本发明涉及一种经D-山梨糖醇发酵转化以高产率制备2-酮基-L-古洛糖酸的方法。

2-酮基-L-古洛糖酸是制备L-抗坏血酸的重要的中间体，它可按熟知的赖希斯坦方法进行转化。

用发酵的方法从D-山梨糖醇或L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸是已知的。

因此，日本专利公报第40154/1976号公开了用醋酸杆菌，杆菌或假单胞菌属的微生物从山梨糖醇生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，这些菌属在需氧条件下具有氧化D-山梨糖醇以生产2-酮基-L-古洛糖酸的能力。但该已知方法的产率非常低，即低于6克/升。

按“中国微生物学报”21（2），185-191（1981）公开的另一已知方法，2-酮基-L-古洛糖酸可用包括沟槽假单胞菌（Pseudomonas    striata）和氧化葡糖杆菌（Gluconobacter    oxydans）的微生物混合培养物从L-山梨糖制备，其产率当起始L-山梨糖 浓度为70克/升时为30克/升，当起始L-山梨糖浓度为100克/升时为37克/升。

此外，欧洲专利公报第0221707号公开了一种用糖生酮假葡糖杆菌（Pseudogluconobacter    saccharoketogenes）与伴生细菌一起或其自身从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法。但该已知的用糖生酮假葡糖杆菌的方法的产率最多为55.3-87.6克/升（转化率：34.2-54.1%）（见欧洲专利公报第0221707号第13页，表4）。

还有，欧洲专利公报第0278447号公开了一种用微生物的混合培养物从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，在微生物混合培养物中其一具有DSM    NO.4025和菌株的分类特点，另一种则具有DSM    NO.4026菌株（一种巨大芽孢杆菌菌株）的分类特点）。此法产率为40克/升或更高。

如上所述，有各种从L-山梨糖或D-山梨糖醇制备2-酮基-L-古洛糖酸的微生物的试验方法，但由于低的产率使它们距离工业应用还差很远，特别是作为从D-山梨糖醇起始的方法，本发明的方法能使产率最少约为60克/升，130克/升的产率是可达到的。

另一方面，从D-山梨糖醇发酵生产L-山梨糖是已知的，该法是赖希斯坦法的一部分。

已知各种醋酸杆菌（在此分类为葡糖杆菌）菌株如木质醋酸杆菌和弱氧化醋酸杆菌能有效地从D-山梨糖醇生产L-山梨糖 （Biotechnology、Volume    6a，436-437，1984，edited    by    H-J.Rehm，and    G.Reed    published    by    Verlag    Chemie.Weinheim，Germany）。

假如人们能建立一种有效地从如D-山梨糖醇的便宜的碳源起始而不是从L-山梨糖起始制备2-酮基-L-古洛糖酸的方法，显然，将大大简化赖希斯坦方法。

如上所述，菌株DSMNO.4025能有效地从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸，但从D-山梨糖醇的转化率则很低。从D-山梨糖醇生产2-酮基-L-古洛糖酸的低转化率是由于形成了如D-葡萄糖，D-葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸这些从D-山梨糖醇衍生来的副产物。从2-酮基-L-古洛糖酸的立体异构体2-酮基-D-古洛糖酸中纯化2-酮基-L-古洛糖酸是困难的，在菌株DSMNO.4025中D-山梨糖醇的可能的代谢途径如下所示：

为改善用菌株DSMNO.4025从D-山梨糖醇发酵制备2-酮基-L-古洛糖酸的产率，考虑利用某些方法尽可能多地增强L-山梨糖的形成途径。

因此本发明的目的是提供一种新的以高转化率从D-山梨糖醇 制备2-酮基-L-古洛糖酸的方法，例如转化率至少约为50mol%到约89mol%。

本发明的另一目的是提供一种操作方式，其中可防止不需要的如D-葡萄糖，D-葡萄糖酸和2-酮基-D-古洛糖酸的副产物的产生。

本发明是一种制备2-酮基-L-古洛糖酸或其盐的方法，它包括在含有D-山梨糖醇的培养基中培养一种具有从D-山梨糖醇生产L-山梨糖能力的属于葡糖杆菌或醋酸杆菌属的微生物（A）和一种具有从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸能力并具有DSMNO.4025菌株分类特点的微生物（B），其功能等价物，亚培养物，突变体或变异体的混合培养物，借此进行混合培养，其中所说的两种微生物在整个培养期的至少一部分时间内是共存于培养基中的，并回收2-酮基-L-古洛糖酸或其盐。

