一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽
阅读：846发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种靶向抑制αvβ3阳性 细胞增殖 的环肽，它们的制备和应用，本发明的环肽，其 氨 基酸序列如下：Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg LysCys其中N端Cys与C端Cys通过二硫键成环。，下面是一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽专利的具体信息内容。
1.一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽，其氨基酸序列如下：
Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg Lys Cys
其中N端Cys与C端Cys通过二硫键成环。
2.含有权利要求1的多肽的药物组合物。
3.权利要求2的药物组合物，其中含有药物可接受的载体。
4.权利要求2的药物组合物，以任何形式的药物制剂形式存在。
5.权利要求2的药物组合物，是注射剂。
6.权利要求2的药物组合物，是冷冻干燥注射剂。
7.权利要求1的多肽的制备方法，其特征在于，所述方法选自基因重组方法或 化学合成方法，如固相合成方法、溶液中合成方法。
8.权利要求7的制备方法，其特征在于，其中固相多肽合成的主要操作步骤如 下：1、树脂溶涨：将Wang-Resin树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，30min； 2、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加 20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min；3、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树 脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加 热5min，变深蓝色为阳性反应；4、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g) 两次，DMF(10ml/g)两次；5、缩合：加入保护氨基酸三倍过量，活化剂HBTU 三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量， 反应30min；6、洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g) 两次；7、重复二至六操作依次连接氨基酸(从C端到N端顺序)，最后一次 洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g) 两次；9、裂解：配制裂解液(10ml/g)——TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％； TIS 1％，120min；10、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次， 然后常温挥干；11、HPLC纯化：以水和乙腈做流动相，在流动相中加入0.1％ 的TFA，梯度从5％--85％，使用C18反相柱；12、二硫键的形成：用醋酸水 溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终醋酸的 浓度为5％，用碳酸氨调节PH值到6，加DMSO(10-20％体积)在25℃， 反应2-3天(HPLC或Ellman test监测)；13、HPLC纯化：稀释最终溶液 到TFA为0.05％，乙腈为5％，上反相柱除掉DMSO和其他杂质；14、冻干。
9.权利要求1的环肽在制备预防和治疗血管生成相关性疾病的药物中的应用。
10.权利要求9的应用，其中所述血管生成相关性疾病包括各种肿瘤；血管性疾 病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬化症；眼病如角膜移植后新 血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角膜病、翼状胬 肉、视网膜变性、晶状体后纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿 性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎；皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、 化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮。
技术领域
本发明涉及一种多肽药物，特别是涉及一种具有预防和治疗血管生成相关性疾病作用的 多肽，它们的制备和应用。
背景技术
血管生成(angiogenesis)通常只发生在诸如伤口愈合、女性月经周期、妊娠和胎儿生长等 情况下，但是在慢性炎症、肿瘤侵袭转移的过程中也存在该现象。病理状态下发生的血管 生成相关疾病包括：各种肿瘤；血管性疾病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬 化症；眼病如角膜移植后新血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角 膜病、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿 性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎；皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、 脂溢性皮炎和痤疮等。
