生物学和化学分析的阵列形式可以快速提供准确的结果，并且减 轻了工作量。(Nature Genetics，1999 Vol.21(1)supplement pp.3-4) 典型地，生物学探针如DNA，RNA或蛋白质分子的阵列通过沉积和 固定作用或通过在惰性基层上进行原位合成来形成。在这些现有技术 方法中，阵列形成通常需要将探针分子直接附着到一种基层上，所述 基层可以是有机物质(如聚合物如硝酸纤维素)或无机物质(如玻璃 或硅)组成的。
硅作为基层的应用提供了涉及半导体晶片和芯片加工完整建立 的方法的某些优点。半导体加工时，晶片在一系列多种加工步骤中被 修饰及转换以产生需要的特征。通常，多种相同特征在每个晶片上通 过平行加工被同时制造以形成在晶片上的独立区段。通过使用平行或 批次加工制造相同特征可以极大的节约制造时间。另外，批次加工产 生了高度芯片一致性，而且通过使用某种光刻法(photolithography) 和蚀刻法可以精确制造非常小(“亚微米级”)的特征。因此，具有高 度特征密度的结构可以在非常小的芯片上制造。加工完成后，各个独 立区段从晶片上切下，该过程称为分割(singulation)以获得一个多 样性芯片。(Peter Van Zant，“Microchip Fabrication”，3rd edition， McGraw Hill 1998)。
含有不同功能芯片的半导体晶片可以在最终封装过程中通过互 连不同的芯片或仅仅通过粘合两个具有不同功能芯片的晶片进行组 合，然后切割晶片叠片组(stack of wafers)。高效的半导体制造过程 可以显著地进行快速的工业生产。高度复杂的系统被发展用于芯片生 产、封装和质量控制。
生物芯片是不同生物分子(“探针”)的阵列，所述分子可以与结 合在固相支持物(solid support)上的特异靶结合。存在两种基本方 法制备生物芯片。
第一种方法涉及将等量的含有预先合成的感兴趣的探针分子的 溶液置于一个平面基层上，然后在指定位置固定所述探针分子。例如， 将探针溶液加在基层上(“点样(spot)”)以形成一维位置编码(Kricka， Larry J.，“Immunoassay”，Chapter 18，pages 389-404，Academic Press， 1996)或二维位置编码(US Patent Nos.5807755和5837551)的定制 组合物的探针阵列。分子探针可以直接附着在基层表面或可以附着在 固相载体上，然后沉积或附着于基层以形成一个阵列。微粒(“珠”) 代表一种类型的这样载体。珠具有将制备和测试基层的过程从制备、 应用和测试探针和分析化学的过程中分离出来的优点(US Patent No.6251691)。多种大小和组合物的珠被广泛用于化学和生物学分析 中以及组合合成中。
所述探针阵列生产的沉积、印制(printing)和点样方法具有一些 不需要的特性。第一，现有技术水平的沉积和印制技术只能生产低特 征密度(low feature density)的阵列，因为典型的点样尺度为100微 米及点对点(spot-to-spot)分离为300微米。第二，目前为止探针沉 积方法不能产生一致的点样点，还有显著的点对点差异。第三，点样 方法，包括如电泳沉积到图案化的电极上的变化方法(美国专利 No.5605662)需要大量的设备和后勤的支持以在任何有意义的规模下 进行阵列的生产。特别地，点样方法不能进行探针阵列的批次制造。 因此，当批次加工样式用于有效生产基层时，随后通过应用化学或生 物学探针“生物功能化”这些基层的步骤是低效率的，因为其不适合批 次加工形式而且需要许多单独的点样步骤。因此，这个制造大量相同 功能化芯片的方法与使用平行加工方法的方法相比是非常耗时和昂 贵的。
制备探针阵列的第二个方法涉及使用类似于半导体加工的标准 程序，光刻法的方法原位光化学合成线性探针分子如寡核苷酸和肽。 近些年这些方法被广泛使用以在一组平行的多步光化学反应中在玻 璃或类似基层的指定位置上合成寡核苷酸(美国专利No.5143854； Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1996，93：13555-13560)。
尽管在一个晶片上同时直接产生大量探针阵列的平行加工具有 批次加工产生的可测量性和本质上提高一致性的优点，对制造探针阵 列而言还是存在严重的缺点。第一，在一系列一步反应中，只有简单 的、相对短的线性分子适于合成，而且实践中，通过这个方法只制备 了短寡核苷酸的阵列。第二，该反应经常不能进行完全，导致明显的 组合物不均一。第三，所有半导体加工必须在导入生物分子之前完成， 因为生物分子可能对某些半导体加工步骤的苛刻环境不适应。这个限 制可能使人无法体现半导体制造技术中的各种优势。第四，如果在批 次制造形式上进行功能化，则制造方法限定了晶片上每个芯片的化学 或生物化学组合物(“内容物(content)”)。就是说，在探针设计中 导入一个变化需要相应地改变整个制造过程。定制(customization)， 尽管理论上可行，但是需要在光化学合成所需探针分子需要的必需掩 蔽(masking)步骤中产生一个变化。这个方法的成本和时间耽搁使 定制在实践中不可行。
附图简述
图1a和1b阐明了本发明的方法。
图2示出了包含一个珠阵列的芯片实例。所述芯片包含三层(L1， L2，L3)。L1是具有一个容纳珠的显微机械加工的阵列的硅基层 (A1)；L2，图案化的SiO2(100nm厚)；L3，是Si3N4层(5-10nm 厚)。
图3示出了晶片设计实例。
图4示出了设计包含珠阵列的芯片的实例。所述基层是硅(Si)。 12触点星图案(12-tip star pattern)位于100nm厚的SiO2层上。所述 星内部未被SiO2覆盖，而所述星外部被SiO2覆盖。在中心存在一个 紧密封装的六边形凹进(recess)的阵列。所述凹进总数是4012。
图5提供了用于保护珠的表面结构的实例。H1是一个保留 (retain)珠的具有直侧壁的孔。H2是可以容纳一个珠的金字塔凹进。 H3是限制一个珠的柱组。Hx是可以容纳多个柱的凹进。
图6示出了阵列结构的实例。A1和A2是矩形凹进的阵列。A3 是六边形凹进的阵列。
图7示出了芯片分组的实例。
图8阐明了芯片封装方法。A，B，C，D是具有不同功能的芯片。 按照所划线，晶片可被分成芯片。各个从不同晶片分出来的具有不同 功能组的芯片可以置于一起。一个4芯片封装由4个不同功能化的互 相连接的芯片组成以进行生物学应用。所述4个芯片可以多种方式排 列，非限制实例包括正方形或线性。
图9阐明了通过移动行和列中的自由芯片的组装芯片的方法。
图10示出了将一个探针阵列置于每个芯片一角的芯片设计实 例。通过图中这种方式组合这样4个芯片，可以形成一个更大的阵列。
图11阐明了包含本发明珠阵列的芯片制造方法。
图12是硅晶片上形成的水凝胶的照片。
图13a阐明了水凝胶形成前和凝胶剥落后芯片上珠阵列的荧光图 像。珠的数量和珠位置是相同的。图13b阐明了经水凝胶处理和未经 水凝胶处理的芯片反应结果。
图14阐明了可移动芯片载体及其应用以及反应槽。
图15阐明了随机编码阵列的实例；(b)芯片文库(c)芯片文库 中芯片的随机组装，(d)阵列的随机拼贴(tiling)。
图16阐明了同时组装或顺序组装具有不同大小的珠的阵列设 计。
图17阐明了多芯片载体的设计。

本发明提供了一种具有半导体制造方法优点的平行加工方法 (parallel processing method)。另外，本发明所述方法很灵活，可以 满足不同数量和不同分析的要求。本发明组合了可以选择具有高特征 密度(high feature density)的阵列内容物的灵活性和平行(批次)阵 列组装的规模经济性。本发明提供了在基层上描绘的间隔中指定的位 置组装可选择组合物的随机编码的、载体展示的探针阵列的方法，所 述基层因而可以被分成多个具有载体展示探针阵列的芯片。另一个实 施方案中，来自一或多个基层的分割的芯片(没有载体展示探针)与 所需种类的载体展示探针接触以形成具有所需阵列的芯片。本发明通 过组合从具有不同种类载体展示探针的基层制备的芯片提供了多芯 片阵列。本发明还描述了设计基层和展示载体如化学标记的微粒的芯 片以在针对多种靶分析物的生物测试和分析中最优化芯片展示微粒 阵列，所述靶分析物包括生物分子如核酸、蛋白质、细胞等。
生产本发明生物芯片的方法包含图案化(pattern)一个基层以形 成多个芯片区域，刻划(delineate)芯片区域间的分隔边界，在所述 基层表面上组装至少一个包含生物功能化的、任意编码珠的珠阵列， 及分割所述芯片区域以形成单独的生物芯片。如上所述，分割可以在 芯片表面珠阵列组装前完成。(本文中，术语“生物芯片”指具有生物 分子附着其表面上的芯片，例如用于生物分析中。)生物分子的非限 制性实例包括寡核苷酸、核酸片段、蛋白质、多肽、配体、受体、抗 原、抗体和生物结合对的各个成员。而且，术语“分割”(singulate或 singulation)指通过破坏基层或含有多个芯片的基层亚单位上的各个 芯片区域间的连接而获得芯片的方法。而且，术语“功能化”及“生物 功能化”指生物分子(例如分子探针)结合基层，包括附着于珠表面 的方法。