此外，按照本发明，用L-山梨糖生产菌株从D-山梨糖醇生产出的L-山梨糖可被2-酮基-L-古洛糖酸生产菌株所利用以形成2-酮基-L-古洛糖酸。另外，基本上没有观察到前面提到的副产物的积累。

关于这一点，在此使用的具有从D-山梨糖醇生产L-山梨糖能力的微生物（A）属于葡糖杆菌属或醋杆菌属，所用的微生物（B），其功能等价物，亚培养物，突变体或其变异体具有从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸的能力并具有DSMNO.4025菌 株分类特点。

在本方法中，得到的任何产物，例如通过处理微生物（A）和（B）的细胞，例如，静止细胞，冻干细胞或固定化细胞均可被使用。

本方法可用各种方法进行，例如，一种将两种微生物（A）和（B）在培养开始时同时接种到培养基中的方法，一种先接种微生物（A），在培养一段时间后随后接种微生物（B）的方法，另一种方法是将两种微生物（A）和（B）分别接种到各自的培养基中，然后在培养一定时间后将其中任一种一次全部，分成几份或不断加入到另一个的肉汁中，紧接着是另一种培养期。

对本发明的方法来说，任何适宜的方法均可用于需培养的微生物，例如，根据被使用的各个微生物的特性改变其混合的方法。即，一种需被接种的微生物的量与另一种微生物的量的比率和接种的次数应根据各个微生物的生长速率及涉及到的微生物产生L-山梨糖的能力和将L-山梨糖转化成2-酮基-L-古洛糖酸的能力，并以所用培养基的性质为基础来进行优选和确定。在某些情况下，处理细胞得到的产物还可用作任一种生长着的细胞的替代物。

能被用于本发明方法中的微生物（A），包括那些在公共保藏单位（培养物保藏中心），如日本大阪发酵研究所（IFO）保存，任何人根据要求可以得到的微生物，这些微生物如下所列：