与传统的抗癌/抗炎治疗相比，抗血管生成治疗具有许多优点：(1)治疗发生时，血管形 成已被启动，因此，抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大，具有良好的特异性；(2)血 管内皮细胞暴露在血液中，循环中的药物直接作用于新生血管壁，故药物能够直接发挥作 用，所用药物剂量小、疗效高；(3)血管内皮细胞基因相对稳定，不易突变，因而不易发生 耐药；(4)作用具有放大效应，因为一个内皮细胞可支持50～100个肿瘤细胞生长；(5)几乎 所有的肿瘤和慢性炎症病灶都要依赖于血管供给营养，故抗瘤/抗炎谱广。正因为如此，血 管生成抑制剂的研发受到了学术界、商业界的广泛重视。
总体来说，血管生成抑制策略主要有以下几种：(1)阻断血管生成因子的合成和释放， 或拮抗其作用，如VEGF单抗Avastin、Endostatin、IFN-α2a、SU5416等；(2)阻断内皮细 胞降解周围基质的能力，如基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，如Marimastat、AG3340、 Neovastat等；(3)直接抑制内皮细胞的功能，如Thalidomide、TNP-470、Squalamine等；(4) 阻断内皮细胞表面整合素的作用，如Vitaxin、EMD121974等。另外，还有一些非特异性 作用机制的血管生成抑制剂，如CLA、IL-12、IM862等。上述策略中绝大部分并非真正 只对新生的血管内皮细胞起作用，故系统性毒性副作用在所难免。唯有整合素αvβ3抗体如 Vitaxin或拮抗剂如EMD121974可真正靶向到新生的血管内皮细胞，并在多种动物模型中 抑制肿瘤生长，目前处于II期临床试验中。
整合素αvβ3是粘附分子整合素家族的重要成员之一，在正常休止期内皮细胞和其他健 康组织中的表达极其有限，而高表达于新生的血管内皮细胞及部分恶性肿瘤细胞(黑素瘤、 乳腺癌、卵巢癌细胞)膜表面，高表达的αvβ3通过与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的 相互作用诱导内皮细胞的分化、增殖及迁移，故αvβ3是新生血管的标记。该分子的表达特 征使得靶向整合素αvβ3以治疗血管生成相关性疾病成为可能。细胞膜整合素αvβ3的天然 配体绝大部分均含精-甘-天冬氨酸(RGD)基序，进一步研究证实，利用含RGD序列的多 肽，可阻止整合素αvβ3与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用，进而抑制新生血 管内皮细胞的增殖。如西仑吉肽(cilengitide.EMD2121974)的化学结构式为c(RGDf(NMe)V)， 是c(RGDfV)改良后得到的化合物。实验表明，该环状RGD肽对肺癌移植瘤具有抗血管生 成和生长抑制双重作用，并增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。也有研究证实，RGD多肽(如 RGDS)可通过内皮细胞膜表面αvβ3的内化作用进入细胞内，进入细胞内的RGD多肽可与 促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9结合并激活其促凋亡活性，进而诱导内皮细胞 的凋亡。
研究表明，转录因子NF-κB在细胞凋亡和增殖中也发挥重要作用，其活化可通过直接 上调凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受体相关因子(TRAF1和TRAF2)、 锌指蛋白A20、超氧化锰歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表达， 抑制细胞的凋亡。而新生血管内皮细胞的持续增殖有赖于NF-κB的持续活化，抑制NF-κB 的活性可有效阻止血管内皮细胞的增殖。
由p50和p65两亚基形成的异二聚体是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重 要的一种，几乎存在于体内所有细胞，其含量远高于其它二聚体。此异二聚体的氨基末端可 构成1个环状结构域，由其介导与DNA碱基特异性结合。晶体衍射分析显示，p50/p65异 源二聚体与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列特异性结合的方式为：p50亚单位的Arg-54、 Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸残基与κB序列5′端的5′-G-5G-4G-3A-2C-1-3′ 碱基系列特异结合；p65亚单位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，与κB序 列3′端的5′-T+1T+2C+3C+4-3′4个碱基对特异结合。另外，由NF-kB p50/p65异源二聚体的氨 基端和二聚化结构域共同构成的环状结构域，还可非特异地识别DNA核糖磷酸骨架。即由 p50和p65N末端共同构成的这一环状结构域形成了NF-κB的DNA结合结构域，介导其与 顺式作用元件的结合，值得注意的是，这种结合为特异性结合。NF-κB激活靶基因首先需要 DNA结合结构域识别靶基因启动子区域内的顺式作用元件，并与之结合，后在p65反式激 活域的辅助下，激活靶基因的表达。因此，若我们获得能够拮抗p65亚基与其顺式作用元件 结合的多肽，则势必能够达到拮抗NF-κB转录活性的效果，最终达到抑制NF-κB调控靶基 因表达及治疗血管生成相关性疾病的目的。我们选用酵母双杂交系统，以NF-κB p65DNA 结合域为诱饵蛋白，从随机肽库中筛选NF-κB相互作用多肽，并鉴定这些多肽的功能。目 前我们已筛选获得8条具有不同序列的NF-κB p65亚基拮抗肽，这里所列的多肽序列中含有 其中一条拮抗肽序列(RLRWRKC)，另外5条分别见专利200510007479.2，200510069451.1。
