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在 酵母中产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯

阅读：866发布：2023-02-24

专利汇可以提供在酵母中产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及从酵母细胞中产生包含在信息素、特别是蛾信息素中的化合物，如去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯及其衍生物。，下面是在酵母中产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种能够产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；
和
ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)；以及
iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶；
其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六烷酰基-CoA的特异性。
2.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶衍生自选自天竺葵(Pelargonium hortorum)、蓖麻(Ricinus communis)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的生物，优选地所述去饱和酶衍生自黑腹果蝇。
3.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自：
i)与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ
9去饱和酶；
ii)与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶。
4.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)选自：
i)与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的来自棉铃虫(Helicoverpa armigera)的FAR具有至少80％同源性的FAR；
ii)与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的来自烟夜蛾(Helicoverpa assulta)的FAR具有至少80％同源性的FAR；
iii)与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；以及
iv)与如SEQ ID NO:45中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR，
优选地，所述FAR是与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR。
5.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶或从所述酵母细胞过表达的天然乙酰基转移酶，优选地所述乙酰转移酶与如SEQ ID NO:21中所示的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙酰基转移酶Atf1具有至少75％同源性。
6.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述酵母属于选自酵母属
(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的属，优选地所述属是酵母属或耶氏酵母属，最优选地所述属是酵母属或耶氏酵母属，优选地所述酵母属于选自酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的物种，优选地所述酵母细胞是酿酒酵母细胞或解脂耶氏酵母细胞，最优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞。
7.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达或过表达硫酯酶，优选地所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟(Cinnamomum camphora)的硫酯酶或与如SEQ ID NO:42中所示的来自大肠杆菌(Escherichia coli)的硫酯酶具有至少
60％同源性。
8.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达具有经修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体，由此所述酵母细胞比表达天然脂肪酰基合酶的酵母细胞在相同条件下合成更高比例的C14 脂肪酸。
9.根据前述权利要求中任一项的酵母细胞，所述酵母细胞还具有导致一种或多种脂肪酶的活性部分或完全丧失的突变。
10.根据权利要求9的酵母细胞，其中所述一种或多种脂肪酶与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2、如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7或如SEQ ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性。
11.根据权利要求9至10中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞是解脂耶氏酵母，并且所述一种或多种脂肪酶选自如SEQ ID NO:72中所示的脂肪酶2、如SEQ ID NO:73中所示的脂肪酶7和如SEQ ID NO:74中所示的脂肪酶8。
12.一种用于在酵母细胞中产生去饱和脂肪酸和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞表达：
i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；和
ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；以及
iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶，从而产生所述去饱和脂肪酰基乙酸酯；
其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六烷酰基-CoA的特异性。
13.根据权利要求12的方法，其中所述酵母细胞如权利要求1至7中任一项所定义。
14.根据权利要求12至13中任一项的方法，其中所述方法产生滴度为至少1mg/L如至少
1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少
4g/L、如至少5g/L或更高的链长为14的去饱和脂肪醇。
15.一种用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和
ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及
iii)任选地，编码能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶的第三多核苷酸，
其中任选地，所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸处于启动子的控制下。
16.一种部件试剂盒，其包含：
a)根据权利要求1至11中任一项的酵母细胞和使用说明书；和/或
b)根据权利要求15的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及c)任选地，待修饰的酵母细胞。
17.一种去饱和脂肪醇或去饱和脂肪酰基乙酸酯，其通过根据权利要求12至14中任一项的方法可获得。
18.根据权利要求1至11或17中任一项的去饱和脂肪醇的用途。
19.根据权利要求1至7或17中任一项的去饱和脂肪酰基乙酸酯的用途。

说明书全文

在酵母中产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯

技术领域

[0001] 本发明涉及从酵母细胞中产生包含在信息素、特别是蛾信息素中的化合物，如去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯及其衍生物。

背景技术

[0002] 自从50多年前DDT出现以来，广谱神经毒性杀虫剂已经为防治农业和公共卫生项目中经济上重要的昆虫提供了主要手段。尽管合成杀虫剂的使用最初导致作物产量的显著
增加和一些重要的人类和动物疾病媒介的抑制，但是昆虫害虫群体中杀虫剂抗性的发展和
由杀虫剂引起的环境损害已经被广泛认为是它们的使用的严重弊端。与制造和使用杀虫剂
相关的最显著的环境问题包括1)它们对非靶标生物(包括人类)的直接毒性；2)它们在它们
可能积累并在高等生物中引起不幸的发育和生殖影响的生物圈中的持久性；3)与它们的制
造和分销相关的显著点源污染；4)它们的全球分散。

[0003] 信息素可以取代杀虫剂用作害虫防治。例如，已经发现(Z)19-14:OAc在单独施用(即没有其他信息素组分)时以86％的效率干扰秋粘虫的交配效率(Mitchell&McLaughlin,
1982)。信息素通过交配干扰来防治昆虫害虫的商业用途具有优于常规杀虫剂的若干优点。
信息素：1)无毒且对环境无害；2)对一种靶标物种具有特异性，而不会不利地影响非靶标有益昆虫，使得它们非常适合用于综合害虫治理项目；并且3)不太可能(并且从未显示过)在
靶标昆虫中产生抗性。与自然界中的信息素合成相反，当前用于商业生产信息素的方法采
用传统的合成化学途径。因为信息素需要非常高的纯度来引发昆虫的反应，所以这些合成
方法是昂贵且困难的，并且产生大量需要处理的有机废物。

[0004] 因此，阻碍使用性信息素的主要障碍仍然是生产成本。因此，全球农业用地中很小一部分采用了信息素(估计低于0.05％)。预期从细胞工厂产生信息素将显著降低信息素的生产成本。

发明内容

[0005] 本发明是如在权利要求中所限定的。

[0006] 本文提供了能够产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的酵母细胞，所述酵母细胞表达：

[0007] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；和

[0008] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)；以及

[0009] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶；

[0010] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0011] 还提供了用于在酵母细胞中产生去饱和脂肪酸和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述
酵母细胞表达：

[0012] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；和

[0013] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；以及

[0014] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶，从而产生所述去饱和脂肪酰基乙酸酯；

[0015] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0016] 本文还提供了用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：

[0017] i)编码至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和

[0018] ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及

[0019] iii)任选地，编码能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶的第三多核苷酸，

[0020] 其中任选地，所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸处于启动子的控制下。

[0021] 还提供了部件试剂盒(kit of parts)，其包含：

[0022] a)如本文公开的酵母细胞和使用说明书；和/或

[0023] b)如本文公开的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及

[0024] c)任选地，待修饰的酵母细胞。

[0025] 还提供了通过本文公开的方法可获得的去饱和脂肪醇。

[0026] 还提供了通过本文公开的方法可获得的去饱和脂肪酰基乙酸酯。

[0027] 还提供了如本文公开的去饱和脂肪醇的用途。

[0028] 还提供了如本文公开的去饱和脂肪酰基乙酸酯的用途。附图说明

[0029] 图1：朝向Z9-C14:OAc的途径。(1)十四烷酰基-CoA(肉豆蔻酰基-CoA)，14:CoA；(2)(Z)9-十四碳烯-1-基-CoA，Z9-14:CoA；(3)(Z)9-十四碳烯-1-醇，Z9-14:OH；(4)(Z)9-十四碳烯-1-基乙酸酯，Z9-14:OAc；(5)(Z)9-十四碳烯醛，Z9-14:Ald。Δ9FAD-Z9-脂肪酰基去饱和酶；FAR-脂肪酰基-CoA还原酶；AcT-乙酰基-CoA转移酶。

[0030] 图2：表达盒。A：Dmd9和HarFAR的表达盒(在质粒pCfB6969上编码)。B：Atf1的表达盒(在质粒pCfB7600上编码)。C：LIP2、LIP7或LIP8的表达盒。“Term.”代表终止子；“prom.”代表启动子。D：Atf1和Dmd9的表达盒(pCfB7235)。E：Dmd9的表达盒(pCfB7239)。F：SliDes11的表达盒(pCfB7240)。G：TesA(LL)/CcFATB1和Dmd9的表达盒(pCfB7251/pCfB7253)。

[0031] 图3：解脂耶氏酵母(Y,lipolytica)中脂肪酶基因的缺失增高了脂肪醇滴度。

具体实施方式

[0032] 定义

[0033] 生物农药：术语“生物农药(biopesticide)”是“生物农药(biological pesticide)”的缩写，是指几种类型的害虫治理干预：通过捕食、寄生或化学关系。在欧盟，生物农药已经被定义为“一种基于微生物或天然产物的农药”。在美国，EPA将其定义为“包括防治害虫的天然存在的物质(生物化学农药)、防治害虫的微生物(微生物农药)以及含有
添加的遗传材料(植物结合保护剂(plant-incorporated protectant))或PIP的植物产生
的杀虫物质”。本公开文本更具体地涉及包含天然产物或天然存在的物质的生物农药。它们通常通过使天然存在的生物和/或其代谢物(包括细菌和其他微生物、真菌、线虫、蛋白质
等)生长和浓缩而产生。它们通常被认为是害虫综合治理(IPM)计划的重要组成部分，并且
作为合成化学植物保护产品(PPP)的替代品已经受到很大的实际关注。生物防治剂手册
(2009年：以前的生物农药手册)对可用的生物杀虫剂(和其他基于生物学的防治)产品进行
了综述。

[0034] 去饱和的：术语“去饱和的(desaturated)”在本文中将可与术语“不饱和的(unsaturated)”互换使用，是指含有一个或多个碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。

[0035] 衍生自：当提及衍生自生物的多肽或多核苷酸时，所述术语意指所述多肽或多核苷酸对于所述生物而言是天然的。

[0036] 脂肪酸：术语“脂肪酸”是指具有长脂肪族链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的羧酸。大多数天然存在的脂肪酸是无支链的。它们可以是饱和的或去饱和的。

[0037] 脂肪酰基乙酸酯：所述术语在本文中将可与“脂肪乙酸酯”互换使用，是指具有脂肪碳链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的乙酸酯。脂肪酰基乙酸酯可以是饱和的或去饱和的。

[0038] 脂肪酰基-CoA：所述术语在本文中将可与“脂肪酰基-CoA酯”互换使用，是指通式R-CO-SCoA的化合物，其中R是碳链长为4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪碳链。脂肪碳链通过硫酯键与辅酶A的-SH基团连接。脂肪酰基-CoA可以是饱和的或去饱和的，这取决于衍生出它
的脂肪酸是饱和的还是去饱和的。

[0039] 脂肪醇：术语“脂肪醇”在本文中是指衍生自脂肪酰基-CoA的醇，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醇可以是饱和的或去饱和的。

[0040] 脂肪醛：所述术语在本文中是指衍生自脂肪酰基-CoA的醛，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醛可以是饱和的或去饱和的。

[0041] 异源的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“异源的”在本文中应解释为指代不天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。例如，当应用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，术语“异源Δ9去饱和酶”是指不天然存在于野生型酿酒酵母细胞中的Δ9去饱和酶，例如衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Δ9去饱
和酶。

[0042] 天然的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“天然的”在本文中应解释为指代天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。

[0043] 害虫：如本文所用，术语“害虫”应指代对人类或人类关怀(特别是在农业或畜牧生产的背景下)有害的生物，特别是动物。害虫是对植物或动物、人类或人类关怀、牲畜、人类结构、野生生态系统等具侵入性或多产、有害、有麻烦、有毒、有破坏性、惹人讨厌的任何活生物。所述术语经常与相关术语害虫(vermin)、杂草、植物和动物寄生虫和病原体重叠。有可能生物在一种环境中是害虫，而在另一种环境中是有益的、驯化的或可接受的。