微生物（A）的实例

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3130

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3255

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3256

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3257

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3258

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3289

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3290

弱氧化葡糖杆菌    IFO    3291

Gluconobacter  gluconicus    IFO    3171

Gluconobacter  gluconicus    IFO    3285

Gluconobacter  gluconicus    IFO    3286

赤褐色葡糖杆菌    IFO    3244

微白色葡糖杆菌    IFO    3251

微白色葡糖杆菌    IFO    3253

Gluconobacter  industrius    IFO    3261

Gluconolacter  cerinus    IFO    3262

Gluconobacter  cerinus    IFO    3263

Gluconobacter  cerinus    IFO    3265

Gluconobacter  cerinus    IFO    3266

Gluconobacter  cerinus    IFO    3267

Gluconobacter  cerinus    IFO    3270

Gluconobacter  diacetonicus    IFO    3273

Gluconobacter  rosuas    IFO    3990

醋化醋杆菌奥尔兰亚种    IFO    3259

醋化醋杆菌醋亚种    IFO    3281

液化醋杆菌    IFO    12257

液化醋杆菌    IFO    12258

液化醋杆菌    IFO    12388

醋化醋杆菌木质亚种    IFO    3288

醋化醋杆菌木质亚种    IFO    13693

醋化醋杆菌木质亚种    IFO    13772

醋化醋杆菌木质亚种    IFO    13773

能用于本发明方法的微生物（B）的主要分类特点是：

负氧化酶试验：乙醇被氧化成乙酸：D-葡萄糖被氧化成D-葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸;多醇的生酮作用;从甘油基本上得不到二羟基丙酮;从D-葡糖二酸产生2-酮基-D-葡糖二酸，但从D-葡萄糖，D-果糖，D-葡萄糖酸，D-甘露糖醇或2-酮基-D-葡萄糖酸则得不到2-酮基-D-葡糖二酸;外观上是多形型的而不是鞭毛型的;从D-果糖产生褐色色素;当在巨大芽孢杆菌或其细胞提取物存在下共培养时能观察到良好的生长;并对链霉素是敏感的。

与微生物（B）相关的特定和优选的微生物已经按布达佩斯条约于1987年3月17日存放于the    Deutsche    Sammlung    Von Mikroorganismen    in    Goettingen，保藏号为DSM    NO.4025（该研究所现地址为：Deusche    Sammlung    Von    Mikroorganismen    and    Zellkulturen    Gmbh，Mascheroder    Weg    1b，D-3300    Braunschweig，联邦德国）。该微生物是一种氧化葡糖杆菌微生物。

进一步优选的微生物是前面提及的微生物的功能等价物、亚培养物，突变体或变异体。

在本发明优选的实施方案中，前面所说的微生物（A）和（B）可在包含有D-山梨糖醇的培养基中进行接种和培养，且这些微生物的细胞，例如，静止细胞或任何处理过的从细胞得到的产物可被用于直接对D-山梨糖醇发生作用。任何已知的手段作为微生物培养技术通过使用曝气搅拌液面下发酵器可被采用的方法均是特别优选的，较好的结果可以通过使用液体肉汁培养基的培养来获得。

关于培养微生物（A）和（B）所用的营养培养基，尽管未提出特别的限制，水溶液营养培养基可以含有碳源和氮源。可被微生物利用的其它无机盐，少量其它养分等适于微生物的良好培养。培养基中可适当地含有那些通常用于微生物更好生长的各种营养物质。

除在本发明中用作原料的D-山梨糖醇外也可加入其它碳源物质如丙三醇，D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-阿糖醇等。

在本发明中各种有机或无机物也可用作氮源，如肉汁、胨、酪蛋白，玉米浆、尿素，氨基酸、硝酸盐，铵盐等。硫酸镁，磷酸钾，氯化铁 和氯化亚铁，碳酸钙等无机物也可被使用。

这些营养成分的混合比率及每种成分的量可随所用微生物的属特性，原料D-山梨糖醇的量，被接种的一种微生物相应于另一种微生物的量和接种次数而变化，并可按各种情况特点选择和确定其他的培养条件。

培养基中起始物D-山梨糖醇的浓度也可随所用微生物的属特性等而变化。D-山梨糖醇可在培养开始点一次加入到培养基中，或在培养期间分次加入。在本发明的方法中。分次加入D-山梨糖醇将得到更可取的结果。通常采用D-山梨糖醇的总浓度约为20到250克/升，更可取的是总浓度为约50至200克/升。

培养条件可依所用微生物的种属特性而变化，当然培养基的组成可按不同情况的特点进行选择和确定以便最有效地产生所需产物，尽管可维持培养温度约13至36℃，较可取的是约在18到33℃，培养基的PH值约在4.0到9.0间，较可取的是在约6.0到8.0之间。正常情况下，培养期在20到80小时就足够了，在此周期内在培养基内形成的所需产物达到最大值。

为保持培养基的PH值使其最适宜酶的活性，任何适宜的酸碱试剂均可在培养期中的合适时间以合适的量加入到培养基中。这一目的还可以通过在培养开始时向培养基中加入适当的缓冲剂来达到。

在培养基中如此制得的2-酮基-L-古洛糖酸可按已知的常 规方法进行分离和纯化，且它可以盐的形式被分离出来，例如钠，钾，钙，铵盐等，该盐用已知的常规方法转化成游离的酸。