本发明还提供了制造包含多种分子探针的分析装置的方法。所述 方法包含从探针文库中选择分子探针并将其附于多种珠上以形成一 个珠亚群(bead sub-population)。所述珠亚群被附于一个含有芯片的 基层的主要表面上，所述芯片具有鉴别来源晶片的可解码标记。所述 晶片然后被分割以生产多种生物芯片。对包含不同分子探针的至少一 种其它珠亚群重复所述过程。所得生物芯片于是组装形成一个生物阵 列。
本发明另一方面提供了按照本发明所述方法制备的分析装置。本 发明的装置包括被分割以限定分隔的芯片区域的基层。这样的基层任 选地可以进一步图案化和分割以限定约束(restrain)一或多个载体如 珠的亚区域。
另一个实施方案中，本发明包含被分割的和任意图案化的基层， 其进一步包含一或多个种类的检测靶分析物的载体探针。
上述分割(fractionation)晶片形成的分割的、具有或不具有载体 探针阵列的芯片也是本发明的一个实施方案。优选地，所述芯片包含 一个载体探针阵列。
本发明还包括检测一或多种靶分析物的分析装置。本发明这样的 分析装置包含一或多个生物芯片，所述生物芯片包含一个适于检测一 或多种所需靶分析物的功能化的珠阵列。在一个优选的实施方案中， 多个不同生物芯片被附于一个载体以提供检测不同靶分析物的能力。
本发明的另一方面提供了一个进行生物分析的方法，包含将多种 结合于一个载体的生物芯片与包含至少一种靶分析物的溶液接触，并 直接或间接检测所述分析物。所述多种生物芯片可以包含至少一个亚 群的、具有一个生物功能化阵列的生物芯片。任意地，所述多种生物 芯片可以包含至少两个亚群的生物芯片，其中不同亚群的生物芯片具 有不同大小或不同的珠阵列几何学。
本发明的另一个方面提供了一个使用上述分析装置进行分析的 方法。所述方法包含将所述分析装置的生物芯片阵列暴露于一种含有 至少一种靶分析物的溶液并检测所述反应产物。
本发明的另一方面提供了一种制造生物芯片载体的方法，包含将 具有至少一种亲水主要表面的固体基层用一种用于空间限定生物芯 片阵列的图案化的疏水层覆盖。
本发明还提供了一种在半导体基层表面组装珠阵列的方法，包含 将一个图案化的电介质膜置于所述半导体基层的表面，其中所述电介 质膜在基层表面形成边界，并且将溶液中的珠加入指定为珠阵列的基 层区域中，其中所述区域是由所述边界限定的。
本发明的另一方面提供了一种直接将珠沉积在半导体基层表面 以形成珠阵列的方法，所述方法包含将珠溶液加入到图案化的半导体 基层的表面，所述基层含有容纳所述珠的结构并且机械地搅动所述溶 液以诱导所述珠沉降在该结构中。
本发明的另一方面提供了一种珠阵列，包含用一种可移除的包被 物保护生物芯片上的珠阵列。其中，珠阵列包含多种具有表面附着分 子探针的珠，并且所述包被物具有对珠表面上的分子探针是非反应性 的性质。
本发明还提供了在制造生物芯片过程中进行质量控制的方法。该 方法包含任意地编码生物功能化的珠，将含有容纳珠的凹进的、图案 化的基层暴露于含有珠的溶液，并且任意地将所述珠成像以保证所述 凹进被充分占据(occupy)。
发明详述
本发明提供了设计和生产所需组合物和布图的、包含化学或生物 实体如生物分子如核酸和蛋白质的阵列的组合物和方法。特别地，本 发明所述方法组合了阵列内容物和高特征密度的实时(real-time)选 择的灵活性和在描绘的晶片间隔(“芯片”)的指定位置组装可选择组 合物的随机编码的、载体展示探针阵列多样性的平行加工的规模经济 性。本发明还包括了形成这样芯片的位置和组合物编码阵列的方法。 进而，本发明提供了在涉及生物分子和细胞的生物测试和分析中最优 化的固体载体如标记微粒(“珠”)和标记芯片(“贴片(tile)”)的晶 片和芯片设计。
本发明提供了制造高单位密度微粒阵列的方法和过程，所述微粒 是生物学或化学功能化的。这样的阵列可以以可调数量、灵活的形式 和用预先选择的组合物生产。本发明的方法和过程可以以批次和平行 的形式进行。特别地，本发明涉及在一或多个晶片上制造这样的微粒 阵列，所以特异晶片的一部分或全部展示一或多个这样的具有预先选 择的组合物和功能性的微粒阵列。本发明还涉及封装多芯片形式的所 得微粒阵列。
本发明提供了具有依赖于阵列最终用途的组合物的阵列。可以制 造含有大约一个珠到几百万个珠的阵列。通常，所述阵列将包含一到 十亿或更多，这依赖于珠和基层的大小以及阵列的最终用途。高特征 密度阵列的优选范围是从大约1000000000(十亿)到1个珠/mm2， 更优选1000000到100个珠/mm2，最优选100000到1000珠/mm2。
功能化本发明的微粒以包括化学或生物学实体，如DNA、RNA 和蛋白质。依赖于感兴趣的应用可以选择这些实体以提供选择阵列内 容物的灵活性。另外，因为这样的微粒阵列具有高特征密度，其可以 被设计以最优化用于进行感兴趣的生物分析的阵列。这样的阵列例如 是PCT/US01/20179和US Patent No.6251691所揭示的，在此其全文 并入参考。
本发明的全部过程的方法可以被分成4个大体类别，称为组装 前、组装、组装后和封装。这样的分类不是试图限制某种类别的某种 方法。如下进一步所述，图1a和1b特别阐明了本发明的方法。
I.组装前
组装前的方法包括进行芯片布图，按照这个布图制造晶片，任意 对晶片划线(scribe)，然后如果需要，进行清洗和检查。如图1a和 1b所述，分割(如下述)可以遵循组装的方法(图1a)或遵循晶片 制造的方法(图1b)。如果各个芯片得自一个晶片，所得芯片被分类 并且每个芯片可以如下述被标记以基于其功能性鉴定这样的芯片。
II.芯片布图
一个芯片布图示于图2。可以理解一个“芯片”可以是任意三维形 状的。每个芯片包含一个基层(例如，层1(L1))，其中组装生物功 能化珠以形成一个微粒阵列。许多类型的物质可以用作基层。适当的 物质具有某些所需的性质。这些性质可以分为机械(例如强度)、电 子(例如，具有可以修饰的边界阻抗(interfacial impedance))、光学 (例如，平面度、透明度、明确的光学吸收光谱、最小自发荧光、高 反射性)和化学(例如易于进行针对精确特征或针对沉积电介质层、 可以共价连接的表面反应性的过程)性质。适当基层的非限制性实例 包括半导体(例如，硅)、绝缘体(例如，兰宝石、云母和红宝石)、 陶瓷物质和聚合物(例如，MylarTM，KaptonTM和LuciteTM)。
某些实施方案中，基层可以是半导体晶片，如单晶半导体晶片， 其通常用于半导体装置工业中。其它实施方案中，基层可以是任意可 图案化的固体基层，其对用于芯片制造和生物分析中使用的试剂是惰 性的。这种基层的非限制性实例包括玻璃、塑料和聚合物。
图2阐明了具有矩形交联区域的芯片并且并非试图限制其它的 芯片几何学。图2中，L1代表中间层(尽管在L1两侧的层不是必需 的)。L1的凹进阵列A1是建立珠阵列的地方。凹进A1的形状不需 要是正方形。其它适当形状的非限制实例包括三角形、矩形、五边形、 六边形和圆形。凹进阵列A1的功能之一是通过在晶片或芯片上建立 矩形结构以限制表面上珠的运动而辅助排列和保护珠。
任意地，所述芯片还可以含有一个第二层(L2)。层L2包含一个 图案化的绝缘电介质层(例如，二氧化硅)。一个可能图案的实例由 图3给出，其在芯片的中间示出了一个星形图案。阴影区域是电介质 物质并且白色区域是电介质被除去的区域。电介质层的厚度典型地， 但非限制的为100nm。如果对芯片垂直应用一个电场，由于L2图案， 在芯片表面附近形成了一个不均一的电势。所述电场可以如在此并入 参考的US Patent No.6251691所述的方法(该方法称为“LEAPS”)应 用于所述表面。使用LEAPS，当AC电势应用于基层时，施加于基 层表面的液体溶液中的珠置于变化的横向电场梯度中。这个电场梯度 驱动溶液中的珠，所以珠将在L1上建立表面结构的A1区域上积聚。 因而，L2的图案可以是任意可以引起珠在基层特定位置积聚的图案， 尽管其应该被那些比其它图案更有效地引起珠积聚的图案所识别。
电介质层L2的图案化和预先确定的设计促进了准永久性修饰珠 溶液-电介质-半导体形成的电解液-绝缘体-半导体(EIS)结构的电阻。 通过空间调节EIS阻抗，电极图案决定了电极附近的离子电流。依赖 于所应用的电场频率，珠或者被挑出，或者避开高离子电流区域。空 间图案化因此可以对珠阵列的放置和形状进行明确地外部控制。
任意地，包含珠阵列的芯片可能含有一个保护性的、通常覆盖表 面的钝化层。L3层的功能是作为芯片和包括珠悬浮液、生物分析样 品或洗涤芯片的化学物液体介质间的一个界面。因此，L3层应该对 化学物的腐蚀和周围环境是相对稳定的(robust)。其还应该保护附于 珠的功能性探针免于在珠阵列组装过程中受静电力的破坏。一些实施 方案中，L3层还在珠阵列组装中将珠粘附到芯片表面减到最小。L3 层优选对生物样品是惰性的，并且优选在与用于生物分析中荧光检测 时相同波长范围内是非荧光的。另外，它的存在不应该使芯片表面附 近电场的分布产生变化，该变化将阻止将LEAPS用于珠组装。作为 实例，L3层可以是具有大约40到大约100A厚度的LPCVD(低压化 学气相沉积)氮化硅薄层。
