一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D－核糖的方法
专利汇可以提供一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D－核糖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种利用膜分离技术从 发酵 液中分离提取D-核糖的方法，由(1)发酵液的预过滤；(2)发酵液的再过滤；(3)发酵液除大分子杂质；(4)发酵液除小分子杂质；(5)发酵液浓缩、结晶等步骤组成。本发明的方法具有条件温和，操作简便，分离步骤少，成本低，选择性好的特点，有效克服了 现有技术 存在的收率低、污 水 排量 大及生产劳动强度高的 缺陷 ，并且使D-核糖收率和 质量 显著提高。，下面是一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D－核糖的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，由以下步骤组成：
(1)发酵液的预过滤：将D-核糖发酵液通过孔径为3-10μm的滤膜过滤，除去发 酵液中较大的杂质微粒和部分菌体，操作压力为0.1-0.5MPa，操作温度为20-40℃， 浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-60％；
(2)发酵液的再过滤：将上述预处理后的D-核糖发酵液再通过孔径为0.2-0.5μm 的微滤膜过滤，彻底去除菌体，得到D-核糖发酵液；微滤操作压力为0.1-0.5MPa， 操作温度为20-40℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的 10％-80％；
(3)发酵液除大分子杂质：将步骤(2)除菌后的D-核糖发酵液采用截流分子量为 3000-10000的超滤膜过滤，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂 质；超滤操作压力0.5-2.5MPa，温度20-40℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体 积百分比计占进料量的10-50％；
(4)发酵液除小分子杂质：将步骤(3)超滤后的D-核糖发酵液采用截流分子量为 300-800的纳滤膜系统过滤，脱除色素及核苷酸、氨基酸、短肽、低聚糖、多价阴阳 离子小分子杂质，得到澄清无色的净化D-核糖溶液；纳滤操作压力0.5-2.5MPa，温 度20-40℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(5)发酵液浓缩、结晶：将步骤(4)经过纳滤纯化后的D-核糖发酵液再以常规方法 进行离子交换、浓缩、结晶，制得纯度达99％以上的D-核糖。
2.如权利要求1所述的一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，其 特征在于，步骤(1)所述的滤膜孔径为5μm，操作压力为0.1-0.3MPa，操作温度为40 ℃，浓缩倍数20倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-40％。
3.如权利要求1所述的一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，其 特征在于，步骤(2)所述的微滤膜孔径为0.4μm，微滤操作压力为0.1-0.3MPa，操 作温度为20-30℃，浓缩倍数20倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的10-60％。
4.如权利要求1所述的一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，其 特征在于，步骤(3)所述的超滤膜截流分子量为6000，超滤操作压力0.5-2.0MPa，温 度20-30℃，浓缩倍数10-20倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-40％。
5.如权利要求1所述的一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，其 特征在于，步骤(4)所述的纳滤膜截流分子量为400，纳滤操作压力0.5-2.0MPa，温 度20-30℃，浓缩倍数20倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-40％。
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种核糖的分离提取方法，尤其涉及一种利用 膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖的生产方法有三种，一是由酵母核酸中分离提取；二是以葡萄糖、阿拉伯糖 等为原料通过化学合成的方法生产；三是二十世纪七十年代建立的用转酮酶缺陷型菌株 以葡萄糖为原料采用发酵法生产D-核糖。由酵母核酸中提取和化学合成生产D-核糖因 为生产效率低、工艺复杂等诸多原因始终没有形成规模化生产。微生物发酵法生产D- 核糖生产效率高、工艺简便、生产成本低，使D-核糖价格大幅度下降，真正实现了D- 核糖规模化生产。利用转酮酶缺陷微生物菌株发酵生产D-核糖的专利有US3919046 (1975)，US3970522(1976)，US4904587(1990)，US5281531(1994)，其专利保护内 容主要涉及发酵用菌种和发酵工艺的控制。国内有关发酵法生产D-核糖的研究始于二 十世纪九十年代，专利有：CN1053697C(2000)，CN1370830A(2002)。