由于NF-κB存在于所有的细胞，故只有对病灶部位细胞实施抑制NF-κB活性的靶向策 略，才不致引起机体生理功能的广泛紊乱，而RGD多肽为实现这一策略提供了可能。研究 证实，化疗靶向的化疗药物主要集中在一些具有高细胞毒性，但是单独使用时其系统毒性 又相当高的药物，如将其特异性靶向到表达整合素αvβ3的肿瘤细胞或肿瘤组织新生血管内 皮细胞，则可以在提高药物效率和减少使用剂量的同时也减轻其系统毒性。主要的化疗药 物有阿霉素(doxorubicin)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)两类。而用于靶向的组件主要是含 RGD序列的环肽和模拟肽段如二环肽CDCRGDCFC、聚乙二醇包被的长循环脂质体-RGD (RGD-PEG-LCL)、RGD-4C、c(RGDfK)、RGD10(GARYCRGDCFDG)等。但应用该靶向 组件将NF-κB抑制剂导入αvβ3阳性细胞的研究尚未见报道。
由于RGD多肽序列与NF-κB p65亚基拮抗肽序列在细胞内的作用靶点不同，故在两序列 间设计一合适的linker至关重要，设计的基本要求应该是：既要让整个多肽序列在细胞外保 持稳定(能耐受降解)，又要让其在细胞内被迅速裂解为两个片断以发挥各自的作用。缬 氨酸-瓜氨酸linker符合这一要求，研究证实，缬氨酸-瓜氨酸linker在小鼠体内的半衰期为144 小时(6天)，明显长于腙键和二硫键形成的linker的半衰期(二者的半衰期分别为＜2天、1 天)，缬氨酸-瓜氨酸linker在猕猴体内的半衰期为230小时(9.6天)，这是迄今为止报道最 长的药物-linker半衰期，但药物进入靶细胞后缬氨酸-瓜氨酸linker可被溶酶体酶如组织蛋白 酶B迅速裂解。这里所列的多肽序列中的N端含有RGD序列片段(CRGD)、C端含有NF-κB p65亚基拮抗肽序列片段(RLRWRKC)，二者通过缬氨酸-瓜氨酸linker(VCit)连接，从 而构成完整的全长序列：CRGDVCit RLRWRKC。而序列首尾的两个半胱氨酸(C)可通过 二硫键成环，环化设计不仅可增加RGD与靶细胞表面整合素αvβ3的亲和力，提高其靶向性， 而且环肽可耐受血清蛋白酶降解，半衰期明显延长，其生物利用度得以大幅度提高，从而 可减少药物使用剂量。而成环的二硫键在细胞浆高浓度谷胱甘肽(比血浆中的浓度高 100～1000倍)作用下裂解，两次裂解反应可使环肽变为两个分离的肽段——CRGDVCit和 NF-κB拮抗肽(RLRWRKC)，后者因解除了分子内的空间位阻干扰，故可高效地发挥其抑 制靶细胞活化及增殖的效应。
与传统的抗癌/抗炎治疗相比，抗血管生成治疗具有许多优点：(1)治疗发生时，血管形 成已被启动，因此，抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大，具有良好的特异性；(2)血 管内皮细胞暴露在血液中，循环中的药物直接作用于新生血管壁，故药物能够直接发挥作 用，所用药物剂量小、疗效高；(3)血管内皮细胞基因相对稳定，不易突变，因而不易发生 耐药；(4)作用具有放大效应，因为一个内皮细胞可支持50～100个肿瘤细胞生长；(5)几乎 所有的肿瘤和慢性炎症病灶都要依赖于血管供给营养，故抗瘤/抗炎谱广。正因为如此，血 管生成抑制剂的研发受到了学术界、商业界的广泛重视。
总体来说，血管生成抑制策略主要有以下几种：(1)阻断血管生成因子的合成和释放， 或拮抗其作用，如VEGF单抗Avastin、Endostatin、IFN-α2a、SU5416等；(2)阻断内皮细 胞降解周围基质的能力，如基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，如Marimastat、AG3340、 Neovastat等；(3)直接抑制内皮细胞的功能，如Thalidomide、TNP-470、Squalamine等；(4) 阻断内皮细胞表面整合素的作用，如Vitaxin、EMD121974等。另外，还有一些非特异性 作用机制的血管生成抑制剂，如CLA、IL-12、IM862等。上述策略中绝大部分并非真正 只对新生的血管内皮细胞起作用，故系统性毒性副作用在所难免。唯有整合素αvβ3抗体如 Vitaxin或拮抗剂如EMD121974可真正靶向到新生的血管内皮细胞，并在多种动物模型中 抑制肿瘤生长，目前处于II期临床试验中。