L3层还可以通过化学处理被工程化以改变表面特性。例如，氮 化硅表面可以被氧化以产生SiOx(即SiO2和/或亚化学计量的氧化硅) 或氧氮化硅(SiOxNy)，这两者都是亲水的，而且促进分散水性样品。 其它实施方案中，表面SiOx或SiOxNy可以进一步用硅烷醇基团功能 化以产生一个疏水表面。
最后，每个芯片的背部可以用一种金属或金属合金包被以进行电 接触(优选欧姆接触)。例如，如果芯片是硅基层制成的，芯片的背 部可以用薄铬粘附层和一较厚的金层包被，使用半导体工业的常规方 法进行。尽管金包被对大多数化学物是惰性的，而且具有高传导性， 然而如果与其它制造方法化学相容，也可使用其它欧姆接触包被物。 非限制实例包括一氮化钛/钨和钛钨/钨。芯片在分割之前或之后可以 用金属或金属合金包被。
任意地，芯片的一侧和/或其平行相对侧(parallel opposite side) 可以用一种磁性反应性物质包被。这可以通过使用常规组装方法在芯 片磁珠的一侧或两侧组装磁珠完成。可以使用2001年12月28日申 请的US Serial No.10/032657所述方法，其并入参考。在组装之前， 所述磁性反应性物质可以被功能化以提供额外的化学和生物学功能 性。或者，芯片的所有侧面可通过使用本领域已知的方法被芯片载体 上随机吸收珠编码。阵列的构型提供了一个鉴定所述芯片的小型化的 标记(“芯片ID”)以及晶片来源(“晶片ID”)。每个芯片ID得自数 字S，其表示一个随机编码的L位置阵列的可区分的构型，通过以下 方式给出，其中r(k)(不可区分的)微粒的n(无序的)样品，1≤k≤n， 可以在L位置中分布：
S(L；n；r(k)，1≤k≤n)＝L！/[r(1)！r(2)！...r(k)！...r(n)！] 表明大量可能组合是L＝16的阵列，由n＝4可区分的珠类型组成， 每个类型出现4次(r(1)＝...r(4)＝4)，可以展示S(16；4；r (k)＝4；1≤k≤4)＝16！/[(4！)(4！)(4！)(4！)]，或者大约六千 三百万可区分的构型。
使用随机编码的阵列产生许多标记T时，其中T＜＜S，对许多实 际应用而言，一个大小为S的大的构型空间被取样以减少重复的机 会。使用随机编码珠阵列构建标记的一个特别的优点是通过本发明的 方法，它们易于以小型化形式和在一步方法中大量地廉价产生。芯片 ID的随机编码的珠阵列形式易于构建以共享共同子域(subfield)或 子码(subcode)，其可以用于确定两个或更多个芯片是否来自于相同 的晶片。例如，如果总共n个珠类型用于在N个晶片上产生芯片ID， p个类型可以被保留，其中p＜n，而且选择的p使2p＞N。于是构建了 只含有剩余的n-p珠类型的晶片特异子码。例如，给定n＝16珠类型 去构建含有鉴定来自N＝100的晶片之一的每个芯片子码的芯片ID， p＝7珠类型可以保留以构建7位数的二进制码以通过一直到7个保 留的珠类型的缺少来鉴定100个晶片中的每个晶片。例如，组中一个 晶片缺少所用7个保留类型，另一个7缺少一个保留类型。编码珠是 功能化的并且在其表面携带探针分子。编码磁性颗粒还可以被磁化及 可以显示化学和生物学功能性。
一个制造的芯片实例示于图4。基层是Si(100)，具有电阻系数 1.5-4欧姆-cm的n-类型掺磷晶片。芯片是边长1.75mm，厚度为0.5mm 的正方形。L2层是1000A的热生长二氧化硅，在中间具有12-触点 星开口。该星的尺度如图4所示。芯片的中心有一个包含68行和59 列的紧密充满的六边形凹进阵列。所述六边形凹进的尺度示于图4。 L3层是60A厚的LPCVD氮化硅层，其覆盖了全部芯片，除了六边 形凹进的侧壁和底部，那里只有具有天然氧化硅的裸露硅。
图5a和5b阐明了适于限制珠运动的其它结构的非限制性实例。 H1是具有直侧壁的保留单珠的凹进或洞穴。H2是可以容纳一个珠的 反向金字塔形凹进。H3是限制一个珠的一组柱子。Hx是可以容纳多 个珠的凹进。上图(图5a)示出了结构的俯视图，而下图(图5b) 示出了横截面视图。一个实施方案中，使用了一个只容纳一个珠的直 侧壁间隔(compartment)H1。这个结构用于在液体介质中限制珠。 图5阴影区域是基层物质而白色区域是空的空间。间隔形状不限于方 形；例如一个金字塔形凹进H2可以用为容纳一个珠的间隔。进而， 尽管凹进的底部优选平坦的，在某些实施方案中这不是必需的。
图6示出了阵列结构的实例。A1和A2是矩形凹进阵列。A3是 六边形凹进阵列。可以在芯片或晶片上制造多种结构以在芯片或晶片 表面形成一个阵列或多个阵列。这些结构可以是相同或者不同类型的 结构和/或不同大小的结构可以共存。图6中阐明了3个说明性实施 方案。图中，阴影区域是凹进。非阴影区域是原始基层表面(其覆盖 有一个薄膜)。排列A1是方形凹进的正则笛卡尔阵列(regular Cartesian array)。排列A2是方形凹进的交互棋盘阵列(alternating checkerboard array)。排列A3是六边形凹进的阵列。尽管本发明的阵 列非限于正则阵列(regular array)，但正则阵列方便阐明反应结果。
当然，芯片中阵列的位置不限于中心。例如，阵列可以位于一个 角，如图10所示。另外，一个芯片上可以存在一个以上的阵列。例 如，在一个芯片上可以制造4个阵列，如图10所示。一些实施方案 中，将不同组的珠加入到芯片上4个阵列的每一个中。在一个大规模 过程中完成这个珠分布的一种方法是使用在一个时间只暴露每个芯 片上一个阵列的掩蔽物(mask)。将不同组的珠加入被暴露的阵列。 该掩蔽物然后移动以暴露芯片上另一个阵列并重复这个过程。重复4 次后，每个芯片具有含有4个不同组的珠的4个阵列。
1.2晶片制造
可以使用几种方法在晶片上使用晶片技术，如例如光刻法或材料 蚀刻术进行选择的芯片布图。选择的方法依赖于晶片设计要求。依赖 于不同的要求，晶片进行一或多个制造循环以产生一个充分加工的晶 片。这个过程中每个晶片循环包含，但非限于，3个步骤：(i)物质 生长和/或沉积；(ii)印刷(lithography)；和(iii)蚀刻。每个循环 通常产生一个结构层。依赖于晶片上的靶结构，可以循环制造一或多 层。
例如，物质生长或沉积可以通过SiO2在硅上的生长或电介质物 质如SiO2、Si3N4或其它物质的化学气相沉积，或者金属如铝、铬、 金、钛或其它金属的沉积完成。印刷步骤可以包括光刻法、电子束印 刷(e-beam lithography)、x-射线光刻或压印印刷法(imprint lithography)。蚀刻步骤可以包括去除掩蔽层如但非限于光致抗蚀剂限 定的某些区域内的一定量的物质。蚀刻方法的非限制性实例包括各向 异性蚀刻，如反应离子蚀刻、偏压晶面(crystal plane-biased)湿法化 学蚀刻或各向同性蚀刻，如各向同性湿法化学蚀刻、气相蚀刻或等离 子体蚀刻。
1.3划片
为有效进行功能化，晶片加工过程后进行芯片区域刻划，以便芯 片区域适于进行批次平行加工。为此，本发明优选刻划晶片以刻划区 域，以便随后的分割可以将其分为单独的芯片。本发明的其它实施方 案中，使用不需要划片的技术分隔芯片。划线的目的是产生折断线以 便于在晶片分割步骤中分离各个芯片而不损伤或破坏各个芯片。应注 意尽管划线是要被折断的，但其足够坚固以便在随后的加工步骤中不 损坏芯片。例如，可以使用划片机械(例如，DISCO，Dynatex，或 Loomis Industry)产生划线以使划线只是晶片厚度的一部分。然后在 垂直方向对划线应用滚子以进一步刻划各个芯片。可以使用钻石头的 划线器划片；一个硅晶片上芯片间的沟道(trench)可以通过使用湿 法化学的化学蚀刻产生，如例如在高温下的氢氧化钾/水溶液。晶片 也可以通过深反应离子蚀刻进行干法蚀刻以在芯片间产生明确的沟 道。
1.4晶片清洁和检查
划片步骤中，可能产生灰尘或颗粒。为保护晶片表面，本发明一 个实施方案中对晶片表面应用了一个保护层。例如，该层可以是胶带 (如果其不破坏晶片表面)、光致抗蚀剂包被物或其它有机包被物。 刻划后，通过从晶片上剥落(例如如果其是胶带)或将其溶解于适当 的溶剂中除去保护层。例如，光致抗蚀剂层可以通过将其溶剂于丙酮 中除去，然后用异丙醇冲洗晶片。如果在晶片上剩下了痕量的保护包 被物，可以使用更侵蚀性的清洗方法。一个实施方案中，晶片用氧等 离子体清洗以除去痕量的有机物。另一个实施方案中，晶片通过RCA 清洗方法清洗，RCA清洗方法是一个半导体工业中标准的清洗方法， 其包括加热到大约75℃的氢氧化铵/过氧化氢混合物。另一个实施方 案中，晶片在高温(大约60℃)用浓缩的硫酸和过氧化氢的混合物 清洗。
1.5芯片分组(grouping)
图7示出了芯片(C3)分组的实例。C1是晶片或便于进行如半 导体工业中所用的批次制造的任何基层单位；C2是C1的亚单位(可 以是整个C1)，其由所需数目的芯片组成；C3是一个芯片，其是生 物芯片的最小单位。通常，C2是进行芯片功能化的完整单位。功能 化后，C2分成单独的C3。
1.6珠功能化和组合(pooling)