[0044] 信息素：信息素是天然存在的化合物。鳞翅目(Lepidopteran)信息素由以醇、醛或乙酸酯官能团结尾并且在脂肪族主链中含有最多3个双键的无支链脂肪族链(9与18个之间的碳，如9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子)指定。信息素组合物能以化学或生物化学方式产生，例如如本文所述。因此，信息素包含去饱和脂肪醇、脂肪醛和/或脂肪酰基乙酸酯，例如可以通过本文所述的方法和细胞获得。

[0045] 饱和的：术语“饱和的”是指不含碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。

[0046] 特异性：酶对给定底物的特异性是此酶表现的催化从所述底物开始的反应的优选性。在本公开文本中，与用十六烷酰基-CoA作为底物的反应相比，对十四烷酰基-CoA(肉豆蔻酰基-CoA)的特异性高于对十六烷酰基-CoA(棕榈酰基-CoA)的特异性的去饱和酶和/或
脂肪酰基-CoA还原酶优选地催化用十四烷酰基-CoA作为底物的反应。确定去饱和酶或脂肪
酰基-CoA还原酶的特异性的方法在本领域是已知的。例如，给定去饱和酶的特异性可以通
过在包含肉豆蔻酸甲酯的溶液中孵育表达所述去饱和酶的细胞长达48小时，随后用甲醇提
取和酯化产物来确定。然后可以通过GC-MS测定得到的脂肪酸甲酯的谱(profile)。对肉豆
蔻酰基-CoA具有更高特异性且对棕榈酰基-CoA具有低特异性的去饱和酶将导致(Z)9-C14:
Me的浓度高于(Z)9-C16:Me。例如，给定还原酶的特异性可以通过在包含(Z)9-肉豆蔻酸的
甲酯的溶液中孵育表达所述还原酶的细胞长达48小时，随后通过GC-MS提取和分析得到的
脂肪醇来确定。对(Z)9-C14:CoA具有更高特异性且对(Z)9-C16:CoA具有低特异性的还原酶
将导致(Z)9-C14:OH的浓度高于(Z)9-C16:OH。

[0047] 去饱和酶

[0048] 在本公开文本中，术语“脂肪酰基-CoA去饱和酶”、“去饱和酶”、“脂肪酰基去饱和酶”和“FAD”将可互换使用。所述术语通常是指能够在链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳原子的酰基-CoA中引入至少一个E/Z构象的双键的酶。可以在任何位置中引入双键。例如，在位置3中引入双键的去饱和酶被称为Δ3去饱和酶。在位置5中引入双键的去饱和酶被称为Δ5去饱和酶。在位置6中引入双键的去饱和酶被称为Δ6去饱
和酶。在位置7中引入双键的去饱和酶被称为Δ7去饱和酶。在位置8中引入双键的去饱和酶被称为Δ8去饱和酶。在位置9中引入双键的去饱和酶被称为Δ9去饱和酶。在位置10中引入双键的去饱和酶被称为Δ10去饱和酶。在位置11中引入双键的去饱和酶被称为Δ11去饱和
酶。在位置12中引入双键的去饱和酶被称为Δ12去饱和酶。在位置13中引入双键的去饱和
酶被称为Δ13去饱和酶。在位置14中引入双键的去饱和酶被称为Δ14去饱和酶。在位置15
中引入双键的去饱和酶被称为Δ15去饱和酶。在位置16中引入双键的去饱和酶被称为Δ16
去饱和酶。在位置17中引入双键的去饱和酶被称为Δ17去饱和酶。在位置18中引入双键的
去饱和酶被称为Δ18去饱和酶。在位置19中引入双键的去饱和酶被称为Δ19去饱和酶。在
位置20中引入双键的去饱和酶被称为Δ20去饱和酶。

[0049] 去饱和酶催化以下反应(图1)：

[0050] 脂肪酰基-CoA+2亚铁细胞色素b5+O(2)+2H(+)<＝>去饱和脂肪酰基-CoA+2高铁细胞色素b5+2H(2)O

[0051] 出于本公开文本的目的，所述去饱和酶能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键。

[0052] 本文公开的酵母细胞表达对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性的去饱和酶和/或对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六烷酰基-CoA
的特异性的酰基-CoA还原酶。换句话说，与链长为16的底物相比，所述去饱和酶对碳链长为
14的底物更具特异性。确定去饱和酶或脂肪酰基-CoA还原酶的特异性的方法在本领域是已
知的。例如，给定去饱和酶的特异性可以通过在包含肉豆蔻酸甲酯的溶液中孵育表达所述
去饱和酶的细胞长达48小时，随后用甲醇提取和酯化产物来确定。然后可以通过GC-MS测定得到的脂肪酸甲酯的谱。对肉豆蔻酰基-CoA具有更高特异性且对棕榈酰基-CoA具有低特异
性的去饱和酶将导致(Z)9-C14:Me的浓度高于(Z)9-C16:Me。例如，给定还原酶的特异性可
以通过在包含(Z)9-肉豆蔻酸的甲酯的溶液中孵育表达所述还原酶的细胞长达48小时，随
后通过GC-MS提取和分析得到的脂肪醇来确定。对(Z)9-C14:CoA具有更高特异性且对(Z)9-
C16:CoA具有低特异性的还原酶将导致(Z)9-C14:OH的浓度高于(Z)9-C16:OH。

[0053] 在一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ5去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ6去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ7去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ8去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ9去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ10去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ
11去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ12去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ13去饱和酶。可以针对酵母细胞对编码异源去饱
和酶的基因进行密码子优化，如本领域所已知的。

[0054] 技术人员将根据所需的去饱和脂肪醇知道使用哪种去饱和酶。例如，为了产生在位置11中去饱和的脂肪醇，优选地使用Δ11去饱和酶。如果需要在位置9中去饱和的脂肪
醇，则可以使用Δ9去饱和酶，如与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶
具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶或与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾
(Spodoptera litura)的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶。

[0055] 在一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源
性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少
67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少
78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少
85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少
92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少
99％、如100％同源性。

[0056] 在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如
SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有如至少61％同源性、如至少62％
同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0057] 在一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自天竺葵(Pelargonium hortorum)。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自Chauliognathus lugubris。在一些实施方案中，异源去饱和酶衍生自黑腹果蝇。

[0058] 异源去饱和酶可以衍生自属于鳞翅目的生物。因此，在一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自斜纹夜蛾。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自玫瑰色卷蛾。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自斑点色卷蛾。

[0059] 异源去饱和酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已
知的。

[0060] 在一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:9中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:9中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少
62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少
71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0061] 在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:36中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如
SEQ ID NO:36中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、
如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少
66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0062] 在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:11中所示的编码来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如
SEQ ID NO:11中所示的编码来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、
如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少
66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0063] 在一些实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶是至少两种异源去饱和酶，例如两种异源去饱和酶。在一些实施方案中，所述两种异源去饱和酶是来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9和来自脐橙螟(Amyelois transitella)的Δ11去饱和酶，分别如SEQ ID NO:10和
SEQ ID NO:68中所示。

[0064] 待修饰的酵母细胞可以表达天然去饱和酶，其可能对去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的产生具有负面影响。因此，如果待修饰的酵母细胞表达这种天然去饱和
酶，则可以优选地修饰细胞使得天然去饱和酶的活性降低或不存在。

[0065] 为了确保缺乏天然去饱和酶的活性，可以使用本领域已知的方法。可以使编码天然去饱和酶的基因缺失或部分缺失，以便确保不表达天然去饱和酶。可替代地，可以使基因突变，使得表达天然去饱和酶但缺乏活性，例如通过使酶的催化位点突变。可替代地，可以通过诸如沉默RNA或siRNA等方法来阻止mRNA翻译为活性蛋白。可替代地，可以在包含抑制
天然去饱和酶活性的抑制剂的培养基中孵育酵母细胞。还可以提供抑制编码天然去饱和酶
的基因转录的化合物，使得当存在所述化合物时使转录失活。

[0066] 因此，天然去饱和酶的失活可以是永久的或长期的，即经修饰的酵母细胞以稳定方式表现天然去饱和酶的降低的活性或没有活性，或者它可以是瞬时的，即经修饰的酵母
细胞可以在一段时间内表现出天然去饱和酶的活性，但可以在其他时间段内抑制此活性。

[0067] 成醇脂肪酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.84)

[0068] 术语“成醇脂肪酰基-CoA还原酶”、“脂肪酰基-CoA还原酶”和“FAR”在本文中将可互换使用。术语“异源FAR”是指不是酵母细胞天然表达的FAR。

[0069] FAR催化两步反应(图1)

[0070] 酰基-CoA+2NADPH<＝>CoA+醇+2NADP(+)

[0071] 其中在第一步中，脂肪酰基-CoA被还原成脂肪醛，之后在第二步中脂肪醛被进一步还原成脂肪醇。脂肪酰基-CoA可以是去饱和脂肪酰基-CoA。

[0072] 能够催化这种反应的FAR是EC编号为1.2.1.84的成醇脂肪酰基-CoA还原酶。

[0073] 在一些实施方案中，所述FAR选自Har_FAR(SEQ ID NO:25，来自棉铃虫(Helicoverpa armigera)的FAR)或其变体(如经修饰的Har_FAR，如SEQ ID NO:27中所示)、Has_FAR(SEQ ID NO 29，来自烟夜蛾(Helicoverpa assulta)的FAR)或其变体(如经修饰的
Has_FAR，如SEQ ID NO:31中所示)、Hs_FAR(SEQ ID:33，来自Heliothis subflexa的FAR)或其变体(如经修饰的Hs_FAR，如SEQ ID NO:35中所示)和Ban_FAR(SEQ ID NO:45，来自
Bicyclus anynana的FAR)。在具体的实施方案中，所述FAR是如SEQ ID NO:25中所示的Har_FAR或其变体，如经修饰的Har_FAR，如SEQ ID NO:27中所示。

[0074] 在一个实施方案中，所述FAR是Har_FAR(SEQ ID NO:25，来自棉铃虫的FAR)或与Har_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Har_FAR(SEQ ID NO:25)具有如至少
76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少
83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少
90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少
97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0075] 在另一个实施方案中，所述FAR是经修饰的Har_FAR(SEQ ID NO:27，来自棉铃虫的FAR，其中信号肽已经被修饰为HDEL)或与其具有至少75％同源性的其变体，所述变体与如
SEQ ID NO:27中所示的经修饰的Har_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。

[0076] 在另一个实施方案中，所述FAR是Has_FAR(SEQ ID NO:29，来自烟夜蛾的FAR)或与Has_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Has_FAR(SEQ ID NO:29)具有如至少
76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少
83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少
90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少
97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0077] 在另一个实施方案中，所述FAR是经修饰的Has_FAR(SEQ ID NO:31，来自烟夜蛾的FAR，其中信号肽已经被修饰为HDEL)或与其具有至少75％同源性的其变体，所述变体与如
SEQ ID NO:31中所示的经修饰的Has_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。

[0078] 在另一个实施方案中，所述FAR是Hs_FAR(SEQ ID NO:33，来自Heliothis subflexa的FAR)或与Hs_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Hs_FAR(SEQ ID
NO:33)具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0079] 在另一个实施方案中，所述FAR是经修饰的Hs_FAR(SEQ ID NO:35，来自Heliothis subflexa的FAR，其中信号肽已经被修饰为HDEL)或与其具有至少75％同源性的其变体，所述变体与如SEQ ID NO:35中所示的经修饰的Hs_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少
78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少
85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少
92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少
99％、如100％同源性。

