl、15mM枸橼酸钠)、50mM磷酸钠(PH 7.6)、 5×Denhardt’s液、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml变性的剪切鲑精 DNA。
在另一个具体实施方式中，本发明提供特异性识别本发明所述 多肽的抗体。这样一种抗体的生产在本领域中是公知的，可以包括 如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988中描述的方法。在一个具体实施 方式中，这种抗体可以包含功能片段，其为本领域中技术人员所熟 知，且可以通过抗体的蛋白水解或者通过编码该片段的DNA在 E.coli或哺乳动物细胞(例如中华仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白 表达系统)内表达而制备。
在另一个具体实施方式中，本发明提供包含本发明所述细胞、 多肽、抗体、核酸和载体的组合物。特定组合物制剂的有效剂量和 给药方法可以根据特定应用而不同。剂量可以作为(例如)所采用 载体类型和给药途径的函数而变动。
在另一个具体实施方式中，本发明提供包含本发明所述核酸、 载体或多肽的细胞。在一个具体实施方式中，该细胞为原核细胞， 或在另一个具体实施方式中，所述细胞为真核细胞。细胞可以为任 何能够表达本发明所述分离的核酸和/或载体的细胞，如本领域中技 术人员已知的。在一个具体实施方式中，细胞可以过表达本发明所 述的多肽。
在另一个具体实施方式中，细胞响应本发明所述的多肽。在一 个具体实施方式中，所述细胞是胰腺β细胞或可能分化为胰腺β细 胞的细胞。在一个具体实施方式中，所述细胞一旦暴露于TMEM27 (在一个具体实施方式中，其为全长蛋白，或者在另一个具体实施 方式中，其为已切割的分泌形式)就出现增殖，或者在另一个具体 实施方式中分泌胰岛素，或者在另一个具体实施方式中，既增殖又 分泌胰岛素。在一个具体实施方式中，所述细胞是终末分化的，或 者在另一个具体实施方式中为不分裂的。在另一个具体实施方式 中，所述细胞是分裂的。
在一个具体实施方式中，本发明提供核酸、载体、多肽、细胞 以及包含上述物质的组合物，在另一个具体实施方式中，其可能经 配制用于口服给药，在另一个具体实施方式中经配制用于局部给 药，例如通过气雾剂、肌内或经皮肤给药或者通过肠胃外应用。根 据给药方法的不同，组合物可以以多种单位剂量形式给药。恰当的 单位剂量形式包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂 等。经皮肤给药可以通过应用能够允许活性化合物渗入皮肤的膏状 物、冲洗剂、凝胶等而实现。肠胃外给药途径包括但不限于电注射 或直接注射例如直接注射入中枢静脉输血导管、静脉内、肌内、腹 膜内、皮内或皮下注射。
本文中证实TMEM27在新生儿和成人胰腺的胰岛β细胞内表 达(图2)，且发现TMEM27蛋白的N末端切割产物被分泌(图4)。 β细胞系响应于TMEM27而增殖(图6)，由于所述转基因的表达， 过表达该蛋白的转基因小鼠表现为β细胞质量增加(图7)。
在一个具体实施方式中，本发明提供一种增加胰腺β细胞质量 的方法，其中所述方法包括用TMEM27多肽接触细胞。根据本发 明所述的这个方面，且在一个具体实施方式中，所述细胞是胰腺β 细胞，或者所述细胞可以经诱导变成胰腺β细胞，并提供利于β细 胞增殖的条件。
在一个具体实施方式中，术语“接触细胞”指的是细胞暴露于 本发明所述的肽、核酸或组合物。细胞可以与本发明所述的化合物 和组合物直接接触，或者通过本领域中已详细描述的方法间接暴 露。例如，在体外培养基中生长的细胞，其中所述培养基用本发明 所述的多肽、核酸、载体或组合物加以补充，为一种接触细胞方法 的实例，且认为是本发明的一部分。在另一个具体实施方式中，接 触细胞可以包括任何对患者的给药途径，例如将本发明所述的肽、 核酸、载体或组合物通过口服或肠胃外给予患者，其中给药使得体 内特定部位中的体内细胞暴露于这些物质。
在一个具体实施方式中，所述被接触细胞是原代培养物。在一 个具体实施方式中，“原代培养物”表示允许从组织中分离的多种 不同细胞类型相互作用的混合细胞群。例如，胰腺导管细胞的原代 培养物可以允许间充质细胞和上皮细胞之间的相互作用。
在另一个具体实施方式中，原代培养物可以为从组织中分离的 纯化细胞群。在一个具体实施方式中，所述原代培养物可以对一种 特殊(细胞)群进行富集。在一个具体实施方式中，富集可以包括 通过本领域中公知的方式进行细胞分选，例如荧光激活细胞分类术 (FACS)，用于例如表达特定细胞表面标记物的细胞群，或者在另 一个具体实施方式中，用于无特定标记物的细胞表面表达的细胞 群。在另一个具体实施方式中，可以采用磁分离法，或者在另一个 具体实施方式中，可采用密度离心法如聚蔗糖-泛影葡胺或蔗糖梯度 分离法。
在一个具体实施方式中，根据本发明方法所述的被接触细胞是 干细胞或祖细胞。术语“祖细胞”作为“干细胞”的同义词使用， 在一些具体实施方式中指的是能够增殖并产生更多祖细胞的未分 化细胞，所述祖细胞具有产生大量母细胞的能力，母细胞又能产生 分化的或可分化的子细胞。在一个具体实施方式中，术语祖细胞或 干细胞指的是无显著特点的母细胞，其后代(子代)常常可以通过 分化(例如通过获得彻底个体化特征)而向不同方向而特殊化，如 在胚胎细胞和组织的渐进性多样化中所发生的。细胞分化是一种复 杂过程，通常通过多次细胞分裂而发生。分化的细胞可以起源于多 潜能细胞，其本身来自多潜能细胞，等等。应该理解任何这种细胞 均可用于本发明所述的方法，或者包含本发明所述的细胞。这种能 力可以是天生的，或者可以在用多种因子治疗后人工诱导，两种方 案之一均可认为是所述细胞的具体实施方式，其可根据本发明所述 的方法而使用，或者包含本发明所述的细胞。
在一个具体实施方式中，本发明所述的细胞以及用于本发明所 述方法的细胞来源于胰腺，或者可分化为胰腺细胞。在一个具体实 施方式中，术语“胰腺”通常指的是横向位于胃后、脾和十二指肠 之间的大、伸长、总状分枝的腺体。在一个具体实施方式中，根据 本发明所述的细胞可以包括组织切片或整个组织，其包括本文中所 述的多肽、核酸、载体或组合物。在另一个具体实施方式中，根据 本发明所述的方法包括器官培养物，或者在另一个具体实施方式 中，包括组织切片或组织片段，其包含感兴趣细胞群。在一个具体 实施方式中，使用胰岛作为该细胞并用于本发明的方法中。在一个 具体实施方式中，所述细胞是β细胞，可构成胰岛细胞的60-80％， 和/或可用于本发明所述的方法中。
在一个具体实施方式中，所述细胞是胰腺祖细胞。在一个具体 实施方式中，术语“胰腺祖细胞”指的是可以分化为胰腺谱系细胞 的细胞，例如能产生通常由胰腺细胞产生的激素或酶的细胞。例如， 可以引起胰腺祖细胞至少部分分化为α、β、γ或δ胰岛细胞或者具 外分泌命运的细胞。本发明所述的胰腺祖细胞也可以在给予患者前 在能够促进细胞增殖和分化的条件下培养。这些条件包括培养细胞 允许体外增殖和融合，这时，所述细胞可以经制备形成假胰岛状聚 集体或簇，并分泌胰岛素、胰高血糖素和/或生长抑素。