在上述公开的专利中，有关从发酵液中分离提纯D-核糖的方法描述的都比较含模 糊，一般描述为：发酵液离心除去菌体，然后用活性炭脱色，再通过离子交换去除发酵 液中的阴阳离子，经减压浓缩，用4倍体积的乙醇沉淀结晶获得D-核糖产品。但是， 经实践和研究发现，采用这种工艺从发酵液中分离提取D-核糖存在以下问题：
1.采用离心的方法去除菌体，由于菌体细小、发酵液粘稠对离心机性能要求比较高， 通常菌体去除不彻底。
2.D-核糖发酵液色值比较高，普通糖用活性碳脱色不完全并且用量大，影响产品质 量和收率。
3.D-核糖发酵培养基中玉米浆用量比较大，并且在发酵过程中需要添加大量的钙盐 来控制发酵的正常进行，因此发酵液杂质成分多、含量高，直接使用离子交换法处理， 树脂污染严重，容易引起树脂结构破坏而失去再生能力，增加了运行成本，同时高含量 的离子性物质会使树脂快速饱和，增加树脂再生次数，造成污水排放量大等问题。
4.D-核糖羟基等电点为12，采用强碱性离子交换树脂，离交过程中局部碱性过强会 造成D-核糖吸附和破坏，使D-核糖收率下降。
国内D-核糖生产提取方法基本沿用上述方法，个别工序进行了调整，如CN1053697C (2000)采用絮凝剂絮凝的方法去除菌体，CN1234404A在离交工序中采用弱碱性阴离子 交换树脂替代强碱性阴离子交换树脂，减少了D-核糖因在强碱条件下因羟基解离造成 的核糖损失。但未从根本上解决D-核糖提取过程中发酵液除杂不彻底，离子交换树脂污 染严重，D-核糖提取收率低，D-核糖结晶纯度低等问题。
上述D-核糖提取工艺是二十世纪七十年代建立起来的。随着生化分离技术的进步， 各种先进的设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜技术的发展和应用，使 各种生化分离工艺大为改观。膜技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例，如 CN1313275A采用膜过滤的方法精制谷氨酸发酵液，CN1500799A利用膜分离技术提取红 霉素。但是利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，经检索还未见报道。
发明内容
本发明提供的利用膜分离技术从发酵液中分离D-核糖的基本步骤是：首先将发酵液 通过孔径为3-10μm的滤膜，过滤除去发酵液中较大的颗粒杂质和部分菌体；然后利用 孔径为0.2-0.5μm的微滤膜去除菌体。除菌后的发酵液利用截流分子量为3000-10000 的超滤膜过滤掉发酵液中残存的蛋白质、胶体颗粒大分子物质，再用截流分子量为 300-800的纳滤膜除去色素及核苷酸、氨基酸、短肽、低聚糖、多价阴阳离子小分子杂 质，得到澄清无色的净化D-核糖溶液，然后再经离子交换、浓缩、结晶等步骤制得高质 量的D-核糖结晶产品。
本发明涉及的利用膜分离技术从发酵液中分离提取D-核糖的方法，具体由以下步 骤组成：
(1)发酵液的预过滤：将D-核糖发酵液通过孔径为3-10μm的滤膜过滤，除去发酵液 中较大的杂质微粒和部分菌体，操作压力为0.1-0.5MPa，操作温度为20-40℃，浓缩倍 数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-60％；
(2)发酵液的再过滤：将上述预处理后的D-核糖发酵液再通过孔径为0.2-0.5μm的 微滤膜过滤，彻底去除菌体，得到D-核糖发酵清液；微滤操作压力为0.1-0.5MPa，操 作温度为20-40℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的 10-80％；
(3)发酵液除大分子杂质：将步骤(2)除菌后的D-核糖发酵液采用截流分子量为 3000-10000的超滤膜过滤，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质； 超滤操作压力0.5-2.5MPa，温度20-40℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分 比计占进料量的10-50％；
(4)发酵液除小分子杂质：将步骤(3)超滤后的D-核糖发酵液采用截流分子量为 300-800的纳滤膜系统过滤，脱除色素及核苷酸、氨基酸、短肽、低聚糖、多价阴阳离 子小分子杂质，得到澄清无色的净化D-核糖溶液；纳滤操作压力0.5-2.5MPa，温度20-40 ℃，浓缩倍数10-30倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(5)发酵液浓缩、结晶：将步骤(4)经过纳滤纯化后的D-核糖发酵液再以常规方法进行 离子交换、浓缩、结晶，制得纯度达99％以上的D-核糖。
上述步骤(1)所述的滤膜孔径优选为5μm，操作压力优选为0.1-0.3MPa，操作温度 优选为40℃，浓缩倍数为20倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-40％。
上述步骤(2)所述的微滤膜孔径优选为0.4μm，微滤操作压力优选为0.1-0.3MPa， 操作温度优选为20-30℃，浓缩倍数20倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的 10-40％。
上述步骤(3)所述的超滤膜截流分子量优选为6000，超滤操作压力优选0.5-2.0MPa， 温度优选20-30℃，浓缩倍数为10-20倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-40％。