整合素αvβ3是粘附分子整合素家族的重要成员之一，在正常休止期内皮细胞和其他健 康组织中的表达极其有限，而高表达于新生的血管内皮细胞及部分恶性肿瘤细胞(黑素瘤、 乳腺癌、卵巢癌细胞)膜表面，高表达的αvβ3通过与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的 相互作用诱导内皮细胞的分化、增殖及迁移，故αvβ3是新生血管的标记。该分子的表达特 征使得靶向整合素αvβ3以治疗血管生成相关性疾病成为可能。细胞膜整合素αvβ3的天然 配体绝大部分均含精-甘-天冬氨酸(RGD)基序，进一步研究证实，利用含RGD序列的多 肽，可阻止整合素αvβ3与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用，进而抑制新生血 管内皮细胞的增殖。如西仑吉肽(cilengitide.EMD2121974)的化学结构式为c(RGDf(NMe)V)， 是c(RGDfV)改良后得到的化合物。实验表明，该环状RGD肽对肺癌移植瘤具有抗血管生 成和生长抑制双重作用，并增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。也有研究证实，RGD多肽(如 RGDS)可通过内皮细胞膜表面αvβ3的内化作用进入细胞内，进入细胞内的RGD多肽可与 促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9结合并激活其促凋亡活性，进而诱导内皮细胞 的凋亡。
研究表明，转录因子NF-κB在细胞凋亡和增殖中也发挥重要作用，其活化可通过直接 上调凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受体相关因子(TRAF1和TRAF2)、 锌指蛋白A20、超氧化锰歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表达， 抑制细胞的凋亡。而新生血管内皮细胞的持续增殖有赖于NF-κB的持续活化，抑制NF-κB 的活性可有效阻止血管内皮细胞的增殖。
由p50和p65两亚基形成的异二聚体是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重 要的一种，几乎存在于体内所有细胞，其含量远高于其它二聚体。此异二聚体的氨基末端可 构成1个环状结构域，由其介导与DNA碱基特异性结合。晶体衍射分析显示，p50/p65异 源二聚体与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列特异性结合的方式为：p50亚单位的Arg-54、 Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸残基与κB序列5′端的5′-G-5G-4G-3A-2C-1-3′ 碱基系列特异结合；p65亚单位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，与κB序 列3′端的5′-T+1T+2C+3C+4-3′4个碱基对特异结合。另外，由NF-kB p50/p65异源二聚体的氨 基端和二聚化结构域共同构成的环状结构域，还可非特异地识别DNA核糖磷酸骨架。即由 p50和p65N末端共同构成的这一环状结构域形成了NF-κB的DNA结合结构域，介导其与 顺式作用元件的结合，值得注意的是，这种结合为特异性结合。NF-κB激活靶基因首先需要 DNA结合结构域识别靶基因启动子区域内的顺式作用元件，并与之结合，后在p65反式激 活域的辅助下，激活靶基因的表达。因此，若我们获得能够拮抗p65亚基与其顺式作用元件 结合的多肽，则势必能够达到拮抗NF-κB转录活性的效果，最终达到抑制NF-κB调控靶基 因表达及治疗血管生成相关性疾病的目的。我们选用酵母双杂交系统，以NF-κB p65DNA 结合域为诱饵蛋白，从随机肽库中筛选NF-κB相互作用多肽，并鉴定这些多肽的功能。目 前我们已筛选获得8条具有不同序列的NF-κB p65亚基拮抗肽，这里所列的多肽序列中含有 其中一条拮抗肽序列(RLRWRKC)，另外5条分别见专利200510007479.2，200510069451.1。
由于NF-κB存在于所有的细胞，故只有对病灶部位细胞实施抑制NF-κB活性的靶向策 略，才不致引起机体生理功能的广泛紊乱，而RGD多肽为实现这一策略提供了可能。研究 证实，化疗靶向的化疗药物主要集中在一些具有高细胞毒性，但是单独使用时其系统毒性 又相当高的药物，如将其特异性靶向到表达整合素αvβ3的肿瘤细胞或肿瘤组织新生血管内 皮细胞，则可以在提高药物效率和减少使用剂量的同时也减轻其系统毒性。主要的化疗药 物有阿霉素(doxorubicin)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)两类。而用于靶向的组件主要是含 RGD序列的环肽和模拟肽段如二环肽CDCRGDCFC、聚乙二醇包被的长循环脂质体-RGD (RGD-PEG-LCL)、RGD-4C、c(RGDfK)、RGD10(GARYCRGDCFDG)等。但应用该靶向 组件将NF-κB抑制剂导入αvβ3阳性细胞的研究尚未见报道。
由于RGD多肽序列与NF-κB p65亚基拮抗肽序列在细胞内的作用靶点不同，故在两序列 间设计一合适的linker至关重要，设计的基本要求应该是：既要让整个多肽序列在细胞外保 持稳定(能耐受降解)，又要让其在细胞内被迅速裂解为两个片断以发挥各自的作用。缬 氨酸-瓜氨酸linker符合这一要求，研究证实，缬氨酸-瓜氨酸linker在小鼠体内的半衰期为144 小时(6天)，明显长于腙键和二硫键形成的linker的半衰期(二者的半衰期分别为＜2天、1 天)，缬氨酸-瓜氨酸linker在猕猴体内的半衰期为230小时(9.6天)，这是迄今为止报道最 长的药物-linker半衰期，但药物进入靶细胞后缬氨酸-瓜氨酸linker可被溶酶体酶如组织蛋白 酶B迅速裂解。这里所列的多肽序列中的N端含有RGD序列片段(CRGD)、C端含有NF-κB p65亚基拮抗肽序列片段(RLRWRKC)，二者通过缬氨酸-瓜氨酸linker(VCit)连接，从 而构成完整的全长序列：CRGDVCit RLRWRKC。而序列首尾的两个半胱氨酸(C)可通过 二硫键成环，环化设计不仅可增加RGD与靶细胞表面整合素αvβ3的亲和力，提高其靶向性， 而且环肽可耐受血清蛋白酶降解，半衰期明显延长，其生物利用度得以大幅度提高，从而 可减少药物使用剂量。而成环的二硫键在细胞浆高浓度谷胱甘肽(比血浆中的浓度高 100～1000倍)作用下裂解，两次裂解反应可使环肽变为两个分离的肽段——CRGDVCit和 NF-κB拮抗肽(RLRWRKC)，后者因解除了分子内的空间位阻干扰，故可高效地发挥其抑 制靶细胞活化及增殖的效应。
