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用于反复合成寡核苷酸的组合物、方法及检测技术

阅读：241发布：2020-09-22

专利汇可以提供用于反复合成寡核苷酸的组合物、方法及检测技术专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供用于检测目的分子的存在的方法，所述的方法通过在多核苷酸序列上反复进行酶促寡核苷酸合成事件产生多重可检测的寡核苷酸，并检测所述的产物。本发明也提供用于多重无效转录的方法。在进一步的方面，本发明提供含有无效启动子盒的树状聚合物的用途。在一方面，本发明提供适合用于本发明的无效启动子盒。在一方面，无效转录的产物通过使用质谱法检测。在另一方面，本发明提供用于检测靶蛋白、DNA或RNA的方法，所述的方法通过用无效转录产生多重可检测的RNA寡核糖核苷酸，所述的RNA寡核糖核苷酸可以例如通过质谱法检测。，下面是用于反复合成寡核苷酸的组合物、方法及检测技术专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于检测靶分子的存在的方法，所述的方法包括：
(a)通过在核酸模板上的无效反复合成，来合成多重拷贝的寡核苷酸；并
(b)通过质谱法测定所述靶分子的存在，因而检测所述靶分子的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中测定所述多重拷贝的寡核苷酸的分子量和丰度。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的靶分子包含所述的核酸模板。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的靶分子不同于所述的核酸模板。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的核酸模板是无效启动子盒。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的核酸包含多个无效启动子盒，所述的无效启动子盒连接至至少一种具有靶分子特异性的第二种分子上。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述的多个无效启动子盒通过树状聚合物连接至所述的第二种分子上。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述的无效启动子盒连接至具有靶分子特异性的第二种分子上，所述的第二种分子选自：
(a)DNA序列；
(b)RNA序列；
(c)PNA序列；
(d)抗体；
(e)结合蛋白；
(f)信号传导分子；
(g)半抗原；
(h)生物素；和
(i)离子。
9.用于检测靶分子的存在的方法，所述的方法包括：
(a)将模板多核苷酸与起始子和聚合酶孵育；
(b)从所述的模板多核苷酸合成多重寡核苷酸，其中延伸所述的起始子直到转录终止，导致合成多重反复的寡核苷酸转录物；并且
(c)通过质谱法测定所述靶分子的存在。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的多重反复的寡核苷酸转录物进一步包含经修饰的核苷酸。
11.如权利要求9所述的方法，其进一步包括将所述的靶多核苷酸与靶位点探针孵育。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述的靶位点探针大小选自：约20-约50个核苷酸；约51-约75个核苷酸；约75-约100个核苷酸；和多于100个核苷酸。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述的靶多核苷酸是DNA，并且所述的多重反复的寡核苷酸转录物包括RNA。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述的靶分子选自：
(a)蛋白质；
(b)核酸；
(c)RNA；
(d)DNA；
(e)糖类；
(f)脂类；
(g)抗原；
(h)半抗原；和
(i)离子。
15.如权利要求1所述的方法，其中检测病原体。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述的分子来自选自以下的生物体：HIV-1；HIV-2；HIV-LP；脊髓灰质炎病毒；甲型肝炎病毒；肠道病毒；人柯萨奇病毒，鼻病毒；欧可病毒；嵌杯状病毒科；披膜病毒科；马脑炎病毒；风疹病毒；黄病毒科；登革热病毒；脑炎病毒、黄热病毒；冠状病毒科；SARS；弹状病毒科；水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；丝状病毒科；欧鲍拉病毒；副粘病毒科；副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒；正粘病毒科；流感病毒；布尼病毒科；哈坦病毒；布尼病毒、白蛉热病毒；内罗病毒；沙粒病毒科；呼肠病毒科；呼肠病毒；环状病毒；轮状病毒；双RNA病毒科；嗜肝 DNA病毒科；乙型肝炎病毒；细小病毒科；乳多空病毒科；乳头状瘤病毒；多瘤病毒；腺病毒科；疱疹病毒科；HSV1；HSV2；水痘-带状疱疹病毒；巨细胞病毒(CMV)；痘病毒科；天花病毒；痘苗病毒；虹彩病毒科；非洲猪瘟病毒；丙型肝炎；诺沃克病毒幽门螺杆菌、布氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、无乳链球菌(B群链球菌)、绿色链球菌群、粪链球菌、牛链球菌、厌氧性链球菌属物种、肺炎链球菌、病原性弯曲杆菌属物种、肠球菌属物种、流感嗜血菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆菌属物种、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌属物种、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、极细密螺旋体、细螺旋体属、衣氏放线菌；新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽酵母、沙眼衣原体、白色念珠菌；恶性疟原虫和鼠弓浆虫。
17.如权利要求1所述的方法，其中检测癌。
18.如权利要求1所述的方法，其中检测DNA甲基化。
19.如权利要求1所述的方法，其中检测突变。
20.如权利要求1所述的方法，其中检测疾病。
21.如权利要求1所述的方法，其中定量RNA表达。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述的质谱法由选自以下的任意一种方法组成：
(a)快速原子轰击(FAB)质谱法；
(b)等离子体解吸(PD)质谱法；
(c)电喷雾/离子喷雾(ES)质谱法；
(d)基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱法；和
(e)基质辅助激光解吸/电离飞行时间分析(MALDI-TOF)；
23.含有树状聚合物的组合物，其中一个或多个无效启动子盒连接至所述的树状聚合物上。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述的组合物包含多个无效启动子盒连接至其上的树状聚合物。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述的连接至所述树状聚合物上的多个无效启动子盒是相同的。
26.如权利要求24所述的组合物，其中所述的连接至所述树状聚合物上的多个无效启动子盒是不相同的。
27.如权利要求23所述的组合物，其中所述的组合物进一步连接至具有目的靶分子特异性的第二种分子上。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述的第二种分子选自：
(a)DNA序列；
(b)RNA序列；
(c)PNA序列；
(d)抗体；
(e)结合蛋白；
(f)信号传导分子；
(g)半抗原；
(h)生物素；和
(i)离子。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述的第二种分子是抗体。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述的第二种分子是DNA 序列。
31.试剂盒，所述的试剂盒包含如权利要求23所述的组合物和一种或多种缓冲剂和一种或多种偶联试剂。
32.用于检测靶分子的存在的方法，所述的方法包括：
(a)通过在核酸模板上的无效反复合成，来合成多重拷贝的寡核苷酸；
(b)将所述多重拷贝的无效的经反复合成的转录物引入信号扩增级联反应；并
(c)测定从所述的信号级联反应中获得的信号的存在，因而检测所述靶分子的存在。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述的信号扩增级联反应选自：
(a)PCR；
(b)无效转录；
(c)FRET；以及
(d)酶扩增。
34.用于检测一种或多种靶分子的存在的方法，所述的方法包括：
(a)同时进行两个或更多个不同的通过在核酸模板上的无效反复合成而进行的多重拷贝的寡核苷酸的合成；和
(b)测定所述靶分子的存在，因而检测两种或更多种靶分子的存在。
35.无效启动子盒，其包含：
a)长度大于13nt的上游臂和长度大于13nt的下游臂；
b)长度为11-14nt的泡区段，包含
(i)含有以下序列的非模板链：5’TANNNTN5-8和
(ii)选自以下的模板链：
A)3’C(C或G或A)N9-13；
B)A(C或G或A)N9-13；
C)T(C或G或A)N9-13；以及
D)G(C或G或A)N9-13；
其中无效转录沿着(proceed off)所述的无效启动子盒进行。
36.如权利要求35所述的无效启动子盒，其中所述的非模板链包含序列：5’TATAATN5-8。
37.如权利要求36所述的无效启动子盒，其中所述的无效启动子盒选自：
a)5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
b)5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN CGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
c)5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN CANNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
d)5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN ACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
e)5′NNNNNNNNNNNNN TATAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN AGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
和
f)5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
  3′NNNNNNNNNNNNN AANNNNNNNNNNNNNNNNNNN。
38.如权利要求35所述的无效启动子盒，其包含靶位点探针，其中所述的靶位点探针包含至少约80％相同于选自以下的序列的序列：
(a)TSP2361；
(b)TSP2361AAC；
(c)TSP2361AAU；
(d)TSP2361AAA；
(e)TSP2361UCA；
(f)TSP2361CA；
(g)TSP2361bub15；
(h)泡4的靶位点探针；
(i)TSP2-1；和
(j)TSP12-1。
39.如权利要求38所述的无效启动子盒，其包含靶位点探针，其中所述的靶位点探针包含选自以下的序列：
(a)TSP2361；
(b)TSP2361AAC；
(c)TSP2361AAU；
(d)TSP2361AAA；
(e)TSP2361UCA；
(f)TSP2361CA；
(g)TSP2361bub15；
(h)泡4的靶位点探针；
(i)TSP2-1；以及
(j)TSP12-1。
40.如权利要求35所述的无效启动子盒，其包含模板链，其中所述的模板链包含至少约80％相同于选自以下的序列的序列：
(a)TEM2361AA-2；
(b)TEM2361AAC；
(c)TEM2361AA；
(d)TEM2361UCA；
(e)TEMUC2361；
(f)TEM-CpA-2361；
(g)TEM2361AU；
(h)TEM-CpG-2361；
(i)泡4的模板链；
(j)TEM2-1；以及
(k)TEM12-1。
41.如权利要求40所述的无效启动子盒，其包含模板链，其中所述的模板链包含选自以下的序列：
(a)TEM2361AA-2；
(b)TEM2361AAC；
(c)TEM2361AA；
(d)TEM2361UCA；
(e)TEMUC2361；
(f)TEM-CpA-2361；
(g)TEM2361AU；
(h)TEM-CpG-2361；
(i)泡4的模板链；
(j)TEM2-1；以及
(k)TEM12-1。
42.如权利要求35所述的无效启动子盒，其包含选自以下的无效启动子盒：
(a)APC4；
(b)APC11；
(c)APC12；
(d)APC14；
(e)APC13；
(f)APC24；
(g)APC25；
(h)APC30；
(i)APC32；
(j)APC33；
(k)泡4；
(l)APC UC2361；
(m)APC2-1；以及
(n)APC12-1。
43.无效启动子盒，其中所述的无效启动子盒靶位点探针和模板链的序列至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同于如权利要求42所述的无效启动子盒。
44.用于检测靶分子的存在的方法，所述的方法包括：
(a)通过从如权利要35所述的无效启动子盒的无效反复合成，来合成多重拷贝的寡核苷酸；并
(b)测定信号的存在，因而检测所述靶分子的存在。

说明书全文

发明领域

[0001]本发明总体上涉及通过在核酸模板上经无效(abortive) 转录起始进行反复(reiterative)合成而产生多重拷贝的寡核苷酸来检测目的分子。多重拷贝的寡核苷酸可通过包括质谱法的方法检测，表明靶分子的存在和/或特定特征。本发明方法可用于检测病原体、毒素、蛋白质、核酸、突变、癌性病症，或其它分子、疾病或病症。相关技术

[0002]近年来，多种用于检测核酸扩增产物的方法的发展已引起检测、鉴别和定量核酸序列方面的进步。核酸检测可潜在地用于定性和定量分析。例如，核酸检测可用于检测和鉴别病原体；检测与确定的表型相关的遗传和后生的改变；诊断遗传病或对特定疾病的遗传易感性；评估在发育、疾病和/或对确定的刺激物(包括药物)作出反应的过程中的基因表达；以及通常通过为研究科学家提供附加的手段以研究加强细胞活性的分子和生物化学机制来促进本领域的进步。

[0003]已经发展了许多种核酸检测技术，其中数种技术已经发展为适用于在试验样品中检测低水平靶核酸的存在的方法。例如，一类这样的方法通常指靶扩增，这种扩增产生靶序列的多重拷贝，并且随后将这些拷贝例如通过凝胶电泳进行进一步分析。其它方法从杂交探针或探针产生多个产物，例如通过切割杂交的探针形成多个产物或通过连接邻近的探针形成独特的杂交依赖性 (hybridization-dependent)产物。另外的方法可扩增由杂交事件产生的信号，例如基于具有靶序列结合域和标记的报告序列结合域的分支DNA探针的杂交的方法。

[0004]有许多本领域已知的靶核酸扩增方法，包括等温靶核酸扩增法，该方法已经得到了发展，以满足迅速而准确地检测病原体如细菌、病毒和真菌，以及检测正常和异常的基因的需求。虽然所有的这些技术为在样品中检测和鉴定少量的靶核酸提供强有力的工具，但它们都受到各种问题影响。

[0005]因此，需要一种能检测低水平的靶分子的迅速、灵敏且标准化的核酸信号检测方法。

[0006]这些需要及其它需要，通过本申请的发明得以满足。无效转录的方法已描述于，于2002年10月29日申请的，以WO 03/038042 发表于2003年5月8日的国际专利申请PCT/US02/34419；于2001年 10月30日申请的，以美国申请公开号US-2003-0099950发表于2003 年5月29日的美国专利申请系列号09/984,664；以及于2003年4 月29日申请的，以美国申请公开号US-2004-0054162-A1发表于2004 年3月18日的未决美国专利申请号10/425,037；所有这些在这里通过全文引用作为参考。

[0007]无效转录提供了其它方法没有的多种有利条件。该方法相对简单；包括很少的步骤，可以等温地并使用价廉的试剂来完成；迅速；高度灵敏；并易适合不同情形。被扩增的核酸无需是实际的靶目的分子。而且，当使用最终涉及通过无效转录进行核酸扩增的步骤检测时，扩增出的核酸可代表例如蛋白质、核酸或其它靶目的分子的存在。

[0008]本发明提供用于通过在核酸模板上的反复合成而产生多重寡核苷酸转录物来检测靶分子(例如核酸序列或蛋白质)存在的方法。多重寡核苷酸转录物可通过多种方法，包括FRET、放射性同位素法、比色法、酶促法和质谱法检测。质谱法能检测未“标记的”分子，是迅速、灵敏而精确的。

[0009]通常，质谱法提供一种通过在真空中电离分子并通过挥发作用使其“飞行”而“称重”单个分子的方法。在电场和磁场的联合影响下，离子沿依赖于它们的个体质量(m)和电荷(z)的轨道运动。质谱法已用于通过测定母体分子离子的质量来分析和表征有机分子。而且，通过将该母体分子离子与其它粒子(如氩原子)碰撞，该分子离子通过所谓的碰撞诱导的解离(CID)碎裂形成次级离子。碎裂方式 /路径通常引出详细的结构信息。人们可在Methods of Enzymology， Vol.193：″Mass Spectrometry″(J.A.McCloskey，编者)，1990， Academic Press，New York中找到质谱法的总结。

[0010]由于质谱法在提供高度的检测灵敏度、质量测量精确性、通过CID并结合MS/MS配置和速度而得到的详细结构信息、以及联机数据转移至计算机中的分析优势，所以已相当愿意采用质谱法对核酸进行结构分析。概述该领域的最近的综述包括K.H.Schram，“Mass Spectrometry of Nucleic Acid Components，Biomedical Applications of Mass Spectrometry”34，203-287(1990)；和P. F.Crain，“Mass Spectrometric Techniques in Nucleic Acid Research，”Mass Spectrometry Reviews 9，505-554(1990)，以及美国专利No 6,602,662。

[0011]通常质谱法检测限于低分子量的合成寡核苷酸，该方法检测母体分子离子的质量并通过它确认已知的寡核苷酸序列，或者备选地，通过在MS/MS配置中由CID产生次级离子来确认已知的序列，特别是为了离子化和挥发而采用快速原子轰击(FAB质谱法)或等离子体解吸(PD质谱法)的方法。例如，采用FAB来分析用于化学合成寡脱氧核苷酸的经保护的二聚体模块(block)已被描述(Wolter等， Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14，111-116(1987))。

[0012]两种更近期的电离/解吸技术是电喷雾/离子喷雾(ES)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。

[0013]电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离质谱法是“软”电离技术，凭该技术来分析样品以主要得到分子量信息。

[0014]电喷雾电离同样适合于大多数小有机分子及蛋白质和其它高分子质量生物分子的质量测量。通常，正电离电喷雾用于分析肽、蛋白质、糖蛋白和含胺和其它能保持正电荷的官能团的小分子。负电离电喷雾用于分析寡核苷酸、糖类和包含酸官能性和其它能保持负电荷的官能团的小有机分子。

[0015]通过电喷雾电离，将样品引入至用于质谱仪的溶液中，并因而该技术能直接与HPLC或CZE结合以产生在线的色谱数据，从而提供所有成分的分子量信息，因此，避免对于分离和分析单个级分之前的离线分离的需要。对ES/EIS质谱法的进一步讨论见例如Yamashita 等(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申请号WO 90/14148)。当前的应用在最近的综述文章如R.D.Smith等，Anal.Chem.62， 882-89(1990)和B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry， Spectroscopy Europe 4，10-18(1992)中概述。14聚体核苷酸的分子量(Covey等，“The Determination of Protein，Oligonucleotide and Peptide Molecular Weights by Ionspray Mass Spectrometry， Rapid Communications in Mass Spectrometry，2，249-256(1988)) 和21-聚体的分子量(Methods in Enzymology，193，“Mass Spectrometry”，(McCloskey，编者)，p.425，1990，Academic Press， New York)已经得以测定。作为质量分析器，最通常使用四极质量分析器(quadrupole)。由于存在全部能用于质量计算的多重离子峰，因而在飞摩尔量的样品中测定分子量是非常精确的。

