核苷类似物通常用作抗病毒剂，尤其用作抗可逆性病毒 (retroviruses)剂。病毒经历基因变异或突变，导致对这些抗病毒 剂相对耐药。一旦发生耐药，病毒迅速繁殖，于是加速了潜在的疾 病发作。感染的早期部署双链RNA(dsRNA)可以降低病毒 耐药出现的速度。即使是感染后期，基因突变已经发生，ds RNA也能恢复病毒对其它无效的抗病毒剂的敏感性。这点可以由 临床上长期使用两种模式相结合治疗导致的出乎意料的结果中看 出。这种临床结果是，宿主免疫功能大大恢复，可检测的病毒甚 微。这种结果是单独使用任何一类抗病毒剂所没有的。

病毒性疾病的长期治疗，特别是可逆的病毒性疾病，与病毒抗 药性出现有关(参考文献1和2)。理想情况是，使用核苷类似 物进行化疗时，核苷能插入到病毒基因信息之中，并导致基因缺陷 或不完全，从而降低病毒生长循环效率。有缺陷的或者不完全的病 毒后代形成感染的能力降低。不过，通过修饰本身的基因构造，病 毒可以相对出现耐药，从而即使存在核苷类似物，也可以产生感染 性的病毒后代。典型的基因变化出现在聚合酶基因(即在生长循环 的第一步指导抗病毒核苷插入的病毒组分)，使得病毒可以受抗病 毒封锁形态影响。目前最好的研究例子是可逆病毒间的相互作用， 例如HIV(人体免疫缺陷病毒)和3′-叠氮基-3′-去氧胸 苷，后者亦称作为AZT或齐多呋定。导致对AZT具有抗药 性的变种常常同时对其它药物，例如二脱氧肌苷(DDI)和二脱 氧胞苷(DDC)(不限于这两种化合物)耐药。

已经发现了在使用核苷类似物治疗前，在适当的时间使用有效 量错误匹配的dsRNA，可以使HIV感染(HIV阳性)的病 人推迟或降低，或既推迟又降低出现核苷类似物耐药病毒的程序。 这些程序使得病人在HIV感染后期，需要使用核苷类似物抗病毒 剂时，对药物敏感。

还描述了使用有效量错误匹配的dSRNA，改进可逆病毒感 染病人的外周血液单核血细胞(PBMC)群，尤其是T4或 CD4淋巴细胞的治疗程序。

dsRNA可以是含有部分尿嘧啶碱基或鸟嘌呤基的聚肌苷和 聚胞苷的复合物，例如这类硷基的含量从1/4至1/29 (poly I.poly(C4-29X＞U或G))。

dsRNA的通式可以是rIn·r(C11-14′U)n或者是 rIn·r(C12′U)n。下面讨论dsRNA的其它合适的例 子。

“错误配对的dsRNA”用来描述那些配对链之间的氢键 (碱基堆积)相对完整，即氢键受到干扰被中断的平均数在连续的 每29个碱基对残基中不足1个碱基时。“错误配对的ds RNA”应按此理解。

本发明提倡使用的错误配对的dsRNA以选自poly (Cn′U)和poly(Cn′G)的共聚核苷酸为基础，其中n为4至 2 9的整数，而且共聚核苷酸是通过沿聚核糖胞苷键(rCn)把 rIn·rIn修饰并插入未配时碱基(尿嘧啶或鸟嘌呤)而生成 的聚核糖肌苷酸和聚核糖胞苷酸的复合物的错误配对的类似物。另 外，通过修饰聚核糖肌苷酸(rIn)的核糖骨架，例如把2′- O-甲基核糖残基包括于其中，从poly(I)·poly(C)ds RNA衍生错误配对的dsRNA。错误配对的复合物可以使用 RNA-稳定化的高聚物，例如聚赖氨酸或纤维素进行复合。 Carter和Ts′o在美国专利4,130,641和4, 024,222中描述了rIn·rCn′的错误配对类似物中优选 的类似物，通式为rIn·(C11-14′U)n或rIn I·r (C29′G)n′，这些发明列为参考文献。按照本发明，其中描述 的dsRNA一般都适用。优选的错误配对的dsRNA为 rIn·(C11-14′U)n或AMPLIGEN(HEN R esarch，Inc，Rocknille，MD，USA)，可以买 到冻干粉。

本发明中使用的错误配对的dsRNA的其它例子包括：

poly(I)·poly(C4′，U)

poly(I)·poly(C7′，U)

poly(I)·poly(C13′，U)

poly(I)·poly(C22，U)