发明内容
本发明涉及一种含精-甘-天冬氨酸序列、能够与持续增殖的血管内皮细胞及部分恶性肿 瘤细胞(黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌细胞)的细胞膜整合素αvβ3相结合的环肽。该环肽中的 精-甘-天冬氨酸序列可特异识别αvβ3阳性细胞，结合在细胞膜表面的环肽经αvβ3内化入靶 细胞后，迅速裂解为含精-甘-天冬氨酸序列以及含核因子-κB p65亚基拮抗肽序列的两个片 段，后者因摆脱了分子内空间位阻的干扰，故可高效发挥对αvβ3阳性细胞的增殖抑制效应。 本发明还涉及该环肽的制备和应用。
本发明的环肽，其氨基酸序列如下：
Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg Lys Cys(N端Cys与C端Cys通过二硫键 成环)
本发明的环肽，其用途是预防和治疗血管生成相关性疾病，包括各种肿瘤；血管性疾 病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬化症；眼病如角膜移植后新血管形成、新 生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角膜病、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后 纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎； 皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮等。
本发明还包括含有本发明的环肽的药物组合物。本发明的药物组合物，必要时可以含有 药物可接受的载体。本发明的药物组合物，可以以任何形式的药物制剂形式存在。如适合口 服的制剂或适合注射的制剂，优选是注射剂。最优选是冷冻干燥注射剂。
本发明还包括本发明的环肽的制备方法，所述方法选自基因重组方法或化学合成方法。 如：常规的固相合成方法、溶液中合成方法。
具有本发明氨基酸序列结构的环肽可与核因子-κB p65亚基专一结合，并阻断核因子-κB 与其顺式作用元件的结合，从而抑制核因子-κB的生物学活性，即核因子-κB调控各种靶基 因表达的活性。此种结构多肽既可以以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白和多肽融和，或 被甲基化、乙酰化和氨基化等修饰，或进行个别氨基酸的突变或替代，或插入蛋白质表面的 特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构多肽的物质可能 表现出与核因子-κB p65亚基结合，并抑制核因子-κB活性的作用。
本发明通过酵母双杂交技术筛选获得与核因子-κB p65亚基新型结合多肽，并证实了此 条多肽具有抑制核因子-κB生物活性的功能，在此基础上设计并合成了具有靶向抑制αvβ3 阳性细胞增殖的新型环肽，这对进一步开发成血管生成相关性疾病的预防和治疗药物具有重 要意义。
研究结果表明，本发明设计并合成的环肽只对αvβ3阳性细胞有效，能够抑制细胞核因 子-κB所调控的靶基因的表达，从而抑制细胞增殖。因而可以成为新的抑制血管生成的药物 或药物前体，本发明的多肽可以用于预防和治疗血管生成相关性疾病。
附图说明
图1为环肽疏水性分析结果。
图2为环肽对核因子-κB p65亚基与DNA结合的竞争抑制实验结果。
图3为环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测结果。
A：罗丹明标记的多肽与人脐静脉内皮细胞共培养30分钟
B：罗丹明标记的多肽与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养30分钟
C：罗丹明标记的多肽与小鼠巨噬细胞共培养4小时
图4为环肽对VEGF介导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效应的实验结果。
图5为环肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(αvβ3+)增殖的抑制效应的实验结果。
本发明的环肽，其氨基酸序列如下：
Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg Lys Cys(N端Cys与C端Cys通过二硫键 成环)
本发明的环肽，其用途是预防和治疗血管生成相关性疾病，包括各种肿瘤；血管性疾 病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬化症；眼病如角膜移植后新血管形成、新 生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角膜病、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后 纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎； 皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮等。
本发明还包括含有本发明的环肽的药物组合物。本发明的药物组合物，必要时可以含有 药物可接受的载体。本发明的药物组合物，可以以任何形式的药物制剂形式存在。如适合口 服的制剂或适合注射的制剂，优选是注射剂。最优选是冷冻干燥注射剂。