此处所用术语“微球体”、“微粒”、“珠”和“颗粒”可互用。珠的组 合物包括但非限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯 酸类聚合物、顺磁物质、氧化钍凝胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交 联葡聚糖如琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、交联胶束和特佛隆(teflon)。 (见“Microsphere Detection Guide”，Bangs Laboratories，Fishers，IN.) 所述颗粒不需要是球形而且可以是多孔的。珠大小可以在纳米(例如， 100nm)到毫米(例如，1mm)的范围内，优选珠在大约0.2微米到 大约200微米范围内，更优选在大约0.5微米到大约5微米范围内。
本发明的一些实施方案中，在分布到晶片表面前将珠功能化，以 便每个珠具有一种连接到其表面的特异类型的生物探针。多种功能化 珠的方法适用于本发明。适当的方法部分取决于用于制造珠的物质的 性质。例如，使用本领域已知的方法，例如使用本领域已知的几种偶 联反应之一，通过附着结合试剂分子而功能化珠，这些分子包括核酸， 包括DNA(寡核苷酸)或RNA片段；肽或蛋白质；适合体(aptamers) 和小有机分子(G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)；L.Illum，P.D.E.Jones，Methods in Enzymology 112，67-84 (1985))。本发明的某些实施方案中，功能化的珠具有共价连接于珠 上的结合试剂分子(例如，DNA、RNA或蛋白质)。珠可以储存于含 有缓冲剂的大体积悬浮液中备用。功能化典型地需要一步或两步反 应，其可以使用标准液压控制机器人平行进行以共价附着任意数量的 所需功能到指定的珠上。可以使用芯-壳体系结构的珠，所述壳由一 薄层聚合物阻挡层组成，选择所述阻挡层的优选组合物；并且依照靶 分析的应用进行功能化。
本发明的一些实施方案中，所述珠用荧光染料进行颜色编码。针 对不同分析的应用，珠可以在其表面包含额外的染料标记的生物物 质。为检测珠和分析的信号，可以使用荧光显微镜成像。
珠文库通过制备不同组珠的亚群建立。每个珠亚群通过将探针文 库中的一种类型的分子探针附于多种珠上形成亚群来制备。每个珠亚 群通过具有荧光染料颜色编码或其它方法来区别。
II.组装
珠阵列通过在晶片或部分晶片的表面上保护珠来进行组装。保护 晶片表面上珠之前，通过用光学可区分的标记将珠化学编码或染色形 成珠文库，所述标记含有一或多种通过激发波长、发射波长、激发态 时间或发射强度进行光谱区分的荧光团染料。所述光学可区分的标记 可用于以特异比率染色珠，如例如Fulwyler，US Patent No.4717655 所揭示。染色还可以通过本领域技术人员已知的方法使颗粒溶胀进行 (Molday，Dreyer，Rembaum&Yen，J.Mol.Biol 64，75-88(1975)； L.Bangs，“Uniform Latex Particles”，Seragen Diagnostics，1984)。例 如，直至12种可区分的珠群可以通过用两种颜色溶胀(swelling)和 bulk染色进行编码，每个有4种强度水平，并且以4种摩尔比率混合。 国际申请No.PCT/US/98/10719揭示了外和内表面的组合颜色编码， 所述国际申请在此以其全文并入参考。United States Patent No.6327410也讨论了颜色编码，其在此以其全文并入参考。
当形成珠阵列时，有许多可能的方式保护芯片表面上的珠。晶片 制造步骤中形成的凹进提供了在基层表面上保留珠的间隔。保护(或 固定)珠的效力依赖于凹进相对于珠大小的尺寸。用于这个目的的凹 进的尺寸是凹进的深度是使用的珠直径的大约0.5到1.5倍。更优选 地，凹进的尺寸是当珠因为重力在凹进中稳定时，其最高点位于边缘 顶部之下，而且只存在足够空间容纳另一个珠1/3的体积。另外，虽 然优选凹进的大小大于珠的大小，在这个优选的实施方案中，每个凹 进应该不能容纳多于一个珠。而且，凹进的开口是略大于珠。例如， 示于图4的六边形阵列与具有3.2微米直径的珠符合。
可能不需要使用基层中的凹进来容纳珠。例如，可以在基层表面 排列多个柱以约束珠。一个可能的结构示于图5c的上图(俯视图) 和下图(透视图)。在这里，每个珠被环绕其的6个柱限制。柱的数 目不限于6个，也可以是3个或更多。进而，任何其它凸起的或凹下 的表面结构都可以使用，包括块、柱、隆起和凹痕。其它实施方案中， 可以使用可以容纳多于一个珠的大的凹进。例如，图5d示出了具有 直侧壁的大的凹进。上图的俯视图示出了所述大的凹进的水平尺寸是 一个珠直径的两倍以上。
如上述，用于组装微粒阵列的凹进的几何学和大小可以是各式各 样的。某些实施方案中，通过蚀刻形成孔后，通过沉积一层氧化硅或 聚合物改变了所述几何学和大小。例如，通过这个沉积方法可以形成 具有凹角侧壁轮廓的凹进。本文中，术语“凹角侧壁轮廓”指这样一种 凹进，表面凹进开口处的直径小于凹进底部的直径。通过这种方法形 成的具有凹角侧壁轮廓的凹进在加工和分析过程中具有更高的珠保 留比率。
通过共价键或范德华力、静电力、重力、磁性或其它力可以将珠 附于表面。也可以组合使用这些结合方法。一个实施方案中，可以通 过从描述的珠阵列组合物中的各个库中挑选指定编码的珠的样份 (aliquot)产生珠阵列。将“组合”(pooled)的悬浮液样份分散到选 定的基层上，如晶片刻划的间隔。
其它实施方案中，可以使用LEAPS制备珠阵列。这些实施方案 中，提供了基本上平行于第二平面电极的第一平面电极(“夹层”构 型)，这两个电极被含有电解液的缝隙分开。第一平面电极的表面或 内部通过界面(interfacial)图案方法进行图案化，如下述。将编码的 和功能化的珠导入缝隙中。当在缝隙中应用AC电压时，珠在第一电 极(例如，芯片或晶片)上形成一个随机编码的珠阵列。或者，使用 LEAPS可以在一个光感电极(例如，芯片或晶片)上形成珠阵列。 优选地，上述夹层构型也用于平面光感电极和另一个平面电极。而且， 两个电极被含有电解液的缝隙分开。将功能化的和编码的珠导入缝隙 中，当组合应用AC电压和光时，其在光感电极上形成一个阵列。
本发明使用的基层(例如，芯片或晶片)可以用LEAPS的界面 图案方法进行图案化，通过例如氧化物或其它电介质物质的图案化生 长以在应用AC电场下产生所需的阻抗梯度构型。或者，通过选择性 的向基层的内部区域中掺杂质可以获得图案化的基层。可以设计图案 以产生所需的AC场诱导的流体和相应的颗粒运输的构型。通过使用 半导体加工技术可以在一个晶片上图案化基层。另外，通过沉积一可 UV图案化、透光聚合物的薄膜对基层进行间隔，使流体管道和间隔 的所需布图附于基层以在一或多个不连续间隔中限制流体，因而在给 定基层上容纳多个样品。
例如，空间编码可以在阵列组装过程中在单液相中完成，例如， 使用LEAPS以响应改变的电场和/或投影到基层上的光图案而以任何 所需的构型组装平面珠阵列。LEAPS在硅芯片和调节介导阵列组装 的电流体动力的溶液间产生界面阻抗的横向梯度。电学要求是适度 的：在两个平面电极间典型地为100m的流体缝隙间典型地应用低于 10Vpp的低AC电压。这个组装方法是快速的而且是光学编程地：在 电场下，几秒内形成含有数千珠的阵列。也可以在维持在间隔的芯片 表面的多流体相中产生多个亚阵列。或者，通过组装分隔的芯片为指 定的多芯片构型完成空间编码，每个芯片携带至少一个来自特异库的 随机编码阵列。
一个实施方案中，全文并入参考的PCT/US01/20179揭示的方法 (该方法称为“READ”)可以用来制备用于进行本发明的多元生物分 子分析的定制珠阵列。使用READ，通过应用分隔的批次加工制备阵 列以生产应用特异的基层(例如，晶片等级的芯片)和生产化学编码 和生物功能化的珠(例如，～108珠/1001悬浮液)。优选地，在阵列 组装前分别进行珠的质量控制(QC)，如确定形态和电学性质，后者 实例包括表面(“Z”)电势和表面导电性。另外，在导入到基层之前， 对悬浮液中的珠进行分析。这是为了最优化阵列条件，通常目的是最 大化阵列敏感性和特异性及最小化珠与珠间的差异。对基层，QC步 骤可以包括光学检查、椭圆光度法和电转移(electrical transport)测 量。
一旦化学编码和生物功能化的珠与基层(例如，芯片或晶片)组 合，所述LEAPS或另一种活性沉积方法可使在基层指定区域密集的 阵列快速组装。通过在相同流体相的组装，可以避免如点对点或芯片 对芯片可变性的问题而不需要重新整备(retool)或设计方法。而且， 这些方法的一致性可以产生珠不依赖于芯片的性质和阵列条件的最 优化。另外，多珠阵列可以在维持在相同芯片或晶片上的不连续流体 间隔中同时形成。一旦形成，这些多珠阵列可以用于多样品的并行加 工。LEAPS和微流体的整合产生了用于蛋白质和核酸平行分析的独 立的、小型化的、可光学编程的平台。
一旦制备了功能化的和编码的珠并与基层结合，珠上结合试剂与 分析物的结合作用可以在基层上组装随机编码的阵列之前或之后进 行。例如，珠阵列可以在分析后形成，随后可以获得阵列的分析图像 和解码图像。或者，珠可以通过物理或化学方式在一个阵列上组装和 固定以生产随机编码阵列。DC电压可以用于生产随机编码阵列。DC 电压，典型地为5-7V(对2-6μm范围内的珠和100-150μm大小的 缝隙)并且以“反偏压(reverse bias)”构型应用＜30s以便n-掺杂硅基 层形成阳极，该DC电压引起阵列压缩，促进阵列中邻近珠的接触并 同时引起珠向电极表面紧邻的高电场区域移动。珠可以通过范德华力 或从珠表面伸出来的“系链(tether)”，例如聚赖氨酸和链霉抗生物素 锚定在表面上。