[0080] 在另一个实施方案中，所述FAR是Ban_FAR(SEQ ID NO:45，来自Bicyclus anynana的FAR)或与Hs_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Ban_FAR(SEQ ID NO:45)具
有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少
82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少
89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少
96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0081] 在一个实施方案中，所述FAR选自与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:45具有至少60％同源性的FAR。在另一个实施方案中，所述FAR选自与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35具有至少60％同源性的FAR。在另一个实施方案中，所述FAR选自与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:45具有至少60％同源性的FAR。在另一个实施方案中，所述FAR选自与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:45具有至少60％同源性的FAR。在另一个实施方案中，所述FAR选自与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:45具有至少60％同源性的FAR。

[0082] 在一些实施方案中，可以诱导去饱和酶和/或FAR的表达，例如如果编码这些酶的基因处于诱导型启动子的控制下的话，如本领域所已知的。将酵母细胞在合适的条件下(如在适当的培养基中且在适当的温度下)孵育，如本领域技术人员所已知的。支持酵母生长的合适培养基在本领域是已知的，并且包括但不限于：成分不明确的完全培养基，如YEPD(或YPD，Yeast Extract Peptone Dextrose)；成分明确的完全培养基，如SC(Synthetic
Complete)；缺乏一种或多种要素(如氨基酸或诱导物)的成分明确的补偿(drop-out)培养
基，如SD(Synthetic Dextrose)；或由盐、维生素和碳源组成的矿物质培养基等。

[0083] 异源脂肪酰基-CoA还原酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。

[0084] 在一些实施方案中，酵母细胞可以表达至少两种(如两种)异源还原酶。在一个具体实施方案中，酵母细胞表达来自棉铃虫的还原酶和来自H.subflexa的还原酶或如本文所
述的其变体。

[0085] 乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)

[0086] 术语“乙酰基转移酶”是指EC编号2.3.1.84的酶，也可以称为“醇-O-乙酰基转移酶”或“AcT”。所述酶作用于脂肪族醇，并且催化如下反应(图1)：

[0087] 乙酰基-CoA+醇<＝>CoA+乙酰基酯。

[0088] 本公开文本的酵母细胞优选地过表达乙酰基转移酶。乙酰基转移酶可以是待修饰的细胞已经能够表达的天然乙酰基转移酶，或者它可以是异源乙酰基转移酶。如果酵母细
胞表达天然乙酰基转移酶，则优选地修饰酵母细胞使得增加天然乙酰基转移酶的表达。这
可以通过本领域已知的方法完成，如但不限于在基因组中或在载体上引入编码乙酰基转移
酶的核酸的另外拷贝、将启动子修饰为具有高表达水平的组成型启动子或修饰为在诱导后
导致高表达水平的诱导型启动子。

[0089] 如果酵母细胞不表达天然乙酰基转移酶或者如果天然乙酰基转移酶的活性不足而导致滴度低，则可以在基因组位置中或在载体上将编码异源乙酰基转移酶的核酸引入细
胞中，以使能够表达乙酰基转移酶。优选地，以高水平表达乙酰基转移酶，例如通过引入编码乙酰基转移酶的核酸的多个拷贝，或通过利用具有高表达水平的组成型启动子或利用在
诱导后导致高表达水平的诱导型启动子。乙酰基转移酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒
等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。

[0090] 因此，术语“过表达”是指与未经修饰以过表达乙酰基转移酶的酵母细胞(即亲本菌株)相比，酵母细胞中乙酰基转移酶的过表达。

[0091] 在一些实施方案中，乙酰基转移酶是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0092] 在其他实施方案中，以化学方式完成至少一部分的由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醇向去饱和脂肪酰基乙酸酯的转化，如技术人员所已知的。例如，可以将乙酰氯添加到脂肪醇中，并且在混合后将混合物在室温下孵育。

[0093] 去饱和脂肪醇的产生

[0094] 本公开文本的酵母细胞可以用于产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯。酵母细胞优选地表达：

[0095] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；和

[0096] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)；以及

[0097] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶；

[0098] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0099] 酵母细胞、去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶和乙酰基转移酶都可以如上所述。

[0100] 因此，本公开文本的酵母细胞可以用于产生一系列去饱和脂肪醇，如：

[0101] -碳链长为14的(Z)-Δ5去饱和脂肪醇；

[0102] -碳链长为14的(E)-Δ5去饱和脂肪醇；

[0103] -碳链长为14的(Z)-Δ6去饱和脂肪醇；

[0104] -碳链长为14的(E)-Δ6去饱和脂肪醇；

[0105] -碳链长为14的(Z)-Δ7去饱和脂肪醇；

[0106] -碳链长为14的(E)-Δ7去饱和脂肪醇；

[0107] -碳链长为14的(Z)-Δ8去饱和脂肪醇；

[0108] -碳链长为14的(E)-Δ8去饱和脂肪醇；

[0109] -碳链长为14的(Z)-Δ9去饱和脂肪醇；

[0110] -碳链长为14的(E)-Δ9去饱和脂肪醇；

[0111] -碳链长为14的(Z)-Δ10去饱和脂肪醇；

[0112] -碳链长为14的(E)-Δ10去饱和脂肪醇；

[0113] -碳链长为14的(Z)-Δ11去饱和脂肪醇；

[0114] -碳链长为14的(E)-Δ11去饱和脂肪醇；

[0115] -碳链长为14的(Z)-Δ12去饱和脂肪醇；

[0116] -碳链长为14的(E)-Δ12去饱和脂肪醇；

[0117] -碳链长为14的(Z)-Δ13去饱和脂肪醇；以及

[0118] -碳链长为14的(E)-Δ13去饱和脂肪醇。

[0119] 因此，本文公开的酵母细胞可以表达异源Δ9去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生(Z)9-C14:OH，即碳链长为14的在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇。此脂肪醇是(Z)9-C14:OAc的前体，(Z)9-C14:OAc是衍生自多种物种(例如秋粘虫草地贪夜蛾
(Spodoptera frugiperda))的信息素的重要组分。

[0120] 在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生(Z)11-C14:OH，即碳链长为14的在位置11处具有Z构象的去饱和的脂肪醇。
此脂肪醇是(Z)11-C14:OAc的前体，(Z)11-C14:OAc是衍生自多种物种(例如欧洲玉米螟
(European corn borer Ostrinia nubilalis)和红带卷蛾(red-banded leafroller
Argyrotaenia velutinana))的信息素的重要组分。

[0121] 在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生(E)11-C14:OH，即碳链长为14的在位置11处具有E构象的去饱和的脂肪醇。
此脂肪醇是(E)11-C14:OAc的前体，(E)11-C14:OAc是衍生自多种物种(例如浅褐色苹果蛾
苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana))的信息素的重要组分。

[0122] 由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醇可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪醇可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。

[0123] 例如，可以产生碳链长为14的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醇。可以产生碳链长为14的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醇。可以产生碳链长为14的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醇。

[0124] 由此产生的去饱和脂肪醇可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短，以便获得具有小于14(如12、10、8、6或4)的碳链的去饱和脂肪醇。因此，可以产生碳链长为12的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醇，可以产生碳链长为12的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪
醇，并且可以产生碳链长为12的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醇。

[0125] 为了进一步增加去饱和脂肪醇的产生，使编码脂肪酶的一种或多种基因突变以使对应的脂肪酶具有部分或完全的活性丧失可能是有益的。因此，在一些实施方案中，酵母细胞可以如本文所述并且另外携带一个或多个导致一种或多种脂肪酶的活性完全或部分丧
失的突变。

[0126] 本领域已知存在许多编码脂肪酶的基因。它们的表达和/或活性可以随培养酵母细胞的培养基而变。因此，培养基的选择可以帮助选择应该使哪种脂肪酶基因缺失或突变，以使对应的脂肪酶在所述培养基中具有降低的活性或完全的活性丧失。

[0127] 几种脂肪酶可以同时在一种培养基中具有活性。因此，在一些实施方案中，酵母细胞具有几个导致几种脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。为了限制脂肪酰基乙酸酯的降解，在一些实施方案中，酵母细胞具有几个导致已知或怀疑在给定培养基中具有活性的所
有脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。

[0128] 举例来说，当使细胞在葡萄糖上生长时，脂肪酶2、脂肪酶5和脂肪酶8是在解脂耶氏酵母中有活性的主要脂肪酶。因此，如果使用基于葡萄糖的培养基，则可以考虑脂肪酶2、脂肪酶5和脂肪酶8中的一种、两种或全部的活性的完全或部分丧失。

[0129] 在一些实施方案中，所述脂肪酶与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2具有至少60％同源性，如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少
73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少
80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少
87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少
94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。在其他实施方案中，所述脂肪酶与如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7具有至
少60％同源性，如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少
74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少
81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少
88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少
95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。在其他实施方案中，所述脂肪酶与如SEQ ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性，如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少
65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少
75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少
82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少
89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少
96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0130] 在一些实施方案中，酵母细胞具有：

[0131] -导致与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变；和

[0132] -导致与如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。

[0133] 在其他实施方案中，酵母细胞具有：

[0134] -导致与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变；和

[0135] -导致与如SEQ ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。

[0136] 在其他实施方案中，酵母细胞具有：

[0137] -导致与如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变；和

[0138] -导致与如SEQ ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。

[0139] 在一些实施方案中，酵母细胞具有：

[0140] -导致与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变；和

[0141] -导致与如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变；和

[0142] -导致与如SEQ ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性的脂肪酶的活性完全或部分丧失的突变。

[0143] 去饱和脂肪酰基乙酸酯的产生

[0144] 本公开文本的酵母细胞可以任选地表达或过表达能够将至少一部分的由细胞产生的去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的天然或异源乙酰基转移酶，并且因此可
以用于产生一系列去饱和脂肪乙酸酯，如：

[0145] -碳链长为14的(Z)-Δ5去饱和脂肪乙酸酯；

[0146] -碳链长为14的(E)-Δ5去饱和脂肪乙酸酯；

[0147] -碳链长为14的(Z)-Δ6去饱和脂肪乙酸酯；

[0148] -碳链长为14的(E)-Δ6去饱和脂肪乙酸酯；

[0149] -碳链长为14的(Z)-Δ7去饱和脂肪乙酸酯；

[0150] -碳链长为14的(E)-Δ7去饱和脂肪乙酸酯；

[0151] -碳链长为14的(Z)-Δ8去饱和脂肪乙酸酯；

[0152] -碳链长为14的(E)-Δ8去饱和脂肪乙酸酯；

[0153] -碳链长为14的(Z)-Δ9去饱和脂肪乙酸酯；

[0154] -碳链长为14的(E)-Δ9去饱和脂肪乙酸酯；

[0155] -碳链长为14的(Z)-Δ10去饱和脂肪乙酸酯；

[0156] -碳链长为14的(E)-Δ10去饱和脂肪乙酸酯；

[0157] -碳链长为14的(Z)-Δ11去饱和脂肪乙酸酯；

[0158] -碳链长为14的(E)-Δ11去饱和脂肪乙酸酯；

[0159] -碳链长为14的(Z)-Δ12去饱和脂肪乙酸酯；

[0160] -碳链长为14的(E)-Δ12去饱和脂肪乙酸酯；

[0161] -碳链长为14的(Z)-Δ13去饱和脂肪乙酸酯；以及

[0162] -碳链长为14的(E)-Δ13去饱和脂肪乙酸酯。

[0163] 因此，在一个实施方案中，酵母细胞表达异源Δ9去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且可以用于获得(Z)9-C14:OAc，即碳链长为14的在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪酰基乙酸酯。此脂肪酰基乙酸酯是衍生自多种物种(例如秋粘虫草地贪夜蛾)的信息素的
重要组分。