Poly(I)·poly(C20，U)

poly(I)·poly(C29，U)和

poly(I)·poly  Cp23 G＞p

适用于实施本发明的另一类dsRNA是确定结构的短链ds RNA，例如通式为

5′-封锁-(I)n-封锁3′

3′-封锁-(C)n-封锁5′ 的寡核苷酸。其中m和n各自都大于5至小于100，I为单磷酸 化肌苷，C为单磷酸化胞苷，而且一根链上的封锁基与相对链上的 封锁基互补。或者是通式为

5′-封锁-〔(I)xA〕d-封锁3 ′

5′-封锁-〔(C)yU〕k-封锁3′ 的寡核苷酸。其中x和y各自大于5小于25，j和k至少等于1 并小于10，I和C同上，A为I以外的核苷酸，U为碱基与A配 对的核苷酸。

另外，短链寡核苷酸可以具有下述结构：

5′(I)n-铰链-(C)m 3′ 其中n，m，I和C的定义同上。

这些寡核苷酸可以在与相对链上的核苷酸不互补的一根链上含 有取代基。这些寡核苷酸最好被互补的非均匀高聚体的内部配对所 稳定，理想地，封锁基和铰链基或二者都含有互补非均匀高聚体的 区域。这些寡核苷酸理想地含有单一链尾。这些寡核苷酸在PCT /US89/02172中已有描述。

病人需要根椐临床改善情况每周一次或每日一次静脉输200 至700mg rI·r(C11-14′U)。dsRNA的用量和给 药次数将使病人的全身血液循环在用药后于远离输液部位的地方测 定到dsRNA水平达0.01μg至1,000μg/升。

例证性的核苷类似物抗病毒剂包括Ziodovudine(象这里普遍 使用的AZT或叠氮胸腺啶或Retrovar)，即3′-叠氮-3′ -去氧胸腺定，是用于因人体免疫缺陷病毒(HIV，HTLV- I，HTLV-II，HTLV-III，LAV，ARV和各种菌株的 类似信息物)引起的AIDS和AIDS相关复杂情况需要全身性 治疗的核苷类似物抗病毒剂。成人剂量是每天每四小时给药 200mg。一个70kg体重的病人，对应的剂量是每四小时每 公斤体重2.9mg。每天每公斤体重的剂量已用达60mg。如 同后面的讨论将进一步显示的，与错误配对的dsRNA配位时， 使用的核苷类似物的可逆病毒剂量通常小于正常剂量和习惯用量。

图1是描述298位病人死亡或AIDS“全身感染”的时间 (月数)表，与症状出现前AZT“早期”(方格)治疗或症状出 现后AZT“晚期”(圆圈)治疗相比较，采用无致命的HIV情 况的病人的比例表示。

图2，比较早期使用dsRNA或它与AZT并用对可逆病毒 生长的控制与单独使用AZT病例中可逆病毒迅速生长。在图2 中，HIV培养按参考文献3进行，使用的PBMC来自例#，至例# 3培养4天，7天和14天之后，收集PBMC，溶于GUSCN 之中，并按方法中描述的使用分子杂化技术测定HIVRNA。P BMC＝外周血液中单核细胞；GUSCN为氰酸胍溶液，用于溶 解细胞并释放病毒物质。

图3，比较dsRNA和AZT作为单一治疗剂时与安慰剂及 dsRNA和AZT联合治疗时，在指明的周数上长期保持HIV 疾病中CD4细胞按CD4T淋巴细胞中的中质变化的相对效果。

图4，把AZT和dsRNA联合治疗的天数与T4水平的变 化百分数相关联，表明dsRNA Ampligen把HIV疾病中 T4细胞的稳定周期扩展到超出了单独使用AZT预期的稳定周 期。指出了联合用药的每个成员的中间剂量。

图5，把Ampligen和AZT联用的天数与T4细胞平均百 分变化(增加)相关联，表明Ampligen增加和/或者稳定 HIV疾病中T4细胞水平在AZT有效的时间周期内仍超出该时 间周期。

图6是12个月中安慰剂、单独使用AZT、Ampligen单 一治疗以及Ampligen和AZT联合治疗时无致命的HIV病人的 比例图解。

在图4和图6中，病人数目在有关数据点附近的括号中指明， 在图3和图5中用N＝指明。

在图2中，按照参考文献3中描述的方法，使用来自例1和3 的外周血液单核细胞完成HIV共培养。共培养4天，7天和14 天之后，收集外周血液单核细胞并溶于氰酸胍溶液中，后者是用来 溶解细胞并释放病毒物质的。用分子杂化测定HIV RNA，下 面将详细描述。