在一个具体实施方式中，本发明所述的细胞以及用于本发明所 述方法的细胞，可以为基本纯化的细胞群。在一个具体实施方式中， 术语“基本纯化的”指的是一群细胞，相对于整个细胞群，其至少 约65％，或者在另一个具体实施方式中至少约70％，或者在另一个 具体实施方式中至少约75％，或者在另一个具体实施方式中至少约 85％，或者在另一个具体实施方式中至少约90％，或者在另一个具 体实施方式中至少约95％为纯化的。
可以采用多种技术从组织获得细胞(分化和未分化的)悬浮液， 构成本发明所述细胞和/或用于本发明所述方法。在一些具体实施方 式中，分离操作是那些尽可能少地引起细胞死亡的操作。例如，所 述细胞可以通过机械方式从分离块样品中取出，例如用移液管机械 剥离。在其他情况下，可能从整个分离块或其一部分解离祖细胞， 例如通过酶消化该分离块，随后根据特定细胞标记物分离激活的祖 细胞群，例如利用亲和力分离技术或荧光激活细胞术(FACS)。细 胞可以通过离心从液体样品例如血液中获得。
通常，所述组织可利用任何恰当方法制备，例如通过轻柔挑拨 离体组织或通过用胶原酶(例如胶原酶A)消化离体组织，借助于 (为了阐明)通过导管渗透或例如将剥离组织在含有恰当pH和张 力强度的缓冲液的胶原酶中的简单孵育。可选地，随后所述制备的 组织可以利用恰当的方法和材料浓缩，例如通过聚蔗糖梯度离心来 浓缩(或者部分纯化)。浓缩的组织随后重悬于任何恰当的容器中， 例如玻璃或塑料组织培养器皿中。在某些具体实施方式中，所述样 品胰腺组织可允许形成融合的单层培养物，NACs可形成自该培养 物。在其他优选的具体实施方式中，所述细胞悬浮液置于非黏附的 培养容器中，且形成祖细胞球。
在一个具体实施方式中，所述细胞起源的组织可以为成人组织 或胎儿组织或任何发育阶段的组织。而且，所述方法可以用相对小 量的初始材料实施。因此，无需处死或严重伤害供体，即可获得供 体的小组织样品。本发明的祖细胞可以扩增，且随后从组织样品分 离。
在某些具体实施方式中，可以用生长因子或包含生长因子(例 如有丝分裂生长因子)的组合物接触培养物，例如，所述生长因子 选自由IGF-1、IGF-II、LIF、TGFα、TGFβ、bFGF、aFGF、HGF 或Hedgehog组成的组。在其他具体实施方式中，所述生长因子是 TGFβ超家族的成员。在一些具体实施方式中，根据本发明所述的 方法包含如本文所述将组合物给予患者，其中所述组合物可以包含 本发明的细胞、多肽、核酸和/或载体，还包括本文所述的任何添加 剂，包含例如糖尿病疗法、生长因子、cAMP增强剂等。
在一些具体实施方式中，所述细胞或培养物中的细胞用cAMP 增强剂(或者包含cAMP增强剂的组合物)接触，例如8-(4-氯苯 硫代)-阿糖腺苷-3’:5’-环-一磷酸(盐)(CPT-cAMP)(参见例如Koike Prog.Neuro-Psychopharmacol.and Biol.Psychiat.16 95-106(1992))、 CPT-cAMP、福斯高林、丁酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和 霍乱毒素(见Martin et al.J.Neurobiol.23 1205-1220(1992))以及8- 溴-cAMP、二丁酰cAMP和二辛酰cAMP(例如，见Rydel et al.PNAS 85：1257(1988))。
在一些具体实施方式中，所述细胞或培养物中的细胞用类固醇 或皮质类固醇(或者包含类固醇或皮质类固醇的组合物)接触，例 如氢化可的松、脱氧氢化可的松、氟氢可的松、去氢氢化可的松、 甲基去氢氢化可的松、去氢可的松、氟羟泼尼松龙、地塞米松、倍 他米松和对氟米松。一般参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，15th Ed.，pp.1239-1267和2497-2506，Berkow et al.，eds.， Rahway N.J.，1987)。
现在存在多种组织培养基适于培养来自动物包括人的组织。在 一些具体实施方式中，组织培养基可以为简单培养基，例如 Dulbecco’s必需基本培养基(DMEM)。在另一个具体实施方式中， 细胞、组织等在含有5％ FBS的Isobecco’s改良MEM细胞培养基 中培养。在另一个具体实施方式中，细胞、组织等在无血清的情况 下长期维持。在本发明的一些具体实施方式中，所述生长因子或其 他有丝分裂剂未包括在用于体外维持培养物的原代培养基中，但随 后可用来引起不同细胞(例如祖细胞)群增殖。
在另一个具体实施方式中，干细胞由于其在缺乏对培养表面的 黏附时仍能够生长的能力，因而可以直接或间接富集。在一些具体 实施方式中，干细胞在悬浮液中自由浮动，而不与培养容器表面或 相接触的其他细胞或材料形成固定或半固定接触。
在一个具体实施方式中，根据本发明所述的细胞用于(且本发 明所述方法提供可移植细胞源)其分化子代的祖细胞群形式中，或 者在另一个具体实施方式中，受体细胞可用来产生胰腺细胞培养物 以得到并纯化分泌因子，例如TMEM27的分泌形式。在另一个具 体实施方式中，培养的细胞可以作为胰岛素源而提供。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种增加胰腺β细胞质 量的方法，所述方法包含用编码TMEM27多肽的核酸接触细胞， 所述细胞是胰腺β细胞或者可以经诱导变成胰腺β细胞的细胞，以 及提供有利于所述核酸表达的条件。
在一个具体实施方式中，β细胞质量增加通过增加β细胞增殖 而实现。在一个具体实施方式中，β细胞质量增加是由于祖细胞分 化成β细胞系增加。在一个具体实施方式中，β细胞质量增加指的 是细胞转换或死亡减少。在另一个具体实施方式中，β细胞质量增 加指的是上述具体实施方式的任何组合。
细胞增殖可以通过本领域中公知的任何数量的方法来确定，如 本文中所例示的，例如通过测定吸收标记的底物，例如氚标记胸苷， 正如本领域中技术人员已知的。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种改变患者体内新陈 代谢的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或编码所述TMEM27 多肽的核酸接触细胞，所述细胞是胰腺β细胞或者可以经诱导变成 胰腺β细胞的细胞。
在一个具体实施方式中，改变新陈代谢指的是增加新陈代谢， 而在另一个具体实施方式中，其指的是减少新陈代谢。在一个具体 实施方式中，葡萄糖代谢被改变。在一个具体实施方式中，所述细 胞在体外或离体进行接触。在另一个具体实施方式中，所述细胞在 体内接触。在另一个具体实施方式中，所述细胞是干细胞或祖细胞。 在另一个具体实施方式中，所述细胞从患糖尿病或易患糖尿病的患 者中分离。
在一个具体实施方式中，所述方法包括将接触过的细胞给予所 述患者的步骤，例如离体细胞治疗。在一个具体实施方式中，给予 患者的细胞相对所述患者是自体同源的，或者在另一个具体实施方 式中，相对所述患者是同种异体的。