珠组装后，检查芯片或晶片并通过荧光显微镜成像以获得解码 图。解码可以在以后用来鉴别每个单独珠的位置和功能性。
填满的阵列位置的百分比优选高于50％，更优选高于90％。为测 试凹进在基层表面保留珠的效力，将包含珠阵列的芯片置于水溶液中 并连续摇动3天。这个测试前后的图像对比显示所有测试芯片上超过 99％的珠保留在凹进中。
III.组装后
组装后过程中，珠阵列用保护性表面覆盖。覆盖珠的前后，包含 珠阵列的晶片被分割为一或多个珠芯片。
3.1保护微粒
本发明某些实施方案中，覆盖珠阵列区域的凝胶可以用于防止珠 移动。其它实施方案中，凹进底部和/或侧壁的化学功能性基团可以 用于将珠连接到表面。在珠沉积前，带电的聚合物也可以用于包被芯 片。选择覆盖聚合物的电荷与珠的相反，以便珠可以通过静电力附于 聚合物上。当一个珠位于带电聚合物包被的凹进中时，珠和凹进侧壁 及底部间的库仑引力保持珠在凹进中。这样，增加了加工和分析过程 中的珠保留比率。一些实施方案中，当珠被置于凹进中后，第二个带 电聚合物沉积在芯片表面。选择第二个聚合物的电荷与珠的相同，以 便没有聚合物沉积在珠上，但是中和了芯片的表面电荷。可以应用这 个技术的几个变体而使核心加工过程(core process)的改变最小。例 如，可以使用单一的聚电解质层，或者可以构建多层结构(具有交互 的正和负电聚合物层)以产生具有更均一和可控厚度的包被物。而且， 除了聚合物，可以使用单独的带电聚合物纳米颗粒或与带电聚合物组 合使用。也可以使用不带电的但低Tg(玻璃化转变温度)的聚合物 和/或纳米颗粒包被物提高珠与芯片表面的粘合。
3.2组装阵列的保护
可以使用可移除的包被物保护分割为生物芯片之前的晶片或分 割的生物芯片阵列上的生物功能化的珠。因此在储存生物芯片或晶片 时需要一种方法保护处于环境灰尘、污垢和其它污染物中的珠阵列。 本发明提供了保护生物芯片和晶片的包被物及制备这种包被物的方 法。优选的实施方案中，包被物保护珠阵列的珠免受环境污染物污染 及防止珠表面的生物分子降解。而且，在进行生物分析之前，可以容 易地将包被物从生物芯片表面除去。
某些实施方案中，包被物包含惰性、非还原糖，例如海藻糖，其 不与反应性化学部分如肽和蛋白质中的氨基相互作用，并因此防止在 使用其它赋形剂干燥时普遍的降解或聚集。
其它实施方案中，可以使用一种水凝胶(例如，琼脂糖水凝胶) 防止储存过程中的污染、脱水及物理损伤。进行生物分析之前，可以 将水凝胶从基层表面剥落。剥落作用不仅移除了水凝胶，也清洁了不 位于凹进或其它保留结构限定的阵列位置中的任何多余珠的表面。这 些多余的、嵌于水凝胶中的珠可以被回收以进一步使用。
3.3芯片分割
功能化后，分割芯片组(晶片或晶片的亚单位)。如果已将晶片 划线，则通过断裂芯片间的连接进行分割。这可以通过在晶片背面将 一滚子以垂直方向延划线滚动完成，与美国专利No.3790051所述方 法一致。或者，通过其它方法如使用Dynatex InternationalTM制造的 GST Scriber/Breaker完成分割。通过这种方法获得的各个芯片准备封 装。除了此处所述的分割方法，也可以使用任何其它分割方法例如激 光切割以达到本发明的目的。
一些实施方案中，在生物功能化之前，进行晶片或亚单位的分割。 各个芯片然后进行相同的生物功能化或通过将芯片亚群暴露于不同 生物活性基团进行生物功能化。
IV.封装
使用本发明的方法，通过组装在编码珠上展示的探针分子的随机 编码阵列可以生产多种芯片。切自一个唯一鉴别的晶片的每个芯片可 以含有一或多个随机编码珠阵列。本发明的这个随机组装的方法涵盖 了一个实施方案，其中含有随机编码阵列芯片上的珠展示探针是在选 自多种晶片的标记芯片上展示的大的探针文库中的成员。不同晶片的 芯片可以被选择及组装以形成组合(pooled)芯片组。优选地，芯片 展示鉴别晶片来源的解码标记。通过在一个平面表面随机组装可以形 成编码芯片的阵列，该方法又称为随机拼贴，如图15d所述。随机拼 贴指组装一组编码芯片为平面排列或阵列的方法，以便可以光学检查 组件或阵列中的每个芯片或每个芯片的一部分。
从珠阵列水平到芯片阵列水平的随机组装的层次规模提供了快 速产生大的定制组合物和高特征密度的探针组阵列的灵活性。通过本 领域已知的分析方法，这样的阵列可用于展示一大组用于基因表达谱 (gene expression profiling)或用于DNA的甲基化谱的探针。另外， 当需要暴露多个探针阵列于不同的反应时，如下述将多种芯片附于单 一支持物的随机拼贴方法提供了进行本领域已知的组合(pooling)和 去卷积策略的快速而灵活的新方法。例如，展示部分重叠探针组的阵 列易于通过适当的构建和芯片选择产生。
组装本发明的珠阵列之后，晶片分割以可以操纵各个标记芯片。 随机拼贴时，选自一或多个晶片的标记芯片置于一个表面上(优选一 个平坦基层的表面)，其上芯片可以移动以形成一个相应于所需布图 的多芯片组装。为促进紧密封装，可以设计芯片为显示凸起对称形状 如方形、三角形或六边形。为减小邻近芯片上珠阵列间的距离，可以 设计芯片显示联锁形状(图14c)。
滑动(sliding)组装
这个实施方案中，多个分割的晶片置于一个共用的大基层上，该 基层具有展示朝下的探针阵列的侧面。优选的实施方案中，使探针阵 列凹进以防止与基层直接接触。自每个晶片中随机选择一或多个芯 片，以相似方式在一个面上滑动小片(coins)，通过将芯片滑动到指 定组装区域以形成一个芯片阵列。推广这个方法到如图8所示的行列 操纵。这个实施方案中，通过用于半导体检查的标准光学和机器视觉 仪器可以监视和记录拼贴过程。这个仪器可以用于追踪自芯片来源的 各个晶片到其分别的最终位置，可以直接进行组装的芯片阵列的位置 编码和解码。完成组装过程之后，将一个多芯片载体(如述)与在组 装区域排列的一或多个芯片阵列排列，然后放下并结合芯片以形成一 个多芯片组装。为促进结合，可以将载体用粘合剂预先包被或可以用 磁性物质包被，如果芯片通过所述方法被磁化。
这个滑动组装方法优选使用一个机械触点，如本领域已知的可以 提起和操纵各个芯片的抽吸装置。或者，使用可以自每个晶片中选择 一或多个芯片的磁性笔操纵可磁化芯片。通过电镀或无电镀沉积的方 法，通过沉积磁性物质如镍或镍铁合金(“透磁合金”)将晶片(和其 上含有的芯片)磁化，如本领域已知的对半导体和陶瓷的例子。或者， 可以导入顺磁性颗粒，作为展示探针分子的随机编码微粒阵列的一部 分或作为单独的特征，例如以在每个芯片指定部分组装的阵列的形 式。可磁化颗粒的阵列可以位于含有随机编码探针阵列的芯片一侧或 另一侧。
滑动组装通常涉及操纵各个芯片并且当芯片阵列的组成芯片数 目增加时变得十分麻烦。如果芯片小，展示例如100μm或更小的线 性尺寸，情况就更遭。例如，陶瓷基层在这个尺寸上可以形成立方体 或近立方体形状的小芯片。这时，各个芯片最好通过本领域已知的、 操纵相似尺寸的玻璃或聚合物微粒的方法操纵。
集体组装(Collective Assembly)
这个实施方案中，切自各个晶片的芯片储存于使用惰性存储缓冲 液如含有痕量叠氮化物的高纯水的大体积悬浮液中。通过机械或磁性 搅拌悬浮芯片。通过分散和混合选择的悬浮液形成芯片组合(pools)。 任意地，可以加入痕量的葡萄糖或其它高溶性分子量成分到悬浮液中 以提高粘性因而改善流体性质。通过使用注射器、移液管或毛细管将 分散的悬浮液加样沉积在一个平面基层上以完成随机沉积或通过使 用本领域已知的连续方法生产包括那些引起流动和毛细力作用的胶 体颗粒的阵列(Adachi，E等，Langmuir，Vol.11，1057-1060(1995)； Science，Vol.276，233-235(1997))。
随机沉积时，可以给基层提供一个模板以指导各个芯片的定位及 在基层指定位置上含有各个芯片。一个实施方案中，通过插入一个网 到悬浮液中并收回其而从混合的悬浮液中收集芯片，所以各个芯片被 提起(lifted)或舀出(scoop out)。优选地，在“持续增加(racked up)” 为一个紧密封装构型之前，芯片，特别是置于平的、无特征基层上的 芯片与其它芯片充分分离以防止部分重叠及堆叠。分离，例如通过滑 动组织(见上)或通过机械搅动完成，其具有在灵活基层如聚合物基 层上引起“磁鼓模式(drum modes)”的优点，如本领域实践中的那样。
一个优选实施方案中，芯片通过机械方式“持续增加”，例如通过 将芯片置于一种流体中，该流体流向平行于一个夹层流体池 (sandwich flow cell)中的基层表面，其中芯片被推向流体池远端的 障碍物。
优选地，随机组装芯片被定向以暴露展示随机编码探针阵列的活 性侧。当活性侧未被暴露时，芯片必须倒转。倒转芯片为优选的方向 通过机械搅动和结合正确定向的(用热或光激活的结合粘合剂包被 的)芯片循环完成。或者，机械搅动过程中的倒转通过将质心移向芯 片非所需一侧辅助，例如通过镀金属法。在存在垂直于基层表面的磁 场梯度时可以沉积镀金属的芯片，以在高粘度介质中提供足够缓慢的 沉降以使芯片在接近表面时采用正确的定向。