分离可按下列步骤的适当结合或重复来进行，例如，通过成盐或利用产物与周围杂质性质的不同，如在溶剂间溶解性，吸附性和分配系数的不同进行分离。例如在离子交换树脂上的吸附是一种方便的分离产物的方法，如此获得的产物可以惯用的方法如重结晶或色谱法进行进一步纯化。

因此，按该新方法收集的2-酮基-L-古洛糖酸能很容易地进行分离，如，通过下列步骤：培养肉汁的上清液在离心过滤后减压下浓缩，向浓缩液中加入一种有机溶剂如乙醇，将得到的2-酮基-L-古洛糖酸结晶以盐的形式分离出来，例如以钠盐或钙盐的形式分离。无论是使用上面的方法还是其它已知的方法，2-酮基-L-古洛糖酸总是可以很容易地进行分离。

如此获得的2-酮基-L-古洛糖酸或其盐可通过酯化，然后通过烯醇化和内酯化直接转化成L-抗坏血酸。

能使用的培养方法包括静置培养，振摇培养，液面下培养等。对于批量培养，使用分批，分批加料和连续操作技术的液面下培养是最适用的，还可使用微生物（A）和（B）的固定化细胞，固定化的方法是在如纤维素，陶瓷或玻璃珠等材料上的吸附，在如琼脂、藻酸钙，K-角叉胶和其它的已知的聚合物的凝胶基质上的截留方法。这一方式使得微生物可被反复使用。

通过下列实施例可以说明本发明：

实施例1

DSM    NO.4025菌株代表微生物（B），而表1中所列的微生物用作微生物（A）。种子培养物的制备：

种子培养物可按如下所述的两种不同方法进行制备。

方法1：在一试管（18mm×200mm）中装入5毫升培养基（SCM）：D-山梨糖醇2%，酵母提取物[面包酵母（Oriental Yeast）]0.3%，牛肉提取物0.3%，玉米浆0.3%，多胨1.0%，尿素0.1%，KH2PO40.1%，MgSO4.7H2O0.02%，及CaCO30.1%（灭菌前PH7.0）并用高压灭菌器在121℃灭菌20分钟。将一菌环的微生物（A）和一菌环的微生物（B）接种到试管中，并在30℃下振荡（220rpm）培育一天。

方法2：将一菌环的微生物（B）和一菌环的微生物（A）接种到含有5毫升SCM的试管（18mm×200mm）中并在30℃下振荡培养一天，取一滴形成的培养液铺展于琼脂培养基上，在SCM中含琼脂2%，在30℃下培育4天，在琼脂培养基上生长的微生物以混合物状态可作为接种物被直接用于下面的液体培养。将一菌环上述混合物接种到含有5毫升SCM的试管中并在30℃下振荡（220rpm）培育一天。

主发酵：

将5毫升如上所制备形成的种子培养液接种到含有50毫升生 产培养基（PM）的500ml锥形瓶中，（PM）：D-山梨糖醇8%，玉米浆1%，尿素1.5%（单独灭菌的），KH2PO40.1%，MgSO4.7H2O0.01%，及CaCO30.6%和消泡剂0.1%（灭菌前PH7.0）在30℃振荡（18rpm）培育4天。表1概括了用高效液相色谱测得的培养的肉汁中2-酮基-L-古洛糖酸的定量测定结果。

实施例2：

按与实施例1中描述的方法1同样的方式制备弱氧化葡糖杆菌IFO3255和DSMNO.4025菌株的种子培养液。弱氧化葡糖杆菌IFO3255和DSMNO.4025菌株的种子培养液的细胞浓度分别为3.7×1010细胞/毫升和5.4×108细胞/毫升。得到的每个种子培养液以全部接种物量的10%（V/V）接种到在500毫升锥形瓶中的50毫升PM中，其中弱氧化葡糖杆菌IFO3255和DSMNO。4025菌株的接种物比率（%，V/V）变化为：0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6，∶4，7∶3，8∶2，9∶1和10∶0。将锥形瓶在30℃下培育4天。结果列于表2。当DSMNO.4025菌株与弱氧化葡糖杆菌IFO3255间接种物比率为1∶9到4∶6时，从80克/升D-山梨糖醇而产生的2-酮基-L-古洛糖酸高至63.9克/升至66.6克/升（转化率74.9到78.1mol%）不产生任何2-酮基-D-古洛糖酸。