在一个具体实施方式中，所述细胞用TMEM27多肽进行接触， 所述多肽包括全长蛋白或其片段。在一个具体实施方式中，所述片 段包含TMEM27蛋白的分泌形式。在另一个具体实施方式中，所 述分泌形式大小约25kDa，包含TMEM27蛋白的氨基酸1-142，或 其片段，或其同源的序列。
在一个具体实施方式中，所述细胞还可以用蛋白酶抑制剂进行 接触。在一个具体实施方式中，蛋白酶抑制剂是遏制、防止、减少、 延缓，或以任何方式改变蛋白酶活性或表达或二者的分子。
在一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑 制剂(Serpin)、金属蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、硫代 蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、门冬氨酸 蛋白酶抑制剂或其组合。
在一个具体实施方式中，蛋白酶抑制剂是 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2)、(OA-Hy；顺式-9-油酸酰基-N-羟 酰胺；油酰-N-氢化环酰胺)，、{N-[[(4，5-二氢-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2- 基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、{α-[[[4，5-二氢-5-硫代-1，3，4-噻二 唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺}、 {(2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、{(2R)-[(4-二苯磺酰)氨 基]-N-羟基-3-苯丙酰胺}、 H-Cys1-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys10-OH、(SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2；基质溶解素-1抑制剂)、[N-异丁基-N-(4-甲氧 苯磺酰)-甘氨酰异羟肟酸；NNGH]{N-[[4，5-二氢-5-硫代-1，3，4-噻二唑 -2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸}、{a-[[[4，5-二氢-5-硫代-1，3，4-噻二唑 -2-基)氨基]-羰基]氨基]-N-(环己基甲基)-(S)-苯丙酰胺}、4-二苯呋喃 -2-基-4-肟基-丁酸、[4-(4-联苯)-4-肟基-丁酸]、{(3R)-(+) -[2-(4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-异羟肟酸盐]}、{(3S) -(-)-[2-(4-甲氧基苯磺酰)-1，2，3，4-四氢异喹啉3-异羟肟酸酯]}、 [N-羟基-1-(4-甲氧苯基)磺酰-4-(4-二苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、 [N-羟基-1-(4-甲氧苯基)磺酰-4苄氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1，10- 二氮菲一水合物)、马马司他、普啉司他、坦诺司他、新伐司他、唑 来膦酸或其组合。
在一个具体实施方式中，所述抑制剂是α1-抗胰蛋白酶、α1-抗 胰凝乳蛋白酶、α2-抗血纤维蛋白酶(在一个具体实施方式中，其为 纤维蛋白溶解作用的抑制剂)、抗纤维蛋白酶(在一个具体实施方式 中，其为血液凝固抑制剂，特别是因子X、因子IX和凝血酵素)、 补体1抑制剂、神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin，在一个具 体实施方式中，其在一些家族形式的痴呆中发生突变)、纤溶酶原 激活剂抑制剂1和2(在一个具体实施方式中，其为纤维蛋白溶解 作用抑制剂)、蛋白Z相关的蛋白酶抑制剂(ZPI，在一个具体实施 方式中是灭活因子Xa和因子XIa)或其组合。
在另一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是亮肽酶素、4- (2-氨乙基)苯磺酰氟化氢氯化物(AEBSF)、抑酞酶、抑糜酶素、 抗纤维蛋白酶III、3，4-二氯异香豆素、L-1-氯-3-[4-甲苯磺酰基-氨 基]-7-氨基-2-庚酮-HCl(TLCK)、TPCK、氟磷酸异丙酯(DIFP)、抗痛 素、4-脒基苯甲基磺酰-氟-HCl(APMSF)、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、 3，4-二氯异香豆素(DCI)、α-对甲苯磺酰氟、BB94、α2-巨球蛋白或 其组合。
在一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是EDTA、钒、钼 酸盐、1，10-二氮菲、磷酸阿米酮、抑氨肽酶素、抑氨肽酶素b、放 线酰胺素、抑二肽素、BB94、α2-巨球蛋白或其组合。
在一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是N-己基顺丁烯二 酰亚胺、亮肽酶素、L-反式环氧-琥珀酰-亮氨酰-氨基-(4-胍基)-丁烷 (E-64)、抑糜酶素、抗痛素、α2-巨球蛋白、PMSF、PEFABLOC或 其组合。
在一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是胃蛋白酶抑制剂 A、α2-巨球蛋白、或其组合。在另一个具体实施方式中，所述蛋白 酶抑制剂是BB94或巴马司他，在一个具体实施方式中，其为丝氨 酸或金属蛋白酶抑制剂。在一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制 剂是可逆的，而在另一个具体实施方式中，所述蛋白酶抑制剂是不 可逆的。