[0164] 在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且可以用于产生(Z)11-C14:OAc，即碳链长为14的在位置11处具有Z构象的去饱和脂肪酰
基乙酸酯。此脂肪酰基乙酸酯是衍生自多种物种(例如欧洲玉米螟(European corn borer
Ostrinia nubilalis)和红带卷蛾(red-banded leafroller Argyrotaenia velutinana))
的信息素的重要组分。

[0165] 在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且可以用于产生(E)11-C14:OAc，即碳链长为14的在位置11处具有E构象的去饱和的脂肪
酰基乙酸酯。此脂肪酰基乙酸酯是衍生自多种物种(例如浅褐色苹果蛾苹果褐卷蛾)的信息
素的重要组分。

[0166] 由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪乙酸酯可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪乙酸酯可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。

[0167] 例如，可以产生碳链长为14的(E)7,(Z)9去饱和脂肪乙酸酯。可以产生碳链长为14的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪乙酸酯。可以产生碳链长为14的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和
脂肪乙酸酯。

[0168] 由此产生的去饱和脂肪乙酸酯可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短，以便获得具有小于14(如12、10、8、6或4)的碳链的去饱和脂肪乙酸酯。因此，可以产生碳链长为12的(E)7,(Z)9去饱和脂肪乙酸酯，可以产生碳链长为12的(E)3,(Z)8,(Z)11
去饱和脂肪乙酸酯，并且可以产生碳链长为12的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪乙酸酯。

[0169] 去饱和脂肪醛的产生

[0170] 虽然本公开文本提供了用于产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法，但是可能感兴趣的是将所述脂肪醇进一步转化为对应的醛。因此，在一些实施方案中，所述方法还可以包括将至少一部分的脂肪醇转化为脂肪醛的步骤，从而产生脂肪醛。这可以通
过化学方法或通过进一步工程化酵母细胞来实现。

[0171] 在一些实施方案中，将至少一部分的脂肪醇转化为对应的醛的步骤是化学转化的步骤。化学转化是基于将脂肪醇氧化成对应的醛。用于进行这种转化的方法在本领域是已
知的。优选的方法是环境友好的并且使有害废物的量最小化。

[0172] 因此，在一些实施方案中，化学转化可以是不含金属的，避免有毒的重金属基试剂，如氧化锰、氧化铬(Jones ox.PDC、PCC)或钌化合物(TPAP、Ley-Griffith ox.)。在一些实施方案中，转化不涉及与活化的二甲基亚砜的反应，例如Swern氧化或Pfitzner-Moffat
类型。此类反应可能涉及刻板形成痕量的可能难以从目标产物中除去的有强烈气味的有机
硫化合物，如二甲基硫醚。

[0173] 在一些实施方案中，所述方法包括Dess-Martin反应(Yadav等人,2004；Meyer等人,1994)。在一些实施方案中，所述方法包括铜(I)/ABNO催化的需氧醇氧化反应(Steves&
Stahl,2013)。

[0174] 在其他实施方案中，化学转化包括在水/有机两相条件下用次氯酸钠氧化(Okada等人,2014；Tamura等人,2012；Li等人,2009)。在一些实施方案中，可以在含有25％吡啶的二氯甲烷介质中用1-氯苯并三唑进行化学氧化(Ferrell和Yao,1972)。

[0175] 可替代地，脂肪醇氧化成对应的脂肪醛可以通过醇脱氢酶酶促地进行。技术人员将知道如何进行酶促氧化。例如，可以通过使经纯化的酶、细胞提取物或全细胞与脂肪醇接触来进行酶促氧化。

[0176] 通过引入编码成醛脂肪酰基-CoA还原酶EC 1.2.1.50(FAR')的基因，可以将通过本文所述的细胞和方法可获得的脂肪醇进一步转化为脂肪醛。以这种方式，至少一部分的去饱和脂肪酰基-CoA可以被成醛脂肪酰基-CoA还原酶(FAR')转化为对应的脂肪醛。能够催化此转化的酶可以催化还原反应，其中脂肪酰基-CoA被还原成脂肪醛。此类酶是EC编号为1.2.1.50的成醛脂肪酰基-CoA还原酶，在本文中也称为FAR'或“成醛FAR'”。它们催化以下反应：

[0177] 脂肪酰基-CoA+NADPH＝脂肪醛+NADP++辅酶A。

[0178] 在一些实施方案中，可以诱导成醛FAR'的表达，例如如果编码此酶的基因处于诱导型启动子的控制下的话，如本领域所已知的。将酵母细胞在合适的条件下(如在适当的培养基中且在适当的温度下)孵育，如本领域技术人员所已知的。支持酵母生长的合适培养基在本领域是已知的，并且包括但不限于：成分不明确的完全培养基，如YEPD(或YPD，Yeast Extract Peptone Dextrose)；成分明确的完全培养基，如SC(Synthetic Complete)；或缺乏一种或多种要素(如氨基酸或诱导物)的成分明确的补偿培养基，如SD(Synthetic
Dextrose)。

[0179] 因此，可以获得以下醛：

[0180] -碳链长为14的(Z)-Δ5去饱和脂肪醛；

[0181] -碳链长为14的(E)-Δ5去饱和脂肪醛；

[0182] -碳链长为14的(Z)-Δ6去饱和脂肪醛；

[0183] -碳链长为14的(E)-Δ6去饱和脂肪醛；

[0184] -碳链长为14的(Z)-Δ7去饱和脂肪醛；

[0185] -碳链长为14的(E)-Δ7去饱和脂肪醛；

[0186] -碳链长为14的(Z)-Δ8去饱和脂肪醛；

[0187] -碳链长为14的(E)-Δ8去饱和脂肪醛；

[0188] -碳链长为14的(Z)-Δ9去饱和脂肪醛；

[0189] -碳链长为14的(E)-Δ9去饱和脂肪醛；

[0190] -碳链长为14的(Z)-Δ10去饱和脂肪醛；

[0191] -碳链长为14的(E)-Δ10去饱和脂肪醛；

[0192] -碳链长为14的(Z)-Δ11去饱和脂肪醛；

[0193] -碳链长为14的(E)-Δ11去饱和脂肪醛；

[0194] -碳链长为14的(Z)-Δ12去饱和脂肪醛；

[0195] -碳链长为14的(E)-Δ12去饱和脂肪醛；

[0196] -碳链长为14的(Z)-Δ13去饱和脂肪醛；以及

[0197] -碳链长为14的(E)-Δ13去饱和脂肪醛。

[0198] 由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醛可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪醛可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。

[0199] 例如，可以产生碳链长为14的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醛。可以产生碳链长为14的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醛。可以产生碳链长为14的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醛。

[0200] 由此产生的去饱和脂肪醛可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短，以便获得具有小于14(如12、10、8、6或4)的碳链的去饱和脂肪醛。因此，可以产生碳链长为12的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醛，可以产生碳链长为12的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪
醛，并且可以产生碳链长为12的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醛。

[0201] 脂肪酰基-CoA

[0202] 为了使酵母细胞产生如本文所述的去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯，需要提供以脂肪酰基-CoA作为底物的酵母细胞。优选地，脂肪酰基-CoA的碳链长为14并且是肉
豆蔻酰基-CoA。

[0203] 此类脂肪酰基-CoA可以在孵育酵母细胞的培养基中提供，或者酵母细胞可以天然地能够产生这种脂肪酰基-CoA，或者可以将酵母细胞工程化以便产生或以便增加此类脂肪
酰基-CoA的产生。优选地，为酵母细胞提供肉豆蔻酰基-CoA或者酵母细胞能够产生肉豆蔻
酰基-CoA。

[0204] 在一些实施方案中，酵母细胞不能天然地产生碳链长为14的脂肪酰基-CoA。在这种情况下，可以如本领域所已知的那样工程化酵母细胞，例如通过引入异源硫酯酶。因此，在一些实施方案中，将编码硫酯酶的核酸引入酵母细胞中、引入载体上或通过基因组整合
引入。硫酯酶基因可以处于诱导型启动子的控制下，或者处于组成型启动子的控制下。可以针对酵母细胞对编码硫酯酶的核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。特别地，可以针对耶氏酵母属(Yarrowia)细胞(如解脂耶氏酵母细胞)对核酸进行密码子优化。

[0205] 在一些实施方案中，硫酯酶衍生自选自湿地萼距花(Cuphea palustris)、萼距花(Cuphea hookeriana)、香樟(Cinnamomum camphora)或选自大肠杆菌(Escherichia coli)
的生物。在优选的实施方案中，硫酯酶衍生自大肠杆菌或香樟。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的衍生自萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的
衍生自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述
硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生
自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID
NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0206] 在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性，如与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少61％
同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少
76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少
83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少
90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少
97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0207] 在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性，如与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有
至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。

[0208] 可以对编码硫酯酶的核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。在一个实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，优选地解脂耶氏酵母细胞，并且相应地对核酸进行密码子优化。

[0209] 在一个实施方案中，所述至少一种硫酯酶由与如SEQ ID NO:39中所示的编码衍生自香樟的硫酯酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:39中所
示的编码来自香樟的硫酯酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少
63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少
72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。

[0210] 在一个实施方案中，所述至少一种硫酯酶由与如SEQ ID NO:41中所示的编码衍生自大肠杆菌的硫酯酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:41
中所示的编码来自大肠杆菌的硫酯酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、
如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少
67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少
78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少
85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少
92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少
99％、如100％同源性。

[0211] 在一些实施方案中，可以增加或进一步增加链长为14的脂肪酸的可用性。例如，可以工程化脂肪酸合酶复合物，使得增加C14-脂肪酰基-CoA的形成。脂肪酸合酶复合物(EC 2.3.1.86)由两个亚基Fas1(β亚基)和Fas2(α亚基)组成。α亚基包含酮酰基合酶结构域(“结合口袋”)，其被假设参与决定合成的脂肪酸的长度。在解脂耶氏酵母中，天然(野生型)FAS2如SEQ ID NO:71中所示。

[0212] 因此，为了将代谢流引导至产生链长为14C的去饱和脂肪醇、乙酸酯或醛，酵母细胞还可以表达具有经修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体。不受理论束缚，假设经修
饰的酮合酶结构域产生经修饰的结合口袋，其因此更容易适应中等长度的底物(如C14底
物)，从而产生更高比例的C14产物。

[0213] 在一个实施方案中，酵母细胞是如本文所述的解脂耶氏酵母细胞，其中细胞还表达经修饰的脂肪酸合酶复合物。在一个实施方案中，通过使编码复合物的α亚基的基因突变来修饰脂肪酸合酶复合物。在一些实施方案中，突变在编码FAS2的基因中。突变可以导致
SEQ ID NO:71的残基1220(I1220)、残基1217(M1217)或残基1226(M1226)中的一个或多个
的修饰，产生变体FAS2。技术人员将知道如何设计此类突变。

[0214] 优选地，突变产生I1220F变体、I1220W变体、I1220Y变体或I1220H变体。在一个具体实施方案中，突变产生I1220F变体。在一些实施方案中，突变产生M1217F变体、M1217W变体、M1217Y变体或M1217H变体。在其他实施方案中，突变产生M1226F变体、M1226W变体、M1226Y变体或M1226H变体。还考虑了具有多于一个上述突变(如在残基I1220、M1217或
M1226处的两个突变或三个突变)的酵母细胞。

[0215] 酵母细胞

[0216] 本公开文本提供了酵母细胞，其已经经修饰以产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯。去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯是信息素的组分，特别是蛾信息
素的组分。因此，本文公开的酵母细胞为环境友好的蛾信息素生产提供了平台。