[0016]相反，当将飞行时间(TOF)配置作为质量分析器使用时， MALDI质谱法是相当吸引人的。MALDI-TOF质谱法已由Hillenkamp等进行了介绍(“Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization： A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules，” Biological Mass Spectrometry(Burlingame和McCloskey，编者)， Elsevier Science Publishers，Amsterdam，pp.49-60，1990)。由于在多数情况下，用该技术不产生多重分子离子峰，所以基本上该质谱法较于ES质谱法看起来更简单。

[0017]多种质谱法技术已用于分析不同大小的DNA(Nelson等， “Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions，Science，246，1585-87 (1989)；Huth-Fehre等，Rapid Communications in Mass Spectrometry，6，209-13(1992)；K.Tang等，Rapid Communications in Mass Spectrometry，8，727-730(1994)；Williams等，“Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix，”Rapid Communications in Mass Spectrometry，4，348-351(1990))。日本专利No.59-131909 描述了一种检测通过电泳、液相色谱法或高速凝胶过滤分离的核酸片段的仪器。质谱检测通过将通常不存在于DNA中的原子如S、Br、I 或Ag、Au、Pt、Os、Hg整合进核酸中而得以完成。

[0018]在本申请中经引用或确定的所有文献或出版物特此通过全文引用作为参考，就好像特定且单独地表明每一个单个的文献以其全文引用作为参考。发明概述

[0019]本发明提供用于通过在多核苷酸模板上进行反复的寡核苷酸合成反应产生多重可检测信号以用于检测靶分子的方法和组合物，所述的信号是反复的寡核苷酸转录物，其可通过使用质谱法检测。本发明也提供对于反复合成和检测方法的应用。本发明的方法和试剂盒的应用包括但不限于，检测突变和单核苷酸多态性、RNA分子、病原体，以及检测癌变前的或癌性的突变和病症。

[0020]在一方面，本发明提供用于检测多重从DNA或RNA多核苷酸反复合成的寡核苷酸的方法。从其上产生多重反复合成的寡核苷酸转录物的模板可能是或不是靶分子。该方法包括：(a)将单链靶多核苷酸与起始子、聚合酶以及任选地另外的核糖核苷酸和任选地靶位点探针和任选地链终止核苷酸孵育；(b)从所述的靶多核苷酸合成多重寡核苷酸，其中延伸所述的起始子直至所述的终止子整合入所述的寡核苷酸，从而合成多重反复的寡核苷酸；并且(c)用质谱法检测或定量目的多核苷酸的所述的反复的寡核苷酸转录物；其中所述的经合成的寡核苷酸的长度选自：约2-约26个核苷酸、约26-约50个核苷酸及约50个核苷酸至约100个核苷酸，以及多于100个核苷酸。

[0021]上述方法的进一步修正已在2003年5月8日出版的国际申请WO 03/038042和2003年5月29日出版的美国申请公开号 US-2003-0099950中描述，两者都在这里通过全文引用作为参考。这些改进包括但不限于：另外步骤的使用，例如在将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基而没有将甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶的条件下使单链靶DNA序列脱氨；捕获探针或固定序列的使用；改进靶位点探针、起始子等以检测单个核苷酸多态性和甲基化中的变化；无效启动子盒的使用；多个靶位点探针、起始子等的用途；不同的反应条件、聚合酶、核苷酸、标记等的使用；改良的核苷酸、核苷；以及本发明试剂盒。

[0022]在一个实施方案中，本发明包括用于检测靶分子存在的方法，方法包括：(a)通过在核酸模板上进行无效的反复合成来合成多重拷贝的寡核苷酸；并(b)通过质谱法测定所述靶分子的存在，从而检测所述靶分子的存在。在另一个实施方案中，还测定所述多重拷贝的寡核苷酸的分子量和/或丰度。

[0023]在一个实施方案中，靶分子包括核酸模板。在另一个实施方案中，靶分子与所述的核酸模板不同。无效转录也可从无效启动子盒发生。

[0024]在一个实施方案中，本发明包括无效启动子盒(Abortive Promoter Cassette)。也提供了对某些无效启动子盒种类的描述和具体实施方案。在相关实施方案中，本发明包括使用这样的无效启动子盒进行无效转录的方法和相关方法。

[0025]在一些实施方案中，这样的无效启动子盒可连接至对靶分子有特异性的第二种分子上，所述的第二种分子选自：DNA序列；RNA 序列；PNA(蛋白质核酸)序列；抗体；结合蛋白；信号传导分子；半抗原；生物素；结合核苷；结合核苷酸；酶底物；酶底物衍生物；和离子。

[0026]在一个实施方案中，本发明包括用于检测靶分子存在的方法，方法包括：将模板多核苷酸与起始子和聚合酶孵育；从所述的模板多核苷酸合成多重寡核苷酸，其中延伸所述的起始子直至转录物终止，从而使多重反复的寡核苷酸转录物合成；通过质谱法测定所述多重反复的寡核苷酸转录物的分子量和/或丰度，从而检测所述的靶多核苷酸的存在。

[0027]在本发明方法的一些实施方案中，多重反复的寡核苷酸转录物进一步包含经修饰的核苷酸。在其它的实施方案中，该方法进一步包括将所述的靶多核苷酸与起始子、聚合酶、终止子和靶位点探针孵育。这种靶位点探针的大小选自但不限于：约20-约50个核苷酸；约51-约75个核苷酸；约75-约100个核苷酸；以及多于100个核苷酸。

[0028]在一些实施方案中，靶多核苷酸是DNA，并且多重反复的寡核苷酸转录物包括RNA。

[0029]靶分子的种类也可以不同。在一些实施方案中，方法包括选自以下的靶分子：蛋白质；核酸；RNA；DNA；糖类；脂类；抗原；半抗原；和离子。

[0030]在一些实施方案中，本发明提供检测病原体的方法。在其它的实施方案中，方法包括从生物体检测分子的方法，所述的生物体选自：HIV-1；HIV-2；HIV-LP；脊髓灰质炎病毒；甲型肝炎病毒；肠道病毒；人柯萨奇病毒，鼻病毒；欧可病毒；嵌杯状病毒科 (Calciviridae)；披膜病毒科(Togaviridae)；马脑炎病毒；风疹病毒、黄病毒科(Flaviridae)；登革热病毒；脑炎病毒、黄热病毒；冠状病毒科(Coronaviridae)；SARS；弹状病毒科(Rhabdoviridae)；水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；丝状病毒科(Filoviridae)；欧鲍拉病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)；副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；流感病毒；布尼病毒科(Bunyaviridae)；哈坦病毒(Hantaan virus)；布尼病毒、白蛉热病毒；内罗病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae)；呼肠病毒科 (Reoviridae)；呼肠病毒；环状病毒；轮状病毒；双RNA病毒科 (Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)；乙型肝炎病毒；细小病毒科(Parvoviridae)；乳多空病毒科(Papovaviridae)；乳头状瘤病毒；多瘤病毒；腺病毒科(Adenoviridae)；疱疹病毒科 (Herpesviridae)；HSV 1；HSV 2；水痘-带状疱疹病毒；巨细胞病毒 (CMV)；痘病毒科(Poxviridae)；天花病毒；痘苗病毒；虹彩病毒科 (Iridoviridae)；非洲猪瘟病毒；丙型肝炎；诺沃克病毒幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)、布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌(Group A Streptococcus))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌(Group B Streptococcus))、链球菌属(绿色链球菌(Streptococcus viridans)群)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属 (Streptococcus)(厌氧性物种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、肠球菌属物种(Enterococcus sp.)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、细螺旋体属(Leptospira)、衣氏放线菌 (Actinomyces israelli)；新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽酵母(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌 (Candida albicans)；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和鼠弓浆虫(Toxoplasma gondii)。这样的分子可以是例如DNA、RNA、蛋白质、毒素、糖类、脂类、抗原或半抗原。

[0031]本发明也包括用于检测癌、DNA甲基化、突变、疾病的方法，所述的方法包括：(a)通过在核酸模板上进行无效反复合成来合成多重拷贝的寡核苷酸；和(b)通过质谱法测定所述靶分子的存在，从而检测所述靶分子的存在。在另一个实施方案中，还测定所述多重拷贝的寡核苷酸的分子量和丰度。

[0032]本发明也包括用于检测和定量RNA表达的方法。

[0033]根据本发明方法可使用多种质谱法，包括(但不限于)快速原子轰击(FAB)质谱法、等离子体解吸(PD)质谱法、电喷雾/离子喷雾(ES)质谱法、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱法和基质辅助激光解吸/电离飞行时间分析法(MALDI-TOF)。

[0034]本发明也包括组合物。在一个实施方案中，本发明包括一个或多个无效启动子盒连接其上的树状聚合物。在一个实施方案中，连接至所述树状聚合物的多个无效启动子盒是相同的。在另一个实施方案中，连接至所述树状聚合物的多个无效启动子盒是不同的。

[0035]在进一步的实施方案中，本发明包括其上连接有一个或多个无效启动子盒的树状聚合物，该树状聚合物进一步连接对靶目的分子有特异性的第二种分子。这种第二种分子可选自：DNA序列；RNA 序列；PNA序列；抗体；结合蛋白；信号传导分子；半抗原；生物素；结合核苷；结合核苷酸；酶底物；酶底物衍生物；和离子。

[0036]在一些实施方案中，本发明包括含有其上连接有一个或多个无效启动子盒的树状聚合物的试剂盒。在另一个实施方案中，本发明是用于实施本发明方法的组合物或装置。

[0037]在一些实施方案中，本发明包括用于检测靶分子存在的方法，所述方法包括：通过在核酸模板上进行无效反复合成来合成多重拷贝的寡核苷酸；将所述多重拷贝的无效的反复合成的转录物引入至信号扩增级联反应中；并测定从所述信号级联反应中产生的信号的存在，从而检测所述靶分子的存在。信号级联反应包括但不限于：PCR；无效转录；FRET；辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶；和其它由合成的转录物引发的信号的酶促扩增。

[0038]在另一个实施方案中，本发明包括用于检测一种或多种靶分子存在的方法，所述方法包括通过在核酸模板上进行无效反复合成来合成多重拷贝的寡核苷酸；同时进行一个或多个不同的通过在核酸模板上的无效反复合成而进行的多重拷贝的寡核苷酸的合成；测定所述的一种或多种靶分子的存在。附图简述

[0039]图1：无效启动子盒。无效启动子盒(APC)是形成聚合酶结合位点并能通过与称为APC连接体的特定核酸序列相互作用而连接至其它大分子上的核酸区域。APC连接体能通过杂交至靶核酸的模板或非模板链上的互补序列而连接至靶核酸(DNA或RNA)上。APC连接体也能杂交至位于任何靶分子如蛋白质上的互补序列上，以用于检测结合至所述蛋白质上的分子。多重可检测的寡核苷酸通过结合至无效启动子盒上的聚合酶而产生。在该图中，所描述的APC含有两个基本互补的区域(A，A’和C，C’)，这两个区域由“泡(bubble)区域” 分离。在该图示中，因为这两条链的区域是非互补的(B和E)，所以产生了“泡区域”。备选地，APC可以有两条完全互补的链。一旦RNA 聚合酶结合后，DNA链分离，导致形成“泡区域”。

[0040]区域A、B和C在一条链上。区域C’、E和A’在互补链上。APC可由两条分离的链(ABC和C’EA’)构成或者所有的6 个区域可在单个多核苷酸上，其中区域C和C’通过连接体区域D分开，该连接体区域D可以修饰成所需的长度。连接体区域D只用于连接C和C’，或区域D的序列可作为能增强无效转录的其它因子的结合位点，所述的因子是例如转录障碍蛋白质，包括但不限于EcoRI QIII 突变体、乳糖抑制子和其它RNA聚合酶。连接体区域D可设计用于结合单个障碍蛋白质或多个障碍蛋白质。连接体区域D的长度取决于该连接体区域的功能。

[0041]图2：通过反复的寡核苷酸合成的信号产生。信号通过酶促整合核苷酸以形成多重寡核苷酸转录物而产生。在适当的条件下， RNA寡核苷酸可在缺少启动子时从核酸模板产生。起始子可由一个或多个核苷、核苷类似物、核苷酸或核苷酸类似物组成。起始子可包含一个或多个共价连接的核苷酸，包括但不限于1-25个核苷酸、26-50 个核苷酸、51-75个核苷酸、76-100个核苷酸、101-125个核苷酸、及126-150个核苷酸、151-175个核苷酸、176-200个核苷酸、201-225 个核苷酸、226-250个核苷酸以及多于250个核苷酸，并且可包含R 官能团(functional R group)。起始子(n个拷贝)可直接用n个拷贝的终止子延长以结束链延伸，或者可在起始子和终止子之间整合入n个拷贝的其它延伸子核苷酸(Y位置)以形成更长的寡核苷酸。终止子可包含第二个官能团。NI＝起始性单核苷酸或寡核苷酸类似物、 NE＝延长性单核苷酸或类似物、NT＝终止性单核苷酸或类似物、Z＝x+y； R1＝H、OH或报告基团；R2＝H、OH或报告基团；N＝脱氧或核糖核苷酸；聚合酶＝RNA-依赖性或DNA-依赖性RNA聚合酶。DNA或RNA可连接至其它的分子如蛋白质上。

[0042]随后用质谱法检测反复的寡核苷酸转录物。质谱法可对于不包含任何“标记性”部分的寡核苷酸转录物来进行。然而，在起始子、整合的核苷酸或终止子分子之任一中使用核苷酸类似物将改变生成物的分子量并且可用于质谱法以区分相同核苷酸长度的多种寡核苷酸。

[0043]图3：在单链DNA或RNA上通过无效起始进行二核苷酸合成。单链(ss)核酸是DNA或RNA。聚合酶是DNA-依赖性或RNA-依赖性RNA聚合酶。NI＝3’-OH核苷或核苷酸起始子；NT＝5’-三磷酸核苷酸或核苷酸类似物终止子。R1可以在5’磷酸基、糖的2’位置上或在嘌呤或嘧啶碱基上。R2可以在嘧啶或嘌呤碱基上或在糖/核糖或脱氧核糖的2’或3’位置上。如在此描述的，R1＝H、OH和/或任何报告基团或报告基团前体。如在此描述的，R2＝H、OH和/或任何报告基团或报告基团前体。

[0044]图4：靶位点探针。通过基因特异性或区域特异性靶位点探针(TSP)的杂交可将RNA聚合酶引导至靶核酸中的特定核苷酸位置 (位点)。靶位点是待分析其序列(如在检测单个核苷酸多态性中) 或结构(如在评估特定核苷酸的甲基化状态中)的DNA中的核苷酸位置，并且其位于靶序列中区域E和C’接合处的靶序列的模板链上。 TSP含有与在靶位点核苷酸上游始于约8-14个核苷酸并止于约15-35 个核苷酸的靶核酸同源的区域(区域A)。TSP的第二个区域(区域B) 设计为与靶位点上游紧接的8-14个核苷酸不互补，这样当TSP与靶核酸杂交时形成熔化的“泡”区域。TSP包含第三个区域(区域C)，该区域与靶位点核苷酸下游紧接的5-25个核苷酸基本互补。RNA聚合酶将结合至泡状复合体上从而使转录将在E/C’接合处开始并向下游移入至C/C’杂交体中。

[0045]图5：DNA中未甲基化的胞嘧啶基团的脱氨基转化。脱氨基作用使未甲基化的C转化为U。甲基化的C基团，例如在调节真核基因的CpG岛(island)中的那些甲基化的C基团可抵抗脱氨基作用并在产物DNA中保持为C。如果发生100％脱氨基作用，则甲基化的DNA 将依然包含CpG双联体，然而未甲基化的DNA将不会含有胞嘧啶并现在将在脱基氨作用之前是CpG双联体的地方含有UpG。因为这两种DNA 编码不同的二核苷酸，所以DNA序列中的这种不同可用于通过无效转录来区分甲基化和未甲基化的DNA。

[0046]二核苷酸合成可用于评估DNA整个的甲基化状态。存在 RNA聚合酶、CTP或CTP类似物(R1-C-OH)以及GTP或GTP类似物 (R1-CpG-R2)时，经脱氨的甲基化的DNA模板将产生n个拷贝的经标记的二核苷酸产物，其中n与初始的DNA中甲基化的CpG二核苷酸的数量成比例。由于经脱氨的未甲基化的DNA模板不再在任何位置编码 “C”，所以该模板不能产生具有这些底物的二核苷酸。

[0047]通过用经标记的以C结尾的二核苷酸(ApC、CpC、GpC、 UpC)起始转录并用GTP终止转录的三核苷酸的无效合成可用于从经脱氨的甲基化的模板中而不是从经脱氨的未甲基化的模板中产生信号。如图6中阐明，这种三核苷酸合成方法可通过加入位点特异性的寡核苷酸得以扩展以使得能评估特定CpG位点而不是整个岛的甲基化状态。