备注：1.弱氧化葡糖杆菌IFO3255

2.DSMNO.4025菌株

3.2-酮基-L-古洛糖酸

4.2-酮基-D-古洛糖酸

实施例3

弱氧化葡糖杆菌IFO3255和Gluconobacter gluconicusIFO3285用作微生物（A），DSMNO.4025菌株用作微生物（B）。按与实施例1中描述的方法2相似的方式制备各自的种子培养液（200毫升）。将各自的种子培养液（200毫升）接种到含有约1.7升发酵培养基的3升发酵器中，发酵培养基：D-山梨糖醇8%，10%或12%，酵母提取物0.5%，玉米浆2.5%，MgSO4.7H2O0.0086%，尿素0.086%（单独灭菌的），KH2PO40.086%和消泡剂0.15%，在121℃下灭菌20分钟，接种后，培养液体积通过加入灭菌水调至2升。在30℃，搅拌速度700rpm和通气量1升/分下进行发酵，用4N的Na2CO3维持培养液PH在7.0，结果列于表3。

实施例4

按与实施例3描述的同样方式，将弱氧化葡糖杆菌IFO3255和DSMNO.4025菌株混合物的种子培养液（200毫升）接种到发酵培养基中含有8%D-山梨糖醇的3升发酵器中，工作体积用灭菌水调至2升。在与实施例3描述的同样条件下开始发酵，分开地，在500毫升培养基瓶中装入300毫升饲养培养基，120克D-山梨糖醇，10克酵母提取物，50克玉米浆，0.172克KH2PO4，1.72克尿素（单独灭菌的）和2.5克消泡剂。在发酵期间，用蠕动泵将上述饲养培养基连续输送到发酵器中，发酵期为12到18小时，进料速度为15毫升/小时;发酵期为18到21小时，进料速度为60毫升/小时;发酵期为21到28小时，进料速度为4.3毫升/小时。结果，经过51小时发酵从276克D-山梨糖醇制得224克2-酮基-L-古洛糖酸，其转化率为76.1mol%。

实施例5

将一菌环弱氧化葡糖杆菌IFO3255接种到含100毫升SCM的500毫升锥形瓶中并在30℃下培育一天。将如此获得的10毫升培养液转移到含100毫升SCM的500毫升锥形瓶中并在30℃下培育一天，总共制得1.5升的弱氧化葡糖杆菌IFO3255种子培养液。另一方面，将一菌环DSMNO.4025菌株接种到装有100毫升种子培养基的500毫升锥形瓶中，种子培养基：L-山梨糖8%，丙三醇0. 05%，尿素0.5%（单独灭菌），玉米浆1.75%，面包酵母（Oriental Yeast）5.0%，MgSO4·7H2O0.25%，CaCO31.5%和消泡剂0.1%（灭菌前PH7.0）于30℃下在旋转振荡器（180rpm）上培养一天，将10毫升如此制得的培养液转移到与上面同样的培养基中30℃下培养一天。总共制得DSMNO.4025种子培养液1.5升。在50升发酵器中，加入25升发酵培养基：D-山梨糖醇8%，玉米浆0.5%，MgSO4·7H2O0.01%，KH2PO40.025%及消泡剂0.17%并在121℃下灭菌30分钟。同时接种两种种子培养液（各1.5升），总培养体积通过加入灭菌水调至30升。在30℃，搅拌速度400rpm及20升/分的送气量下进行发酵，培养液的PH用6.25N-NaOH保持在7.0分开地，装有含1800克D-山梨糖醇，150克玉米浆，1.29克MgSO4·7H2O，7.5克KH2PO4和25克消泡剂的饲养培养基的5升培养基瓶在120℃下灭菌20分钟，培养12小时后利用蠕动泵以222毫升/小时的速度连续向发酵器中加入饲养培养基，历时18小时，培养45.5小时后，得到36.8升含93.5克/升2-酮基-L-古洛糖酸的发酵肉汁，换句话说，从4200克D-山梨糖醇中制得了3441克2-酮基-L-古洛糖酸，其转化率为76.8mol%。