[0217] 酵母细胞可以是非天然存在的酵母细胞，例如已经工程化以产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯的酵母细胞。

[0218] 在一些实施方案中，细胞已经在基因组水平上进行了修饰，例如通过在基因组中进行基因编辑。还可以通过插入至少一种核酸构建体(如至少一种载体)来修饰细胞。可以
如技术人员所已知的那样设计载体，以使核酸序列能够整合到基因组中，或者能够在不进
行基因组整合的情况下表达由包含在载体中的核酸序列编码的多肽。

[0219] 酵母细胞可以属于选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和
油脂酵母属(Lipomyces)的属。在一个优选的实施方案中，所述属是酵母属或耶氏酵母属，最优选地所述属是耶氏酵母属。

[0220] 酵母细胞可以属于选自酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母
(Lipomyces lipofera)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母
(Rhodosporidium toruloides)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、普鲁兰丝孢酵母
(Trichosporon pullulan)和解脂耶氏酵母的物种。在优选的实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞或解脂耶氏酵母细胞，最优选地酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞。

[0221] 待修饰的酵母细胞(也称为宿主细胞)可以表达天然酶，其与产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯所必需的酶属于相同类别。然而，在一些情况下，此类天然酶可能对可以获得的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的滴度产生负面影响；因此，可以通过本领域已知的方法(如基因编辑)使天然酶失活。例如，可以使编码对滴度具有负面影响
的天然酶的基因缺失或突变，从而导致天然酶的活性完全或部分丧失。

[0222] 本公开文本的酵母细胞表达至少一种如本文所述的能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如本文所述的能够将至少一部分的
所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶和任选地能够
将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶，其中所
述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂
肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六烷酰基-CoA的特
异性。在一些实施方案中，酵母还表达乙酰基转移酶。在一些实施方案中，酵母还表达硫酯酶。

[0223] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0224] i)至少一种异源Δ3去饱和酶；和

[0225] ii)至少一种异源FAR；并且

[0226] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0227] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0228] 其中Δ3去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置3中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶衍生自香樟(如SEQ ID NO:40中所示)或衍生自大
肠杆菌(如SEQ ID NO:42中所示)。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所
示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0229] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0230] i)至少一种异源Δ5去饱和酶；和

[0231] ii)至少一种异源FAR；并且

[0232] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0233] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0234] 其中Δ5去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置5中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0235] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0236] i)至少一种异源Δ6去饱和酶；和

[0237] ii)至少一种异源FAR；并且

[0238] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0239] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0240] 其中Δ6去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置6中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0241] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0242] i)至少一种异源Δ7去饱和酶；和

[0243] ii)至少一种异源FAR；并且

[0244] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0245] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0246] 其中Δ7去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置7中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0247] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0248] i)至少一种异源Δ8去饱和酶；和

[0249] ii)至少一种异源FAR；并且

[0250] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0251] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0252] 其中Δ8去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置8中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0253] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0254] i)至少一种异源Δ9去饱和酶；和

[0255] ii)至少一种异源FAR；并且

[0256] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0257] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0258] 其中Δ9去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置9中去饱和的脂肪醇。乙酰基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性
的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0259] 在一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0260] -与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0261] -与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的Har_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的Har_FAR具有如至少76％、如至少
77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少
84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少
91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少
98％、如至少99％、如100％同源性；

[0262] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0263] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0264] -与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0265] -与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的Has_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的Has_FAR具有如至少76％、如至少
77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少
84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少
91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少
98％、如至少99％、如100％同源性；

[0266] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0267] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0268] -与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0269] -与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的Hs_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的Hs_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；

[0270] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0271] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0272] -与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0273] -与如SEQ ID NO:45中所示的Ban_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:45中所示的Ban_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；

[0274] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0275] 在一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0276] -与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0277] -与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的Har_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的Har_FAR具有如至少76％、如至少
77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少
84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少
91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少
98％、如至少99％、如100％同源性；

[0278] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0279] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0280] -与如SEQ ID NO:12中所示的来自夜斜纹蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:12中所示的来自夜斜纹蛾的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0281] -与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的Has_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的Has_FAR具有如至少76％、如至少
77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少
84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少
91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少
98％、如至少99％、如100％同源性；

[0282] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0283] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0284] -与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0285] -与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的Hs_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的Hs_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；

[0286] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0287] 在另一个特定实施方案中，酵母细胞表达：

[0288] -与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和
酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；和

[0289] -与如SEQ ID NO:45中所示的Ban_FAR具有至少75％同源性的FAR，所述FAR与如SEQ ID NO:45中所示的Ban_FAR具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性；

[0290] -并且任选地表达或过表达乙酰基转移酶和/或硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌
的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示
的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ
ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0291] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0292] i)至少一种异源Δ10去饱和酶；和

[0293] ii)至少一种异源FAR；并且

[0294] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0295] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0296] 其中Δ10去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置10中去饱和的脂肪醇。乙酰
基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源
性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0297] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0298] i)至少一种异源Δ11去饱和酶；和

[0299] ii)至少一种异源FAR；并且

[0300] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0301] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0302] 其中Δ11去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置11中去饱和的脂肪醇。乙酰
基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源
性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0303] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0304] i)至少一种异源Δ12去饱和酶；和

[0305] ii)至少一种异源FAR；并且

[0306] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0307] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0308] 其中Δ12去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置12中去饱和的脂肪醇。乙酰
基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源
性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0309] 在一个实施方案中，酵母细胞表达：

[0310] i)至少一种异源Δ13去饱和酶；和

[0311] ii)至少一种异源FAR；并且

[0312] iii)任选地过表达乙酰基转移酶，并且

[0313] iv)任选地过表达硫酯酶，

[0314] 其中Δ13去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性，由此酵母细胞产生碳链长为14且在位置13中去饱和的脂肪醇。乙酰
基转移酶可以是SEQ ID NO:21的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源
性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:21具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少
79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少
86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少
93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如
100％同源性。在一些实施方案中，所述硫酯酶与选自以下的硫酯酶具有至少60％同源性：
如SEQ ID NO:23中所示的衍生自湿地萼距花的硫酯酶、如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距
花的硫酯酶、如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶和如SEQ ID NO:42中所示的来自
大肠杆菌的硫酯酶。优选地，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶
或如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。在一个实施方
案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的衍生自香樟的硫酯酶具有至少60％同源性。
在另一个实施方案中，所述硫酯酶与如SEQ ID NO:42中所示的衍生自大肠杆菌的硫酯酶具
有至少60％同源性。

[0315] 在一些实施方案中，酵母细胞还具有一个或多个导致一种或多种脂肪酶的活性部分或完全丧失的突变，如上文所详述。在一些实施方案中，酵母细胞还具有导致脂肪酰基合酶复合物的一个或多个亚基修饰的突变；特别是考虑了导致酮合酶结构域修饰的突变，如
上文所详述。

[0316] 在一些实施方案中，酵母细胞还具有一个或多个导致一种或多种脂肪酶的活性部分或完全丧失的突变以及导致脂肪酰基合酶复合物的一个或多个亚基的一种或多种修饰
的突变，特别是导致酮合酶结构域修饰的突变，如上文所详述。

[0317] 核酸

[0318] 应理解，贯穿本公开文本，术语“编码活性的核酸”应指代能够编码具有所述活性的肽、蛋白质或其片段的核酸分子。此类核酸分子可以是开放阅读框或基因或其片段。核酸构建体也可以是一组核酸分子，它们一起可以编码具有目标活性的几种肽、蛋白质或其片段。术语“活性”或“目标活性”是指以下活性中的一种：如本文所述的去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶、成醛脂肪酰基coA还原酶、硫酯酶和/或乙酰基转移酶活性。所述一种或多种目标活性的性质将取决于希望用本发明方法获得的所需产物的性质。

[0319] 在本发明方法的一些实施方案中，编码本发明活性中的每一种(即如本文所述的去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶、成醛脂肪酰基-CoA还原酶、硫酯酶和/或乙酰基转移酶)的核酸中的每一种可以包含在酵母细胞的基因组内或包含在酵母细胞内包含的载体内。

[0320] 在一些实施方案中，编码本发明活性中的每一种的核酸中的每一种可以存在于所述酵母细胞的基因组中，或者因为核酸编码天然蛋白质，或者因为它已经通过基因组工程
或基因组编辑或者通过使不同交配类型的酵母细胞杂交整合在其中。用于整合核酸的方法
在本领域是熟知的。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码目标活性。可以对编码所述活性的异源核酸进行密码子优化，或者所述异源核酸可以包含可以
帮助改善活性的特征。例如，可以修饰异源核酸以编码经修饰的蛋白质。此类修饰包括但不限于引入定位信号、功能获得或功能丧失突变、蛋白质与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予提高的稳定性和/或半衰期的修饰。

[0321] 编码目标活性的异源核酸的引入可以通过本领域已知的方法进行。技术人员将认识到此类方法包括但不限于：基于克隆和同源重组的方法。克隆方法可以涉及在诸如大肠
杆菌等生物中设计和构建质粒。质粒可以是整合型或非整合型载体。无克隆方法包括基于
同源重组的方法，如适配体介导的PCR或缺口修复。此类方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。

[0322] 编码目标活性的核酸能以高拷贝数存在。

[0323] 用于产生去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法

[0324] 本文提供了用于在酵母细胞中产生去饱和脂肪酸和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所
述酵母细胞表达：

[0325] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；和

[0326] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；以及

[0327] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶，从而产生所述去饱和脂肪酰基乙酸酯；

[0328] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0329] 酵母细胞可以能够天然地合成十四烷酰基-CoA，或者可以被工程化以合成十四烷酰基-CoA，或者可以在孵育细胞的培养基中提供十四烷酰基-CoA，如部分“脂肪酰基-CoA”中所述。所述至少一种异源去饱和酶和至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶可以如本文其他
地方所述。酵母细胞可以如上所述。

[0330] 本文所述的酵母细胞可以用于产生具有前所未有的滴度的链长为14的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法中。

[0331] 特别地，在一些实施方案中，去饱和十四烷酰基-CoA与去饱和十六烷酰基-CoA的比率为至少0.1，如至少0.2、如至少0.3、如至少0.4、如至少0.5、如至少0.75、如至少1、如至少2、如至少3、如至少4、如至少5、如至少6、如至少7、如至少8、如至少9、如至少10、如至少
12.5、如至少15或更高。

[0332] 在一些实施方案中，所述方法产生滴度为至少1mg/L(如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少
500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L或更高)的去饱和脂肪醇。

[0333] 在一些实施方案中，所述方法产生滴度为至少1mg/L(如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少
500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L或更高)的链长为14的去饱和脂肪醇。

[0334] 在一些实施方案中，所述方法产生去饱和脂肪醇，其包含至少1％(如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少4.5％、如至少5％、如至少7.5％、如至少10％或更多)的链长为14的去饱和脂肪醇。

[0335] 在一些实施方案中，所述方法产生滴度为至少1mg/L(如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少
500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L或更高)的去饱和脂肪乙酸酯。

[0336] 在一些实施方案中，所述方法产生滴度为至少1mg/L(如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少
500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L或更高)的链长为14的去饱和脂肪乙酸酯。

[0337] 在一些实施方案中，所述方法产生去饱和脂肪乙酸酯，其包含至少1％(如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少4.5％、如至少5％、如至少7.5％、如至少10％)的链长为14的去饱和脂肪乙酸酯。