[0048]图6：通过无效起始评估CpG岛中特定CpG位点的甲基化状态。靶位点探针可用于检查特定基因中特定CpG岛的甲基化状态。在经脱氨的甲基化的DNA中，二核苷酸CpG在3个甲基化位点1、3 和4而不是在未甲基化位点2由模板编码。如图4中描述，为了特定地测定位点3是否是甲基化的，并且如果是甲基化的，则测定达到什么程度，位置(C21)可以用靶位点探针定向。所讨论的模板C定位于泡区域和下游双链体的接合处，这样它编码对于结合至泡区域的、合适引发的(primed)RNA聚合酶的下一个整合的核苷酸。如果使用起始子R1-NXpC-OH，其中NX可以是二核苷酸CpC起始子的C或者NX可以是三核苷酸起始子的CpC等，则该起始子可用GTP或GTP类似物pppG-R2G 延伸以形成三核苷酸R1NXCpG-R2。类似地，如果所讨论的C不是甲基化的，则该位置现在将是U并且将编码核苷酸A。如果存在ATP或ATP 类似物pppA-R2A，它将会插入至C不是甲基化的相反位置。

[0049]质谱法，其能够基于分子量而容易地区分不同的三核苷酸序列，可用于测定在以G结尾的寡核苷酸较于以A结尾的寡核苷酸的相对量。对应于以G结尾的三核苷酸的峰的大小与以A结尾和以G结尾的三核苷酸的整个峰的比率相当于甲基化指数(M)。如果在那个位置的所有C是甲基化的，则M＝1。如果没有位点是甲基化的，则M＝0。此外，核苷酸类似物也可用于本发明以赋予所获得的寡核苷酸不同的分子量。

[0050]图7：通过无效转录检测和鉴定单个核苷酸多态性(SNPs)。特定的DNA核苷酸(A、C、G、T/dU)同一性可使用靶位点探针(TSP) 通过无效转录鉴定。例如，为了测定DNA是包含正常的核苷酸(野生型)还是突变的核苷酸(点突变、单个核苷酸多态性/SNP)，可将基因特异性TSP加入至靶DNA(或扩增/复制产物)从而使SNP位置对应于在下游双链体和泡区域的接合处的C/C’杂交体中最后的核苷酸。与SNP位点上游区域互补的起始子寡核苷酸(R1NI-OH)可由RNA聚合酶延伸以加入与SNP对应的下一个编码的核苷酸。合成的寡核苷酸可用质谱法检测并相互区分。

[0051]图8：通过无效转录间接地检测核酸、蛋白质等。无效转录可用于通过反复的寡核苷酸转录物而直接检测与特定疾病或与病毒和细菌性病原体相关的核酸，例如DNA或RNA。备选地，可通过将a) 识别所述蛋白质、糖类、脂类、半抗原或其它分子的抗体、互补核酸序列、化学部分等结合至b)一个或多个无效启动子盒(APC)来间接地检测核酸、蛋白质、糖类、脂类、半抗原或其它分子的存在。可检测从APC产生多重反复的寡核苷酸转录物，表明靶分子的存在。

[0052]APC可以包含人工启动子，或者它可包含用于特定RNA聚合酶的启动子。分子靶标的增强检测可通过使用颗粒来实现，该颗粒连接有多个拷贝，包括十、百、千、万个或甚至更多的无效启动子盒 (APC)。图8阐明了使用偶联至捕获序列上的APC用于检测核酸。

[0053]图9：通过杂交性、化学修饰的、序列特异性靶位点探针可以检测RNA或DNA靶。虽然核酸靶可通过直接在靶分子上进行无效转录来检测，但其也可通过与连接有无效启动子盒(APC)的探针序列杂交来检测。可连接多个APC，增强从单个结合事件的信号产生，并从而增强灵敏度。灵敏度和特异性也可通过多路技术(multiplexing) 增强：由一个反应产生多个不同的信号。将三个探针杂交至靶核酸，每个探针杂交至同一靶分子的不同区域，并且每个探针用不同的APC 标记。通过对一个靶分子使用三个APC来增强灵敏度。特异性也得以增强，因为从一个靶分子产生三个独立的信号减少了可能出现的假阳性。

[0054]通过异双功能连接体将包含多个APC的树状聚合物连接至靶位点探针。每个树状聚合物包含同一APC的多个拷贝并编码单一的无效转录物(abscript)。可合成多个树状聚合物，每个树状聚合物包含不同的APC。所有的APC可同时检测和定量。可通过看每种不同 APC产物的比率来测定特异性。通过使用额外的、用编码不同的无效转录物的APC标记的树状聚合物可获得增强的特异性。通过使用多个树状聚合物，每个树状聚合物编码相同的产物，来获得增强的灵敏度。

[0055]也可能将APC标记的树状聚合物连接至蛋白质例如抗体上。

[0056]图10：当处理核酸时，多路技术可以提高灵敏度和特异性。因为捕获抗体可将靶分子从大体积样品中提取出来，所以使用捕获抗体可进一步提高特异性(因为只有特定的蛋白质可结合)并也可提高灵敏度。在该图解说明的实施方案中，将蛋白质毒素用捕获抗体固定。加入两种更多的毒素表位特异性肽抗体，每种用无效启动子盒标记。加入无效转录(abscription)底物，这样每个APC产生不同的无效转录(abscription)产物，随后检测并定量该产物。通过加入更多的毒素特异性抗体可获得更高水平的特异性。随后正信号会要求从每种这些抗体中以合适的比率产生无效转录物。例如，APC1编码ApUpA， APC2编码ApUpC，APC3编码ApUpG。所有的三种无效转录物使用相同的ApU起始子。每种整合不同的核苷酸作为位置3，从而产生不同质量的无效转录物。备选地，可不同地标记A、C和G，每种标记产生不同的信号。

[0057]图11：通过反复寡核苷酸合成检测端粒酶活性。用DNA 聚合酶的反复寡核苷酸合成也能用于信号产生，然而产物寡核苷酸无需释放，而是可将其串联地连接在产物中。例如，通过将端粒酶特异性探针固定在固体基质上以捕获细胞端粒酶可检测端粒酶活性，该细胞端粒酶携带它自己的用于DNA合成的RNA模板。例如，对于人端粒酶，酶上的RNA模板编码DNA序列GGGTTA。如果样品中存在端粒酶，那么捕获探针可包含序列GGGTTA，该序列将反复地被加入至端粒酶捕获探针的末端。信号的产生可通过多种途径达到，其中一种涉及在合成反应中包括一种或多种报告基团标记的dNTP以产生具有沿DNA产物主链连接的多个R1基团。图11显示了用于无效转录反应的模板序列。图11a：Poly[dG-dC]是重复dCpdG的合成的脱氧核糖核苷酸聚合物。单独的链包含不同数量的二核苷酸重复。图11b：泡复合体1通过退火合成的、部分互补的模板和非模板链制成。非模板链的垂直偏移表示分子的单链泡部分。坐标系基于泡的下游末端。紧靠双链区段的不配对碱基位于+1位置。位置+1左边(上游)的位置是以-1开始的负数。该坐标系用于表示核糖核苷酸起始子的3’末端的位置。起始子 AA的3’末端排列在+1而起始子AU的3’末端排列在+2。根据理论，转录反应从起始子的3’末端由左至右进行。图11c表示无互补非模板链的模板链。该序列以3’至5’的方向显示。

[0058]图12：用于本发明的方法和组合物的、可以是延伸子或终止子的一些核苷酸。显示了可以包含于寡核苷酸内部或3’末端位置的核苷酸类似物。通过置换3’OH基团可简单地将所有的这些类似物转化为终止子。在特定反应条件下，这些类似物也可作为具有3’OH 基团的终止子起作用。

[0059]图13：其它可能是R的荧光基团。这样的基团在其加入至嘧啶的5-S-位置或嘌呤的8-S-位置后可用于本发明的方法和组合物。

[0060]图14：核苷酸的其它R基团修饰：式NucSR的5-S-取代的嘧啶或8-S-取代的嘌呤，其中a是1至2。

[0061]图15：多路DNA检测。将多个靶特异性探针加入至包含靶DNA分子的样品中，每个所述探针杂交至靶DNA分子的不同区域，并接近有约100个核苷酸。如果这些TSP编码具有相同序列和报告基团的无效转录产物，则该方法将导致灵敏度增强。

[0062]如果这些TSP编码具有不同序列和报告基团的无效转录产物，则可出现高度选择性和多路技术。

[0063]图16：模块化的APC(Modular APC)。可以设计APC具有TSP连接体或具有对靶序列有特异性的核酸探针。如果APC编码具有相同序列和报告基团的无效转录产物，则该方法将导致灵敏度增强。

[0064]如果APC编码具有不同序列和报告基团的无效转录产物，则可出现高度选择性和多路技术。

[0065]图17：使用APC检测蛋白质。

[0066]图18：50皮摩尔的AUG和AAG三核苷酸的质谱图比较。

[0067]图19：用于检测50％CH3CN/H2O中的50、5和0.5pmol 的AAG三核苷酸的质谱法的灵敏度。

[0068]图20(A)：对用10和100μM AAG掺料的无效转录反应的第190-210次扫描(～3.5-3.8分钟)合计的质谱图。从-2价离子产生接近468Da的AAG信号。

[0069]图20(B)：来自以100μM掺料的样品的468-469Da(AAG) 和593-594Da(ApA)质量范围中的信号的色谱图。

[0070]图21：用于范例多路技术反应的无效启动子盒。无效转录复合物的泡部分用粗体显示，并且模板链上的起始位点用灰色突出。两个无效启动子盒用相同的靶位点探针(TSP)即A192，但用不同的模板链(TEM)即A197或A56构建。泡4的起始子是ApA，而对于UC2361 其是UpC，以及整合的核苷酸是GTP。从泡4产生的期望的无效转录产物是AAG而从UC2361产生的期望的无效转录产物是UCG。

[0071]图22：通过TLC分析从混合的APC试验产生的无效转录产物。泳道1-3有泡4(100fmol，最终)，并用ApA(泳道1)、UpC (泳道2)、ApA+UpC(泳道3)起始。泳道4-6有等摩尔浓度的泡 4(100fmol，最终)和APC UC2361(100fmol，最终)，并且在泳道4中它们用ApA起始，在泳道5中用UpC起始，在泳道6中用ApA+ UpC起始。泳道7-9有APC UC2361(100fmol，最终)，并用UpC(泳道7)、ApA(泳道8)和ApA+UpC(泳道9)起始。泳道10是用ApA 起始的TEM A197，泳道11是用UpC起始的TEM A57，而泳道12是具有起始子ApA+UpC而无APC的对照。泳道13是α32P-GTP的对照。对于每一个，起始子浓度是1mM终浓度。

[0072]图23：用寡核苷酸链的不同组合构成的10种无效启动子盒的描绘，它们用于多路无效转录反应。无效转录复合物的泡部分用粗体显示，并且模板链上的起始位点用灰色突出。用于构建APC的每个靶位点探针(TSP)和模板链(TEM)的同一性在APC旁列出。也列出了起始子和期望的无效转录产物。

[0073]图24：在4％琼脂糖凝胶上通过电泳测定寡核苷酸链退火而形成图23中描述的APC。APC的4％琼脂糖凝胶分析。将5μl 1pmol/ μl的APC上样至每个泳道中(1-10)。为了显示与单链的比较，将 TEM A191(5μl 50pmol/μl)上样至泳道11，并且泳道12具有50 bp的梯形条带(ladder)。

[0074]图25：从APC 4、12、24、25和32产生的无效转录物的 TLC分析。每个无效转录反应用100fmol的APC、1mM终浓度的起始子、1mM终浓度的如图中列出的NTP和1μl的无效转录酶 (abscriptase)一起进行。无效转录反应在45℃进行60分钟。将来自每个反应的2μl反应物在TLC板上点样，并用6∶3∶1的异丙醇∶NH4OH∶H2O展开。将TLC板暴露于磷光显像仪的屏10分钟。

[0075]图26：夹心ELISA中的SEB蛋白质的浓度(x-轴)相对于产生的无效转录物(y-轴)。

[0076]图27：从它们独立的操作产生的全部10种三核苷酸的组合的色谱图。嵌入的图表说明哪个编号的峰指哪个无效转录物，以及相关的保留时间、m/z值和峰面积。10μl10μM的溶液用Atlantis dC18 3um 2.1mm×30mm柱分析(100pmol)。所用的MS协调文件(tune file) 为“无效转录物”。

[0077]图28：通过质谱法同时检测的无效转录物的混合物。将每种无效转录物紧靠其对应的m/z比率显示。10μl 10μM的溶液用 Atlantis dC18 3um 2.1mm×30mm柱分析(100pmol)。所用的MS 协调文件(tune file)为“无效转录物”。

[0078]图29：用于多路无效转录反应的两种无效启动子盒的描绘。无效转录复合物的泡部分用粗体显示，并且模板链上的起始位点用灰色突出。用于构建APC的每个靶位点探针(TSP)和模板链(TEM) 的同一性在APC旁列出。也列出了起始子和期望的无效转录产物。

[0079]图30：较于对照反应从多路无效转录反应产生的总的信号。

[0080]图31：从用两种APC即APC 2-1和APC 12-1的多路反应产生的质谱图。在450.0895处的峰对应AAU，而在469.5732处的峰对应AAG。使用Atlantis dC18 3um 2.1mm×30mm柱，并且所用的 MS协调文件为“无效转录物”。发明详述

[0081]本发明提供用于检测靶分子(例如核酸序列或蛋白质)存在的方法，该方法通过在核酸模板上反复合成而产生多重寡核苷酸，并用质谱法检测。该方法一般包括，使用核苷酸或寡核苷酸转录起始子来开始无效寡核苷酸产物的合成，该产物基本上与靶核酸上的位点互补；终止聚合反应(例如通过核苷酸剥夺、插入链终止核苷酸或通过模板序列中的转录终止信号的存在)；并，任选地，使用(1)靶位点探针来形成转录泡复合体，该复合体包含单链靶位点的任意一边上的双链区段，或(2)无效启动子盒，其包含包括靶位点的转录泡区域，或(3)无效启动子盒，其连接至任何靶分子并然后用于产生信号。信号包括通过质谱测定的多重寡核苷酸转录物。

[0082]根据一方面，本发明提供用从靶DNA或RNA序列的部分合成的多重无效寡核苷酸转录物来检测靶分子的方法，其中该方法包括将下面的物质组合在一起并反应：(a)单链靶核酸，其包括至少一个靶位点；(b)与靶核酸上位于靶位点上游的位点互补的RNA起始子； (c)RNA聚合酶；(d)任选地，核苷酸和/或核苷酸类似物；(e) 链终止子；和(f)任选地，(1)部分杂交至靶核酸上的靶区域的靶位点探针，形成转录泡复合体，该复合体包括单链靶位点上任一边上的第一个和第二个双链区域，或(2)无效启动子盒，其含有包括转录起始位点的转录泡区域。将该组合处于合适的条件，如下描述的，这样(a)靶位点探针与含有靶位点的靶区域中的靶核酸杂交；(b)RNA 起始子在靶位点上游杂交；(c)RNA聚合酶利用RNA起始子在靶位点处开始转录，进行延伸，并合成寡核苷酸转录物；(d)在延伸期间链终止子终止转录；(e)RNA聚合酶释放短的、无效的寡核苷酸转录物而基本没有从聚合酶结合位点上移开或从模板上解离；并(f)重复(c) -(e)直到产生足够的信号并停止反应。备选地，(a)无效启动子盒与靶核酸的末端杂交；(b)RNA起始子与转录起始位点的上游杂交； (c)RNA聚合酶利用RNA起始子在靶位点处开始转录，进行延伸，并合成寡核苷酸转录物；(d)在延伸期间链终止子终止转录；(e)RNA 聚合酶释放短的、无效的寡核苷酸转录物而基本没有从聚合酶结合位点上移开或从模板上解离；并(f)重复(c)-(e)直到产生足够的信号并停止反应。

[0083]由此产生的多重寡核苷酸转录物即信号，用质谱法检测和定量，表明靶分子的存在。在一些方面，本发明方法也表明靶分子的性质或靶分子库的性质。一般技术

[0084]本发明的实行将采用，除非另外表明，传统的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术，它们全部在本领域普通从业者的能力之内。术语

[0085]为了促进理解本发明，下列术语具有下列的含义，除非明确的另外申明。这里使用的许多术语的其它详尽细节可以在2003年五月8日发表的国际申请WO 03/038042和2003年五月29日发表的美国申请公开号US-2003-0099950以及2003年四月29日申请的未决美国申请10/425,037中找到。

[0086]这里使用的“大约”表示提及为“大约”的数目包括叙述的数目加上或减去1-10％的叙述的数目。例如，“大约”50个核苷酸取决于情形，可以表示45-55个核苷酸或少至如49-51个核苷酸。

[0087]“无效转录(Abortive transcription)”是酶介导的过程，该过程反复地起始并终止寡核苷酸的合成，该寡核苷酸对应于互补核酸模板序列的至少一部分，或靶位点。合成的无效寡核苷酸的核苷酸长度不同，可以包含约2-约26个核苷酸、约26-约50个核苷酸和约50-约100个核苷酸，以及多于100个核苷酸。