上述步骤(4)所述的纳滤膜截流分子量优选为400，纳滤操作压力优选0.5-2.0MPa， 温度优选20-30℃，浓缩倍数为20倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-40％。
本发明涉及的从发酵液中分离提取D-核糖的方法，首次将膜分离技术引入发酵法生 产D-核糖的提取中，并根据发酵液中杂质粒度的分布情况，建立了一套多级膜分离系 统。本发明涉及的膜分离技术具有条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好的特点， 同时利用本发明的方法建立的去除杂质效率高、D-核糖损失少的优化组合多级膜分离 体系，克服了现有技术存在的收率不高、污水排量大及生产劳动强度大的缺陷，使D- 核糖生产成本降低，收率和质量显著提高。
与现有工艺技术相比，利用本发明的方法所具有的优越性如下：
1.本发明法采用微孔过滤去除菌体，改变了常规发酵液处理采用的离心及压滤机压 滤的方法，操作过程中无高速运转部件，降低了维修费用，降低工人的劳动强度。经微 孔滤膜过滤滤除菌体彻底，过滤清液澄清透明，除菌效果大大高于离心、絮凝等方法。
2.本发明采用超滤和纳滤膜过滤使发酵液中的离子性杂质和色素大量去除，减少离 子交换树脂的污染，大大延长了离子交换树脂的使用寿命，减少了排污量。
3.采用本发明工艺各工序之间串联紧密，发酵液始终在密闭的条件下循环流动，避 免了环境中的机械杂质对D-核糖提取液的二次污染，减少了分散操作造成的大量跑料现 象，并且工艺过程条件温和，D-核糖由化学反应造成的损失减少，所以采用本发明工艺 D-核糖提取率明显提高。
4.采用本发明工艺最突出的优越性在于精制后的D-核糖溶液质量显著提高，经离子 交换、浓缩、结晶得到的D-核糖产品经液相色谱(HPLC)分析纯度达99％以上。
具体实施方式
D-核糖发酵液25L通过5μm滤膜去除颗粒杂质及部分菌体，操作压力0.2Mpa，温 度40℃，浓缩倍数20倍，透析水量2.5L。过滤清液流经0.4μm的微孔滤膜滤除残余 菌体，操作压力0.3MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量7L。微滤清液通过截流 分子量为6000的超滤膜过滤滤除蛋白质胶体等大分子物质，操作压力1.5MPa，温度 30℃，浓缩倍数10倍，透析水量9L。超滤清液流经截流分子量为400的纳滤膜除去色 素及其他氨基酸、短肽、低聚糖、多价阴阳离子等小分子物质，操作压力2.0Mpa，温 度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量8L。结果见下表。
T(640nm) 体积(L) D-核糖(g/L) 收率(％) 发酵液 13.5 25.0 78.5 5μm滤液 72.4 26.5 72.6 98.1 0.4μm滤液 88.1 32.2 58.8 98.5 超滤清液 95.5 38.5 48.4 98.3 纳滤清液 99.2 46.0 39.6 97.8 总收率 92.8.
实施例2
D-核糖发酵液25L离心分离去菌体，3000rpm，10分钟，少量水洗涤菌体，合并离 心清液。离心去菌体发酵液流经0.4μm的微孔滤膜滤除残余菌体及颗粒性杂质，操作 压力0.1-0.2MPa，温度30-40℃，浓缩倍数20倍，透析水量8L。微滤清液通过截流分 子量为10000的超滤膜过滤，操作压力1.5-2.0MPa，温度25-30℃，浓缩倍数10倍， 透析水量10L。超滤清液流经截流分子量为500的纳滤膜，操作压力1.0-1.5MPa，温 度25℃，浓缩倍数20倍，透析水量10L。结果见下表。 T(640nm) 体积(L) D-核糖(g/L) 收率(％) 发酵液 13.5 25.0 76.8 离心清液 51.4 27.0 69.0 97.1 0.4μm滤液 81.5 33.6 54.4 98.1 超滤清液 93.4 40.8 43.6 97.3 纳滤清液 99.1 48.5 35.9 97.8 总收率 90.6
实施例3
D-核糖发酵液25L通过0.4μm的微孔滤膜滤除残余菌体及颗粒性杂质，操作压力 0.5MPa，温度25-30℃，浓缩倍数10倍，透析水量15L。微滤清液通过截流分子量为 4000的超滤膜过滤，操作压力1.0-1.5MPa，温度30-35℃，浓缩倍数20倍，透析水量 10L。超滤清液流经截流分子量为600-800的纳滤膜，操作压力2.0-2.5MPa，温度35-40 ℃，浓缩倍数20倍，透析水量10L。结果见下表。 T(640nm) 体积(L) D-核糖(g/L) 收率(％) 发酵液 13.5 25 76.5 0.4μm滤液 83.2 38 49.0 97.5 超滤清液 95.5 46.5 39.4 98.3
纳滤清液 99.2 55.3 32.3 97.5 总收率 93.4
实施例4
采用实施例1方法处理后的D-核糖发酵液50L(核糖含量40g/L)，采用常规低温减 压浓缩(温度60℃，操作压力-0.08MPa)至15L左右，再经离子交换进一步去除离子性 杂质，具体步骤为：浓缩后的D-核糖溶液首先流经HZ732阳离子交换树脂柱(上海华震 科技有限公司)，然后流经HZ335阴离子交换树脂柱(上海华震科技有限公司)，再流经 HZ110阳离子交换树脂柱(上海华震科技有限公司)。经离子交换后的D-核糖溶液再经 减压浓缩(温度60℃，操作压力-0.08MPa)至糖液呈粘稠糖浆状，加入约4倍的乙醇， 搅拌均匀，加少量晶种，缓慢降低温度使核糖结晶，抽滤分离核糖晶体并用冷乙醇洗去 晶体表面母液，母液再结晶一次。晶体冷冻干燥，共得到D-核糖1.85kg，经HPLC测定 D-核糖含量达99％以上。
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