在另一个具体实施方式中，所述细胞可以用PKC抑制剂进行 接触，在一个具体实施方式中，其为沙芬戈(L-苏-二氢(神经)鞘氨 醇)、Ro-1、Ro32-0432(双吲哚马来酰亚胺叔胺)、UCN-01(7-OH- 十字孢碱)、Flavopiridol(L86-8275，一种黄酮类抗癌新药)、苔藓抑 素1(大环内酯)、双吲哚马来酰亚胺I、InSolutionTM双吲哚马来酰 亚胺I、氢氯化物、双吲哚马来酰亚胺II、双吲哚马来酰亚胺III、 氢氯化物、双吲哚马来酰亚胺抑制剂Set、双吲哚马来酰亚胺IV、双 吲哚马来酰亚胺V、钙感光蛋白C、支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides)、心脏毒素、黑颈眼镜蛇(Naja nigricollis)、氯化 白屈菜红碱、地喹氯铵、逆没食子酸、二水化物、G6976、 InSolutionTMG6976、G6983、G7874、氢氯化物、H-7、氟安定、Iso-H-7、 氟安定、HBDDE、Hispidin、金丝桃蒽酮、K-252a、诺卡(氏)土壤 菌属(Nocardiopsis sp.)、InSolutionTM K-252a、诺卡(氏)土壤菌属 (Nocardiopsis sp.)、K-252b、诺卡(氏)土壤菌属(Nocardiopsis sp.)、 K-252c、蜂毒素、NGIC-I、根皮素、云杉鞣酚、PKCbII/EGFR抑 制剂、星孢菌素(staurosprorine)、N-苯甲酰PKCb抑制剂、硫酸多 粘菌素B、蛋白激酶C抑制剂20-28、细胞可渗透的、豆蔻酰化、 蛋白激酶C抑制剂肽19-31、蛋白激酶C抑制剂肽19-36、蛋白激 酶C抑制剂组合、蛋白激酶C抑制剂、EGF-R片段651-658、豆蔻 酰化、蛋白激酶Ce易位抑制剂肽、蛋白激酶Ce易位抑制剂肽、阴 性对照、蛋白激酶Cz假底物抑制剂肽、蛋白激酶Cz假底物抑制剂 肽、豆蔻酰化、蛋白激酶Ch假底物抑制剂肽、豆蔻酰化、蛋白激酶 Cq假底物抑制剂肽、蛋白激酶Cq假底物抑制剂肽、豆蔻酰化、假 金丝桃素、Ro 31-7549，固定的，Ro-31-7549、Ro-31-8220、 InSolutionTM Ro-31-8220、Ro-31-8425、Ro-32-0432、楸毒素、沙芬 戈、桑吉瓦霉素、Scytonemin(一种色素)、林氏藻(Lyngbya sp.)、 丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂组合、D-红-神经鞘氨醇、二氢、D-红-神 经鞘氨醇、自由碱基、牛脑、D-红-神经鞘氨醇、自由碱基、高纯度、 D-红-神经鞘氨醇、N，N-二甲基-、星孢菌素(staurosprorine)、链霉 菌属(Streptomyces sp.)、枸橼酸他莫昔芬、他莫昔芬、4-羟基-、(Z-)、 TER14687、琥珀酸维生素E或者能够抑制蛋白激酶C表达的反义 核苷酸。
在一个具体实施方式中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶 和弹性蛋白酶。在一个具体实施方式中，半胱氨酸蛋白酶包括木瓜 蛋白酶、钙蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶。在一个具体实施方式中， 门冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶和凝乳酶。在一个具体实施方式中， 金属蛋白酶包括嗜热菌蛋白酶和羧肽酶A。
在一个具体实施方式中，根据本发明所述的组合物和/或方法可 以包含使用如本文所述抑制剂的任何组合。
在另一个具体实施方式中，还可以用Tcf1蛋白或编码所述Tcf1 蛋白的核酸接触所述细胞。
在一个具体实施方式中，所述Tcf1蛋白可以具有氨基酸序列， 其同源于或就是NCBI’s基因库中列出的序列，登陆号：CAI59577、 P15257、P22361、P20823、NP_033353、NP_036801、NP_739570 或NP_000536。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种增加胰腺β细胞 质量的方法，该方法包括用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触β细胞 或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞，其中所述细胞表达或经可诱导 表达TMEM27，并提供利于β细胞增殖的条件。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种改变患者体内新 陈代谢的方法，所述方法包含用丝氨酸或金属蛋白酶抑制剂接触胰 腺β细胞或可经诱导变成胰腺β细胞的细胞，其中所述细胞表达或 可经诱导表达TMEM27。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种抑制、遏制或治 疗患者糖尿病的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或编码所述 TMEM27多肽的核酸接触细胞，所述细胞是胰腺β细胞或者所述细 胞可以经诱导变成胰腺β细胞。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种抑制、遏制或治 疗患者糖尿病的方法，所述方法包括用一种蛋白酶抑制剂(用丝氨 酸或金属蛋白酶抑制剂)接触胰腺β细胞或可经诱导变成胰腺β细 胞的细胞，其中所述细胞表达或可经诱导表达TMEM27。
在一个具体实施方式中，“治疗”既指治疗性疗法又指预防性 措施，其中目标是预防或减轻如上文中所描述的靶病理疾患或病 症。因此，在一个具体实施方式中，治疗可以包括遏制、抑制、预 防、治疗或其组合。因此，在一个具体实施方式中，“治疗”指的 尤其是增加时间以持续进展、加快缓解、诱导缓解、促进缓解、加 快恢复、增加替代治疗的效果或降低对替代治疗的耐受性，或其组 合。在一个具体实施方式中，“遏制”或“抑制”指的尤其是延缓 症状出现、预防疾病复发、减少复发发作的次数或频率、延长症状 性发作之间的潜伏期、降低症状的严重程度、降低急性发作的严重 程度、减少症状的数目、减少疾病相关症状的发生率、减少症状潜 伏期、缓解症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活期， 或其组合。
在一个具体实施方式中，症状是原发的，而在另一个具体实施 方式中，症状是继发的。在一个具体实施方式中，“原发”指的是 作为糖尿病直接结果的症状，而在一个具体实施方式中，“继发” 指的是症状起源于原发性原因或是原发性原因的结果。在一个具体 实施方式中，用于本发明中的化合物治疗原发或继发症状或者与糖 尿病相关的继发并发症。
在另一个具体实施方式中，“症状”可以是疾病或病理状态的 任何临床表现，在一个具体实施方式中，其是糖尿病，包括尿频、 过度口渴、剧烈饥饿、不寻常体重减轻、疲劳加重、易激惹、视力 模糊、低胰岛素水平、高血糖或高尿糖水平，或者其组合。
在一个具体实施方式中，术语“糖尿病”指的是一种原发性的 哺乳动物患者的疾病，或者在另一个具体实施方式中是指继发性糖 尿病，或者在另一个具体实施方式中是指1型NIDDM-暂时，或者 在另一个具体实施方式中是指1型IDDM，或者在另一个具体实施 方式中是指2型IDDM-暂时，或者在另一个具体实施方式中是指2 型NIDDM，或者在另一个具体实施方式中是指2型MODY，其表 现可能如在Harrison’s Internal Medicine，14th ed.1998中所述的。
根据本发明的这个方面，且在一个具体实施方式中，所述患者 是胰岛素抵抗的，或者在另一个具体实施方式中，所述患者是低胰 岛素血症型。在另一个具体实施方式中，所述患者易患糖尿病。在 另一个具体实施方式中，所述患者患有青春晚期糖尿病(MODY)。