[0088]“无效转录”可以包括三个阶段，即起始、延伸和终止。在起始阶段，聚合酶在起始子和第二个NTP之间形成磷酸二酯键，并随后加入后续的NTP等，转录模板序列来合成约2-约50个核苷酸长度的寡核苷酸转录物，然后终止转录事件而释放新生的寡核苷酸转录物，聚合酶基本上不从聚合酶结合位点移开或从模板上解离。换而言之，RNA聚合酶基本上保持在模板的起始结合位点上，释放第一个新生的寡核苷酸转录物，并随后能参与另一转录起始事件来产生第二个寡核苷酸转录物，其中该转录物基本上与基本相同的转录产生第一个寡核苷酸转录物的靶位点基本上互补。以这种方式，聚合酶反复转录模板的单一部分(即靶区域)并释放多重拷贝的基本相同的新生寡核苷酸转录物。

[0089]“反复的(reiterative)”指目的序列的多个相同或高度相似的拷贝。

[0090]“寡核苷酸产物”指通过本发明的反复合成反应合成的寡核苷酸。如果聚合反应是由RNA聚合酶催化的转录反应，则寡核苷酸产物可以为“寡核苷酸转录物”，或者如果聚合反应是由端粒酶或DNA 聚合酶催化的DNA合成，则寡核苷酸产物是“寡核苷酸重复序列”。术语“寡核苷酸”一般指短的、通常是单链的、合成的多核苷酸，其包含两个或更多个核苷酸，并通常是，但不是必须地，至少约200个核苷酸长度。

[0091]“终止”指用链终止子来结束由聚合酶催化的链延长或引物延伸反应。“链终止子”或“终止子”可以包括任意化合物、组合物、复合物、反应物、反应条件或过程(包括停止提供化合物、反应物或反应条件)，其抑制由聚合酶引起的转录继续而超出起始和/或延伸阶段。“链终止核苷酸”是包括核苷酸或核苷酸类似物的链终止子，一旦整合进所述核苷酸或核苷酸类似物，由于复制或转录该核苷酸类似物的结构或该核酸的序列，就能抑制进一步的链延伸。

[0092]“靶序列”或“靶多核苷酸”是期望用来检测、表征或定量的目的多核苷酸序列。靶序列的实际核苷酸序列可以是已知或未知的。“靶序列”可能是或可能不是实际的目的分子。

[0093]“靶位点”是通过由聚合酶转录从而形成寡核苷酸产物来检测的那部分靶序列。根据本发明，在靶核苷酸上有至少一个靶位点。靶位点的序列可能是详细已知或不是详细已知的。即，虽然靶核酸的实际基因序列可能是已知的，但通过聚合酶进行转录或复制的特定靶位点的基因序列不需要已知。

[0094]“靶区域”是靶位点探针部分杂交至其上以形成泡复合物的那部分靶序列，这在后面详细描述。根据本发明，在靶核酸上有至少一个靶区域，并且每个靶区域包含靶位点。靶区域的序列足够详细地知道以使得能与互补的靶位点探针足够严格地杂交，这样靶位点探针和靶区域形成泡复合体。

[0095]一般来说，“模板”是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些情况下，术语“靶序列”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、“核酸模板”、“靶序列”及它们的变化形式，是可互换使用的。具体地，术语“模板”或“模板链”指在其上通过模板依赖性核酸聚合酶活性从核苷酸或核苷酸类似物合成互补拷贝的核酸链。

[0096]“核苷酸”包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)核苷酸和类似物。

[0097]术语“起始子”指单核苷、单核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或它们的类似物，它们整合进新生的RNA分子的5’端并可认为是 RNA合成的“引物”(“起始子引物”)。

[0098]“整合”指成为核酸聚合物的一部分。当关于核酸前体的整合时，该术语中具有已知的灵活性。例如，核苷酸dGTP是脱氧核糖核苷三磷酸。当整合进DNA时，dGTP变成dGMP，即脱氧鸟苷一磷酸部分。虽然DNA不包括dGTP分子，但可以说将dGTP整合进DNA。

[0099]“同一性”或“相同的”在这里按本领域通常理解的使用。例如，具有与参考核苷酸序列至少例如95％“相同的”核苷酸序列的多核苷酸表示该多核苷酸的核苷酸序列在目的区域上是与参考序列相同的，除了该多核苷酸序列可能包括上至每100个参考核苷酸序列中有5个不匹配。换而言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，在参考序列中上至5％的核苷酸可以删除或用其它核苷酸取代，或上至5％的参考序列中的全部核苷酸的许多核苷酸可以插入参考序列中。参考(查询)序列可以是显示的全部核苷酸序列或它们的任意多核苷酸片段。

[0100]对于实际情况，任意特定的核酸分子是否是至少80％、 85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同于参考序列，例如，该核苷酸序列可以通常用已知的计算机程序如Bestfit程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix， Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)测定。Bestfit用Smith和Waterman， Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法来找到两个序列之间最好的同源性区段。当用Bestfit或任何其它序列比对程序来测定特定序列是否是例如95％与根据本发明的参考序列相同时，当然设置参数时应使得能在参考核苷酸序列的全长上计算同一性的百分数并允许参考序列中的核苷酸总数的多达5％的同源性缺口。

[0101]参考(查询)序列(本发明的序列)和受试序列之间的同一性，也称为总体序列比对，也可以用基于Brutlag等的算法的 FASTDB计算机程序测定(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))。用于DNA序列的FASTDB比对来计算同一性百分数的优选参数是：矩阵＝一元的，k-串(k-tuple)＝4，错配罚分＝1，连接罚分＝30，随机化组长度＝0，截断得分(Cutoff Score)＝1，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或受试核苷酸序列的长度，看哪个更短。根据本实施方案，如果受试序列由于5’或3’端的缺失而不是因为内部缺失而比查询序列短，则对结果进行手动校正来考虑到当计算同一性百分数时，FASTDB程序没有考虑受试序列的5’和3’端的截短。对于相对于查询序列在5’或3’端截短的受试序列，通过将不匹配/对准的在受试序列5’和3’端的查询序列的碱基数目计算为查询序列全部碱基的百分数而校正同一性百分数。核苷酸是否是匹配/对准的确定可通过FASTDB序列比对的结果测定。然后从通过上面的FASTDB程序用特定的参数计算的同一性百分数中减去该百分数，得到最终的同一性百分数评分。这种校正的打分就是用于本实施方案目的的打分。只有在受试序列的5’和3’端碱基外的与查询序列不匹配/对准的碱基，如FASTDB比对显示的，才为了手动调节同一性百分数的目的而进行计算。例如，将90个碱基的受试序列与100个碱基的查询序列进行比对来测定同一性百分数。缺失出现在受试序列的5’端，并因而 FASTDB比对不显示在5’端的开始10个碱基的匹配/对准。这10个不配对的碱基代表10％的序列(不匹配的5’和3’端的碱基数目/查询序列的碱基的总数目)，所以从由FASTDB程序计算的同一性百分数得分中减去10％。如果剩下的90个碱基完全匹配，则最终的同一性百分数为90％。在另一实例中，将90个碱基的受试序列与100个碱基的查询序列比较。这次，缺失是内部缺失，所以在受试序列的5’或3’ 端没有与查询序列不匹配/对准的碱基。在这种情况下，同一性百分数由FASTDB计算而不需手工校正。再次说明，只有与查询序列不匹配/ 对准的受试序列的5’和3’端碱基需要手动校正。本实施方案不需要进行其它的手工校正。

[0102]术语“标记”指任何可用于提供直接或间接可检测的信号，并且可以连接至核苷酸、核苷酸类似物、核苷单、二或三磷酸、核苷单、二或三磷酸类似物、多核苷酸或寡核苷酸的原子、分子或部分。在一些实施方案中，标记通过标记部分给予生成的寡核苷酸的质量改变而检测。可检测的分子也可以是能定量的。这种质量标记也可以通过其它本领域已知的手段检测。

[0103]术语“多路的”指形成从同一反应中同时产生几个信息或信号的体系或与之相关。

[0104]术语“质谱法”指用于在高度真空中测定一束从样品中产生的离子化的分子或分子片段中的组分的相对质量和/或相对丰度的分析方法。如这里使用的，术语包括，尤其是快速原子轰击(FAB)质谱法、等离子体解吸(PD)质谱法、电喷雾/离子喷雾(ES)质谱法、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间分析(MALDI-TOF)，并可与其它技术结合，这些技术包括电泳、液相色谱、高速凝胶过滤等。使用质谱法的检测可通过整合进通常在 DNA中不出现的核酸同位素、分子或原子如S、Br、I或Ag、Au、Pt、 Os、Hg来增强。

[0105]术语“树状聚合物(dendrimer)”(来自希腊文树(dendra) 的意思)指分枝的结构，其通常是制造的或合成的分枝状聚合物。组分和反应条件
靶核酸

[0106]靶核酸可以是天然出现或合成的多核苷酸片段，并且可通过本领域熟知的技术获得或合成。试验样品中待检测的靶序列最初可以表现为不连续的分子，可以仅表现为较大分子的一个组分、复杂混合物如生物样品的次要的或主要的级分。待检测的靶核酸可以包括来自任何来源的、纯化或未纯化形式的核酸，其可以是DNA(包括双链 (ds)DNA和单链(ss)DNA)或RNA(包括tRNA、mRNA、rRNA)、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、DNA-RNA杂交体或它们的混合物；基因、染色体或质粒；和来自生物材料的基因组，例如微生物、植物、动物、人的基因组的DNA。本领域中的标准技术可用于获得并纯化来自试验样品的核酸。RNA靶的检测可能需要或不需要最初的互补DNA (cDNA)的合成，这一点是本领域已知的。DNA-RNA杂交体的检测可能需要将杂交体变性来获得s sDNA或变性后通过反转录获得cDNA。其它靶分子

[0107]在本发明的另一实施方案中，靶可以是其它分子，例如蛋白质，其可以通过核酸序列的共价或非共价连接而进行标记，所述的核酸序列可用于反复的寡核苷酸合成。例如，分子可以通过偶联至核酸序列上的抗体检测，所述的核酸序列可以作为合成多重反复的寡核苷酸的模板。待检测的靶分子可包括来自任何来源、纯化或未纯化的蛋白质、肽、糖类、脂类、半抗原或其它分子。本领域的标准技术可用于获得并纯化来自试验样品的分子。固定

[0108]在本发明的一个实施方案中，靶分子可以固定在基质上。在另一实施方案中，靶分子可以经固定形成例如微阵列。依照本实施方案的单个分子阵列包括固体基质、生物反应层或生物粘合层和生物抗性层。用作本发明基质的固相包括但不限于，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或任意固体材料，它们是试管、珠状微粒、浸渍片、膜、微量滴定板、试管和Eppendorf管、玻璃珠、玻璃试管的形状和由玻璃制成的任意其它适当的形状。通常，合适的固体基质包含生物粘合层如配体结合剂可以附着至其上的任何表面或自身提供配体附着位点的任何表面。

[0109]抗体或寡核苷酸捕获探针可以通过本领域已知的方法附着至生物粘合样式(pattern)上，所述的方法包括提供多组氨酸标签或交联剂。

[0110]在一实施方案中，固体基质可以装在具有进口和出口的流动小室中以容纳多种溶液和反应物，这些溶液和反应物可以流过固定的捕获探针。流动小室可以由塑料或玻璃制造并在用显微镜或光学阅读机观察的平面可以是敞开的或透明的。电渗流包括固定支持物上的固定电荷和通过位于固体支持物相对的末端上的两个电极之间的电压梯度(电流)。引物

[0111]依照本发明的实施方案，可将引物用于起始在靶核酸上的靶位点的聚合酶转录，并且引物可以由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。在一个实施方案中，引物长度少于约25个核苷酸，通常是约 1-约10个核苷酸长度，并优选约2-3个核苷酸长度。可以希望在引物的一个或多个位置中修饰核苷酸或磷酸二酯键。靶位点探针

[0112]依照本发明的一个实施方案，寡核苷酸靶位点探针用于引导聚合酶至靶核酸上的靶位点处(图4)。靶位点探针也可以称为“非模板链”。靶位点探针在核苷酸长度上可以不同，包括但不限于，约 20-约50个核苷酸、约51-约75个核苷酸、约76-约100个核苷酸或多于100个核苷酸。泡复合体包含在包括靶位点的单链区域的任一边上的双链区域。靶区域中的泡复合体可以通过靶位点探针的结构形成。在一个实施方案中，靶位点探针包括三个区域：与模板序列上的靶位点上游的模板序列互补并与之杂交的靶位点探针5’末端的第一个区域；第二个区域，该区域是第一个区域的3’端，它与模板序列不互补并因而不与模板序列杂交；和第三个区域，该区域在靶位点探针的 3’末端，它与靶位点下游的模板序列互补并与之杂交。在另一实施方案中，靶位点探针基本与单链区域互补，并且泡复合体通过聚合酶的作用形成。

[0113]使用靶位点探针引导聚合酶至模板序列上特定的酶结合位点(即，由模板序列和引物在靶位点上游形成的双链区段和泡)以促进在特定的靶位点开始转录。即，不是促进随机起始通过聚合酶沿着单链模板序列的长度的合成反应，如上描述的，本实施方案提供聚合酶的靶向结合以用于检测包含于靶位点探针形成的泡之中的特定靶位点。

[0114]靶位点探针的序列取决于靶序列而不同。选择靶位点探针的全长用于让第一和第三个区域与靶序列杂交并优化优化第二个非杂交区域的长度。设计靶位点探针的第一个和第三个区域用以与靶核酸模板的已知位点杂交。取决于实际应用，可以设计靶位点探针的第二个区域的序列，这样使得第二个区域可以是或不是自身互补的。

[0115]在一个实施方案中，至少一个靶位点探针用于在核酸模板上的一个或多个靶位点上特异性地开始无效的寡核苷酸合成以产生多重的寡核苷酸产物。在另一个实施方案中，在缺少模板启动子序列时，靶位点探针引导在单链靶位点上的无效转录的起始。见，例如，美国专利No.5,571,669；Daube和von Hippel，Science，258：1320-1324 (1992)。无效启动子盒(也称为无效泡盒(Abortive Bubble Cassette))

[0116]依照本发明，无效启动子盒(APC)可用于将靶连接至一序列上以产生多重的可检测的寡核苷酸产物，多重的可检测的寡核苷酸产物的产生表示在试验样品中靶的存在。APC也可以称为无效泡盒 (ABC)。APC是自身互补的DNA序列，其可以包括：(1)一个连续的寡核苷酸，RNA聚合酶可以结合于其上形成转录泡；(2)两个部分互补的上部和下部寡核苷酸，它们形成单链转录泡区，该转录泡区含有起始子和合适的RNA聚合酶可以从其上开始合成无效寡核苷酸产物的位点；或(3)两个互补的寡核苷酸，它们在存在RNA聚合酶时形成转录泡，这使得能合成无效寡核苷酸产物。APC可以含有人工启动子，或它可以含有对于特异的RNA聚合酶的启动子。例如，可用共同的噬菌体RNA聚合酶产生的三核苷酸或四核苷酸产物可以用GpA或 GpApA起始子和pppG或pppA终止子来制得。

[0117]在示例性的实施方案中，如在图4中说明的，APC包含八个区域，包括含有3’或5’端单链突出区域的APC连接体序列(即“粘性末端”)。APC 5’末端上的第一个区域(A)与APC的3’末端附近的第二个区域(A’)互补。第三个区域(B)和第四个区域(E)通过区域C、D和C’相互分隔开并相互不互补，这样当APC的自身互补区域相互作用时，区域B和E在APC上形成单链泡区域。区域C和C’ 基本上自身互补，这样区域C的5’末端与区域C’的3’末端互补。区域D可以是连接C和C’从而形成连续APC的短序列，或可以是含有两个分开的上部和下部的寡核苷酸的游离3’或5’末端的区域，从而形成两部分的APC。最后，APC也包括APC连接体，即在APC寡核苷酸的5’末端或3’末端上的单链区域，其通过区域A和A’的互补相互作用形成。APC连接体促进APC与其它靶分子如捕获的靶DNA、RNA 或蛋白质连接。

[0118]许多APC在本发明中体现。在一些实施方案，APC具有以下特征：上游臂长＞13nt
下游臂长＞13nt
泡区段长度＝11-14nt
泡序列：非模板链共有序列：
上游5’TANNNTN5-8
优选的序列：5’TATAATN5-8

[0119]泡序列：模板链上游3’C(C或G或A)N9-13或A(C或G或 A)N9-13，其优选是T(C或G或A)N9-13或G(C或G或A)N9-13。

[0120]在下面一般的APC结构中，有下划线的核苷酸是在泡内的，并且“nn”表示起始位点。在第一个APC下面显示的数字表示第一个APC中可能的(备选的)起始子位点。1.在泡内的2个最下游位点。
2.跨越泡和下游臂的接合点的位点。
3.直接毗邻泡的下游2nt。
4.从泡边缘偏移1nt的下游位点。
类似的起始子位点在其它示例性的APC中发现，但没有显示。
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
                            nn             1.
                             nn            2.
                              nn           3.
                               nn          4.
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN CGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN CANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN ACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN AGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5′NNNNNNNNNNNNN TATAATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
3′NNNNNNNNNNNNN AANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

[0121]由上面描述的一般的APC结构表示的APC的具体非限制性实例可以在图11、21、23和29中找到。在一些实施方案中，本发明提供如上面描述的APC，包括在图21、23和29中描述的APC，但除了含有具有以下序列的靶位点探针的APC：5′GGATACTTACAGCCATTAT ATTTAGCCCTACTCCATTCCATCCCGGGTTCGTCC-3′；和/或含有具有以下序列的模板链的APC：3′CCTATGAATGTCGGTACCTGTGCCGCTTATGAGGTAAGG TAGGGCCCAAGCAGG 5′；或它的反转或互补链之外。