[0338] 在一些实施方案中，酵母细胞还可以表达如上文所述的成醛脂肪酰基-CoA还原酶EC 1.2.1.50(FAR')。

[0339] 回收

[0340] 可能需要回收通过本文公开的方法获得的产物。因此，本发明方法可以包括回收由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的另外的步骤。

[0341] 在一些实施方案中，所述方法包括回收去饱和脂肪醇的步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括回收碳链长为14的去饱和脂肪醇的步骤。在其他实施方案中，所述方法包括回收脂肪酰基乙酸酯的步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括回收碳链长为14
的脂肪酰基乙酸酯的步骤。

[0342] 用于回收通过本发明获得的产物的方法在本领域是已知的，并且可以包括用疏水性溶剂(如癸烷、己烷或植物油)进行提取。

[0343] 可以进一步修饰所回收的产物，例如如上所述，可以将去饱和脂肪醇转化为对应的去饱和脂肪醛。

[0344] 也可以将所回收的产物(即去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯)配制成信息素组合物。所述组合物还可以包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。
由所述去饱和脂肪醇得到的脂肪醛也可以包含在此类组合物中。

[0345] 试剂盒

[0346] 本文提供了用于进行本发明方法的部件试剂盒。所述部件试剂盒可以包含如本文所述的“即用型”的酵母细胞。在一个实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。

[0347] 在另一个实施方案中，所述部件试剂盒包含编码待引入酵母细胞中的目标活性的核酸构建体。核酸构建体可以作为多种核酸构建体来提供，如多种载体，其中每种载体编码一种或几种所需活性。

[0348] 所述部件试剂盒可以任选地包含待修饰的酵母细胞。

[0349] 在一些实施方案中，所述部件试剂盒包含所有上述项。

[0350] 信息素组合物

[0351] 因此，本公开文本提供了化合物(特别是脂肪醇和脂肪酰基乙酸酯)以及它们的衍生物和它们的用途。特别地，使用本发明细胞和方法可获得的化合物可用作信息素组合物
的组分。此类信息素组合物可用于综合害虫治理。它们可以如本领域所已知的那样用于例
如交配干扰。

[0352] 可以将通过本发明方法或使用本发明酵母细胞可获得的去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯配制在信息素组合物中。

[0353] 此类信息素组合物可以用作综合害虫治理产品，其可以用于监测害虫存在的方法中或用于干扰害虫交配的方法中。

[0354] 如本文公开的信息素组合物可以用作生物农药。可以将此类组合物喷洒或分配在培养物上、在田间或在果园中。如本领域所已知的，也可以将它们浸泡在例如橡胶隔垫上，或者与其他组分混合。这可以导致交配干扰，从而防止害虫繁殖，或者它可以与诱捕装置组合使用以捕获害虫。可以使用本发明信息素组合物对抗的害虫的非限制性例子是：棉铃虫
(cotton bollworm/Helicoverpa armigera)、条纹螟虫(striped stemborer)(二化螟
(Chilo suppressalis))、小菜蛾(diamond back moth/Plutella xylostella)、甘蓝夜蛾
(cabbage moth/Mamestra brassicae)、大甘蓝心毛毛虫(large cabbage-heart
caterpillar)(大菜螟(Crocidolomia binotalis))、欧洲玉米秆蛀虫(European corn
stalk borer)(蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))、醋栗透翅蛾(currant clearwing)(茶
藨子透翅蛾(Synanthedon tipuliformis))和洋蓟羽蛾(artichoke plume moth/
Platyptilia carduidactylal)。因此，将本发明组合物用于培养物可以提高作物产量，基本上没有环境影响。

[0355] 本发明信息素组合物中脂肪醇和脂肪酰基乙酸酯的相对量可以根据作物的性质和/或待控制的害虫而变化；也可能存在地理差异。因此，确定最佳相对量可能需要常规优化。所述信息素组合物还可包含脂肪醛。

[0356] 用作驱虫剂的组合物的例子可见于Kehat&Dunkelblum,1993(针对棉铃虫)；Alfaro等人,2009(针对二化螟)；Eizaguirre等人,2002(针对蛀茎夜蛾)；Wu等人,2012(针
对小菜蛾)；Bari等人,2003(针对洋蓟羽蛾)。

[0357] 在一些实施方案中，所述信息素组合物还可以包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。例如，合适的载体或基质包括植物油、精制矿物油或其馏分、橡胶、塑料、二氧化硅、硅藻土、蜡模和纤维素粉末。

[0358] 可以如本领域所已知的那样配制信息素组合物。例如，它可以呈溶液、凝胶、粉末的形式。可以配制信息素组合物使得其易于分配，如本领域所已知的。

[0359] 实施例

[0360] 实施例1：质粒和菌株的构建

[0361] 以解脂耶氏酵母的密码子优化形式通过GeneArt(Life Technologies)合成编码来自天竺葵(SEQ ID NO:1)和蓖麻(SEQ ID NO:3)的去饱和酶的基因。以酿酒酵母的密码子
优化形式通过GeneArt合成编码来自脐橙螟(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)、来自黑腹果蝇
(SEQ ID NO:9)的去饱和酶和来自酿酒酵母的OLE1的基因。编码脐橙螟去饱和酶和酿酒酵
母去饱和酶OLE1的合成基因掺入了attB1-attB2位点，其允许通过Gateway克隆系统
(Invitrogen： Technology Manual)将这些基因克隆到载体pDONR221中。
[http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf]。从酿酒酵母菌
株CEN.PK102-5B的基因组DNA制剂中扩增编码醇乙酰基转移酶ATF1的基因(SEQ ID NO:
19)。修饰编码来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶的基因，使得其推定的天然KKSYE信号被来自
酿酒酵母的HDEL信号替换，并且也以酿酒酵母的密码子优化形式通过GeneArt(Life
Technologies)合成此基因。通过PCR扩增所有基因以获得用于克隆到酵母表达载体中的片
段。引物列于表1中，并且得到的DNA片段列于表2中。在含有RedSafeTM(iNtRON
Biotechnology)的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。从凝胶上切下正确大小的PCR产物，并使用凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。

[0362] 表1：引物。

[0363]

[0364]

[0365]

[0366] 表2：使用所指示模板和引物通过PCR获得的DNA片段。

[0367]

[0368]

[0369] 实施例2：载体pYEX-CHT-Dmd9、pYEX-CHT-Phd9、pYEX-CHT-Rcd9、pYEX-CHT-Atrd1432、pYEX-CHT-Atrd236和pYEX-CHT-OLE1的克隆

[0370] 根据制造商的方案，通过使用Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)(ThermoFisher Scientific)分别从质粒pCfB5316、pCfB4584和pCfB4585中扩增DNA片段
BB1870、BB1871和BB1872。PCR混合物含有20μl水、25μl Maxima Hot Start Green PCR Master Mix、2.5μl正向引物(10μM)、2.5μl反向引物(10μM)和5ng DNA模板，并且使用以下PCR程序：94℃持续2min，35个循环的[94℃持续15sec、55℃持续30sec、72℃持续2min
30sec]，72℃持续7min。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。从凝胶上切下正确大小的PCR产物，并使用凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。

[0371] 通过Gateway克隆技术将得到的DNA片段(BB1870、BB1871和BB1872)克隆到pDONR 221中，产生所谓的“入门克隆”(ThermoFisher Scientific)。通过混合100ng合成基因、
100ng pDONR 221和1μL BP克隆酶(Life Technologies)进行BP反应。将反应在室温下孵育
1小时。将反应混合物通过热休克转化到大肠杆菌感受态HB101细胞(Life Technologies)
中，并且将细胞铺板在含50mg/L卡那霉素的Lysogeny Broth(LB)琼脂板上，并且在37℃下
孵育过夜。将单菌落接种到13-ml无菌管中的含50mg/L卡那霉素的5ml液体LB中，并且伴随
振荡培养过夜。从过夜大肠杆菌培养物中纯化质粒，并且测序以确认正确的克隆。通过将
100ng入门克隆与100ng指定载体pYEX-CHT-DEST和1μL LR克隆酶(Invitrogen)混合，使基
因从入门克隆穿梭到指定酵母表达载体pYEX-CHT-DEST中(Ding BJ,Carraher C,
C.2016.Sequence variation determining stereochemistry of aΔ11desaturase
active in moth sex pheromone biosynthesis.Insect Biochem Mol Biol.74:68-
75.doi:10.1016/j.ibmb.2016.05.002.)。将反应在室温下孵育1小时，然后通过热休克转
化到大肠杆菌感受态HB101细胞中。将细胞铺板在含100mg/L氨苄青霉素的Lysogeny Broth
(LB)琼脂板上。从过夜大肠杆菌培养物中纯化质粒，并且通过测序确认正确的克隆。

[0372] 实施例3：载体pCfB5316、pCfB4584、pCfB4585、pCfB4580的克隆

[0373] 如下通过PCR扩增DNA生物砖BB0410、BB1696、BB0301、BB1420、BB0301、BB1421、BB0464、BB0915和BB1422。PCR混合物含有32μl水、10μl高保真聚合酶缓冲液(5x)、1μl dNTP(10mM)、1μl Phusion U聚合酶、2.5μl正向引物(10μM)、2.5μl反向引物(10μM)和1μl DNA模板，并且使用以下PCR程序：94℃持续2min，30个循环的[94℃持续15sec、52℃持续20sec、68℃持续1min 30sec]，68℃持续2min，在10℃下暂停。

[0374] 整合型载体EasyClone 2.0pCfB2909(XII-5-MarkerFree)描述于Jessop-Fabre等人,2016中，并且pCfB2190描述于Stovicek等人,2015中。如Stovicek等人,2015中所述，通过DNA片段BB0593(含有pCfB387载体主链)和BB0598(含有诺尔丝菌素抗性盒)的USER融合
构建质粒pCfB2912。将所有整合型载体用 AsiSI(Fermentas)在37℃下线性化
2小时，然后用Nb.BsmI(New England Biolabs)在65℃下切口1小时。将得到的含有粘性末
端的载体通过凝胶电泳分离，切下并使用凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-
Nagel)进行凝胶纯化。经由以下方案通过USER-克隆将DNA片段克隆到如此制备的载体中：
将1μl线性化质粒、1μl启动子片段、1.5μl基因片段、1μl高保真聚合酶缓冲液
(5x)和0.5μl USER酶(New England Biolabs)混合并且在37℃下孵育25min且在25℃下孵
育25min。将反应转化到化学感受态大肠杆菌DHα细胞中并且将细胞铺板在含100mg/L氨苄
青霉素的Lysogeny Broth(LB)琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜，并且通过菌落PCR筛选得到的菌落。从过夜大肠杆菌培养物中纯化质粒，并且通过测序确认正确的克隆。所构建的载体列于表3中。

[0375] 表3：表达载体。

[0376]

[0377]

[0378] 实施例4：菌株的构建

[0379] 使用酿酒酵母易酵母转化试剂盒(Life Technologies)将含有不同去饱和酶基因的pYEX-CHT衍生的重组表达载体引入OLE1和ELO1有缺陷的酿酒酵母(MATa elo1::
HIS3ole1::LEU2ade2his3leu2ura3；(Schneiter等人,2000))中。为了选择尿嘧啶和亮氨酸原养型克隆，将转化后的酵母细胞铺板在由0.7％YNB(不含氨基酸，含硫酸铵)、1.546％缺乏尿嘧啶和亮氨酸的补偿混合物(FormediumTMLTD，英格兰诺里奇)、2％葡萄糖、1％
tergitol(型号Nonidet NP-40，Sigma-Aldrich Sweden AB，瑞典斯德哥尔摩)、0.01％腺嘌呤(Sigma)和0.5mM油酸(Sigma)组成的培养基上。所构建的酵母菌株列于表4中。