图1说明在HIV感染病人的充分公布的Veterans组的 “早期”(例如失重，盗汗等症状出现之前)或者“晚期”(即包 括由真菌或细菌引起的HIV相关的感染在内的这类症状出现以 后)使用AZT治疗时，致命情况(发展成全身感染的AIDS或 死亡)的发展。

从图1可以明显看出，“早期”使用AZT不延长寿命。取自 发展了致命情况的病人的血样表明AZT耐药病毒(本文以AZT 表示)浓度增加，而在大约40个月观察周期中仍无致命情况的病 人一般有对AZT都变为敏感的病毒(AZTS)。

以下，更充分的特征是：从尽管AZT治疗，疾病仍然发展的 病人身上分离的典型的HIV分离体的相对AZT敏感度，并把这 些结果与包括从疾病得到相对好的控制的病人身上分离到的肝炎病 毒在内的病毒分离体进行比较。很明显，出现AZT病毒会缩短 生命期。典型的人体可逆病毒HTLV-1，HTLV-2， HTLV-3以及通过相同机制繁殖的病毒包括一些肝炎病毒。

在此本发明人描述改进这一目前未解决的问题的发明。该发明 可以通过多种途径实施，这些途径包括：(a)在病毒暴露于AZ T或其它类似物前，使用特殊类型的dsRNA，降低AZT 的出现(b)通过往体系中反加dsRNA，克服AZTHIV (或其它病毒耐药类似物)的致死性质。dsRNA/核苷体系显 示了对抗AZTHIV的出乎意料的协同作用而没有对应的协同 毒性，这样这种体系确实是独特的出乎意料有用的联合药物，使用 正确即可挽救生命。

本发明人的研究考察了如何联合使用AmpligenAZT降低 HIV-病毒所造成的问题，研究中病毒无细胞来自或者接受Amp liger单独治疗或接受AZT单独治疗或接受Ampligen-AZT 联合治疗的病人，该病毒用于感染新鲜的人外周血液细胞，该血液 血胞事先被暴露在Ampligen、AZT、或Ampligen和AZT之 中。来自于仅接受AZT单一治疗一年以上的病人的病毒对AZT 不敏感(0.5uMAZT＝4％抑制率；ED50＜5uM)，但 象原始HIV病毒一样对单一Ampligen敏感(5ug/ml，Ampli gen-AZT联用比单-Ampligen可以产生更大的HIV抑制率 (93％)。来自于接受单一Ampligen治疗或Ampligen-AZ T联合治疗的病人的病毒显示了对AZT相对耐药，对Ampligen 敏感，而对Ampligen-AZT联合用药甚至有更大的敏感性。根 据病人的不同治疗计划，比较用许多不同病毒分离体所得的结果， 可以明显看到，来自暴露于AZT之前就接受了Ampligen治疗病 人的病毒对于AZT(以及其它核苷类似物)的敏感性要大于来自 于首先接受了AZT的病人的病毒。

                                       表1                                     HIV分离体的抗药性    HIV   分离   Ampligen   ED50   (μg/ml)   AZT   ED50   (μg/molar)   联合指数a     AZT  表现型   H112-2   6910-6   Case#1   Case#2   Case#3   Case#4   Case#5   Case#6     2     3     1     1     .5     1     .5     2     .03     2     0.6     0.2     ＞5     ＞5     ＞5     ＞5     0.5     0.2     0.4     0.2     0.2     0.8     0.2     0.3     敏  感     耐  药     部分耐药     ″         耐  药     ″        ″        ″

a＝AZT-Ampligen相互作用通过等数分析测定(参考 文献4)。联合指数(CI)定义为CI+(Ac/As)+ (Be/Bs)，其中Ac和Bc是联合治疗中使用的药物浓度， As和Bs是单独使用时产生联合治疗相同效应的药物浓度。当 CI＜1时，药物是协同的；当CI＝1时，药物是加和的；当 CI＞1时，药物相互拮抗。ED50为抑制50％病毒繁殖的体外 剂量。