[0122]用于实践本发明的APC可以通过酶或通过合成制备。选择 APC的长度来优化泡区域的稳定性并提供APC连接体序列与靶序列的杂交，这已经在例如WO 03/038042和美国申请公开号 US-2003-0099950中描述。

[0123]具有对靶目的分子的特异性的单个分子可以连接至一个或多个APC上。通常，相同类型的APC连接至一个分子上。然而在一些实施方案中，不同的APC可以连接至同一个靶分子上。如在图9中说述的，大量APC可以连接至单个分子上，极大地提高了单个结合事件产生的信号。APC可以连接至核酸、抗体或任意其它分子上。

[0124]在一个实施方案中，本发明提供可通过化学偶联连接至任何期望的分子上的APC。

[0125]本发明也包括使用本发明的APC来检测靶分子的方法。树状聚合物结构

[0126]树状聚合物是具有分枝的结构，其通常是人工生产或合成的分枝状聚合物。例如，树状聚合物可以用丙烯酸和肼制成。树状聚合物可以从例如Dendritech，Inc.3110 Schuette Drive，Midland， MI 48642商购获得。

[0127]树状聚合物的合成属于聚合物化学的领域，其定义为用规则的、高度分枝的单体形成单分散性的树状或世代结构。合成单分散性聚合物要求高水平的合成控制，这可通过分步反应，每次在一单体层或“世代”上搭建树状聚合物来完成。每个树状聚合物由多官能核心分子和连接至每个官能位点的树状楔(wedge)构成。核心分子称为 “世代0”。沿着所有分枝的每个相继的重复单位形成了下一世代，即“世代1”、“世代2”等直到终端世代。

[0128]有两种定义的树状聚合物的合成方法，发散2和收敛3。在发散方法中，分子从核心向外周组装；而在收敛方法中，树状聚合物是从外面开始合成并在核心结束。在任一方法中，合成需要分步过程，将一个世代连接至上一世代，纯化并然后改变官能团用于反应的下一阶段。这种官能团转换是必要的以防止不加约束的聚合反应。这种聚合反应将得到高度分枝的分子，它不是单扩散性的一否则应称为超支化的聚合物。尽管超支化的聚合物有许多用途，但本文不研究它们。

[0129]在发散方法中，表面基团最初是非反应性的或是经保护的基团，在用于反应的下一阶段时将这些受保护的基团转化为反应性基团。在收敛方法中与之相反，因为活性基团必须在树状楔的焦点上。

[0130]由于位阻效应，持续反应树状聚合物重复单位导致形成球形或球体分子，直到空间过度拥挤而阻止在特定世代的完全反应并破坏分子的单分散性。可能的世代数目可以通过在核心分子的分枝中使用更长的间隔单位来增加。树状聚合物的单扩散性和球状空间扩展引发多种有意思的性质。

[0131]树状楔长度的空间限制导致小的分子大小，但球体形状的密度产生相当高的分子量。球形也提供了有趣的分子拓扑学的研究。树状聚合物具有两个主要的化学环境，即由终端世代上的官能团产生的表面化学，它是树状球体的表面，以及球体内部，它由于树状聚合物结构的球体形状而大部分与外部环境相隔离。在这样一种分子内的两个不同的化学环境的存在暗示了树状聚合物应用的许多可能性。

[0132]理论上，在这两个环境中，疏水/亲水以及极性/非极性相互作用可以不同。树状聚合物内部中空隙的存在助长了这两种异质环境在树状聚合物化学中起重要作用的可能性。树状聚合物研究已经确认树状聚合物能在树状空隙中接受客体分子。

[0133]已经发现树状聚合物实际的和潜在的用途，仅举几例，可用作分子量和分子大小的标准、基因转染试剂，用作运输生物学上重要的客体(guest)的宿主，和用作抗癌药剂。对树状聚合物的许多兴趣涉及它们用作催化剂，利用它们的高度表面官能性以及容易回收。然而树状聚合物的球体形状和分子拓扑学使得它们同样高度地可用于生物学体系。

[0134]在本发明的一些实施方案中，APC通常通过化学偶联连接至树状聚合物的分枝上。在树状聚合物的表面上结合APC可以导致高密度的APC。APC-树状聚合物的一个分枝连接至具有靶目的分子特异性的第二种分子如探针、抗体、结合蛋白等上。因此，第二种分子结合至靶目的分子上将得到高密度的APC，并因此从APC上得到大量的无效寡核苷酸转录物。因此，树状聚合物使得能大规模扩增与检测靶分子相关的信号，结果增加了检测的敏感度和(潜在地)速度。聚合酶

[0135]用于本发明方法和组合物的模板依赖性聚合酶是本领域已知的并包括真核或原核聚合酶、热稳定性聚合酶、DNA依赖性RNA- 聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性 DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶，该聚合酶能忍受在磷酸基团、核酸酶和/或在未整合的核苷酸的戊糖环上的标记部分，能转录没有启动子序列的单链DNA模板的聚合酶和其它先前描述的。

[0136]通常，本发明方法中包括的酶优选地不对本方法产生的核酸组分产生实质的降解。核苷酸

[0137]根据本发明，聚合酶在寡核苷酸产物上以通常的5’→ 3’方向催化反应，并通过相继地加入核苷酸(NTP)而延伸起始子或引物的3’末端来转录或复制靶核酸，其中所述的核苷酸可以包括核苷酸类似物(NTP类似物)并且它可以是经标记的或不经标记的。

[0138]在一些实施方案中，本方法使用用同位素、半抗原、生物素、酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、蛋白质、人工启动子盒、光致交联剂、化学交联剂、链霉亲和素(steptavidin)、荧光部分、比色部分(colorimetric moiety)、发光部分、化学发光部分、金属(例如，金、银)或染料之中任一衍生的核苷酸。

[0139]在其他实施方案中，本方法使用核苷、核苷酸、寡核苷酸或核酸，它们含有式NucSR的5-S-取代的嘧啶或8-S-取代的嘌呤；其中Nuc是嘧啶基或嘌呤基；
其中S是硫；
其中R选自H、半抗原、生物素、酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、蛋白质、人工启动子盒、光致交联剂、化学交联剂、链霉亲和素(steptavidin)、荧光部分、比色部分(colorimetric moiety)、发光部分、化学发光部分、金属(例如，金、银)或染料、核酸细胞细胞摄取基团、C6-10芳基、C6-10芳基(C1-6)烷基、C6-10芳氨基(C1-6) 烷基、C6-10芳基氧基(C1-6)烷基、C6-10芳基(C1-6)烷基氨基(C1-6)烷基、 C6-10芳基(C1-6)烷氧基(C1-6)烷基、C6-10芳基(C1-6烷基)羰基氨基(C1-6)烷基、C6-10芳基(C1-6烷基)羰基氧基(C1-6)烷基、(C6-10芳基)羰基氨基(C1-6) 烷基、(C6-10芳基)羰基氧基(C1-6)烷基、(C6-10芳基)羰基(C1-6)烷基和C6-10 芳基(C1-6烷基)羰基(C1-6)烷基，其中每个前面基团的芳基部分任选地用1-4个取代基取代，这些取代基独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基、 C3-8环烷基、C1-6卤代烷基、C1-6羟基烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6 烷氧基、(C1-6烷基)羰基、(C1-6烷氧基)羰基、氨基、氨基(C1-6)烷基、氨基羰基、单(C1-6烷基)氨基羰基、双(C1-6烷基)氨基羰基、C1-6烷基氨基、双(C1-6)烷基氨基、(C1-6烷基)羰基氨基、C6-10芳基氨基、(C6-10芳基) 羰基氨基、单(C6-10芳基)氨基羰基、双(C6-10芳基)氨基羰基、单(C6-10 芳基(C1-6烷基))氨基羰基、双(C6-10芳基(C1-6烷基))氨基羰基、 N-(C6-10)芳基-N-(C1-6烷基)氨基羰基、N-(C6-10)芳基(C1-6)烷基-N-(C1-6 烷基)氨基羰基、N-(C6-10)芳基(C1-6)烷基-N-(C6-10芳基)氨基羰基、C1-6 烷硫基、C6-10芳硫基、C6-10芳基(C1-6)烷硫基、羧基、羧基(C1-6)烷基、硝基、氰基、杂芳基以及饱和的或部分不饱和的杂环，其中杂芳基和饱和的或部分不饱和的杂环独立地是单环或稠合的双环，并且独立地具有5-10个环原子，其中一个或多个环原子独立地选自氧、氮和硫。经修饰的核苷酸类似物以及合适的修饰基团的实例在图12-14中显示。

[0140]为了促进反复的无效合成起始事件，可将NTP和/或NTP 类似物在合成反应之前和/或期间加入至反应混合物中，包括链终止子，它可以终止由聚合酶起始的合成事件。在合成反应中，使用链终止子停止聚合酶，抑制了进行的延伸复合物的形成，并因而促进了从靶位点反复合成短的无效寡核苷酸。(Daube和yon Hippel，Science， 258：1320-1324(1992))。

[0141]根据本发明，链终止子可以包括任意化合物、组合物、复合物、反应物、反应条件或过程(包括停止提供化合物、反应物或反应条件)，其能够抑制在引物延伸反应期间由聚合酶进行的转录或复制的继续。在一个实施方案中，合适的链终止子是NTP剥夺，即链终止是由对聚合酶剥夺对应于随后的模板序列的互补核苷酸的特定NTP 而引起。换而言之，既然对链延伸的NTP需求由互补的链序列控制，那么给定确定的模板序列和确定的引物长度，可将选择的NTP在反应混合物中停止供给，这样当反应混合物不能给聚合酶提供继续转录或复制模板序列需要的NTP时引起了通过聚合酶的链延伸的终止。

[0142]备选地，在另一实施方案中，链终止子可以包括核苷酸类似物，所述的核苷酸类似物在通过聚合酶整合进入寡核苷酸产物时，引起了核苷酸聚合反应的终止。

[0143]有关反应条件、核苷酸和核苷酸分子的额外信息已经在 WO 03/038042和美国申请公开号US-2003-0099950中描述。反应条件

[0144]用于进行本发明方法的合适反应介质和条件可以包括对特定聚合酶最优化的含水缓冲介质，它可能有或没有补充有各种离子、缓冲剂、螯合剂、聚阴离子或阳离子分子、蛋白质载体或其它蛋白质，包括转录因子(sigma、NusA、Rho、溶菌酶、GreA、GreB、NusG等)。所有反应组分中的变化可能可以改变无效转录物对全长转录物的比例。例如，RNA聚合酶对模板的高摩尔比增强在λPR启动子上的无效转录对全长转录的频率。这种效果明显是由在启动子上的串联聚合酶之间的碰撞引起的。较于野生型聚合酶，某些RNA聚合酶突变体已经提高了无效转录的比例。无效转录的相对水平对于启动子的核苷酸序列是敏感的。本发明方法的任何方面可以在相同或不同的温度下发生，包括是等温的，或在一些实施方案中，用于转录或复制的温度可以与在检测法中其它地方使用的温度不同。

[0145]根据本发明的不同方面和实施方案，靶核酸分子可以杂交至寡核苷酸捕获探针、与靶核酸的一部分互补的单核苷酸或寡核苷酸起始子、与靶核酸的一部分互补的APC连接体和/或与靶位点的任一边上的区域互补的靶位点探针上。杂交是在获得所希望的特异性程度必需的条件下，用本领域技术人员熟知的方法进行的。可能有必要在杂交前将试验样品中的靶核酸变性。

[0146]转录条件和试剂是本领域熟知的并已经在其它地方描述。如在Lu等，美国专利No.5,571,669中描述的，用于从人工转录泡复合体开始的转录的聚合酶浓度通常是比用于启动子起始的或回文序列起始的转录的理想聚合酶浓度约高一个量级。

[0147]在一个实施方案中，将组分在开始无效合成和检测方法时同时加入。在另一实施方案中，按不同反应需要和/或允许的，在方法期间以任意次序在合适的时间点之前或之后加入组分。这种时间点可以由本领域技术人员很容易地确定。在本发明方法中不同的反应可以在不同的时间点停止并在稍后时间重新开始。这些时间点可以由本领域技术人员很容易地确定。用于停止反应的方法是本领域中已知的，包括，例如，冷却反应混合物至抑制酶活性的温度。本发明的无效合成和检测方法

[0148]根据本发明的一方面，将可检测的寡核苷酸产物从靶核酸模板合成。该寡核苷酸产物也可以包括起始子上的和/或通过聚合酶整合进每个寡核苷酸产物中的NTP或NTP类似物上的标记部分，所述的寡核苷酸产物在靶核酸上和/或在其它分子上合成，其中所述的其它分子是合成的复合物的一部分或者它们与合成的复合物的一个或多个组分相互作用。

[0149]根据本发明，检测寡核苷酸产物可预示靶序列的存在。在一些实施方案中，靶序列包括靶目的分子。在其它实施方案中，靶目的分子不同于寡核苷酸产物从其上产生的靶序列；因而，寡核苷酸的检测表明靶序列的存在，而所述的靶序列的存在又表明靶目的分子的存在。在这些实施方案中，目的分子可以是例如蛋白质、肽、半抗原、糖类、毒素、脂类、离子或另一种核酸。因而，在一些实施方案中，靶序列的存在可以进一步表明目的蛋白的存在。在一些实施方案中，将无效启动子盒偶联至具有目的分子特异性的DNA、RNA、PNA(蛋白质核酸，其中核苷酸骨架用氨基键替代，而不是磷酸键)、抗体、结合蛋白、半抗原、信号传导蛋白、离子或其它分子上。

[0150]定量分析也是可行的。直接和间接的检测方法(包括定量) 是本领域熟知的。例如，通过将从含有未知量的靶核酸的试验样品产生的寡核苷酸产物的量与从具有已知量的靶核酸的参考样品产生的寡核苷酸产物的量比较，可以测定试验样品中的靶核酸的量。本发明的反复无效合成起始和检测方法也可以扩展至分析靶核酸中的基因序列改变，这在下面进一步描述。

[0151]提供下面的本发明的无效合成和检测方法的实例以更具体地描述本发明。这些示例性的方法仅意在举例说明并不意在用来限制上面提供的描述。可以理解，通过给定上面的一般性描述，可以实践不同的其它实施方案。例如，提及使用引物时，指可以使用任何在此描述的引物，包括RNA起始子。

[0152]根据本发明的一方面，提供了用于通过在靶核苷酸上的反复合成起始事件而产生多重可检测的寡核苷酸产物来检测靶多核苷酸存在的方法。

[0153]图2以图示方式阐述了多种反应物，可以组合这些反应物并在存在RNA聚合酶时反应以合成多重的可检测的寡核苷酸产物。本发明方法可以使用可能含有靶序列的试验样品进行。可以直接检测试验序列或可以检测靶的引物延伸或逆转录的产物。可将序列或标签加入至靶(例如生物素、ssDNA区域)的拷贝中。试验样品可以包括双链DNA、单链DNA或RNA。DNA或RNA可以用用于将DNA或RNA从细胞、组织或其它样品中分离的标准技术分离和纯化。

[0154]在一个实施方案中，将靶序列通过连接至固体基质例如微量滴定板上的序列特异性的(例如基因特异性的)寡核苷酸捕获探针而固定。将固定的捕获探针在杂交条件下用包含单链DNA(即变性的 DNA)或RNA的试验样品处理。存在于试验样品中的任何靶序列杂交至捕获探针上并然后接受根据本发明的其它试剂处理。

[0155]在一个实施方案中，起始子(n 5’-R1-(NI)x-OH 3’)在存在靶位点探针(图4)时与靶位点的上游靶序列杂交，并促进聚合酶在靶位点催化聚合反应。起始引物可以包括核苷、核苷类似物、核苷酸和核苷酸类似物，并且可以在核苷酸数量上不同，这在WO 03/038042 和美国申请公开号US-2003-0099950中描述。采用合适的RNA聚合酶来从靶序列或它的任意部分合成寡核糖核苷酸产物。

[0156]在聚合反应期间，由聚合酶通过整合已经加入至反应混合物中的核苷酸来延长或延伸起始子。当聚合酶反应继续时，聚合酶由模板序列引导，通过整合存在于反应混合物中的相应核苷酸而延长起始子。在一个实施方案中，这些反应物核苷酸包含链终止子(例如n 5’ pppNT-R2，它是一种链终止性核苷酸类似物，如上描述)。当聚合酶整合链终止子进入新生的寡核苷酸产物时，链延伸由于聚合酶不能在链终止子的戊糖环上的3’位置催化核苷酸的加入而终止。结果，聚合酶通过释放寡核苷酸产物(即5’R1-(NI)zpNT-R2，其中z＝x+y) 并在靶位点再次开始无效起始合成反应而中断起始的合成事件。