也可以通过产生三维形状促进倒转，如金字塔形状，金字塔尖的 朝向远离活性表面，如标准半导体蚀刻方法所产生的。
芯片可以封装在单一或多个芯片封装中。在多芯片封装中，含有 不同生物探针阵列的芯片置于相同的载体上。图8示出了封装在一起 的4个芯片形成一个方形结合芯片或一个线性结合芯片。这4个芯片 可以粘在一个共用的载体上，如载玻片，或者通过其它方法将它们附 于载体上，如在芯片背面粘贴磁性物质以便它们粘到磁性载体上。芯 片处理不限于使用收集和放置(pick-and-place)设备。分割后，芯片 可以以行或列分组。芯片的这些行和列可以通过限制条(confinement bars)移动。图9示出了通过选择性排列不同的芯片行获得芯片的不 同组合。
图10示出了另一种封装设计。在角上具有阵列的4个芯片组合 形成一个在中间具有较大阵列的芯片。如果4个芯片上的阵列包含不 同的功能性探针，大阵列将含有4倍于单个芯片含有的信息量。
通过组装珠上展示的探针的随机编码阵列可以生产多种芯片。每 种芯片可能包括一或多种随机编码珠阵列并可能从一个唯一鉴别的 晶片上切割。另一个实施方案中，含有珠上探针随机编码阵列的芯片 可以是探针文库的成员。这个实施方案中，多芯片阵列的每个芯片展 示了鉴别来源晶片的可解码标记。
在载玻片的玻璃表面或其它相似表面可以用于制造多芯片载体。 为制备作为载体的载玻片，于是可以应用一种包被物，如特佛隆TM， 以产生环状开口或孔(即，没有任意特佛隆覆盖的玻璃区域)。每个 孔是直径为6.5mm的圆。一或多个芯片可以结合到一个孔中的玻璃 表面。一种典型地载玻片为25×75mm及1mm厚，具有一个为2×5 的孔阵列。典型芯片大小为1.75×1.75mm，直至4个芯片可以结合到 每个孔中的玻璃表面上。结合到载体前，同孔中的每个芯片可以具有 不同的组装珠组。例如，如果每个芯片具有含有39种珠组的阵列， 具有4个不同芯片的孔将具有总共为4×39＝156种珠。另一方面，对 于较大的芯片(例如，4.5×4.5mm平方)，一个孔完全被一个芯片占 据。对于此处所述的孔尺寸，每个孔可以保留多到40μl的液体(通 常是水溶液)。典型地，将20μl体积的样品溶液加入每个孔中进行生 物反应，以便每个芯片完全被样品溶液覆盖。因为孔外部的特佛隆包 被是疏水的，所以水溶液样品不会洒出。可以设计载体载玻片的形式 以适应某些应用。例如，载片上一排8个孔可以用于分析8个样品。 而且，一个4×8孔阵列可以用于分析32个样品。同样，在一个载片 上排列更多的孔(例如，96384和1536)可以分析更多的样品。
在一个可移动的芯片载体的某些实施方案中，结合芯片到一个基 层如玻璃、不锈钢、塑料物质、硅或陶瓷物质上。整个载体单位可移 动并且在加工过程中可以转移(transport)以暴露芯片于不同的反应 介质，如反应槽、洗脱槽和信号阅读器(signal reading stage)。
其它实施方案中，可移动芯片载体包含一个槽和其上芯片被保护 了的槽。通过将可移动芯片载体内的芯片覆盖，可以将转移过程中的 污染最小化。某些实施方案中，可移动芯片载体的槽还作为一种加工 环境。如果需要，针对不同目的如进行生物分析或清洗芯片的反应气 体或液体溶液可以加入槽中，随后可以排除(evacuated)。另外，可 移动芯片载体可以具有改变槽热力学性质的手段(means)，如槽压力 或温度。
V.分析
本发明的包含珠阵列的生物芯片可用于进行多种生物分析和化 学分析。一旦组装，本发明生物芯片上的珠阵列可以被成像以记录分 析信号并可以被解码以鉴别与阵列中各个珠相关联的探针结合的靶 分析物。珠阵列提供了可以用于阅读多步生物分析或化学分析序列结 果的系统。另外，由于存在多种涉及包含不同靶分析物阵列的探针， 可以同时检测多个靶分析物。除了提供检测特异靶分析物存在与否的 能力，还发现本发明的珠阵列可以用于确定结合探针的靶分析物的亲 和常数。因此，生物芯片具有检测例如，生物分子如TNF-α和IL-6 的广泛应用。其它非限制应用包括通过多态分析的基因定型 (genotyping)；基因表达分析；细胞因子表达的数量多元谱 (quantitative multiplexed profiling)，同一流体样品中的基因和基因产 物的分析；亲和性指纹分析；及反应动力学的多元(multiplexed)分 析。可以使用本发明的生物芯片进行其它分析和分析确定，如美国专 利No.6327410所述，其并入参考。
实施例
本发明通过下述实施例可以更好理解。然而，本领域技术人员可 以容易地理解此处讨论的特异方法和结果仅仅是说明其后权利要求 书所述的本发明。
实施例1：晶片制造和设计包含珠阵列的芯片
如图4所示的包含珠阵列的芯片制造过程在图11中描述。基层 是100mm直径、0.5mm厚的硅晶片，具有(100)掺杂n-型磷的晶 体取向。这些晶片的适当阻抗范围是1.5-4Ω-cm。通常晶片以多至 25个进行批次制造。第一步包含SiO2生长。首先晶片通过RCA清洗 方法清洗，包含步骤：(1)将晶片在体积比为1∶1∶5的NH4OH∶ H2O2(30％)∶H2O的混合液中在75℃浸泡10分钟；(2)使用18MΩ-cm 的水用级联水批次清洗法(cascade water batch cleaning)冲洗；(3) 将晶片在体积比为1∶1∶5的HCI(36％)∶H2O2(30％)∶H2O混合 液中在75℃浸泡10分钟；及(4)用级联流动水批次清洗法(cascade flow waterbatch cleaning)冲洗直至批次中的水至少是16MΩ-cm。晶 片旋转干燥，然后置于水平炉进行SiO2生长。晶片垂直置于一个石 英舟(quartz boat)并在1050℃及760torr压力下导入具有O2+HCl(4％) 的氧化炉中。氧化时间是34分钟。通过这种方法获得了一个一致为 1000A的SiO2层，如使用椭圆光度法证实(折射率：n＝1.46，厚度 变化(thickness variation)：＜5％)。
具有SiO2的晶片用光致抗蚀剂(Shipley 1813)在4000rpm转速 下(旋转30秒)旋转包被，然后在115℃在一个热平板上烘烤60秒 以除去溶剂。晶片然后在使用Hybrid Technology Group’s(HTG)系 统3HRcontact/接近式曝光机(proximity mask aligner)的接触印刷步 骤中暴露于UV光(365-405nm)。UV暴露后，晶片通过AZ300 MIF 显影器(developer)显影60秒，在DI水中冲洗并用压缩干燥氮气流 吹干。然后将晶片没于缓冲的氧化物蚀刻剂中(6∶1的氟化铵和50％ 氟化氢水溶液的混合液)2分钟以在暴露区域蚀刻SiO2(图11中的 星号)。然后将晶片用DI水冲洗，然后在60℃浸泡在1165 Microposit 光致抗蚀剂去除剂中60分钟以除去光致抗蚀剂。然后将晶片在DI 水中冲洗并用干燥压缩氮气吹干。整个这个方法产生了具有图案化氧 化物层的晶片。
氧化物图案化步骤之后，将晶片通过RCA方法清洗，然后置于 水平炉上进行氮化硅(Si3N4)沉积。可以使用两种氮化硅：标准和 低应激(low stress)氮化物。进行沉积的条件如下：LPCVD氮化物 (标准)，压力＝200mtorr，温度＝800℃，SiCl2H2＝30sccm，NH3＝ 90sccm；LPCVD氮化物(低应激)：压力＝150mtorr，温度＝850℃， SiCl2H2＝47sccm，NH3＝10sccm。沉积2到3分钟后，Si3N4膜厚度 在60-90A之间。
下一步是制造阵列结构。晶片用光致抗蚀剂OCG 12i在4000rpm 转速下(旋转时间30秒)旋转包被，然后在90℃的热平板上烘烤60 秒以除去溶剂。将晶片暴露于UV光(365nm)并且使用GCA-6300 10x i-line步进器(Stepper)进行重复光蚀刻。暴露后，晶片在热平板上 在115℃烘烤90秒，然后通过AZ300 MIF显影器显影60秒，在DI 水中冲洗，并用压缩干燥的氮气流吹干。晶片在90℃烤箱中烘烤20 分钟。将晶片在Plasma Therm 72蚀刻仪中使用CF4气体反应离子蚀 刻进行蚀刻以除去暴露区域(阵列中的六边形特征)的氮化硅。然后 可以使用氧气反应离子蚀刻除去六边形特征上残留的聚合物。六边形 凹进通过深反应离子蚀刻(DRIE)使用Unaxis SLR 770 ICP Deep Silicon蚀刻仪(licensed Bosch Fluorine process)制造。调整该方法以 便用2-3分钟蚀刻出3.8微米深的凹进。深度控制在0.3微米以内。 蚀刻后，将晶片在65℃浸泡于1165 Microposit光致抗蚀剂去除剂中 60分钟以除去光致抗蚀剂。晶片在DI水中冲洗并用干燥压缩氮气吹 干。然后将晶片通过氧等离子体在GaSonics，Aura1000，Downstream 光致抗蚀剂剥离器中加工以除去DRIE过程中产生的六边形凹进中的 任何残留聚合物。然后将晶片用保护性光致抗蚀剂包被物(Shipley 1813，转速4000rpm，旋转时间30秒)旋转包被，然后在热平板上 在115℃烘烤60秒以除去溶剂。在背部用100A的铬作为粘附层包被 500A的金以将晶片售出。在使用氩离子阴极真空喷镀的包被过程之 前，剥落晶片背部的天然氧化硅层。