在图2中发明人表明本发明的典型的实施方案，在实施方案中 早期使用Ampligen或与AZT同时使用，事实上会产生实质上 的好处，比如降低象可逆病毒这样的有害病毒的体内浓度。用开环 表示的病毒RNA(核糖核酸)的迅速升高的产生曲线是来控制病 毒生长的指征，而两条平线表示通过联合治疗病毒产生得到良好控 制。图2中的开环说明AZT病毒迅速发展，这样就成为图1中 病人的典型症状，这些病人当单独给AZT时，往疾病的更晚期发 展。

无论什么耐药表现型(表1)，一些dsRNA，尤其是错误 配对的dsRNA若与AZT(或其它核苷类似物)联用，则显示 对可逆病毒的协同抑制作用。H112-2和6910-6是分别 显示典型敏感度和耐药的非常特征化的HIV显型克隆。而例#1 到例#6是从暴露于各种体系(例如例#1，2，3病人与图2 中的病人相同，例如4，5，6病人象图1中建议的，开初用 AZT单独治疗)的特殊病人中分离出的病毒。

当在临床上联合用药时，结果再次出乎意料，而且根据单独使 用两种药物(单一治疗)的临床观察根本不可预测。例如，单独使 用AZT(和其它类似物)使一些免疫细胞短时增加(参考文献5 )，这些免疫细胞叫作CD4细胞，它们最易为一些可逆病毒和一 些肝炎病毒(特别是HHV6)进攻。短时增加之后(见于12至 16周左右)，由于HIV增殖和出现AZTHIV，免疫细胞 恶化(图3)。括号中的数目叫作研究的主体数。相比之外，单独 合作Ampligen始终引起CD4细胞数处于水平线(图3，例如 免疫细胞数既不增加也不减少，换句话说，细胞数稳定化)， Ampligen的剂量大约400至500mg，每周两次，静脉给 药。

病人接受AZT单独治疗，每天每四小时口服200mg (1200mg/日)。Ampligen单独治疗组的病人每周静脉 最低给药量两次(平均剂量范围为每周463-555mg)。〔 图4中显示的接受联合治疗的病人也每周两次输以400mg典型 的Ampligen剂量，而且平均伴用每日剂量范围300至540 mg的AZT〕。

安慰剂和AZT单一治疗组(16周之后)T4淋巴细胞中值 变化的趋势与疾病进程无情地衰退的证据相符。没有有效的治疗干 预，安慰剂病人的淋巴细胞的中值变化计数下降。开初增加之后， 即使接受AZT单一治疗的病人也经历他们的T 4细胞中值计数的 下降并出现AZTHIV。这种下降从第12周起开始出现与安 慰剂处理的病人中出现的下降相平行。

根据AZT单独治疗和安慰剂组12周开始T4细胞中值变化构 成的线性回归线统计方法比较斜率，表明它们与中值T4细胞水平 无变化的0斜率具有统计学差别(分别有p＜0.01和p＜ 0.01)。“无变化”典型地表示免疫学疾病的稳定，“负斜 率”表示疾病恶化，而最理想的后果是正科率，表示疾病(免疫) 恢复，但这不可能通过研究的单一治疗体系而达到。

安慰剂的AZT单一治疗12周之后，Ampligen单独消除 了预料的CD4下降。Ampligen治疗中的连续中值CD4水平 的回归线斜率与反映无CD4细胞损失的水平线在整个时间都没有 统计学差异。

            斜率与水平线(无变化)相比较

                                  p值

Ampligen   无统计学意义        p＞0.2

AZT           显著差异            p＜0.01

安慰剂        显著性差异          p＜0.01

虽然Ampligen的单一治疗(图3)可以消除在安慰剂和 AZT治疗的两组病人中都看到的中值T4淋巴细胞(在短时的 12周升高之后)的严重下降，但平均T4水平不升高。而且在 Ampligen组中，在一年中观察到的小的(无统计学差异)中值 T4淋巴细胞减少(图3)可以通过把剂量增至每周两次200 mg以上而生产更持久的T4稳定化而容易逆转。在Ampligen 单一治疗组中从12周开始观察到的中值T4细胞的变化构成的回 归线的斜率与表明疾病稳定的0之间没有显著差异。图3给出的 Ampligen单一治疗组，AZT单一治疗组或安慰剂治疗组具有 大致相等的中值和平均的绝对T4(亦称CD4)淋巴细胞水平。 然后我把它们与接受Ampligen和AZT联合治疗的新组进行比 较。该新组实际上具有较低的(约33％)中值和这种加重的 HIV感染的预后指征的绝对水平，从而表明他们具有更大的死亡 危险或别的“致命事件”。