[0157]可以这样控制无效起始反应，即聚合酶在用预定量的核苷酸延长起始子后中断合成。例如，如果期望在起始子延长了单个核苷酸后终止合成反应，这可通过例如以下完成：(1)给反应混合物仅加入为链终止子的核苷酸，因此在当第一个核苷酸由聚合酶整合进入以后抑制聚合反应；或(2)如果靶位点的基因序列是已知的，那么给反应混合物仅加入预选的链终止性核苷酸类似物(即，包含A、G、T、C 或U之一的核苷酸类似物)，其与靶位点的核苷酸互补。备选地，如果期望在起始子延伸了预定量的核苷酸后，终止合成反应，并且如果靶位点的基因序列是已知的，这可以通过例如以下方式完成，将预选的链终止性核苷酸类似物(即包含A、G、T、C或U之一的核苷酸类似物)加入至反应混合物中，所述的核苷酸类似物与靶位点的第N个核苷酸互补，其中N是寡核苷酸产物所含的核苷酸的预定数目，不计起始子。以这种方式，聚合酶合成了含有起始子和链终止性核苷酸类似物的多重无效寡核苷酸产物。

[0158]聚合酶释放寡核苷酸产物而没有从酶结合位点移开或从靶多核酸序列上解离。核苷酸剥夺可以用于在聚合酶结合位点隔绝聚合酶。例如，如果仅提供起始子和终止子，那么通过聚合酶的延伸是不可能的。

[0159]此外，可以对无效转录起始优化反应条件，藉此，有助于聚合酶保持结合在聚合酶结合位点上，甚至是存在延伸性核苷酸时。通过调整盐、二价阳离子的浓度，甘油含量和使用的还原剂的量和类型，可将无效起始反应缓冲液优化成增加无效事件。另外，“障碍” 蛋白质可用于防止聚合酶移动。

[0160]在本发明的另一方面，如图4中图示说明的，靶位点探针可用于在靶序列的靶区域中形成泡复合体。如上描述，泡复合体含有位于包括靶位点的单链区域的两侧的双链区域。在该实施方案中，靶位点探针用于通过在靶序列上的单链泡区域和下游双链体区域的接合处定位靶位点而引导聚合酶至靶位点。在模板序列上的靶位点处，聚合酶和起始子结合并起始合成反应。通过整合包含合适链终止子的核苷酸，聚合酶延伸起始子以合成无效寡核苷酸产物。起始子和核苷酸 (包括链终止性核苷酸)都可以用标记部分修饰。

[0161]因此，用于检测通过在靶序列上的反复合成起始事件而获得的多重寡核苷酸产物的说明性步骤可以包括：(a)固定设计用于与特异性或普通靶序列杂交的寡核苷酸捕获探针；(b)将寡核苷酸捕获探针与可能含有靶序列的试验样品杂交；(c)将靶序列与靶位点探针杂交；(d)修饰起始子和包含链终止子的核苷酸中至少之一以使得能检测由聚合酶合成的寡核苷酸产物；(e)将靶序列与引物杂交；并且 (f)用聚合酶延长起始子，这样使得聚合酶通过整合包含链终止子的互补核苷酸并释放无效寡核苷酸产物来反复合成与靶位点互补的寡核苷酸产物，而聚合酶不从酶结合位点移开或从靶序列上解离。

[0162]在通过RNA聚合酶转录模板期间，RNA聚合酶通过整合已经加入至反应混合物中的核苷酸来延伸RNA起始子。当聚合酶反应继续时，RNA聚合酶由模板序列引导，通过整合存在于反应混合物中的相应核苷酸而延长RNA起始子。在一个实施方案中，这些反应物核苷酸包含链终止子(例如n 5’pppNT-R2，它是一种链终止性核苷酸类似物，如上描述)。当RNA聚合酶整合链终止子进入新生的转录物时，由于聚合酶不能催化在链终止子的核糖环上的3’位置加入核苷酸而终止链延伸，并且RNA聚合酶通过释放转录物并在靶位点重新开始转录而中断起始的转录事件。可以这样控制无效转录起始反应，即使得产生多重无效的寡核苷酸产物，其具有预定长度并含有RNA引物和链终止性核苷酸类似物。

[0163]在一示例性实施方案中，RNA起始子可以是单核苷酸并且反应混合物中提供的核苷酸可以只包括链终止子。在这个实施方案中，在RNA起始子已经延长单个核苷酸并产生无效二核苷酸转录产物后通过RNA聚合酶中断转录。在另一实施方案中，RNA起始子可以包含例如二核苷酸或三核苷酸，因而无效转录起始事件可以分别产生包含三核苷酸或四核苷酸的无效转录物。可以理解，取决于RNA起始子的长度和选择用于包含于反应混合物中的反应物核苷酸的性质和组成，可以获得任何期望长度的无效转录物。例如，如果模板的核苷酸序列是已知的，可以选择转录反应的组分(例如，靶位点、起始子和反应物核苷酸)，以使得通过本发明方法产生任意期望长度的无效转录物。

[0164]在本发明的另一方面，RNA起始子包括这样的部分(例如 R1，如在图3中描述的)，该部分可以共价结合至整合进RNA起始子中的核苷酸或核苷酸类似物之一的5’磷酸基团、核糖环的2’位置或者嘌呤或嘧啶碱基上。而且，包含于反应混合物中的用于通过RNA聚合酶整合进寡核苷酸转录物中的反应物核苷酸和/或核苷酸类似物每个还可以包括这样的部分(例如R2，如图3中描述的)，该部分可以共价结合至核酸碱基(nucleobase)或者核糖环的2’位置或3’位置上。R1和R2部分每个可以包含H、OH或任意合适的标记部分、报告基团或报告基团前体，如上面十分详细描述的。

[0165]因此，用于检测通过在靶序列上的反复转录起始事件而获得的多重寡核苷酸转录物的说明性步骤可以包括：(a)可选地固定设计用于与特异性或普通靶序列杂交的寡核苷酸捕获探针；(b)可选地将寡核苷酸捕获探针与可能含有靶序列的试验样品杂交；(c)可选地将靶序列与靶位点探针杂交；(d)修饰RNA起始子和包含链终止子的核苷酸中至少之一以使得能检测由RNA聚合酶合成的寡核苷酸转录物；(e)将靶序列与RNA起始子杂交；并且(f)用RNA聚合酶延长 RNA起始子，这样使得RNA聚合酶通过整合包含链终止子的互补核苷酸并释放无效寡核苷酸转录物来反复合成与靶位点互补的寡核苷酸转录物，而RNA聚合酶基本上不从酶结合位点移开或从靶序列上解离。可以用质谱法快速检测和定量多重反复寡核苷酸转录物。例如，如在表1a和1b和实施例2中显示的，质谱法可以区分任何三核苷酸。三核苷酸之间的差异可以通过使用标记，包括金属离子、同位素或其它分子而强化。在对应于三核苷酸的峰下的积分面积将表明三核苷酸的量(以绝对或相对的形式表示)。最后，样品可以几乎实时地得以分析。因而，可将样品进行无效转录，和接近实时地，读取的结果表明靶分子的存在、其丰度，以及通过测定产生了哪种/哪些类型的寡核苷酸转录物来表明靶分子的性质。
多路技术

[0166]本发明的方法不限于一次只有单一类型的无效转录反应，而是还包括一次同时进行多个反应，即多路技术。换而言之，在单个样品上可以同时发生多个不同的无效转录反应。

[0167]多路技术具有许多优点。多个可检测信号的存在提高灵敏度。通过使用多个可检测的信号也增加了特异性。例如，如果使用4 种探针，将获得4种不同的无效转录产物。检测4种无效转录产物的存在将确认靶目的分子的存在，然而检测仅1种无效转录产物可能被视为假阳性反应。

[0168]在一个实施方案中，在同一靶目的分子上进行多路技术。在一个实施方案中，使用多个TSP，它们的每个对来自靶核酸的DNA 的不同部分具有特异性。在另一实施方案中，不同的DNA探针，它们的每一个连接至不同的APC或APC-树状聚合物复合物上，使得能杂交至靶核酸序列上。在另一实施方案中，使用不同抗体，它们的每一个连接至不同的APC或APC-树状聚合物复合物上。当进行无效转录反应时，它将产生和存在的不同APC类型一样多类型的信号。通过例如质谱法，检测产生的多路信号。

[0169]在一些实施方案中，在一个样品上进行多个不同的反应，所述的样品包括混合的靶目的分子群。在一个实施方案中，样品可以包括多个目的病原体，它们的每个可以通过特异于每个病原体独一无二的DNA部分的单独TSP检测。备选地，病原体可以通过连接至特异于靶病原体的序列或抗原的核酸探针或抗体的APC(或APC-树状聚合物复合物)检测。通过多路技术，一系列不同的靶分子可以同时检测，这种检测比单独检测每个靶分子具有增加的速度和更低的费用。

[0170]在一些进一步的实施方案中，多路反应可以包括多个靶分子的检测，每个靶分子通过一个或多个无效转录反应得以检测。进一步的信号扩增

[0171]无效反复转录的产物可以直接或间接检测。在一个实施方案中，将产物接受进一步直接扩增。在另一实施方案中，将产物导入信号扩增级联反应中，增加检测靶分子的灵敏性。

[0172]在一个信号级联反应实施方案中，将无效寡核苷酸转录物用生物素标记；然后可将这种生物素标记的分子用偶联至例如产生可检测信号的酶(例如HRP)上的抗生物素蛋白来检测。在另一实施方案中，抗生物素蛋白可以偶联至APC或APC-树状聚合物复合物上，从其上可以进一步合成无效寡核苷酸转录物。

[0173]在另一实施方案中，将无效寡核苷酸转录物用作后来的反应中的试剂，例如在转录反应中用作起始子，或在PCR反应中用作引物。无效合成和检测方法的应用

[0174]本发明方法可用于多种诊断和分析方面，包括但不限于，评估特定基因的甲基化状态、检测已知的基因突变的存在、检测病原生物体的存在、检测mRNA表达水平和检测蛋白质。将质谱法用于检测反复的寡核苷酸转录物，而不是通过荧光、放射性同位素或其它方法。导致产生反复的寡核苷酸转录物的方法及其用途仅在这里以例证和非限制性的目的进行概述。有关这样的方法的其它细节可以在WO 03/038042和美国专利申请公开号US-2003-0099950中找到。DNA甲基化

[0175]本发明方法可以用于诊断性检测法，所述的检测法通过评估已知与特定疾病状态相关的特定基因及其调控区域的甲基化状态来检测与疾病起始和发展相关的后生变化。DNA甲基化是用于改变DNA 性质而不改变那个序列的编码功能的细胞机制。CpG甲基化可能是癌进展的强有力的标记物，并也可能与基因印记(imprinting)、转位因子的失活以及雌性的X染色体的失活相关。人基因组中的DNA甲基化在二核苷酸序列CpG中的C上是最频繁的。

[0176]因而，在一个实施方案中，可以利用本发明方法通过提供能检测改变的甲基化状态和模式的诊断技术，来监控疾病开始、发展、转移、复发以及对治疗疗法的任何反应。DNA片段中的甲基化的胞嘧啶残基可以基于这种残基对于由脱氨基试剂如亚硫酸氢钠而进行的脱氨基作用的抗性而得以检测。如在图5中说明的，当变性(即单链) 的DNA曝露于脱氨基试剂如亚硫酸氢钠时，未甲基化的胞嘧啶(C)残基转化为尿嘧啶残基(U)，而甲基化的胞嘧啶残基(5-mCyt)保持不变，因而它们的互补碱基配对配偶体从鸟嘌呤变为腺嘌呤(A)。然而，甲基化的胞嘧啶(5-mCyt)保留了它们对于G的碱基配对特异性。从上述看来，靶DNA序列中CpG岛的甲基化水平可以通过测量未改变的 CpG位点的相对水平来测定。

[0177]在另一个实施方案中，如图6中图示说明的，当已经将靶 DNA序列脱氨基后，例如通过用亚硫酸氢钠处理靶DNA序列，可将靶位点探针用于在靶DNA序列上形成含有靶CpG位点的泡复合体。在这个实施方案中，靶位点探针用于通过在靶DNA序列上的单链泡区域和下游双链体区域的接合处定位靶CpG位点而引导RNA聚合酶至靶CpG 位点。在该说明性实施方案中，靶位点探针包括约18-54个核苷酸：杂交至靶位点上游的靶DNA序列的第一个区域，其包括约5-20个核苷酸；非碱基配对核苷酸的内部第二个区域，其包括约8-14个核苷酸；以及杂交至靶位点下游的靶DNA序列的第三个区域，其包括约5-20 个核苷酸。在将DNA靶序列与RNA聚合酶以及合适的RNA起始子一起孵育之前或同时，可将靶位点探针杂交至靶DNA序列。聚合酶结合RNA 起始子并在DNA模板上于CpG位点起始转录和RNA合成。通过整合合适的链终止子，聚合酶延长起始子以合成无效寡核苷酸转录物。可以修饰起始子和链终止性核苷酸中之任一或同时修饰两者。

[0178]在另一实施方案中，捕获探针可以设计成用于捕获目的基因，并且将无效转录起始用于测定所希望的基因的甲基化状况。每个目的基因可以通过杂交至对于目的基因独特的捕获序列而从样品中移出。基因突变

[0179]在本发明的另一方面，这里公开的方法可以用于诊断检测法，所述的诊断检测法检测总(gross)染色体重排或者单个或多个核苷酸改变、取代、插入或删除形式的突变。病原生物体

[0180]在本发明的另一方面，这里公开的方法可用于诊断检测法，所述的诊断检测法检测特定核酸(DNA或RNA)的存在，因而用于表明特定的或一类的含有该基因的生物体的存在，或所述的诊断检测法使得能进行特定生物体的遗传分型而不需培养该生物体。可以怀疑试验样品含有来自特定微生物如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌等的靶核酸序列。试验样品可以从许多来源收集，包括但不限于动物、植物或人体组织、血液、唾液、精液、尿液、血清、脑或脊髓液、胸膜液、淋巴、痰、乳房洗出液、粘膜分泌物、动物固体、粪便、微生物培养物、液体和固体食物以及饲料产品、废物、化妆品、空气和水。

[0181]在一些实施方案中，将对于靶病原体多核苷酸有序列特异性的寡核苷酸捕获探针连接至固体基质上。存在于试验样品中的靶病原体多核苷酸杂交至捕获探针上，然后进行洗涤以除去没有被捕获探针固定的任何试验样品组分。靶DNA或RNA可以例如通过加入特定的序列，经过引物延伸而重新得到。在一个实施方案中，捕获的靶病原体多核苷酸与无效启动子盒(APC)杂交。APC连接体包括在它的3’ 或5’末端(取决于产生与捕获探针反向平行的杂交体所需要的方向)的单链突出区域。换而言之，APC连接体与捕获的靶病原体多核苷酸的游离末端上的序列互补，因而使得APC连接体杂交至靶病原体多核苷酸上。然后按这里描述的进行无效转录，产生反复的寡核苷酸转录物，其随后用质谱法进行检测。

[0182]因此，用于检测病原体存在的说明性步骤(图8)可以包括：(a)任选地固定设计用来与靶病原体多核苷酸杂交的捕获探针； (b)任选地将捕获探针与可能含有靶病原体多核苷酸的试验样品杂交。通过逆转录(对于RNA病原体)或引物延伸(对于DNA病原体) 可以将靶核酸复制为DNA。在两种碱基中，对应于无效启动子盒(APC) 连接体的DNA序列将加入至靶拷贝中(图1)；(c)任选地洗涤被捕获的靶病原体多核苷酸以除去试验样品的任何未杂交的组分；(d)将捕获的靶病原体多核苷酸与无效启动子盒杂交；(e)修饰起始子和包含链终止子的核苷酸中至少之一以使得能检测由聚合酶合成的寡核苷酸产物；(f)将无效启动子盒与起始子杂交；(g)用聚合酶延伸起始子，这样使得聚合酶通过整合包含链终止子的互补核苷酸并释放无效寡核苷酸产物来反复合成与靶位点互补的寡核苷酸产物，而不从酶结合位点移开或从APC上解离；并且(h)用质谱法检测和任选地定量多重无效寡核苷酸产物。

[0183]在另一方面，本发明提供用于用质谱法检测试验样品中病原体存在的方法。该方法包括：(a)连接所述试验样品中的靶病原体多核苷酸或蛋白质至人工启动子盒上，所述的人工启动子盒含有可以通过用聚合酶转录来检测的区域；(b)将所述的APC-标记的靶分子与起始子、RNA聚合酶、延伸子和/或终止子孵育；(c)合成与 APC起始开始位点互补的寡核苷酸转录物，其中延伸所述的起始子直到转录终止并释放寡核苷酸，因而合成多重反复寡核苷酸转录物；并且(d)通过用质谱法检测或定量所述的从所述试验样品反复合成的寡核苷酸转录物来确定病原体的存在。

[0184]在更进一步方面，本发明提供使用捕获探针和质谱法用于检测试验样品中病原体的方法。该方法包括：固定设计用于与所述试验样品中的靶DNA或RNA多核苷酸相互作用的捕获探针；(b)将所述的捕获探针与可能含有所述靶多核苷酸的试验样品混合；(c)将所述试验样品中的靶多核苷酸连接至含有与靶病原体多核苷酸相互作用的区域和可以通过用聚合酶转录来检测的区域的人工启动子盒上； (d)将所述靶多核苷酸与RNA聚合酶、起始子、延伸子和/或终止子孵育；(e)合成与APC的所述起始转录开始位点互补的寡核苷酸转录物，其中延伸所述的起始子直至转录终止并释放寡核苷酸，因而合成多重反复寡核苷酸转录物；并且(f)通过使用质谱法检测或定量所述的反复合成的寡核苷酸转录物来测定病原体存在或不存在。