制造的晶片从表面切开以限定每个芯片(每个芯片的尺寸， 1.75×1.75mm平方)。伤口的深度是晶片厚度的2/3。切开后，通过将 其在60℃浸泡在1165Microposit光致抗蚀剂去除剂中60分钟以除去 光致抗蚀剂，然后在DI水中冲洗并用压缩干燥氮气流吹干。然后通 常将晶片在60℃浸泡于NanoStrip(浓缩的硫酸和过氧化氢的混合物) 2小时，然后在DI水中冲洗并用压缩干燥氮气流吹干。这些步骤后， 晶片备好以进行珠组装步骤。
珠组装后，可以除去未在凹进中被保护的额外的珠。除去未被保 护的珠的一种方法是用湿棉签擦拭芯片或晶片表面。另一种方法是使 用几乎平行于芯片或晶片表面的水流洗掉未被保护的珠。另一种方法 包含在表面生长一种凝胶而且随后剥落这种凝胶。
实施例2：功能化珠及形成珠阵列
颜色编码的、甲苯磺酰基功能化的3.2μm直径的珠用作固相载体 (solid phase carrier)。通过使用标准方法染色的颗粒产生几组可区分 的颜色编码(Bangs.L.B.，“Uniform Latex Particles”，Seragen Diagnostics Inc.，p.40)。染了色的珠用中性链亲和素(Neutravidin) (Pierce，Rockford，IL)，一种生物素结合蛋白质功能化以介导生物 素化探针或引物的固定。一个典型的小规模偶联反应中，200μl含有 1％珠的悬浮液用500μl 100mM的磷酸盐缓冲液/pH7.4(缓冲液A) 洗三次，并且在500μl这种缓冲液中重悬。加入20μl 5mg/ml的中性 链亲和素到珠悬浮液中后，在37℃反应过夜。然后用含有10mg/ml BSA的500μl PBS/pH7.4(缓冲液B)将偶联的珠洗一次，在500μl 该缓冲液中重悬并在37℃反应1小时以封闭珠表面未反应的位点。 封闭后，用缓冲液B将珠洗3次并存储于200μl该缓冲液中。
在偶联到珠的探针(用于检测靶分子)和引物(其可以用作随后 催化反应延伸杂交DNA靶的模板以鉴别反应的探针)的5’末端进行 生物素化；一个15碳的三甘醇接头插入到生物素和寡核苷酸之间以 最小化随后反应中表面固定的破坏性影响。对每个引物，使用50μl 珠悬浮液进行结合反应。珠用500μl 20mM的Tris/pH7.4，0.5M NaCl(缓冲液C)洗一次，并重悬于300μl该缓冲液中。将一种引物溶液 (2.5μl 100μM的溶液)加入珠悬浮液中并在室温反应30分钟。用 20mM Tris/pH7.4，150mM NaCl，0.01％triton将珠洗三次并存储于 20mM Tris/pH7.4，150mM NaCl中。
一个示例珠阵列组装如下。通过上述步骤获得的珠悬浮液用去离 子水(所用使用的水都是具有18MΩ-cm或更高阻抗的高纯并且无菌 的)洗5次，然后悬浮于0.01mM的TRIS Base+0.01％Triton x-100 水溶液中。悬浮液中珠含量是0.5％。将2μl珠悬浮液通过微量吸管 (micro-pipet)加到包含珠阵列的4.5mm方形芯片的表面。然后将芯 片进行LEAPS方法。计数电极(counter electrode)是包被有一层氧 化铟锡(ITO)的一块玻璃。芯片表面和ITO-包被玻璃间的缝隙是100 微米。AC电源如表1所示的顺序应用。
表1 AC施加顺序。电压是峰值至峰值振幅的一半。   步骤   时间   (分钟)   频率   (Hz)   电压   (±伏特)   功能   1   2   2000   3   AC on   2   2   1000   3   AC on   3   2   500   3   AC on   4   2   2000   3   AC on   5   2   500   3   AC on   6   2   2000   3   AC on   7   2   200   3   AC on   8   2   2000   3   AC on   9   2   200   3   AC on   10   0   200   0   AC stop
完成顺序后，星形图案范围区域内的珠浓缩在阵列区域。通过存 在星形图案诱导的流体(flow)图案辅助浓缩珠。等珠沉降15分钟 后，将装置慢慢浸泡在纯水中。将ITO玻璃包被物慢慢提起，并且慢 慢排干水以便芯片表面显现。这时，可以通过将芯片停留在室温一段 时间或通过将芯片在一个烤箱中在55℃烘烤5分钟将表面干燥。干 燥的芯片在纯水中浸泡15分钟，然后用湿的棉花签轻轻擦拭芯片表 面几次以除去未在阵列中的珠。随后用纯水冲洗芯片3次，然后通过 向其表面吹压缩氮气干燥。最后，通过荧光显微术检查芯片以保证在 阵列之外没有额外的珠。
实施例3：形成一个珠阵列
将珠浆直接散布在芯片上的阵列区域。用湿棉签(K1)轻轻地搅 动阵列表面的珠浆。K1的运动可以是圆形的、线性的或其它有意义 的方式，并且通常平行于芯片表面。搅动浆几次后，将珠移到阵列。 于是通过使用K1清洗芯片表面以擦除未在阵列中的额外的珠。这个 方法可以在从单个芯片到晶片规模的多芯片组装中按比例调整，并且 可以自动化。
一个形成珠阵列的加工步骤的实例如下。2微升的于100微升磷 酸盐缓冲盐溶液(也已知为PBS：150mM，NaCl；100mM，NaP， pH7.2)中的1％微粒(大约3.2微米直径)用于组装每个芯片上具有 4000个微孔的硅芯片(2.5×2.5mm)上的8个微粒阵列。使用以下步 骤：
(1)通过离心(14000g，1分钟)收集PBS中的微粒于1.5ml 的离心管中。可以使用其它收集手段。
(2)使用移液管(transfer pipet)通过吸取丢弃上清。
(3)重悬微粒于5微升于Tris pH7.5中的5％10mM甘油中。
(4)通过离心收集甘油溶液中的微粒。可以使用其它收集手段。
(5)从微粒沉淀中吸取甘油溶液。
(6)重悬沉淀于1微升5％甘油，10mM Tris，pH7.5中。
(7)将8个硅芯片置于贴在显微镜载玻片上的双面胶带上。
(8)将0.1微升体积的微粒悬浮液加到具有4000个微孔的区域 中的每个芯片上。
(9)用洗瓶中的水洗涤棉签。
(10)通过使用压缩空气将湿棉签吹干30秒。气流从棉签棉花 中除去了多余的水分。另外，空气还从表面吹走了一些纤维，使棉花 球更蓬松。
(11)由于在空气中珠悬浮液的蒸发和溶液中甘油的潮解性质， 完成步骤9和10后(大约2分钟)，步骤8的悬浮液中的水含量达到 平衡。因为提高的粘性，小滴更呈浆状。为组装微粒阵列，珠浆用湿 棉签的顶端以环形运动轻轻搅动几次。棉花球的松散纤维将珠送到表 面上的微孔中(图3)。
(12)微孔的颗粒占据通过使用荧光显微镜检查。如果占据不令 人满意，可以重复步骤11。
(13)通过使用棉签从芯片上轻轻擦除多余的颗粒。为消除表面 上多余的水分，棉签不挤压芯片。
(14)通过向芯片表面吹压缩氮气干燥芯片。
(15)通过这个方法制备组装的微粒可以用于分析或存储于4℃ 的溶液中备用。
这个实施例中，为直接在硅芯片上沉积微粒阵列，将微粒悬浮于 少量的5％甘油，10mM Tris pH7.5的溶液中。然而，当颗粒悬浮于其 它溶液中时，如果LEAPS用于组装珠，高溶液粘性或离子浓度可能 干扰LEAPS，(例如，在基层如图案化的或阐明的电极的指定区域上 组装颗粒)。因而，推荐悬浮液的离子浓度大约为1.0mM或更低，优 选在大约0.1mM到1.0mM之间。另外，推荐悬浮液的粘性为大约 100cp或更小。
另外，某些盐，如磷酸钠和氯化钠，在步骤11的过程中在升高 的浓度下可以形成晶体。这样的晶体可能干扰珠表面的生物分子。因 而，不建议在珠悬浮液中使用它们。
实施例4：直接沉积
本申请所述的直接沉积方法是在固体表面有效组装微粒阵列的 简单方法。例如，0.25微升体积的1％微粒溶液(10mg/ml，其相应 于168000个珠)足够在含有4000个微孔的硅芯片上以高于95％的占 据率组装阵列。换言之，悬浮液中2％的珠填在表面的微孔中。另外， 组装过程在具有中性pH、室温下的水溶液中进行。这些温和的条件 保证了当固定在颗粒上时，分子如DNA、RNA、肽和蛋白质的反应 性在组装中保持不变。这样，使用这个方法组装的微粒阵列与多种生 物化学分析相容。而且，可以在从单芯片组装到晶片规模的组装中按 比例调整这个组装方法，而且可以自动化以生产大量的微粒阵列。
直接沉积方法通过以下实施例进一步阐明。将2微升1％的微粒 溶液(微粒大约3.5微米的直径)加入到100微升磷酸盐缓冲盐溶液 (也已知为PBS：150mM，NaCl；100mM，NaP，pH7.2)中以在每 个芯片上具有4000个微孔的硅芯片(2.5×2.5mm)上形成8个微粒阵 列。步骤如下：
(1)通过离心(14000g，1分钟)收集PBS中的微粒于塑料离 心管(eppendorftube)中。可以使用其它收集手段。
(2)使用移液管通过吸取除去上清
(3)重悬颗粒于5微升于10mM Tris pH7.5的5％的甘油中。
(4)通过离心收集甘油溶液中的颗粒。可以使用其它收集手段。
(5)从颗粒沉淀中吸取甘油溶液。