在另一个具体实施方式中，作为组合治疗的一部分，根据本发 明所述的方法可以进一步包括将其他糖尿病药剂给予所述患者的 步骤。在一个具体实施方式中，所述糖尿病药剂可以包括磺酰脲类、 瘦素(leptin，来普汀)、氯茴苯酸、双胍、噻唑烷二酮类、α-糖苷 酶抑制剂或其组合。
在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法可以进一步 包括给予患者GLP-1受体拮抗剂，或者在另一个具体实施方式中， 用GLP-1受体拮抗剂接触患者体内的细胞。在一个具体实施方式 中，所述GLP-1拮抗剂可以包括天然存在的肽例如GLP-1、exendin-3 和exendin-4(见例如美国专利第5,424,286号；美国专利第5,705,483 号；美国专利第5,977,071号；美国专利第5,670,360号；美国专利第 5,614,492号)、GLP-1类似物或变异体(见例如美国专利第5,545,618 号和美国专利第5,981,488号)和小分子类似物。GLP-1受体拮抗 剂可以如美国专利第5,981,488号中所述检测其活性。
在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法可以进一步 包括PDX-1或PYY，或者编码PDX-1或PYY的核酸。
应该理解本文中描述的关于本发明所述细胞、组合物、多肽、 核酸或载体的任何具体实施方式，均可以用于本发明所述的方法 中，均可认为是本发明的具体实施方式。
在一个具体实施方式中，本发明提供一种估计患者体内胰岛质 量的方法，所述方法包括确定所述患者血清中TMEM27浓度的步 骤以及将该浓度与对照浓度进行比较的步骤。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种用于估计高胰岛素 血症、血内胰岛素不足、糖尿病或对用于上述病症治疗的疗法的反 应的诊断工具和/或方法。在一个具体实施方式中，TMEM27作为 生物标记物，其在特定体液(例如在血清、血浆或尿中)中的浓度 是高胰岛素血症、血内胰岛素不足或明显(frank)糖尿病的函数。 在一个具体实施方式中，TMEM27的分泌形式是生物标记物。根据 本发明的这个方面，且在一个具体实施方式中，诊断方法可以是通 过标准检测法例如ELISA试验确定TMEM27蛋白或其片段、分泌 形式的水平。在一个具体实施方式中，疾病严重性作为多肽表达的 函数而诊断。在另一个具体实施方式中，多肽表达的变化，无论是 蛋白质还是RNA水平，可以是(在另一个具体实施方式中)对治 疗(例如本文中提供的治疗方法)反应的函数。在另一个具体实施 方式中，表达的相对变化可以作为本发明所述核酸或载体递送的函 数，其可以代表本发明的一种疗法。在一个具体实施方式中，本发 明所述的方法可以利用本发明的抗体或抗体片段、或者包含该抗体 或抗体片段的组合物。一种含有本发明所述抗体、核酸、载体、细 胞和/或组合物的试剂盒也包括在本发明之内。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种用于鉴定与 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包含 一个步骤，即在足以促进所述多肽与所述感兴趣分子之间特异性相 互作用的条件下，用感兴趣分子接触TMEM27多肽一段时间以及 鉴定所述感兴趣分子。
在一个具体实施方式中，TMEM27可以作为激素发挥作用，一 个相互作用蛋白可以包含对激素发生反应的未鉴定受体。在一个具 体实施方式中，所述相互作用蛋白可以包含与患者体内新陈代谢途 径有关的已知受体。
在一个具体实施方式中，这些筛查方法在本领域中是公知的， 且可以包含在用于凝胶电泳的变性和非变性条件下、利用化学交联 剂或其他分子方法例如利用酵母2杂交系统时，直接或间接评估例 如两种分析之间的相互作用。
应该理解，确定本发明所述TMEM27蛋白的相互作用蛋白的 任何方法均可以实现，且认为是本发明的一部分，包括鉴定相互作 用蛋白以及在本文描述的条件下鉴定这个相互作用蛋白的作用，例 如积极的新陈代谢效应，例如其对于增强胰腺β细胞质量的效应， 或在另一种具体实施方式中，有害的新陈代谢效应，例如形成高胰 岛素血症。
接下来将提供材料、方法和实施例用于举例说明目的，作为实 施本发明的方式，而非出于限制的目的。
实施例
材料和方法：
动物：
所有的动物模型均在动物研究中心实验室(Laboratory of Animal Research Center，LARC，Rockefeller大学的一个无病原体 动物实验室)中饲养。所述动物均维持12小时的明/暗周期并用标 准的啮齿类动物食物饲养。在从3周龄的小鼠分离的DNA上通过 PCR进行突变小鼠的基因型测定。
抗体：
对两种肽：抗-Col-3：VQSAIRKNRNRINSAFFLD(SEQ ID NO： 1)和抗-Col-4：GIPCDPLDMKGGHINDGFLT(SEQ ID NO：2)进 行合成并加工至纯度>90％，轭合于KLH，用于兔的免疫(Betyl实 验室，得克萨斯)。将抗血清进行亲和力纯化并通过western印记和 免疫组织化进行检测。亲和力纯化抗血清用于所有研究。其他用于 免疫印记和免疫组织化的抗体从下列来源获得：抗胰岛素(Linco)、 抗胰高血糖素(Linco)、抗-V5(Invitrogen)、罗丹明红轭合的驴抗 几内亚猪(Jackson实验室)、爱力生(Alexa)488驴抗兔(Molecular Probes)。
细胞培养
将MIN6细胞用含有25mM葡萄糖、15％胎牛血清和5.5mM 的2-巯基乙醇的DMEM培养基进行培养。INS-1细胞用含有25mM 葡萄糖、5％胎牛血清和10mM Hepes pH7.4的RPMI 1640进行培 养。将HepG2细胞用含有25mM葡萄糖、10％胎牛血清的DMEM 培养基进行培养。
瞬时转染和萤虫素酶分析
在瞬时转染中，用于HepG2细胞的Fugene试剂(Roche)以及 用于MIN6细胞的Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据生产商的指导 而使用。每个35mm平皿中加入0.5μg的萤光素酶报告子构建体、 表达载体和CMV-LacZ。通过相应的β半乳糖苷酶活性对萤光素酶 的转染效率进行标准化[AlamJ.，Cook，J.L.：Reporter genes： Application to the study of mammalian gene transcription.Anal. Biochem.188：245-254，1990]。
为了得到萤光素酶构建体，将815bp的启动子区域克隆于萤光 素酶启动子的上游，与Tcf1表达载体共表达。TMEM27启动子序 列(小鼠)如下：
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caggggatggttcgcttctatggacgtattaacccaactgatgggcgttaattattaaaccttttagatggtggctcgctgattt(SEQ ID NO：17).