本发明还包括本发明的环肽的制备方法，所述方法选自基因重组方法或化学合成方法。 如：常规的固相合成方法、溶液中合成方法。
具有本发明氨基酸序列结构的环肽可与核因子-κB p65亚基专一结合，并阻断核因子-κB 与其顺式作用元件的结合，从而抑制核因子-κB的生物学活性，即核因子-κB调控各种靶基 因表达的活性。此种结构多肽既可以以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白和多肽融和，或 被甲基化、乙酰化和氨基化等修饰，或进行个别氨基酸的突变或替代，或插入蛋白质表面的 特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构多肽的物质可能 表现出与核因子-κB p65亚基结合，并抑制核因子-κB活性的作用。
本发明通过酵母双杂交技术筛选获得与核因子-κB p65亚基新型结合多肽，并证实了此 条多肽具有抑制核因子-κB生物活性的功能，在此基础上设计并合成了具有靶向抑制αvβ3 阳性细胞增殖的新型环肽，这对进一步开发成血管生成相关性疾病的预防和治疗药物具有重 要意义。
研究结果表明，本发明设计并合成的环肽只对αvβ3阳性细胞有效，能够抑制细胞核因 子-κB所调控的靶基因的表达，从而抑制细胞增殖。因而可以成为新的抑制血管生成的药物 或药物前体，本发明的多肽可以用于预防和治疗血管生成相关性疾病。
附图说明
图1为环肽疏水性分析结果。
图2为环肽对核因子-κB p65亚基与DNA结合的竞争抑制实验结果。
图3为环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测结果。
A：罗丹明标记的多肽与人脐静脉内皮细胞共培养30分钟
B：罗丹明标记的多肽与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养30分钟
C：罗丹明标记的多肽与小鼠巨噬细胞共培养4小时
图4为环肽对VEGF介导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效应的实验结果。
图5为环肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(αvβ3+)增殖的抑制效应的实验结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1、多肽的理化性质分析
将本发明多肽分子的氨基酸序列按ANTHPROT V5.0软件所要求的格式输入，后计算多 肽分子的各种理化特征常数。
结果见表1、图1
表1多肽理化特征常数分析结果
实施例2、多肽对核因子-κB p65亚基与DNA顺式作用元件结合的竞争抑制实验
多肽1为线形肽(RLRWRKC)、多肽2为全长环肽，序列的合成由上海华大天源生物 科技有限公司合成，纯度＞95％。于包被了核因子-κB顺式作用元件的96孔酶联板(购自美 国Clontech公司的MercuryTM Transfactor p65kits)中加入150μl/孔转录因子封闭液，室温孵 育15min；弃转录因子封闭液后加入50μl/孔用转录因子封闭液稀释的检测样品，样品分别为 含10ng/μl的p65标准蛋白作为阳性对照、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入系列浓度阳性 多肽、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入相同系列浓度阴性肽，室温孵育1h，空白对照为 加入50μl转录因子封闭液；加入转录因子封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤 液；加入用转录因子封闭液以1∶500稀释的p65抗体100μl/孔，室温孵育1h；加入转录因子 封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；加入用转录因子封闭液以1∶1000稀释的 羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室温孵育30min；加入转录因子缓冲液250μl/孔洗涤4次， 每次4min，去除洗涤液；加入TMB底物，室温孵育10min，待液体变蓝后，用100μl/孔的 终止液终止反应；于450nm和630nm双波长检测OD值。p65结合肽对p65与其顺式作用元 件结合的抑制百分数计算公式为：(p65标准蛋白阳性对照孔OD-多肽孔OD)/p65标准蛋 白阳性对照孔OD。
结果表明，本发明的多肽可特异性抑制p65与其DNA顺式作用元件的结合，而这种抑 制效应具有量效关系，即抑制作用随着多肽浓度的升高而增加，而阴性肽则不影响p65与 其DNA顺式作用元件的结合。其中多肽1的作用优于多肽2，可能是多肽2(环肽)的空 间位阻导致其与p65的亲和力下降所致。见图2。
实施例3、环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测
本实验中环肽及标记由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度＞95％。在无脂质体 转染的细胞培养体系中，将荧光素(罗丹明)标记的多肽(终浓度为75μM)与人脐静脉内 皮细胞、其他αvβ3阳性细胞(如人乳腺癌细胞MDA-MB-231)共培养30分钟，与αvβ3 阴性细胞(如小鼠巨噬细胞)共培养4小时，激光共聚焦显微镜下观察结果。