[0185]本发明方法特别用于监控病原体核酸和蛋白质的存在或不存在。本发明可用于检测、诊断和监控与病原体多肽或多核苷酸相关的疾病和/或病症。本发明提供用于检测多肽或多核苷酸的不正常表达的方法。本方法包括(a)使用上面描述的无效起始转录的方法检测目的多肽或多核苷酸在个体的细胞、组织或体液中的表达，并且(b) 将基因表达、蛋白质表达或目的序列的存在的水平与标准的基因或蛋白质表达水平或目的序列比较，凭借检测的多肽或多核苷酸水平较于标准水平有增高或降低而预示不正常表达，表明目的病原体的存在。

[0186]个体活检组织或体液中异常量的转录物的存在可以提供用于在实际的临床症状出现之前检测疾病的手段。更确定的这类诊断可以使得健康专业人员能更早采用预防措施或积极处理，从而预防由病原体引起的疾病的发生或进一步发展。

[0187]本发明特别用于监控病原生物体的存在，所述的病原生物体包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、链球菌属(Steptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、HIV和肝炎。

[0188]本发明方法可用于检测含水液体，特别是水(例如饮用水或游泳用水或淋浴用水)，或其它含水溶液(例如用于细胞培养的发酵培养液和溶液)，或者气体和气体混合物例如可呼吸的空气和用于喷洒、清洁或从表面除去颗粒物的气体中的病原微生物。来自任何来源，包括但不限于家、学校、教室、工作场所、航空器、航天器、汽车、火车、公共汽车和任意其它的人聚集的建筑或建造物，的可呼吸的空气可以就病原微生物的存在进行检测。mRNA表达

[0189]在本发明的另一方面，在此公开的方法可用于诊断检测法，该诊断检测法以定量或非定量形式检测信使RNA(mRNA)表达水平。蛋白质检测

[0190]在本发明的另一方面，在此公开的方法可用于检测蛋白质的诊断检测法。例如，无效启动子盒连接体可以用所连接的蛋白质修饰基团制成，并用于连接APC至蛋白质上。合适的蛋白质包括，但不限于抗体、结合蛋白、抗生物素蛋白、信号传导分子、蛋白质A等。在一些实施方案中，将APC连接至抗体上，所述的抗体是对于靶目的蛋白质分子特异性的。抗体结合至靶目的蛋白质分子上，并且将连接的APC用于产生多重反复寡核苷酸转录物，其然后用质谱法检测。通过连接APC至对靶分子有特异性的抗体或其它蛋白质上，该方法也可用于非蛋白质的靶目的分子。疾病检测

[0191]本发明可用于通过监测DNA甲基化的状态、基因突变、 mRNA表达模式和蛋白质表达模式来检测动物中的疾病。本发明可用于检测、诊断和监控与多肽或多核苷酸异常的表达和/或活性相关的疾病和/或病症。本发明提供对多肽或多核苷酸的异常表达、突变的存在和 DNA甲基化状态的变化的检测。本发明的诊断检测法可以用于任何疾病的诊断和预后，包括但不限于阿尔茨海默病、肌肉萎缩症、癌、乳腺癌、结肠癌、囊性纤维化、脆性X染色体综合征、血友病A和B、肯尼迪病(Kennedy disease)、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、强直性肌营养不良、泰-萨病、威尔逊病和威廉斯病(Williams disease)。拒信这些检测法特别可用于所有类型的癌症的诊断和预后。试剂盒

[0192]在一些实施方案中，本发明是试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括一小瓶，小瓶含有无效启动子盒，其中所述的无效启动子盒含有连接体用于将APC偶联至对靶目的分子具有特异性的分子(例如核酸或抗体)上。在另一实施方案中，试剂盒含有树状聚合物、APC 和偶联试剂。在另一实施方案中，树状聚合物偶联至APC上。另外的小瓶含有适合于实施上述偶联的试剂。试剂盒也可能含有聚合酶、适合于该APC的起始子和适合于无效转录的核苷酸。检测仪器

[0193]可以将无效转录技术整合进仪器中，这样使得可以快速地并以可携带的方式检测靶目的分子的存在。这种仪器可以是整合了反应组分的微流装置(microfluidic device)，这样使得样品可以从一开口加入至仪器中，从另一开口获取寡核苷酸转录物，并然后将其加样至质谱仪中。在一些实施方案中，单个仪器可以在单个仪器中结合有样品收集、无效转录反应以及质谱法检测。实施例

[0194]提供下列的实施例仅用于说明并不用于限定。本领域那些技术人员将容易认识到有许多可以变动或修饰以产生基本相似的结果的非关键参数。例如，叙述的个别动作可以不必限于这里出现的顺序。实施例1
使用RNA聚合酶的RNA引物-起始的无效转录

[0195]已经优化了反应条件用于无效转录起始。缓冲液T的组分和浓度有利于无效转录的起始。缓冲液T包括：20mM Tris-HCl pH 7.9， 5mM MgCl2，5mM β-巯基乙醇，2.8％(v/v)甘油。引物是核糖核苷三磷酸(NTP)或二核苷酸，浓度为0.2-1.3mM。最终的NTP浓度是 0.2-1.3mM。该浓度范围高的一端是设计用于制备型无效转录。模板 DNA浓度以磷酸盐计少于2μM。加入大肠杆菌RNA聚合酶至终浓度15 nM-400nM之间。可将全酶或核心酶与单链模板DNA一起使用。将酵母无机焦磷酸酶以1单位/ml加入至制备型(preparative)反应中来防止焦磷酸的积聚。高浓度焦磷酸可以逆转合成反应，引起RNA聚合酶消耗RNA产物而再生出NTP。一单位的焦磷酸酶定义为能在25℃ 和pH 7.2时每分钟释放1.0μM无机正磷酸的酶的量。将反应物在37℃ 下孵育达72小时以进行制备型反应。这些条件是代表性的；对于具体的模板，优化特定的组分和浓度可以增强无效起始的效率。

[0196]三种不同的起始子用于该实施例中：(1)TAMARA-ApG； (2)生物素ApG；和(3)ApG。通过在95℃沸腾5分钟并立即置于冰上将靶核酸模板变性。每个反应体系按如下制备：5.0μl 1X缓冲液T
2.5μl a-32P-UTP
14.3μl ddH2O
1μl大肠杆菌RNA聚合酶(1U/μl)
100ng(2μl)模板DNA
10nmo l(1.2μl)起始子
22.8μL反应缓冲液

[0197]在37℃孵育12-16小时。将样品接受质谱法，并将得到的对应TAMARA-ApG；生物素ApG；ApG和它们的裂解产物的分子量的峰用于测定靶分子的存在。使用本领域已知的用以测定在第三位置上 UTP整合的程度的标准方法，这些物质种类的存在也可以用薄层色谱法加以确认。实施例2
具有经标记的终止子的无效起始反应

[0198]用经标记的起始子和/或经标记的终止子进行无效转录起始反应。下列的反应条件用于整合经标记的终止子：5μl 1X缓冲液T
3μl 100ng变性的DNA模板(pBR 322)
13.5μl dd H2O
1μl大肠杆菌RNA聚合酶
1.2μl二核苷酸起始子ApG
1.5μl 7mM SF-UTP

[0199]将混合物在温度受控制的微量滴定板阅读器中于37℃孵育16小时。使用本领域已知用以证明经标记的三核苷酸ApGpU产生的标准方法，进行薄层色谱法。将样品用质谱法检测以确定三核苷酸 ApGpU的产生。如在表1中预测的，质谱法应该能容易地区分三核苷酸的种类。

[0200]通过质谱法检测使得能同时检测多个靶分子或靶序列而不需要报告物质标记的核糖核苷酸类似物。表1(a)显示了具有不同 MW的三核苷酸。表1(b)显示了按分子量排序的同样的20个三核苷酸。通过使用报告物质标记的起始子和/或终止子核苷酸也可以完成进一步的多路技术。表1(a)。通过质谱法检测三核苷酸无效转录物。   三核苷酸   核苷酸位置   MW   1   2   3   ApApA   267   347   347   961   ApApC   267   347   323   937   ApApG   267   347   363   977   ApApU   267   347   324   938   ApCpG   267   323   363   953   ApGpU   267   363   324   954   ApCpU   267   323   324   914   CpCpC   243   323   323   889   CpCpA   243   323   347   913   CpCpG   243   323   363   929   CpCpU   243   323   324   890   CpGpU   243   363   324   930   GpGpG   283   363   363   1009   GpGpA   283   363   347   993   GpGpC   283   363   323   969   GpGpU   283   363   324   970   UpUpU   244   324   324   892   UpUpA   244   324   347   915   UpUpC   244   324   323   891   UpUpG   244   324   363   931
表1(b)。通过质谱法检测三核苷酸无效转录物：根据分子量排序的三核苷酸   三核苷酸   核苷酸位置   MW   1   2   3   CpCpC   243   323   323   889   CpCpU   243   323   324   890   UpUpC   244   324   323   891   UpUpU   244   324   324   892   CpCpA   243   323   347   913   ApCpU   267   323   324   914   UpUpA   244   324   347   915   CpCpG   243   323   363   929   CpGpU   243   363   324   930   UpUpG   244   324   363   931   ApApC   267   347   323   937   ApApU   267   347   324   938   ApCpG   267   323   363   953   ApGpU   267   363   324   954   ApApA   267   347   347   961   GpGpC   283   363   323   969   GpGpU   283   363   324   970   ApApG   267   347   363   977   GpGpA   283   363   347   993   GpGpG   283   363   363   1009
                        实施例3
用大肠杆菌RNA聚合酶全酶的RNA引物-起始的无效转录

[0201]大肠杆菌RNA聚合酶全酶可以从缺少启动子序列的单链 DNA起始转录。将变性的poly[dG-dC](10g/25μl反应体系)用大肠杆菌RNA聚合酶全酶(1.9pmol/反应体系)转录。用二核苷酸GpC 起始无效转录。GTP是可用于延伸引物的唯一核苷三磷酸。省略由模板链编码的其它核苷三磷酸(CTP)。进行质谱法，表明三核苷酸产物 GpCpG的存在依赖于GTP的浓度，并且表明可检测的产物是一个大小的，这表明省略CTP有效地在形成三核苷酸产物后终止了转录。

[0202]大肠杆菌RNA聚合酶全酶将强烈地偏好泡底物而不是缺少部分互补的非模板配偶体的模板链。检测大肠杆菌RNA聚合酶全酶与DNA泡复合体较于它与相应的单模板链的相对转录活性，表明RNA 聚合酶表现出与泡复合体1的转录活性水平比当单独提供相等摩尔量的模板链时的转录水平要高70倍。在检测T7RNA聚合酶对泡复合体 DNA的偏好的试验中将获得类似的结果。

[0203]已经显示具有不同启动子识别性质的RNA聚合酶使用泡复合体1作为底物进行无效转录。在本试验中，将泡复合体1与大肠杆菌全酶、大肠杆菌核心RNA聚合酶、噬菌体T7和噬菌体SP6RNA 聚合酶孵育。用于大肠杆菌全酶和大肠杆菌核心聚合酶的反应缓冲液包括150mM醋酸钠。在T7和SP6反应中省略去醋酸钠，因为高的盐浓度抑制这些酶。所有的反应体系含有20mM HEPES pH 8缓冲液， 10mM MgCl2和2mM DTT。在所有反应中，以每种1mM提供起始子 ApA和UTP。预期大肠杆菌全酶将比大肠杆菌核心聚合酶多产生约2 倍的产物，并且比T 7和SP6聚合酶多产生10倍的产物/聚合酶。

[0204]基于使用放射性前体的引物起始的无效转录和放射自显影检测的检测法灵敏性。

[0205]基于引物起始的无效转录反应的检测法的灵敏性可以通过定义可以产生可检测信号的泡复合体1的最小量而测定。例如，可用量逐渐减少的泡复合体1(10fmol-1zeptomole/25μl反应体系) 进行一系列无效转录反应。转录用ApA和放射性UTP起始。UTP是包括于反应体系中的仅有的核苷三磷酸以限制产物为三核苷酸ApApU。使用质谱法，对每个转录反应进行时-程(time-course)试验。3小时的RNA聚合酶无效转录反应后，通过质谱法10fmol泡复合体产生的信号将可以清楚地检测，并且1fmol泡复合体产生的微弱信号可以辨别。100amol泡复合体1产生的ApApU信号在转录24小时后可以检测。实施例4
用于通过反相HPLC/电喷雾电离质谱法定量无效转录产物(无效转录
物(Abscript))的方案

[0206]通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)检测无效转录物需要将无效转录物与反应溶液中存在的其它盐或离子分离。没有进行这种分离，离子抑制效应会妨碍无效转录物的检测。本方案描述了用于检测和定量从标准无效转录反应产生的无效转录物的色谱法和ESI-MS的设置。本方案包括用来与正常溶液无效转录反应使用的标准品和样品的制备实例，并包括处理产生的数据的方法，所述的数据用于无效转录反应中产生的无效转录物的定量。本领域一般技术人员可以进一步修饰本方案并使本方案适用于不同条件。HPLC

[0207]在个人电脑上用MassLynx 软件控制的Waters Alliance 2795Separations Module。

[0208]Waters Atlantis C18柱：2.1×30mm，300μm的颗粒大小HPLC级乙腈和水
梯度条件：
流速＝0.4mL/分钟。
溶液A＝水
溶液B＝乙腈
0.00分钟：0％B        100％A
3.00分钟：7.5％B      92.5％A    线性斜坡
3.10分钟：80％B       20％A      线性斜坡
4.00      80％B       20％A      保持
在下次运作开始之前在起始条件下再平衡1分钟
注射体积：10μL
ESI-MS

[0209]在负离子V模式运行Waters/Micromass LCT Premier ESI-MS w/Lockspray装置，在PC上用MassLynx软件控制，使用面心 (centroid)数据收集。用氮气发生器(Peak Scientific，NM30LA) 供应高纯度的N2气，亮氨酸脑啡肽(1ng/mL)用作lockspray参考质量标准。HPLC柱流出物整体引入MS源。ESI-MS源设置：
毛细管电压：      2700
样品锥形体(cone)：50
去溶剂化气体温度：300℃
源温度：          100℃
去溶剂化气流：    400
锥形体气流：      0
Lockspray流速：4μL/分钟。
ESI-MS离子导向设置：
离子导向1         5.0
孔径1             5.0
离子能量          105.0
孔径              24.0
Hexapole DC       6.0
孔径3             4.0
加速              200.0
Y Focus           3.0
操纵(Steering)    0.2
管透镜            200.0
弱化的Z-focus  500.0
正常的Z Focus  65.0
ESI-MS推动器、飞行管和检测器设置
TOF飞行管                     5630.0
Reflectron                    1780.0
推动器(pusher)                820.0
推动器偏移                    -0.2
拉动器(Puller)                720.0
拉动器偏移                    0.0
MCP检测器                     2700.0
推动器频率                    29,411.76Hz
标准品和样品制备
IDT双链体缓冲液：
30mM HEPES
100mM 乙酸钾
pH 7.5

[0210]双链体缓冲液中5mM的RNA三核苷酸标准购自Dharmacon 公司。5X泡缓冲液(bubble buffer)
100mM HEPES，pH 8
50mM MgCl2
0.5mM EDTA
40mM亚精胺
5mM DTT
750mM 乙酸钠
150μg/mL乙酰化BSA
14％甘油
于无核酸酶的水中
Ribomaker聚合酶(883fmol/μL)
50fmol/μL的APC泡
双链体缓冲液中5mM的合适的NpN起始子
双链体缓冲液中5mM的合适的NTP
标准品制备：

[0211]用在1X泡缓冲液、70.6fmol/μL Ribomaker聚合酶、8 fmol/μL的APC泡、1mM合适的NTP和1mM合适的NpN起始子的基质中的0.5、1、5、10、50和100μM浓度的三核苷酸制备20μL的溶液。将标准溶液在冰上或4℃冷却以防止出现任何无效转录。备选地，也可以使用将不会从溶液中的起始子/NTP组合产生无效转录物的APC 泡。样品制备：

[0212]按在此别的地方详细描述的来实施无效转录方案。将标准品和待评估的样品以1/10稀释于HPLC级水中，并用上面列出的 HPLC/ESI-MS条件运行。数据处理

[0213]使用对于接受评估的无效转录物的合适的M/Z值产生色谱图。使用双倍负荷(doubly charged)的信号通常将获得更高的灵敏度。无效转录物和起始子具有2-3分钟的保留时间。使用默认的积分参数将色谱图积分。将从标准制备物得到的数据拟合为一条直线，从而产生标准曲线，其可用于计算在无效转录反应中产生的无效转录物的浓度。实施例5
AAG和AUG对照的质谱法检测

[0214]使用电喷雾电离质谱仪(ESI-MS)检测化学合成的AAG和 AUG三核苷酸。材料：
AAG和AUG三核苷酸
HPLC级乙腈(EM science)和水(Fisher)
三乙胺，pH 7
方法：

[0215]通过以10μL/分钟直接注入而将样品引入MS中并在负离子模式用V光学系统(V-optics)评价。源条件：2500V毛细管，35 V锥形体，150℃去溶剂化温度，80℃源，550L/分钟的去溶剂化流量。评价10μL样品，并因此在一系列的1秒钟扫描中获取数据1分钟，扫描之间间隔0.1秒。结果：