实施例6

在实施例5中得到的发酵肉汁（36.8升）通过离心过滤除去细胞及其它沉积物，含有93.5克/升2-酮基-L-古洛糖酸的上清液（2升）在于45℃减压下浓缩至约1升，在浓缩过程中可观察到白色 沉淀。然后向浓缩液中加入100毫升乙醇，随后在10℃静置一天。得到的沉淀用过滤法收集，用少量50%冷乙醇洗并在室温下减压干燥。结果得到137.6克2-酮基-L-古洛糖酸单钠盐一水合物，该一级产品的纯度为99.14%。母液在减压下浓缩至约400毫升，向其中加入约100毫升乙醇使其在10℃下静置24小时，结果作为二级产品得71.9克2-酮基-L-古洛糖酸单钠盐-水合物（纯度：85.04%）。

实施例7

在实施例6中获得的上清液（0.5升）通过AmberliteIR-120（H-型）（Rohm    and    Haas    Company）并在减压下干燥，向干燥物（约50克）中加入400毫升甲醇和0.5毫升98%硫酸，混合物在90℃加热2小时后，除去甲醇，剩余物用少量甲醇洗涤并干燥，然后将干燥过的剩余物悬浮于150毫升的甲醇中并在加热下与10克甲醇钠一起回流。滤出冷却后得到的结晶并在减压下干燥，结果得到35.1克L-抗坏血酸钠盐。

实施例8

将一菌环弱氧化葡糖杆菌IFO3291接种到装有100毫升SCM的500毫升锥形瓶中并在30℃下培育18小时。另外，将一菌环DSMNO.4025菌株接种到装有100毫升如实施例5所述的种子培养基的500毫升锥形瓶中并在30℃下培养22小时，将如此制得的10毫升培养液接种到装有100毫升与上面同样的培养基的500毫 升锥形瓶中并在30℃下培育18小时。

向3升发酵器中加入1.6升含有160克D-山梨糖醇，10克玉米浆，0.2克MgSO4·7H2O，0.5克KH2PO4和2克消泡剂的发酵培养基并在121℃下灭菌30分钟。

同时接种如上制得的两种种子培养液（各100毫升），总培养体积通过加入灭菌水调至2升。分开地，装有300毫升含180克D-山梨糖醇，10克玉米浆，0.086克MgSO4·7H2O，0.215克KH2PO4和1克消泡剂的饲养培养基的500毫升培养基瓶在121℃下灭菌30分钟。在通气速度为1.0升/分下进行发酵并用NaOH将培养基PH调整到7.0，其它发酵参数列于表4，培养6.5小时后，饲养培养基用蠕动泵以30毫升/小时的速度送入发酵器中持续10小时，如表4所示，从340克D-山梨糖醇总共制得2-酮基-L-古洛糖酸322.7克，其摩尔转化率为89.0%，此时发酵在28℃和800rpm搅拌速度下进行。

关于在实施例中所用的特定菌株和菌株混合物1992年3月30日按照布达佩斯条约进行了追加保藏，如下所示：

A.单一培养物    新保藏号

DSM    NO.4025菌株    FERM    BP-3812

B.混合微生物培养物    保藏号

DSM    NO.4025菌株+弱氧化    FERMBP-3815

葡糖杆菌IFO3256

DSM    NO.4025菌株+弱氧化    FERMBP-3813

葡糖杆菌IFO3291

DSM    NO.4025菌株+弱氧化    FERMBP-3814

葡糖杆菌IFO3255