结果显示，人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231内可见荧光素标记的多肽， 但多肽即使与小鼠巨噬细胞共培养4小时，也只能见到少许多肽进入细胞(可能是巨噬细 胞对多肽的非特异性吞噬所致)。表明本多肽可进入到αvβ3阳性细胞内，而不能或极少进 入到αvβ3阴性细胞内。见图3。
实施例4、环肽抑制αvβ3阳性细胞增殖的实验
本实验中环肽由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度＞95％。以含10％小牛血清 的RPMI1640培养人脐静脉内皮细胞(添加10μg/ml的VEGF)、人乳腺癌细胞MDA-MB-231， 取对数生长期的细胞，经0.25％胰酶消化后计数，以2.5×104/ml的细胞浓度接种在96孔板中， 每孔接种100μl，使细胞接种量分别为2.5×103/孔。待细胞培养贴壁4小时后，按分组的不同 分别加入系列浓度的多肽100μl，终浓度分别为75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM，同时 设αvβ3单抗预处理组(RPMI1640配制成5μg/100μl)，待细胞培养72小时后以MTT法测定 细胞增殖，采用多功能读板机在波长570nm下测量各孔OD值。
结果表明，本发明的环肽可抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231在体外的增殖反应，且该抑制效应具有量效关系，即抑制作用随多肽浓度的 升高而增强，而将αvβ3单抗预处理这两类细胞，则可阻止环肽肽的上述效应。表明环肽的 抑制效应是通过αvβ3而介导的。见图4、图5。
实施例5、环肽制备方法的操作步骤
固相多肽合成的主要操作步骤如下：1、树脂溶涨：将Wang-Resin树脂放入反应管中， 加DMF(15ml/g)，30min。2、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min， 去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂， 用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色 为阳性反应。4、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。5、缩合： 加入保护氨基酸三倍过量，活化剂HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管， 立刻加入NMM十倍过量，反应30min。6、洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次， DMF(10ml/g)两次。7、重复二至六操作依次连接氨基酸(从C端到N端顺序)，最后一次洗 涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次。9、裂 解：配制裂解液(10ml/g)——TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％，120min。10、吹干 洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。11、HPLC纯化：以水和 乙腈做流动相，在流动相中加入0.1％的TFA，梯度从5％--85％，使用C18反相柱。12、二 硫键的形成：用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终 醋酸的浓度为5％，用碳酸氨调节PH值到6，加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3 天(HPLC或Ellman test监测)。13、HPLC纯化：稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈 为5％，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。14、冻干。
实施例1、多肽的理化性质分析
将本发明多肽分子的氨基酸序列按ANTHPROT V5.0软件所要求的格式输入，后计算多 肽分子的各种理化特征常数。
结果见表1、图1
表1多肽理化特征常数分析结果
实施例2、多肽对核因子-κB p65亚基与DNA顺式作用元件结合的竞争抑制实验
多肽1为线形肽(RLRWRKC)、多肽2为全长环肽，序列的合成由上海华大天源生物 科技有限公司合成，纯度＞95％。于包被了核因子-κB顺式作用元件的96孔酶联板(购自美 国Clontech公司的MercuryTM Transfactor p65kits)中加入150μl/孔转录因子封闭液，室温孵 育15min；弃转录因子封闭液后加入50μl/孔用转录因子封闭液稀释的检测样品，样品分别为 含10ng/μl的p65标准蛋白作为阳性对照、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入系列浓度阳性 多肽、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入相同系列浓度阴性肽，室温孵育1h，空白对照为 加入50μl转录因子封闭液；加入转录因子封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤 液；加入用转录因子封闭液以1∶500稀释的p65抗体100μl/孔，室温孵育1h；加入转录因子 封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；加入用转录因子封闭液以1∶1000稀释的 羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室温孵育30min；加入转录因子缓冲液250μl/孔洗涤4次， 每次4min，去除洗涤液；加入TMB底物，室温孵育10min，待液体变蓝后，用100μl/孔的 终止液终止反应；于450nm和630nm双波长检测OD值。p65结合肽对p65与其顺式作用元 件结合的抑制百分数计算公式为：(p65标准蛋白阳性对照孔OD-多肽孔OD)/p65标准蛋 白阳性对照孔OD。