下表给出了Ampligen和AZT长期维持HIV疾病中每 mm3CD4细胞的相对效应。

                              表2     治    疗   病人数         基   线   一年中中值绝对CD4   细胞变化    中值   平均值   Ampligen+AZT   Ampligen   单用   AZT           单用   安慰剂     11     54     260     255     201     311     350*     350*     248     350     355     356           +15           -15           -28*           -59*

正如在图3中看到的，完成一年治疗使用安慰剂的病人中值绝 对T4淋巴细胞计数减少59个细胞(大约每月减少4.9个细 胞)；接受AZT单一治疗的病人减少28个细胞(大约每月减少 2.3个细胞)；接受Ampligen单一治疗的病人，只减少15 个细胞(平均每月约减少1.25个细胞)。不过，接受Ampli- gen和AZT联合治疗组，该组具有最低的预治疗中值和平均绝 对T4淋巴细胞水平(所以处于最大的冒险之中)，实际上经历了 中值绝对T4细胞水平增加了13个细胞，即使联合治疗一年之 后，仍然如此。这些结果总结在表2中，且图4中列得更为详细。

图4阐明了在联合治疗的一年中中值T4淋巴细胞水平的连续 变化，该联合治疗应与图3中的Ampligen单一治疗，AZT单 一治疗及安慰剂效应相比较。用于比较的基线根椐开始联合治疗前 的三个月立即测定的病人的连续绝对T4淋巴细胞计数的平均值算 得。

头九十天周期中观察到的增加与原先报道的图3中观察到的 AZT单一治疗的初步效果相符。不过，所看到的从180天至 540天联合治疗中持续增加显示统计学差异，这在接受AZT单 一治疗的病人中，未观察到。(非参数分析证实了一年中T4计数 增加，具有统计学意义(p＞0.05)。之所以进行这种分析， 是由于相对小的样本数使得有可能T水平分布不正常)。这样一 来，T4淋巴细胞增加持续的时间要比AZT一单治疗预计的3至 6个月的短时增加要长，而且这种结果必须来自于dsRNA的存 在。另外，使用相对低剂量的AZT和dsRNA时，也看到这种 效应。该观察与早先在低至200mg剂量的情况下看到的相符 合。每周静脉注射两次，持续1至4个月，Ampligen的单一治 疗可以稳定未经治疗的HIV感染病人(T4＝60-300细胞 /mm3)的预计的T4细胞减少，如果病人继续这种治疗5至8 个月，可以维持这种效应(图3)。

根据dsRNA和AZT联合治疗的135天至630天中T4 淋巴细胞计数的平均百分变化，得到的回归线见于图5。联合治疗 的91至180天中每个病人的连续T淋巴细胞计数的平均数， 用作确定百分变化的基线。该基线被选作为分界点，在该点的后 面，估计的AZT对T4水平的影响一般已经消失。

使用统计方法，回归线的正斜率和95％可信限度的斜率指 出，Ampligen和AZT联合治疗成功地阻止了预计到的未经治 疗的病人(4-6个细胞/月)和长期AZT单一治疗病人(多于 6个细胞/月)的长期T4细胞减少。这样一来，联合治疗事实上 无限期地维持了T4水平，而且持续时间比原先AZT单一治疗观 察到的长得多，这一点正好说明了本发明在核酸耐药病毒，特别是 可逆病毒治疗中的基本用途。

最后，图6通过表述当病人接受安慰剂、AZT单一治疗， Ampligen单一治疗，或者Ampligen和AZT联合治疗时， 发展成AIDA感染/淋巴瘤(“致命事件”)的比例，证实了本 发明的效用。

如同图6指出的，接受安慰剂的病人中有大约10％在12个 月的观察周期中经历致命事件。开始的病人数目，研究的第6个月 和第12个月，在括号中标明。在该时期内，接受AZT的病人中 有大约4％经历致命事件。特别应当指出的是，单独使用AZT可 以预期形成的肿瘤(参考文献6)，通过联合治疗而得到避免。使 用Ampligen和AZT联合治疗时，在绝对T4淋巴细胞计数大 于115个细胞/mm3的病人中，无人发生致命事件，甚至那些 由于联合治疗前基线上的中值CD4水平只有201，免疫系统明 显恶化的，这样做处于极大危险中的病人，也是如此。

与实践本发明相一致，在控制病毒复制的基础打好之后，可以 明智地加入诸如白细胞介素和干扰素一类的淋巴细胞活素。

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