(6)重悬沉淀于1微升5％甘油，10mM Tris，pH7.5的溶液中。
(7)将8个硅芯片置于贴在显微镜载玻片上的双面胶带上。
(8)将0.1微升颗粒悬浮液加到具有4000个微孔的区域上的各 个芯片中。
(9)用洗瓶中的水洗涤棉签。
(10)通过使用压缩空气吹干湿棉签30秒。气流从棉签上除去 了多余的水分。另外，气体也自表面吹走了一些纤维，使棉花球更蓬 松。
(11)由于在空气中珠悬浮液的蒸发和溶液中甘油的潮解性质， 完成步骤9和10后(1-2分钟)，步骤8的悬浮液中的水含量达到 平衡。因为提高的粘性，小滴变成了浆。为组装微粒阵列，珠浆用湿 棉签以圆形运动轻轻搅动几次。棉花球的松散纤维将珠送到表面上的 微孔中。
(12)通过使用荧光显微镜检查微孔的颗粒占据率。如果占据不 令人满意，重复步骤11。
(13)通过使用棉签从芯片上轻轻擦去多余的颗粒。为消除表面 上多余的水，棉签不挤压芯片。
(14)步骤13之后，组装的微粒阵列备好用于分析，或存储于 4℃的溶液中后用。
对使用直接沉积组装阵列，使用悬浮于少量5％甘油，10mM Tris pH7.5溶液中的微粒。使用浓缩的甘油(即高于5％)可以提高珠浆 的粘性以及芯片上小滴中溶液的特异重力(步骤11)。而且，这可以 包含组装效力。尽管用于直接沉积方法的溶液不限于10mM Tris， pH7.5，应注意到某些盐，如磷酸钠和氯化钠，易于在高浓度时形成 晶体，如步骤11。盐晶体不但降低孔中微粒的占据率，而且可能破 坏组装过程中表面上的分子。
还推荐在分析应用之前，在潮湿的槽中短期(例如30分钟)存 储芯片或包含芯片的晶片以使珠通过重力沉降在凹进中。离心结合到 玻璃载玻片上的组装阵列可以促进沉降过程。推荐的离心设置如下：
离心机：    Sorvall centrifuge model RT6000B
转子：      Sorvall swing bucket model H1000B
速度：      2000RPM
时间：      5分钟
操作事项：  在10℃冷却模式下设置离心机
            设置刹车为关闭模式
            在开始2分钟时缓慢将速度从0升高到2000，然后
            再在2000RPM离心5分钟。
            为此目的可以使用等同的设备和设置。
为进行显微镜检查，可以使用多种沉浸介质用于放置载玻片上的 芯片。一个实例是使用含有2.25M的盐酸四乙铵(tetrathylammonium chloride)，37.5mM Tris，pH8.0，25％甘油的放置介质。
实施例5：生物芯片阵列的平行组装
本发明提供了平行组装生物芯片阵列的方法。这个实施方案中， 来自不同晶片的芯片形成了生物芯片阵列。一个非限制性实例如图9 所述，其示出了4个不同晶片产生了4种芯片：A、B、C和D。芯 片的行或列可以以任意几何学组合以形成一个中间芯片矩阵 (intermediate chip matrix)。优选实施方案中，芯片具有规则几何学 形状(例如，方形或矩形)，并且相应的中间芯片矩阵也具有规则集 合形状。然后将行或列从中间芯片矩阵中提出，以便行或列包含不同 类型的芯片。依赖于应用，混合的行或列可以含有多于一个拷贝的某 种类型的生物芯片。这些实施方案中形成的混合的行和/或列可以整 合到生物芯片阵列中以进行生物分析。优选实施方案中，半导体芯片 处理设备用于组装中间芯片矩阵及提取混合的行或列。通过使用芯片 的长的行或列形成中间芯片矩阵，可能同时产生许多混合的行或列。 这样，可能大量产生混合的行或列。
实施例6：通过糖包被的生物芯片保护
使用标准方法在芯片上组装功能化的珠。组装后，清洗芯片表面， 在芯片(表面尺寸：1.75×1.75mm)上散布2-4μl于DI水中的1％海 藻糖溶液(α-D-吡喃葡糖-α-D-吡喃葡糖苷，一种天然产生的、形成玻 璃的二糖)并且在周围条件下干燥。干燥时，基层上形成玻璃膜并包 囊化组装的珠。尽管即使在高湿度条件下膜也是稳定的，但暴露于液 体水时膜也立即溶解。
为评价形成膜对功能化颗粒活性的影响，中性链亲和素功能化颗 粒在生物芯片上组装。一些生物芯片如上述用海藻糖溶液钝化并处于 正常的周围条件，而其它生物芯片不用海藻糖溶液包被而是在4℃存 储2周。发现生物包被芯片的生物活性与存储在4℃未包被生物芯片 的活性相似。
实施例7：在晶片清洗、存储和颗粒回收中作为多功能试剂的水 凝胶
可以应用琼脂糖水凝胶作为剥落试剂以从芯片上除去颗粒并可 以在以后回收颗粒。水凝胶还可以用作存储物质以防止晶片和颗粒降 解及灰尘。
在包含芯片的6英寸晶片上组装功能化的颗粒。为清洗留在表面 的颗粒，在55℃将1％的琼脂糖溶液(熔点95℃，凝胶化温度50℃) 倾倒在晶片上，并在周围条件下或在4℃下保持直至产生凝胶化。不 同厚度的凝胶，从微米到毫米，可以通过使用不同厚度的边条(spacer) 产生。边条在晶片边缘提供了一个障碍物以防止琼脂糖溶液流出边 缘。位于晶片表面而不是凹进中的珠嵌入凝胶中。当溶液完全固化后， 凝胶膜以及嵌入的珠可以容易地剥落下来。然后立即应用压缩氮气流 吹干少量残留在表面上的水。这样，保持晶片表面清洁。
为分析剥落过程对占据率的影响，以及琼脂糖凝胶膜对功能化颗 粒活性的影响，在芯片上组装颗粒，然后将芯片进行解码分析及扩展 (extension)分析。图12示出了剥落过程没有降低占据率(即没有 颗粒从凹进中被剥落)。相信凝胶溶液的粘性在保持孔中颗粒中起作 用。凝胶溶液粘性越高，凝胶化前溶液进入凹进的倾向越低，所以占 据率不太可能受到影响。芯片分析的SSP表明信号和CV是相当的(图 13ab)，表明凝胶不影响分析灵敏性。
琼脂糖凝胶是热可逆、物理交联的水凝胶。为颗粒回收目的，应 该使用具有极低熔点(m.p.＜50℃，凝胶化温度，8-17℃)的琼脂糖。 随后，在50-55℃可以再熔化琼脂糖凝胶，并可以回收嵌入的颗粒。 在这些条件下保持了颗粒上生物分子的生物学活性。
这样的亲水水凝胶不但可以用作剥落试剂，还可以作为存储试剂 以防止在存储和运输过程中颗粒/晶片的降解、灰尘和物理损坏。
实施例8：聚合物包被
将小批次清洁的各个芯片(大约5到20个)置于装有1ml 1％ (1mg/ml)的聚丙烯胺盐酸盐(polyallylamine hydrochloride)(Mw～ 15000)或0.1％聚赖氨酸溶液(Sigma Aldrich)的小的特佛隆容器中 (体积～5ml)。在室温孵育芯片1-2小时并轻轻摇动。然后，将其 从聚合物溶液中取出并在50-70℃温度范围内干燥～1小时。这个处 理通常在芯片表面留下了一个厚而不均匀的聚合物包被膜。这些修饰 的芯片使用标准方法用于组装珠。组装过程最后的表面清洗步骤去除 了大部分多余的聚合物和多余的珠。聚合物包被物的存在提高了珠与 芯片表面的粘附并且这样的处理后，珠在凹进中的保留被显著提高。
实施例9：封装生物芯片以形成用于生物学分析的多芯片载体及 添加珠阵列及制备其的方法
对特定生物芯片的封装类型的选择依赖于应用。通常，为了方便， 将一或多个生物芯片附于一个芯片载体上。载体可以是简单如玻璃载 玻片，或可以是具有射流操作、温度控制、信号记录和其它功能的复 杂装置(cartridge)。生物芯片可以通过胶水永久结合载体或通过多种 方式如磁性或机械力可逆结合。
实施例9A-从玻璃载玻片制造多芯片载体：为制备作为载体的载 玻片，于是应用特佛隆包被物以产生圆形开口或孔(即，没有特佛隆 覆盖的玻璃区域)。每个孔是6.5mm直径的圆形。一或多个芯片可以 结合一个孔中的玻璃表面。典型的玻璃载玻片是25×75mm及1mm厚， 具有2×5阵列孔。具有典型的1.75×1.75mm大小的芯片，直至4个芯 片可以结合每个孔的玻璃表面。在结合载体前，同一孔中的每个芯片 可以具有不同的组装的珠组。例如，如果每个芯片具有含有39种珠 组的阵列，具有4个不同芯片的孔将有总共4×39＝156种珠。另一方 面，对于较大的芯片(例如，4.5×4.5mm平方)，一个芯片就可以占 据一个孔。对此处所述的孔尺寸，每个孔可以容纳多至40μl的液体 (通常是水溶液)。典型地，20μl体积的样品溶液加入到每个孔中以 进行生物学反应，所以每个芯片完全被样品溶液覆盖。因为孔外的特 佛隆包被物是疏水的，所以水溶液样品不会溢出来。可以设计载体载 玻片的形式以适应某些应用。例如，载玻片上单行8个孔可以用于分 析8个样品。而且，4×8阵列的孔可以用于分析32个样品。同样， 在一个载玻片上可以排列更多的孔(例如，96384和1536)以分析更 多的样品。
实施例9B-可移动芯片载体：可移动芯片载体的某些实施方案中， 芯片结合基层如玻璃、不锈钢、塑料物质、半导体或陶瓷物质。整个 载体单位是可移动的并且在加工过程中可以转移以暴露芯片于不同 的反应介质，如反应槽、清洗槽和信号阅读器。(见图14的一个实施 方案)。
其它实施方案中，可移动芯片载体包含一个槽或结合芯片的槽。 通过覆盖可移动芯片载体中的芯片，可以最小化转移过程中的污染。 某些实施方案中，可移动芯片载体的槽也作为加工环境。如果需要， 不同目的如进行生物分析或清洗芯片的反应气体或液体溶液可以加 到可移动芯片载体上随后再排空。另外，可移动芯片载体可以具有改 变槽热力学性质的手段，如槽压力或温度。