此外，TMEM27启动子的Tcf1位点选择性突变，分别称为M1 和M2启动子序列，如下：
TMEM27-M1启动子序列(小鼠)：
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gaggggatggttcgcttctatggacgtattaacccaactgatgggcgttaattattaaacctttagatggtggctcgctgattt(SEQ ID NO：18)
TMEM27-M2启动子序列(小鼠)：
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细胞裂解物中的蛋白交联
当MIN6细胞在6孔板中生长至90％融合时，收集MIN6细胞 并重悬于反应缓冲液和试剂中，体积50μl，4℃孵育2小时。通过 加入50mM Tris pH 7.4置于冰上10分钟而终止反应。然后用PBS 洗涤细胞，并在蛋白酶抑制剂存在的情况下在RIPA缓冲液中4℃ 裂解15分钟。细胞裂解物以10,000xg离心5分钟，对上清进行还 原和非还原的SDS-PAGE随后进行免疫印迹。交联试剂和缓冲液： BMH(Pierce)溶解于DMSO中，并在PBS中孵育，而DTBP(Pierce) 溶解于水中，并在0.2M三乙醇胺(pH 8.0)中孵育。
N-糖基化的抑制和酶切
将表达pV5-TMEM27的MIN6细胞用溶解于DMSO的指定浓 度的衣霉素(Sigma)以及单独的DMSO在37℃孵育12小时。随后 细胞裂解物进行SDS-PAGE并用抗V5抗体进行免疫印迹。
用重组酶N联聚糖酶(Prozyme，San Leandro，CA)将完整的N 联聚糖从TMEM27的分泌部分除去。MIN6细胞和胰岛的上清在 20mM磷酸钠pH 7.5、0.1％SDS和50mM的β-巯基乙醇中通过100 ℃加热5分钟而变性。将NP-40加至终浓度0.75％，将反应混合物 与N联聚糖酶37℃孵育3小时。
电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)
在结合缓冲液(20mM Hepes pH7.9、150mM NaCl、1mM DTT) 中，对10μg总细胞提取物进行EMSA分析。总细胞提取物与32P 标记的双链寡核苷酸探针一起孵育，所述探针在TMEM27启动子 上含有野生型或突变型HNF-1结合位点(序列分别为： 5’-GGAGATTTTCGTAAATAACTGACA-3’(SEQ ID NO：3)、 5’-GGGCGTTAATTATTAAACCTTTTA-3’(SEQ ID NO：4)和 5’-GGGCAGAGATTATTAAACCTTTTA-3’(SEQ ID NO：5))。利用抗 Tcf-1抗体(Geneka Biotechnology Inc.，Montreal，Canada)实施抗体 胶移动(supershift)。利用来自C57/B6小鼠或MIN6细胞的分离的 原代肝细胞和ChIP分析试剂盒(Upstate Cell Signaling Solutions， Lake Placid，NY)，按照生产商的流程进行ChIP分析。Tcf1与抗 HNF-1α抗体一起沉淀，且DNA利用引物x和y(序列： 5’-ACAGGAGGCAGGTGGGAGGCTTCT-3’)(SEQ ID NO：6)和 (5’-CCCGGATTAGGGTATCGGAGAA-3’)(SEQ ID NO：7)来扩 增。用于apoM的引物是5’-GGGCTCAGCTTTCCTCCTA-3’(SEQ ID NO：8)和5’-CTCCGCCTTAACTGTTCTCTGATG-3’(SEQ ID NO：9)。
总细胞提取物制备
MIN6细胞在150mm组织培养皿中生长至90％融合。将细胞 在冰冷却的PBS中洗涤一次，并刮进3ml PBS中。将细胞4000xg 离心4分钟并重悬于2倍体积的高盐提取缓冲液(400mM KCl、20 mM Tris pH 7.5、20％甘油、2mM DTT、1×完全TM蛋白酶抑制 剂(Boehringer Mannheim)和20μg/ml抑酞酶)中。细胞裂解通过 冻融而实现，通过16,000xg于4℃离心10分钟而除去细胞碎片。
激素测定
利用酸乙醇(10％冰醋酸溶于无水乙醇中)从胰腺中提取胰岛 素和胰高血糖素，声波处理10分钟、12,000xg于4℃离心2次， 每次10分钟。收集上清并储存于-20℃以便通过敏感的胰岛素或胰 高血糖素RIA试剂盒(Linco Research)测定胰岛素。
胰岛和RNA的分离
胰岛从6-8周龄的小鼠上分离。我们利用胶原酶消化并通过葡 聚糖梯度进行差速离心。随后利用TRIzol试剂(Gibco-BRL)根据 生产商的说明提取总RNA。污染的基因组DNA根据每5μl的RNA 利用1μl无RNA酶的DNase-I(即，胰脱氧核糖核酸酶) (Boehringer)而除去。
胰岛形态测定法
将胰腺在低聚甲醛中固定，并如上所示进行胰岛素和胰高血糖 素的染色。切取贯穿整个胰腺的切片(7μm)，每第六张切片用作 形态学分析。利用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM 510， Germany)扫描至少288张不重叠的图像(像素尺寸为0.88μm)。 在本研究中测定的参数利用Metamorph软件包(Universal Imaging Corporation，PA)中的整合的形态学测定分析工具进行测定。由用胰 岛素或胰高血糖素染色的细胞所覆盖的区域可利用大小大于3倍像 素的着色物体进行整合。
RT-PCR
利用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取总RNA，并用5U无RNA 酶的DNase-I(Ambion)处理10μg的RNA。利用Moloney白血 病病毒逆转录酶，用dNTP和随机六聚体引物(Invitrogen)合成 cDNA。如前所述，在[α-32P]dCTP和Taq聚合酶存在的情况下， cDNA提供利用特异引物的PCR的模板[Shih DQ，Screenan S， Munoz KN，Philipson L，Pontoglio M，Yaniv M，Polonsky KS，Stoffel M.(2001)Loss of HNF-1alpha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism.Diabetes 50：2472-80]。
免疫印迹和免疫组织化学
用SDS-PAGE(4-15％)分离细胞溶质蛋白提取物并利用电印 迹将其转移至硝基纤维膜(Schleicher & Schuell)上；用抗Col3和 抗Col4血清(1:500)检测TMEM27。将膜与第一抗体于4℃孵 育过夜。含第二抗体的孵育液置于室温1小时。通过从样品缓冲液 中去除DTT而实施非还原的SDS-PAGE。
将MIN6细胞铺于涂覆载玻片(Nalge Nunc Int.)上，并用4％ 的低聚甲醛于4℃固定20分钟。载玻片在含3％正常驴血清的0.01％ 皂苷/PBS中室温孵育30分钟，加入抗Col3和抗Col4(1:20)后， 4℃过夜。加入第二抗体后，置于室温30分钟。