[0216]50pmol的AAG和AUG三核苷酸的质谱图显示于图18中。对于AAG和AUG，在936.9Da和914.0Da观测到母体离子，预测实际的MW为941.6和918.6。在两种情况下来自母体离子的信号十分微弱，但来自双倍负荷的离子的信号更强。这些信号出现在母体离子质量的一半处，值分别是468.3和456.8Da。图19显示了50、5和0.5pmol 水平的AAG的谱。AAG在0.5pmol时可以检测。实施例6
通过RP-HPLC/MS定量评价三核苷酸

[0217]将反相HPLC/质谱法用于检测和定量(1)悬浮于无效转录反应混合物中的AAG掺料样品(spiked sample)中的三核苷酸AAG，和(2)实际无效转录反应产生的AAG。实验方法
材料：
Atlantis C18柱：2.1×30mm，300μm的颗粒大小
HPLC级乙腈(EM science)和水(Fisher)。
AAG三核苷酸
泡22(产生AAG无效转录物)
方法：
无效转录
使用浓度为50、35、20和5fmol/μL的储存泡(stock bubble)，按标准方案进行无效转录反应。
无效转录混合物：
水                                    2μL
泡缓冲液(5X浓缩液)                    2.5μL
泡储液                                2μL
无效转录酶(Abscriptase)(883fmol/μL)  1μL
ApA(5mM)                              2.5μL
GTP(5mM)                              2.5μL
将无效转录反应在45℃进行30分钟，然后于在LC/MS上操作之前用水从20μL稀释为200μL。
RP-HPLC/MS条件
流动相：
组分A：水
组分B：乙腈
梯度条件：
0分钟                 100％A
1.4分钟               线性斜坡至70％B。
7.0分钟               保持在70％B
12分钟                7分钟后立即转换为100％A，
                      保持5分钟。
流速：                0.2mL/分钟
注射体积：            10μL
MS条件：
毛细管电压：          2500
源电压：              35
去溶剂化温度：        180℃
源温度：              80℃
去溶剂化气体流速：750L/小时
以V模式运行。
样品运行：

[0218]在水中制备100、70、40和10μM浓度的AAG溶液：这些样品跨越10％-1％的转化范围，这在无效转录反应中通常观测到。AAG- 掺料样品以上述的相同浓度制备，但在含有正常浓度的无效转录试剂的混合物中。使用50、35、20和5fmol/μL浓度的泡储液构建无效转录反应。也进行阴性对照反应，反应体系中仅含有模板链。在进行前用水将所有样品从20μL稀释至200μL。结果

[0219]图20A显示了从用10和100μM的AAG掺料的两个无效转录反应产生的质谱。在两种情况下，优势信号是在593Da，其来自反应混合物中存在的1mM的ApA。使用的HPLC条件导致AAG和ApA的接近的共洗脱，如图20B中显示。图20A和20B显示两个不同的数据代表，这些数据用于定量从反应中产生的无效转录物的量。图20A以信号强度的形式表示了无效转录物的量，所述的信号强度来源于在图 20B中显示的色谱峰的整个宽度上合计得到的单独的质谱图。

[0220]表2说明了不同已知量的AAG和得到的信号之间的关系。仅在水中和在与无效转录反应相同的溶液基质中制备样品。采用三种定量方法评价数据：1.MS强度：将含有色谱峰的单独的扫描，如在图20B中显示的，加和在一起，得到一单个的质谱，如在图20A中显示的，它的强度应该与无效转录物的量相关。
2.峰高和3.峰面积：按标准的色谱法方法，AAG信号的色谱图，如图20B中的，可以通过峰高或峰面积进行定量。
表2.从具有已知量的三核苷酸的溶液产生的信号。表中最后一行是作为AAG浓度的函数进行作图的目的信号的最小二乘拟合线 (least-squares fitted line)的决定系数。 AAG浓度(uM) 在水中在无效转录反应体系中 MS强度峰高峰面积 MS强度峰高峰面积 10 40 70 100 1245 4121 6545 11442 3749 12470 18785 29863 499.62 1693.787 2627.618 4601.606 1359 4530 7629 10652 4265 14119 22735 30113 519.077 1799.24 3084.891 4239.686 R2 0.974 0.989 0.974 1 0.996 0.999

[0221]表2证明了，全部的三种定量方法显示了对在水中或在无效转录反应基质中的无效转录物的相对线性响应。性能水平表明从掺料溶液例如那些用于产生表2中的数据的溶液产生的校准曲线可以精确地用于测定未知样品中的无效转录物的浓度。附加的数据点和重复进行，也可以用来增加校准曲线的精度。

[0222]根据此方法，将从表2的数据产生的MS强度、峰高和峰面积这三个定量测量的校准曲线用于计算新样品中无效转录物的浓度。使用数个已知浓度的APC的反应得到数个含有未知浓度的无效转录物的溶液。用LC/MS方法和上面描述的三个定量测量评估这些溶液。用得到的浓度值，与已知的APC浓度一起，用于计算受试APC的转换率。结果显示于表3中，表明增加量的APC与增加的转换率相互关联。然而，对于在校准曲线外的样品，校准曲线的外推并不总是得到转化率的一致的计算结果(见，例如5fmol/μl APC浓度)。这个问题通过用校准曲线中的更多数量和更大范围的数据点来弥补。表3.使用不同量的APC通过无效转录反应而产生的转换率的检测和计算。将从掺料反应得到的数据用作标准曲线来定量产生的AAG的量，并且将这些量用于转换率计算。   泡22   浓度   (fmol/uL)   MS强度   峰高   峰面积   计算的转换率   MS强度   峰高   峰面积   5   20   35   50   467   1505   2934   4518   1251   4711   9571   14627   153.196   574.306   1204.808   1880.771   42   115   148   168   -110   98   157   183   25   112   154   176   模板   119   212   31.295   -10   -26   -10   R2   0.992   0.993   0.990
                    实施例7
                多路无效转录反应

[0223]一次同时进行多个无效转录反应的能力即多路技术，在含有两种APC的反应混合物上得以证明。选取图21中显示的两种APC、泡4和APC UC2361用于该目的。用相同的靶位点探针(TSP)即A192，但用不同的模板链(TEM)即A197或A56构建这两种无效启动子盒。泡4的起始子是ApA，UC2361的起始子是UpC，并且整合性的核酸是 GTP。所期望的从泡4产生的无效转录产物是AAG，而从UC2361产生的是UCG，这可通过TLC和质谱法区分。

[0224]反应组分列于表4中。在每列中给出的体积是用于两个反应的，这样可以重复进行两次反应。将每个反应重复进行两次。每个反应的终体积是12.5μl。将反应组分以表4中列出的顺序集合于PCR 管中。将反应体系在45℃孵育30分钟并且将2μl无效转录产物点样在硅胶(铝-支持的)TLC板上。将TLC在6∶3∶1的异丙醇∶NH4OH∶H2O 的溶剂混合物中展开，然后干燥。然后将TLC板暴露于磷光显像仪的屏20分钟，并从点的强度计算转换数(转录物/模板/分钟)。图22 显示用TLC对从混合的APC试验得到的无效转录物的分析。泳道1-3 具有泡4(100fmol，最终)，并用ApA(泳道1)、UpC(泳道2)、 ApA+UpC(泳道3)起始。泳道4-6具有等摩尔浓度的泡4(100fmol，最终)和APCUC2361(100fmol，最终)，并且在泳道4中它们用ApA 起始，在泳道5中用UpC起始，和在泳道6中用ApA+UpC起始。泳道7-9具有APCUC2361(100fmol，最终)，并用UpC(泳道7)、ApA (泳道8)以及ApA+UpC(泳道9)起始。泳道10是用ApA起始的 TEMA197，泳道11是用UpC起始的TEM A57，以及泳道12是没有APC 而具有起始子ApA+UpC的对照。泳道13是α32P-GTP的对照。起始子的浓度对于每一个是1mM终浓度。

[0225]在这个试验中，每个无效转录反应使用不同的模板和不同的起始子，但两者都整合GTP。结果证明，当两种不同的APC存在于同一反应混合物中时，一个无效转录反应没有因为其它APC的存在而受到抑制。当将APC混合在一起时，总的转换没有明显的下降，即使是整合相同的GTP核苷酸(泳道4-6)。不正确的整合，其可能表示错误的起始子与APC相互作用，没有观测到(泳道2、3、6、8和9)。表4：用于混合的APC反应的反应组分   组分   起始   浓度   1.   Bub4   ApA   2.   Bub4   UpC   3.   Bub4   ApA   upC   4.   Bub4   UC   ApA   5.   Bub4   UC   upC   6.   Bub4   UC   ApA   UpC   7.   UC   upC   8.   UC   ApA   9.   UC   ApA   UpC   10.   TEM   A197   ApA   11.   TEM   A56   UpC   12.   No   APC   ApA   UpC   13.   □32P-   GTP   终浓度   H2O   6.5   6.5   4   2.5   2.5   ---   6.5   6.5   4   6.5   6.5   13   17.5   泡缓冲液   5X   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   1X   泡4   50   fmol/μl   4   4   4   4   4   4   ---   -----   -----   ---   ---   ---   -----   8   fmol/μl   UC2361   50   fmol/μl   -----   ----   ---   4   4   4   4   4   4   ---   ---   ---   ---   8   fmol/μl   TEMA197   50   fmol/μl   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   4   ----   ---   ---   8   fmol/μl   TEMA56   50   fmol/μl   --   --   --   ----   ---   --   --   --   --   --   4   --    --   8   fmol/μl   E.coli holo   RNAP   883   fmol/μl   2   2   2   2   2   2   2   2   2   2   2   2   ------   70   fmol/μl   ApA   10mM   2.5   ----   2.5   2.5   ----   2.5   ----   2.5   2.5   2.5   ----   2.5   -----   1mM   UpC   10mM   ----   2.5   2.5   ----   2.5   2.5   2.5   ----   2.5   ----   2.5   2.5   ----   α32P-GTP   5mM   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   1mM
                       实施例8
                   多路无效转录反应

[0226]产生生成不同无效转录物的十种APC。图23显示了由寡核苷酸链的不同组合构成的10种无效启动子盒的描绘，它们用于多路转录反应。

[0227]寡核苷酸链退火形成图23中描述的APC通过在4％的琼脂糖凝胶上的电泳测定，如在图24中显示的。APC的4％的琼脂糖凝胶分析。将5ul 1pmol/μl的APC上样至每个泳道上(1-10)。为了显示与单链的比较，将TEM A191(5μl 50pmol/μl)上样至泳道11，并且泳道12具有50bp的梯形条带(ladder)。

[0228]在APC 4、12、24、25和32上进行无效转录，并在TLC 上处理无效转录物。每个无效转录反应用100fmol的APC、1mM终浓度的起始子、1mM终浓度的如图中列出的NTP和1μl的无效转录酶一起进行。无效转录反应在45℃进行60分钟。将来自每个反应的2 1反应液在TLC板上点样，并用6∶3∶1的异丙醇∶NH4OH∶H2O展开。然后将TLC板曝露于磷光显像仪的屏10分钟。

[0229]如图25中显示的将来自每个APC的无效转录产物用放射性检测。每个APC产生不同的无效转录物，虽然AAG和AAU不能通过 TLC很容易地区分。实施例9
用抗SEB抗体-APC复合物的基于无效转录的SEB蛋白质的检测

[0230]使用夹心ELISA和偶联至无效启动子盒的抗SEB的抗体来检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)。试验方法
偶联

[0231]APC 22(APCAA2361)，其产生AAG无效转录物，是胺修饰的，将其偶联至抗SEB的抗体上。偶联后，将Ab-APC缀合物和未反应的组分的混合物用HPLC分成不同级分。收集级分17-19和22-24 并检测。用30kDa旋转过滤器(spin filter)浓缩收集的样品。用购自Pierce的micro BCA assay测定这些样品中的抗体浓度。夹心ELISA

[0232]SEB包被的板用2％BSA/PBS-Tween 20封闭一小时。将10 μg/mL IgG的抗体缀合物溶液和1/2系列稀释液加入至板的第1-11列中，这样列1中的抗体浓度是10μg/mL，列2是5μg/mL，列3是2.5 μg/mL等，以及在列11中的浓度是9.77ng/mL。每孔的终体积为50μL。室温和摇动下孵育1小时后，如下进行无效转录反应。将10μL 883nM 的泡缓冲液中的无效转录酶加入至每个孔中，随后加入10μL在泡缓冲液中的含有2mM I-ApA、2mM T-GTP、0.1μCi/μLα-32P-GTP的无效转录反应试剂。将20μL在泡缓冲液中的1mM T-030，0.1μCi/μL α-32P-GTP的溶液对照置于空闲的孔中。将板在热混合器(Eppendorf) 中在45℃以400rpm摇动孵育两小时，随后冷却至4℃以储存过夜。将2μL反应溶液和对照上样至铝支持的硅胶TLC板(Whatman)上并展开。将磷光屏(Molecular Dynamics)曝露于TLC板20分钟，用 Phosphoimager：SI(Molcular dynamics)成像，并用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)评估和定量。校准器显示数据在显像仪 (imager)的线性范围内。结果

[0233]两个缀合物库产生的信号的滴定曲线在图26中显示。库 22-24对应于最大缀合物带的峰级分，库17-19对应于稍早洗脱的第二个峰。当在非还原性SDS-PAGE凝胶上走样时(没有显示)，来自这两条带的缀合物具有不同的迁移率。不同的洗脱时间和电泳迁移率表明，在17-19级分中洗脱的物质是结合有两个APC的缀合物，而22-24 级分的物质是仅结合有一个APC的缀合物。无效转录反应的这种滴定显示了两个缀合物的特异性无效转录活性的明显区别，并进一步支持了库17-19结合有两个APC而库22-24结合有一个APC的观点。比较性的直接的ELISA检测法没有显示这些缀合物结合能力的显著差异，所以观测到的信号的不同主要是由于无效转录能力的不同。实施例10
通过质谱法同时检测10种三核苷酸

[0234]为了证明至少10种无效转录物可以用质谱法独立地检测，将10种化学合成的三核苷酸既分别检测又作为单个混合物检测。图27显示了来自它们独立操作的全部10种三核苷酸的组合的色谱图。嵌入的图表说明哪个编号的峰指哪个无效转录物，以及相关的保留时间、m/z值和峰面积。图27证明了大多数三核苷酸具有稍微不同的保留时间。然而，即使LC保留时间相似或相同，样品同样可以用质谱法独立地评估。例如，峰7(AUU)和8(AAU)显示了相同的保留时间，但产生了不同的m/z值。

[0235]质谱法从含10种无效转录物的库中区分不同的无效转录物的能力如下进行证明。将10种纯化的三核苷酸的混合物以等摩尔浓度混合在一起，并通过质谱法分析。图28显示了通过质谱法同时检测的三核苷酸混合物的输出。将每种三核苷酸紧靠其对应的m/z比率显示。10μl 10μM的溶液用Atlantis dC18 3um 2.1mm×30mm柱分析(100pmol)。所用的MS协调文件(tunefile)为“无效转录物”。

[0236]表5显示了，对于每个无效转录物，通过质谱法观测到的双倍负荷的离子的计算得到的分子量和观测到的m/z值。表5 无效转录物分子量 m/z值 AAG 941.662 469.6 AAU 902.662 450.1 ACC 877.612 437.6 AGC 917.637 457.6 AGG 957.662 477.6 AUU 879.581 438.6 UCC 854.572 426.1 UCG 894.597 446.1 UGG 934.622 466.1 CGG 933.617 465.6

[0237]因此，将质谱法用于区分含有至少10种不同APC的多路反应的产物，并因而应该能检测至少10种不同的靶分子，或以更高的灵敏性和精度检测更有限数量的靶。实施例11
多路无效转录并用质谱法检测

[0238]将显示于图29中的两种APC即APC 2-1和12-1混合并在 45℃进行无效转录反应29分钟，并且通过LC-MS分析无效转录物，全部根据先前描述的方案。APC 2-1产生的无效转录物是AAG(类似于 APC 4)，以及APC 12-1产生的无效转录物是AAU。无效转录物AAG 和AAU不能通过TLC分开，如在图25中显示的。然而，这些无效转录物可以通过质谱法分开。图31显示了从具有两种APC的多路反应得到的色谱图，它们可基于m/z值很容易地分开。这些数据也证明了一种 APC的无效转录反应没有因从另一种APC发生的无效转录反应的存在而受到抑制。

[0239]图30显示了较于对照反应从多路无效转录反应产生的 AAU和AAG信号的总结。单独的ABC 2-1反应数据在列1和列2中。单独的ABC 12-1反应数据在列5和列6中。组合的反应数据(重复进行反应)在列9-12中。AAG、AAU和AAG+AAU对照在列13-16中。在前述的说明书中，本发明已经通过参考具体的实施方案而得以描述。然而，可以理解，可以进行多种不同的修饰和改变而不脱离在下面的权利要求书中列出的本发明的范围。应该以举例说明性的方式考虑说明书和附图，而不是以限制性的方式，并且有意将所有这样的修饰都包括在本发明范围内。所有引用的参考文献通过全部引用作为参考。当实施方案可能包括各种不同元素或特征时，也可认为这样的实施方案也可以基本由，或由所述的元素或特征组成。
发明背景

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