[0380] 用 NotI(Fermentas)将整合型表达载体pCfB4580和pCfB5316线性化。使用乙酸锂方案(Gietz&Schiestl,2007)将pCfB4580转化到酿酒酵母CEN.PK102-5B中，产生菌株ST4854。在不含亮氨酸的酵母合成补偿板(Sigma-Aldrich)上选择阳性转化体。通过菌落PCR确认表达构建体在酿酒酵母的基因组中的正确整合。通过使用(Jessop-Fabre等
人,2016)中描述的方法将pCfB5316整合到ST4854中来构建菌株ST5290。所构建的菌株列于
表5中。

[0381] 实施例5：Δ9去饱和酶活性和特异性

[0382] 在具有分别编码Δ9-脂肪酸去饱和酶和中链酰基延长酶的OLE1和ELO1基因的缺失的酿酒酵母菌株中测试去饱和酶的活性和特异性(Schneiter等人,2000)。

[0383] 将菌株ST_Atr1432、ST_Atr236、ST_Phd9、ST_Rcd9、ST_ScOLE1和ST_DmeD9的三个单独菌落接种到1mL选择性培养基(SC-Ura-Leu)中，并且在30℃和300rpm下孵育48h。在补充有2mM CuSO4和0.5mM肉豆蔻酸甲酯(14:Me)(Larodan Fine Chemicals，瑞典)的5mL选择
性培养基中将培养物稀释至OD600为0.4。将肉豆蔻酸甲酯原液制备成在96％乙醇中的浓度
为100mM。将酵母培养物在30℃下以300rpm孵育48小时。

[0384] 取样1mL培养物并且添加3.12μg十九烷酸甲酯作为内标。在玻璃小瓶中使用3.75mL甲醇/氯仿(2:1，v/v)提取总脂质。向管中添加1mL乙酸(0.15M)和1.25mL水。将管剧烈涡旋并以2,000xg离心2min。将含有总脂质的底部氯仿相(约1mL)转移到新的玻璃小瓶
中，并且蒸发溶剂至干。通过酸甲醇分解由此总脂质提取物制备脂肪酸甲酯(FAME)。向管中添加1mL硫酸的2％甲醇溶液(v/v)，剧烈涡旋，并且在90℃下孵育1h。孵育后，添加1mL水并充分混合，然后用1mL己烷提取FAME。

[0385] 在与质量选择检测器HP 5973连接的Hewlett Packard 6890GC上对甲酯样品进行GC-MS分析。GC配备有INNOWax柱(30m×0.25mm×0.25μm)，并且将氦气用作载气(平均速度：
33cm/s)。以电子撞击模式(70eV)操作MS，并且在220℃下以不分流模式配置注射器。烘箱温度设定如下：在80℃下持续1min，然后以10℃/min的速率增加至210℃，随后在210℃下保持
15min，然后以10℃/min的速率增加至230℃，随后在230℃下保持20min。通过将它们的保留时间和质谱与合成标准品的保留时间和质谱进行比较来鉴定单不饱和脂肪酸产物。通过
ChemStation 软件(Agilent,Technologies，美国)分析数据。

[0386] Z9-14:Me和Z9-16:Me的测量浓度(表4)显示表达来自黑腹果蝇的去饱和酶的菌株ST_DmeD9产生最高浓度的Z9-14:Me(3.67mg/L)和Z9-14:Me与Z9-16:Me的最大比率。这表明
在所测试的去饱和酶中，黑腹果蝇去饱和酶对C14-CoA底物具有最高的活性和特异性。

[0387] 表4：异源去饱和酶在酵母中的活性和特异性。

[0388]

[0389]

[0390] 实施例6：(Z)9-十四碳烯-1-基乙酸酯的产生

[0391] 在具有活性OLE1和ELO1基因的酿酒酵母CEN.PK102-5B的基础上产生用于产生信息素的菌株。所获得的菌株列于表5中。

[0392] 将菌株ST4854和ST5290接种到5ml合成完全培养基(缺乏组氨酸、亮氨酸、色氨酸，补充有20mg/L尿嘧啶和76mg/L组氨酸)中，并且在带有金属labocap盖(Lüdiswiss，瑞士弗拉维尔)的12-ml玻璃管(Duran，德国沃特海姆)中在30℃下伴随以250rpm振荡培养过夜。第二天，将过夜培养物离心，弃去上清液，并且将沉淀重悬于2ml矿物质培养基中，所述培养基具有如(Jensen等人,2014)所述的组成。所述培养基补充有76mg/L组氨酸和20mg/L尿嘧啶。
将培养物在30℃下伴随以250rpm振荡孵育48小时。

[0393] 将1mL培养物样品转移到4-mL玻璃小瓶中，并且添加10μL内标原液(1μg/μl(Z)10-庚-1-基甲酯的100％乙醇溶液)。用小块铝箔覆盖小瓶，我们用针刺穿箔盖上的小孔。将样品涡旋并置于-80℃下储存直至分析。将样品在-40℃下冷冻干燥(Freezone6and Stoppening盘式干燥器，Labconco，美国堪萨斯城)，然后添加1mL氯仿:甲醇2:1以破坏细
胞。将混合物涡旋45s并在室温下放置4小时。在氮气流下缓慢蒸发有机溶剂。添加1ml己烷，将样品涡旋10s，离心并且将200μl转移到新的玻璃小瓶中。如实施例5中所述进行GC-MS分析。基于内标计算(Z)-9-十四碳烯-1-基乙酸酯的浓度。

[0394] 从结果中可以看出，黑腹果蝇去饱和酶的过表达使Z9:14:OAc的滴度增高了超过5倍。此外，总脂肪酰基乙酸酯的产物分数从2％增加到10％。

[0395] 表5：通过酵母产生(Z)-9-十四碳烯-1-基乙酸酯

[0396]

[0397]

[0398] 实施例7：产生Z11-C14:OAc的方法

[0399] 在酵母菌株中与HarFAR和Atf1一起过表达编码优先产生Z11-C14:CoA的Δ11去饱和酶的基因。使得到的菌株在培养基中生长并产生Z11-14:OAc。所述基因编码例如来自斜
带叶卷蛾玫瑰色卷蛾(oblique banded leaf roller moth Choristoneura rosaceana)的
Δ11去饱和酶(SEQ ID NO:65)。从发酵液中回收信息素并且将其配制成交配干扰产品以控
制害虫，例如欧洲玉米螟(European corn borer Ostrinia nubilalis)。

[0400] 实施例8：产生E11-C14:OAc的方法

[0401] 在酵母菌株中与HarFAR和Atf1一起过表达编码优先产生E11-C14:CoA的Δ11去饱和酶的基因。使得到的菌株在培养基中生长并产生E11-14:OAc。所述基因编码例如来自斑
点色卷蛾(spotted fireworm moth Choristoneura parallela)的Δ11去饱和酶(SEQ ID
NO:66)。从发酵液中回收信息素并且将其配制成交配干扰产品以控制害虫，例如浅褐色苹
果蛾苹果褐卷蛾。

[0402] 实施例9：质粒和解脂耶氏酵母菌株的构建

[0403] 以解脂耶氏酵母的密码子优化形式通过GeneArt(Life Technologies)合成编码来自脐橙螟(SEQ ID NO:68)、斜纹夜蛾(SEQ ID NO:12)和黑腹果蝇(Dmd9；SEQ ID NO:10)
的去饱和酶，棉铃虫的脂肪酰基还原酶(HarFAR；SEQ ID NO:25)，来自大肠杆菌(SEQ ID
NO:42)和来自香樟(SEQ ID NO:40)的硫酯酶以及酿酒酵母的醇乙酰基转移酶(Atf1；SEQ
ID NO:21)的基因。以酿酒酵母的密码子优化形式通过GeneArt(Life technologies)合成
Heliothis subflexa的脂肪酰基还原酶(SEQ ID NO:70)。

[0404] 在菌株ST6629中，使基因HFD4(YALI0B01298g)、HFD3(YALI0A17875)、HFD2(YALI0E15400)和HFD1(YALI0F23793g)的开放阅读框以及GPAT(YALI0C00209g)编码序列上
游的核苷酸-1130至-100缺失。将过早终止密码子和移码引入PEX10(YALI0C01023g)和FAO1
(YALI0B14014g)中，产生非功能性基因。

[0405] 菌株ST7394是基于ST6629，并且表达来自染色体C(核苷酸2192680-2193710)和D(核苷酸1842294-1843343)上的基因间区的如pCfB6969和pCfB7600中所述的Dmd9、HarFAR
和Atf1(图2)。

[0406] 在菌株ST6365中，HFD1、HFD4、PEX10和FAO1的开放阅读框被选择标记盒替换。ST6365表达来自脐橙螟的Δ11去饱和酶和来自Heliothis subflexa的脂肪酰基还原酶。

[0407] 菌株ST6357表达来自染色体E(核苷酸1722042-1723055)上的基因间区的如pCfB7235中所述的Atf1和HarFAR(图2)。

[0408] 菌株ST6359表达来自染色体E(核苷酸1722042-1723055)上的基因间区的如pCfB7235中所述的Atf1和HarFAR(图2)和来自染色体E(2881519-2882566)上的基因间区的
如pCfB7239中所述的Dmd9(图2)。

[0409] 菌株ST6360表达来自染色体E(核苷酸1722042-1723055)上的基因间区的如pCfB7235中所述的Atf1和HarFAR和来自染色体E(2881519-2882566)上的基因间区的如
pCfB7240中所述的SliDes11(图2)。

[0410] 菌株ST6373表达来自染色体E(核苷酸1722042-1723055)上的基因间区的如pCfB7235中所述的Atf1和HarFAR和来自染色体E(2881519-2882566)上的基因间区的如
pCfB7251中所述的Dmd9和TesA(LL)(图2)。

[0411] 菌株ST6375表达来自染色体E(核苷酸1722042-1723055)上的基因间区的如pCfB7235中所述的Atf1和HarFAR和来自染色体E(2881519-2882566)上的基因间区的如
pCfB7253中所述的Dmd9和CcFATB1(图2)。

[0412] 在菌株ST7010中，解脂耶氏酵母天然脂肪酰基合成酶2基因(YALI19382)的核苷酸3658-3660(ATC)被TTC替换。

[0413] 在菌株ST7895和ST7944中，分别使基因LIP2和LIP2LIP8的开放阅读框缺失。

[0414] 实施例10：用于通过异源表达硫酯酶增加解脂耶氏酵母中(Z)9-14:OH和(Z)9-14:Ac的产生的方法

[0415] 将表9中的菌株接种到2mL YPG培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和70g/L甘油)中，至光密度(600nm)为1，并且在带有金属labocap盖(Lüdiswiss，瑞士弗拉维尔)的在
12-ml玻璃管(Duran，德国沃特海姆)中在30℃下以250rpm振荡培养48小时。如果指出，则所述培养基补充有1g/L肉豆蔻酸甲酯。