将胰腺于4％低聚甲醛中4℃固定4小时，并在石蜡中包埋。切 取7μm切片，脱蜡后，通过将载玻片在0.01M枸橼酸钠pH 6.0进 行微波处理而暴露抗原。将切片在0.1％Triton-X-100中进行透化处 理，并在3％正常驴血清/PBS中孵育30分钟。如上，染色完成。
电镜研究
将Min6细胞在4％低聚甲醛和0.02％戊二醛/0.1M二砷酸盐缓 冲液pH7.4中固定2小时。所述细胞用PBS进行洗涤并在10％明胶 中包埋，如上再次固定。细胞沉淀利用2.3M蔗糖溶液在PBS中进 行冷冻保护，并将样品储存于液氮中直至使用(Tokuyasu，K.T.1973. J.Cell.Bio.57-551-565)。在Reichert-Jung FC-4E冰冻超薄切片机中 利用玻璃刀切取冷冻超薄切片。切片在聚乙烯醇缩甲醛-碳 (Formvar-carbon)包被的镍格上收集，用1％的BSA-PBS封闭并 用抗Col4(1:10稀释液)孵育。用PBS洗涤2次，每次15分钟 而终止孵育。随后将切片与羊抗兔IgG一起孵育，所述IgG轭合于 10nm金颗粒(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)。对所 述镍格进行加工处理并按照Griffiths et al.1983.Methods Enzymol. 96：466-485进行染色。
胸苷掺入研究
将[3H]胸苷掺入在24孔培养板(5×104细胞/孔)中如下进行 分析。电穿孔后48小时，将细胞在生长抑制培养基(0.5％FCS)中 孵育24小时，随后在正常生长培养基中再孵育24小时。在所述孵 育过程的最后4个小时，加入0.25μCi/孔的[3H]甲基胸苷(Perkin Elmer)。孵育完成后，将细胞用冰预冷的PBS冲洗2次，并与10％ 三氯醋酸(TCA)于冰上孵育20分钟。用10％TCA洗涤后，将细 胞在0.2M NaOH/1％ SDS中室温溶解10分钟。TCA不溶性物质用 0.2M HCl中和，并用液体闪烁计数器确定其反射性。
RNA干扰
人工siRNA由Dharmacon Research(Lafayette，CO)合成。siRNA 针对小鼠TMEM27(NM_020626)、PC1/3(NM_013628)、PC2 (NM_008792)、弗林蛋白酶(NM_011046)和羧肽酶E (NM_013494)序列而设计。将3μg每一种siRNA/1×106细胞电 穿孔入MIN6细胞内。
统计分析
结果以均值±SD给出。利用学生氏t检验实施统计分析，在 0.05的水平拒绝零假设。
实施例1：
Tcf1调控一种新蛋白在胰腺β细胞中的表达
为了鉴定胰腺β细胞中的促有丝分裂因子，利用AffymetrixTM 寡核苷酸表达试验比较分离的Tcf1-/-野生型同胞小鼠胰岛中的基因 表达。该试验鉴定出一种编码经膜跨膜蛋白(TMEM27)的基因， 其表现出Tcf1-/-小鼠的表达水平相比于对照降低了16倍。该结果在 独立组动物中通过RT-PCR得到了确认(图1a)。为了研究Tcf1是 否为TMEM27转录的直接激活剂，对TMEM27启动子进行了分析， 在其调控区鉴定了两种保守的高亲和力结合位点(图1b)。人类上 游调控区(SEQ ID NO：10)和小鼠上游调控区(SEQ ID NO：11) 包含Tcf结合位点，起始于在人类和小鼠分别为约-117至约-102 (SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)和-62至约-47(SEQ ID NO： 14和SEQ ID NO：15)。
将815bp的启动子区域(SEQ ID NO：17)克隆于萤光素酶启 动子的上游，与Tcf1表达载体共表达。Tcf1与TMEM27启动子的 瞬时共转染引起萤光素酶活性5倍以上的激活(图1c)。如果将 TMEM27启动子中的每一个Tcf1位点选择性突变，则转录激活作 用降低70-80％(图1c)。凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)检测DNA/ 蛋白复合物，该分析利用包含Tcf结合位点的双链32P标记的寡核 苷酸和MIN6细胞提取物(图1d)。通过利用未标记寡核苷酸的竞 争性分析以及进一步利用特异性抗Tcf1抗血清变动所述DNA-Tcf1 复合物，而确定结合于这些位点的蛋白的特异性(图1d)。为了确 定Tcf1是否直接增加TMEM27的表达，进行了染色质免疫共沉淀 (ChIP)。Tcf1结合于MIN6细胞的TMEM27启动子中的结合位点， 但在不表达TMEM27的肝细胞内则无结合(图1e)。这些数据确定 了体内Tcf1结合位点的功能性，表明Tcf1对于胰腺β细胞中 TMEM27的表达是必需的。
实施例2：
TMEM27表达在胰腺发育过程中受到调控
免疫组织化学分析表示了小鼠胰腺发育过程中的TMEM27表 达模式。在新生儿和成人胰腺中，TMEM27表达限于胰岛的β细胞。 在胰腺发育过程中，当激素(主要是胰高血糖素阳性细胞)表现出 阳性时，TMEM27在最早期表达。在胚胎期的E11.5和E12.5， TMEM27表达位于表达胰高血糖素和胰岛素的细胞中。在内分泌细 胞扩充的高峰期(从胚胎期13.5-18.5)，TMEM27主要与胰高血糖 素共存，直至出生前(E18.5)，此时其在胰岛素阳性细胞内也可检 测到。在新生儿和成人胰腺中，在胰岛α细胞内不再能检测到 TMEM27，其表达局限于β细胞(图2)。
实施例3：
TMEM27是一种N联糖蛋白，在体内形成二聚体
TMEM27包含两种预测的N-糖基化位点，分别在氨基酸残基 76和93。用衣霉素处理MIN6细胞，衣霉素抑制N-糖基化。细胞 在衣霉素浓度不断增高的条件下孵育，制备蛋白提取物并用 SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。用衣霉素处理后，出现两条带的 电泳迁移率增大，而高分子量蛋白消失(图3a)。该结果在体外分 析中利用N-聚糖酶得到确认，N-聚糖酶是一种释放完整N联聚糖 的酶。用Western印迹分析与该酶一起孵育的MIN6细胞提取物， 表现出类似于衣霉素处理的结果(图3b)。
进行化学交联试验，检测TMEM27蛋白是否以多聚体存在。 MIN6细胞提取物在两种不同交联剂存在的情况下进行孵育：BMH (双马来酰亚胺己烷)，其是一种能透过膜的不可切割的化合物， 以及DTBP(二甲基3-3’二硫代丙酸盐)，其是一种能透过膜、可在 SDS-PAGE分析(在还原和非还原条件下实施)前被切割的化合物。 非还原western印迹出现一条带，正好为还原条件下western印迹中 TMEM蛋白分子量的二倍。用BMH处理的细胞提取物在还原和非 还原印迹中均表现为二聚体蛋白。然而，在DTBP存在时，还原条 件下所述蛋白二聚体消失(图3b)。该结果与内源性表达TMEM27 的MIN6细胞以及由TMEM27表达载体瞬时转染的N2A细胞中的 结果类似(数据未示出)。
综上，这些数据表明所述TMEM27蛋白是N-糖基化的，且以 二聚体存在。
实施例4：
TMEM27在胰腺β细胞中加工并从其分泌
人们预测TMEM27是跨膜蛋白，具有N末端细胞外结构域。 分别生成了两种由该蛋白细胞外和细胞内结构域识别肽的抗体 (α-Col-3和α-Col-4)。在western印迹试验中，α-Col-4在MIN6细 胞的总细胞裂解物中检测到两条带(图4a)。分子量较高的条带对 应于糖基化全长蛋白的预测分子量。较低条带(≈25kD)也是特 异性的，因为其可以在用表达C末端V5-Tag融合蛋白和抗V5抗 体的载体(p-TMEM27.V5-His)转染后在细胞裂解物中用western 印迹检测到(图4b)。