结果表明，本发明的多肽可特异性抑制p65与其DNA顺式作用元件的结合，而这种抑 制效应具有量效关系，即抑制作用随着多肽浓度的升高而增加，而阴性肽则不影响p65与 其DNA顺式作用元件的结合。其中多肽1的作用优于多肽2，可能是多肽2(环肽)的空 间位阻导致其与p65的亲和力下降所致。见图2。
实施例3、环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测
本实验中环肽及标记由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度＞95％。在无脂质体 转染的细胞培养体系中，将荧光素(罗丹明)标记的多肽(终浓度为75μM)与人脐静脉内 皮细胞、其他αvβ3阳性细胞(如人乳腺癌细胞MDA-MB-231)共培养30分钟，与αvβ3 阴性细胞(如小鼠巨噬细胞)共培养4小时，激光共聚焦显微镜下观察结果。
结果显示，人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231内可见荧光素标记的多肽， 但多肽即使与小鼠巨噬细胞共培养4小时，也只能见到少许多肽进入细胞(可能是巨噬细 胞对多肽的非特异性吞噬所致)。表明本多肽可进入到αvβ3阳性细胞内，而不能或极少进 入到αvβ3阴性细胞内。见图3。
实施例4、环肽抑制αvβ3阳性细胞增殖的实验
本实验中环肽由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度＞95％。以含10％小牛血清 的RPMI1640培养人脐静脉内皮细胞(添加10μg/ml的VEGF)、人乳腺癌细胞MDA-MB-231， 取对数生长期的细胞，经0.25％胰酶消化后计数，以2.5×104/ml的细胞浓度接种在96孔板中， 每孔接种100μl，使细胞接种量分别为2.5×103/孔。待细胞培养贴壁4小时后，按分组的不同 分别加入系列浓度的多肽100μl，终浓度分别为75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM，同时 设αvβ3单抗预处理组(RPMI1640配制成5μg/100μl)，待细胞培养72小时后以MTT法测定 细胞增殖，采用多功能读板机在波长570nm下测量各孔OD值。
结果表明，本发明的环肽可抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞 MDA-MB-231在体外的增殖反应，且该抑制效应具有量效关系，即抑制作用随多肽浓度的 升高而增强，而将αvβ3单抗预处理这两类细胞，则可阻止环肽肽的上述效应。表明环肽的 抑制效应是通过αvβ3而介导的。见图4、图5。
实施例5、环肽制备方法的操作步骤
固相多肽合成的主要操作步骤如下：1、树脂溶涨：将Wang-Resin树脂放入反应管中， 加DMF(15ml/g)，30min。2、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min， 去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂， 用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色 为阳性反应。4、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。5、缩合： 加入保护氨基酸三倍过量，活化剂HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管， 立刻加入NMM十倍过量，反应30min。6、洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次， DMF(10ml/g)两次。7、重复二至六操作依次连接氨基酸(从C端到N端顺序)，最后一次洗 涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次。9、裂 解：配制裂解液(10ml/g)——TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％，120min。10、吹干 洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。11、HPLC纯化：以水和 乙腈做流动相，在流动相中加入0.1％的TFA，梯度从5％--85％，使用C18反相柱。12、二 硫键的形成：用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终 醋酸的浓度为5％，用碳酸氨调节PH值到6，加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3 天(HPLC或Ellman test监测)。13、HPLC纯化：稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈 为5％，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。14、冻干。
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