为了确定该25kD条带是否代表TMEM27切割形式的C末端 部分，以及/或者其是否被分泌的，用α-Col-3抗体对来自不同细胞 系(包括神经元N2A细胞、HepG2细胞、Hek293细胞和起源于肾 收集管并表现出TMEM27的内源性表达的M-1细胞)的上清进行 了检测。将细胞在无血清培养基中培养48小时，利用α-Col-3通过 western印迹进行检测，在同源β细胞系MIN6和INS1E中检测到 一条对应于≈25kD蛋白的条带(图4c，数据未示出)。在与分离 的小鼠胰岛一起孵育的培养基中也检测到公认的切割和分泌蛋白 (图4d)。有趣的是，尽管细胞裂解物中强表达全长蛋白，在用 TMEM27表达载体(p-TMEM27)瞬时转染的非β细胞系的培养基 中，却无法在western印迹分析中检测到该条带。
相反，在MIN6和INS1E细胞中过表达TMEM27导致各自培 养基中分泌蛋白的量增加。siRNA介导的TMEM27蛋白水平降低 与MIN6细胞上清中TMEM27的分泌形式水平下降有关系(图4e)。 最后，为了无可辩驳的证实TMEM27的N末端部分从β细胞切割 并分泌，构建了一个表达载体(pHA-TMEM27)，其中在TMEM27 蛋白的氨基酸残基39和40之间插入9个氨基酸的HA-抗原表位标 签，用该载体转染的MIN6细胞分泌一种蛋白，可用抗HA抗体检 测，大小类似于上清中的蛋白。该蛋白在对照细胞或在表达未加标 签蛋白的细胞中未被检测到(图4f)。综上，这些数据表明TMEM27 是一种β细胞特异的、切割的和分泌的跨膜蛋白。
实施例5：
TMEM27定位于胰岛素分泌颗粒和细胞膜中
采用抗Col-3和抗Col--4抗体的免疫荧光研究表明TMEM27 定位于胰腺β细胞中。将MIN6细胞在载玻片上培养、固定、透化 并用第一抗体处理。可在细胞膜上以及核周区室和粒子内检测到特 异性染色(图5a)。该结果与TMEM27定位于胰岛素分泌粒子内以 及通过这些小囊泡运输至细胞膜相一致。使用免疫金标记的抗 Col-4抗体的电镜研究表明TMEM27定位于胰岛素分泌颗粒内部 (图5b)。纳米金(nanogold)颗粒与细胞膜相连，与小囊泡/膜融 合事件相邻(图5c)，表明TMEM27是与胰岛素分泌颗粒共定位的 细胞膜蛋白。
实施例6：
Ob/Ob胰岛中TMEM27表达增加以及体外β细胞复制增强
评估ob/ob和aP2-Srebp-1c转基因小鼠的肥大胰岛中的 TMEM27表达，以确定相比于对照的相对表达。分离6-8周龄小鼠 的胰岛，并与其野生型同胞小鼠胰岛的基因表达水平加以比较。在 半定量RT-PCR分析中，发现ob/ob和aP2-Srebp-1c胰岛中TMEM27 水平相比于对照值分别增加2.1倍和1.7倍(图6a和6b)。此外， 相比于野生型同胞小鼠的大小匹配的胰岛，来自ob/obb和 aP2-Srebp-1c小鼠的胰岛分泌入培养基中的已切割TMEM27显著增 加(图6c，数据未显示)。为了确定TMEM27是否刺激胰腺β细胞 复制，评估了TMEM27表达对MIN6细胞复制的效应。细胞用质 粒pTMEM27或靶向TMEM27的siRNA进行电穿孔。细胞复制则 通过细胞计数及电穿孔后48h测定[3H]胸苷掺入来评估(图6d-g)。 相比于pcDNA3转染的细胞，用pTMEM27转染的MIN6细胞表现 为约5倍过表达，并在平板接种(plating)后48小时，表现出[3H] 胸苷掺入增加约3倍，且细胞密度增加(图6e、g)。相反，在siRNA 处理后，蛋白质表达降低的MIN6细胞表现出[3H]胸苷掺入和细胞 密度的显著降低(图6d、f)。此外，未观察到细胞中的凋亡随 TMEM27表达增高或降低而发生变化(数据未显示)，表明其表达 不影响细胞死亡。这些结果表明TMEM27调节MIN6细胞中的细 胞增殖。
实施例7：
胰岛中表达TMEM27的转基因小鼠表现为胰岛肥大
胰腺β细胞特异的转基因小鼠通过原核微注射载体构建体而产 生，该构建体中，鼠TMEM27 cDNA处于鼠胰岛素启动子的控制之 下。RT-PCR和免疫印迹分析表明相比于野生型同胞小鼠，转基因 小鼠中TMEM27的表达增加4倍(图7A)。通过胰岛形态测定学 研究8-12周龄转基因动物的胰岛质量。转基因小鼠表现为胰岛形态 学正常(根据利用胰岛素/胰高血糖素共染色的免疫组织化学)，但 相比于野生型同胞小鼠，胰岛质量增加约2倍(图7B和7C)。所 述胰岛质量的增加通过测定转基因小鼠和野生型小鼠的总胰岛素 含量而进一步确证。在过表达TMEM27的转基因小鼠中，总胰岛 素含量也显著增加(图7D)。空腹和餐后血浆葡萄糖和胰岛素水平 在转基因和对照小鼠中相似，表明转基因小鼠中的胰腺β细胞在葡 萄糖感应方面并不具有较大异常(数据未显示)。综上，这些数据 表明TMEM27在体内调节胰岛生长。
实施例8：
BB94抑制TMEM27脱落
胰腺β细胞系MIN6用含有25mM葡萄糖、15％胎牛血清和 5.5μM 2-巯基乙醇的DMEM培养基进行培养。将MIN6细胞以50％ 融合铺于12孔板中，孵育24小时。用OPTI-MEM(Invitrogen)洗 涤细胞，并用DMSO或蛋白酶抑制剂BB94(1μM)在OPTI-MEM 中于37℃孵育15分钟。上述孵育后，用DMSO、PMA(Sigma P8139)、BB94或者PMA+BB94在OPTI-MEM中孵育2小时。每 一种上清均收集30μl用于SDS-PAGE。用识别TMEM27N末端(已 切割部分)的抗TMEM27抗体实施免疫印迹(图8)。利用抗V5 抗体(其识别TMEM27的C末端(细胞内)部分)的免疫印迹用 作对照，表明PMA和BB94不改变TMEM27的表达水平(图8)。 BB94(而非PMA)降低TMEM27N末端的表达水平(图8)，但 不改变TMEM27C末端的表达水平。因为BB94是一种已知的丝氨 酸蛋白酶和金属蛋白酶的抑制剂，这可以表明TMEM27是一种属 于丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶家族的蛋白酶的底物。
尽管本文中已经举例说明并描述了本发明的某些特征，对于本 领域中的普通技术人员来说，还可以进行多种变化、替代、改变和 等同。因此，应该理解附加的权利要求涵盖所有这些落入本发明真 实精神的改变和变化。
SEQUENCE LISTING
<110>洛克菲勒大学(The Rockefeller University)
<120>胰腺β细胞增殖的刺激
<130>P16629 HAB
<140>PCT/US2006/022211
<141>2006-06-07
<150>US 60/687,856
<151>2005-06-07
<150>US 60/741,893
<151>2005-12-05
<160>19
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>1

<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>2

<210>3
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