[0416] 为了提取脂肪醇，将1mL培养物转移到4-mL玻璃小瓶中，并且添加10μL内标溶液(2μg/μL(Z)-10-庚-1-基甲酯的100％乙醇溶液)。用小块铝箔覆盖小瓶，并且用针刺穿箔盖上的小孔。将样品涡旋并置于-80℃下储存直至分析。将样品在冷冻干燥系统(Freezone6and Stoppening盘式干燥器，Labconco，美国堪萨斯城)中于-40℃下冷冻干燥，然后添加1mL氯仿:甲醇2:1以破坏细胞。将混合物涡旋45s并在室温下放置4小时。在氮气流下缓慢蒸发有机溶剂。添加1ml己烷，将样品涡旋10s，离心并且将200μl转移到新的玻璃小瓶中。用配备有
INNOWax 30m×0.25mm×0.25μm柱的SCION TQ GC-MS(Bruker)进行定量，其中氦气作为载
气。在250℃下以不分流模式配置注射器，烘箱温度设定如下：在80℃下持续1min，然后以10℃/min的速率增加至210℃，随后在210℃下保持10min，然后以10℃/min的速率增加至230
℃，随后在230℃下保持5min。以电子撞击模式(70eV)操作MS，在m/z 30与350之间扫描。通过将保留时间和质谱与参考化合物的保留时间和质谱进行比较来鉴定化合物。通过记录的
总离子电流(TIC)定量化合物。通过BrukerMSWorkstation软件分析数据。基于内标计算
脂肪醇的浓度(表9)。

[0417] 所述实施例显示在解脂耶氏酵母中产生(Z)9-14:OH和(Z)9-14:OAc。来自大肠杆菌或香樟的硫酯酶的额外表达分别使化合物的产量提高了20％和25％。

[0418] 表9.通过异源表达硫酯酶增加的解脂耶氏酵母中(Z)9-14:OH和(Z)9-14:OAc的产生。在右边的两列中，上面一行表示C14的产物，下面一行表示C16的产物。N.A.：没有得到。

[0419]

[0420]

[0421] 实施例11：用于通过在解脂耶氏酵母脂肪酰基合成酶(FAS2)中引入点突变来增加解脂耶氏酵母中(Z)9-14:OH的产生的方法

[0422] 如实施例10中所述培养表10中的菌株，但不补充培养基。

[0423] 通过在天然脂肪酰基合成酶(FAS2)中引入点突变(I1220F)，(Z)9-14:OH的产量提高了大约15倍。

[0424] 表10

[0425]

[0426]

[0427] 实施例12：用于通过使解脂耶氏酵母脂肪酶基因缺失来增加解脂耶氏酵母中(Z)9-14:Ac的产生的方法

[0428] 如实施例10中所述培养表11中的菌株。所述培养基补充有1g/L肉豆蔻酸甲酯。使脂肪酶2单独缺失或使脂肪酶2和脂肪酶8一起缺失导致脂肪醇滴度增高，如可以从图3中所
见到的。

[0429] 表11

[0430]

[0431] 序列

[0432] 概述

[0433] SEQ ID NO:1-来自天竺葵的Δ9去饱和酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0434] SEQ ID NO:2-来自天竺葵的Δ9去饱和酶

[0435] SEQ ID NO:3-来自蓖麻的Δ9去饱和酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0436] SEQ ID NO:4-来自蓖麻的Δ9去饱和酶

[0437] SEQ ID NO:5-来自脐橙螟的Δ9去饱和酶Atr236的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列

[0438] SEQ ID NO:6-来自脐橙螟的Δ9去饱和酶Atr236

[0439] SEQ ID NO:7-来自脐橙螟的Δ9去饱和酶Atr1432的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列

[0440] SEQ ID NO:8-来自脐橙螟的Δ9去饱和酶Atr1432

[0441] SEQ ID NO:9-来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列

[0442] SEQ ID NO:10-来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9

[0443] SEQ ID NO:11–来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶Des11的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0444] SEQ ID NO:12-来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶Des11

[0445] SEQ ID NO:13-来自Chauliognathus lugubris的Δ9去饱和酶Cld9的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0446] SEQ ID NO:14-来自Chauliognathus lugubris的Δ9去饱和酶Cld9

[0447] SEQ ID NO:15-来自赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的去饱和酶D6的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0448] SEQ ID NO:16-来自赤拟谷盗的去饱和酶D6

[0449] SEQ ID NO:17-来自赤拟谷盗的去饱和酶D8的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0450] SEQ ID NO:18-来自赤拟谷盗的去饱和酶D8

[0451] SEQ ID NO:19-酿酒酵母ATF1DNA序列；DNA编码序列。

[0452] SEQ ID NO:20-来自酿酒酵母的醇乙酰基转移酶ATF1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0453] SEQ ID NO:21-酿酒酵母ATF1p氨基酸序列

[0454] SEQ ID NO:22-来自湿地萼距花的硫酯酶CpFATB2的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0455] SEQ ID NO:23-来自湿地萼距花的硫酯酶CpFATB2的蛋白质序列

[0456] SEQ ID NO:24-棉铃虫脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列

[0457] SEQ ID NO:25-棉铃虫脂肪酰基还原酶

[0458] SEQ ID NO:26-信号肽变为HDEL的棉铃虫脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；DNA编码序列。

[0459] SEQ ID NO:27-信号肽变为HDEL的棉铃虫脂肪酰基还原酶

[0460] SEQ ID NO:28-烟夜蛾脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。

[0461] SEQ ID NO:29-烟夜蛾脂肪酰基还原酶的氨基酸序列

[0462] SEQ ID NO:30-信号肽变为HDEL的烟夜蛾脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列

[0463] SEQ ID NO:31-信号肽变为HDEL的烟夜蛾脂肪酰基还原酶的氨基酸序列

[0464] SEQ ID NO:32-Heliothis subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。

[0465] SEQ ID NO:33-H.subflexa脂肪酰基还原酶的氨基酸序列

[0466] SEQ ID NO:34-信号肽变为HDEL的H.subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列

[0467] SEQ ID NO:35-信号肽变为HDEL的H.subflexa脂肪酰基还原酶的氨基酸序列

[0468] SEQ ID NO:36–来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0469] SEQ ID NO:37–来自萼距花的硫酯酶ChFatB3的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0470] SEQ ID NO:38–来自萼距花的硫酯酶ChFatB3的氨基酸序列

[0471] SEQ ID NO:39-来自香樟的硫酯酶CcFatB1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0472] SEQ ID NO:40–来自香樟的硫酯酶CcFatB1的氨基酸序列

[0473] SEQ ID NO:41–没有前导序列的称为TesA(LL)的来自大肠杆菌的硫酯酶TesA的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0474] SEQ ID NO:42-没有前导序列的称为TesA(LL)的来自大肠杆菌的硫酯酶TesA的蛋白质序列

[0475] SEQ ID NO:43–来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶Har_FAR的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0476] SEQ ID NO:44–来自Bicyclus anynana的脂肪酰基还原酶Ban-wFAR2的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0477] SEQ ID NO:45-来自Bicyclus anynana的脂肪酰基还原酶Ban-wFAR2的蛋白质序列

[0478] SEQ ID NO:46-PR-1852(PTDH3_fw)

[0479] SEQ ID NO:47PR-1853(PTDH3_rv)

[0480] SEQ ID NO:48PR-1565(PTEF1)

[0481] SEQ ID NO:49PR-8332(Har_FAR_U1_fw)

[0482] SEQ ID NO:50PR-10739(Har_FAR_HDEL_U1_rev)

[0483] SEQ ID NO:51PR-14318(Phd9_U2_fw)

[0484] SEQ ID NO:52PR-14276(Phd9_U2_rev)

[0485] SEQ ID NO:53PR-14319(RCd9_U2_fw)

[0486] SEQ ID NO:54PR-14278(RCd9_U2_rev)

[0487] SEQ ID NO:55PR-14320(Atf1_U2_fw)

[0488] SEQ ID NO:56PR-14321(Atf1_U2_rev)

[0489] SEQ ID NO:57PR-15974(Dmd9_U1_fw)

[0490] SEQ ID NO:58PR-15975(Dmd9_U1_rev)

[0491] SEQ ID NO:59PR-15976(attB1_Dmd9_F)

[0492] SEQ ID NO:60PR-15977(attB2_Dmd9_R)

[0493] SEQ ID NO:61PR-15978(attB1_Phd9_F)

[0494] SEQ ID NO:62PR-15979(attB2_Phd9_R)

[0495] SEQ ID NO:63PR-15980(attB1_Rcd9_F)

[0496] SEQ ID NO:64PR-15981(attB1_Rcd9_R)

[0497] SEQ ID NO:65来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶。

[0498] SEQ ID NO:66-来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶

[0499] SEQ ID NO:67-脐橙螟Δ11去饱和酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0500] SEQ ID NO:68–来自脐橙螟的Δ11去饱和酶

[0501] SEQ ID NO:69-棉铃虫脂肪酰基还原酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列

[0502] SEQ ID NO:70-Heliothis subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列

[0503] SEQ ID NO:71：FAS2序列(野生型)

[0504] SEQ ID NO:72：来自解脂耶氏酵母的LIP2的序列。

[0505] SEQ ID NO:73：来自解脂耶氏酵母的LIP7的序列

[0506] SEQ ID NO:74：来自解脂耶氏酵母的LIP8的序列

[0507] 参考文献

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[0529] 项目

[0530] 1.一种能够产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的酵母细胞，所述酵母细胞表达：

[0531] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；和

[0532] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)；以及

[0533] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶；

[0534] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0535] 2.根据项目1的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自Δ3去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ7去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ10去饱和酶、Δ11去饱和酶、Δ12去饱和酶和Δ13去饱和酶。

[0536] 3.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶能够在位置5、6、7、8、9、10、11、12或13中引入至少一个双键。

[0537] 4.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶衍生自选自天竺葵、蓖麻、黑腹果蝇、斜纹夜蛾和赤拟谷盗的生物，优选地所述去饱和酶衍生自黑腹果蝇。

[0538] 5.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自：

[0539] i)与如SEQ ID NO:2中所示的来自天竺葵的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0540] ii)与如SEQ ID NO:4中所示的来自蓖麻的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0541] iii)与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0542] iv)与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0543] v)与如SEQ ID NO:14中所示的来自Chauliognathus lugubris的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0544] vi)与如SEQ ID NO:16中所示的来自赤拟谷盗的去饱和酶具有至少60％同源性的去饱和酶；和

[0545] vii)与如SEQ ID NO:18中所示的来自赤拟谷盗的去饱和酶具有至少60％同源性的去饱和酶；

[0546] viii)与如SEQ ID NO:65中所示的来自玫瑰色卷蛾的去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；

[0547] ix)与如SEQ ID NO:66中所示的来自斑点色卷蛾的去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶，

[0548] 优选地，所述去饱和酶是与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶或与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9
去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶。

[0549] 6.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自：

[0550] i)与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0551] ii)与如SEQ ID NO:12中所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0552] iii)与如SEQ ID NO:14中所示的来自Chauliognathus lugubris的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；

[0553] iv)与如SEQ ID NO:16中所示的来自赤拟谷盗的去饱和酶具有至少60％同源性的去饱和酶；和

[0554] v)与如SEQ ID NO:18中所示的来自赤拟谷盗的去饱和酶具有至少60％同源性的去饱和酶；

[0555] vi)与如SEQ ID NO:65中所示的来自玫瑰色卷蛾的去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；

[0556] vii)与如SEQ ID NO:66中所示的来自斑点色卷蛾的去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。

[0557] 7.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)选自：

[0558] i)与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR；

[0559] ii)与如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR；

[0560] iii)与如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35中所示的来自Heliothis

[0561] subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；以及

[0562] iv)与如SEQ ID NO:45中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR，

[0563] 优选地，所述FAR是与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR。

[0564] 8.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶或从所述酵母细胞过表达的天然乙酰基转移酶。

[0565] 9.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶与如SEQ ID NO:21中所示的来自酿酒酵母的乙酰基转移酶Atf1具有至少75％同源性。

[0566] 10.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述酵母属于选自酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属的属，优选地所述属是酵母属或耶氏酵母属，最优选地所述属是耶氏酵
母属。

[0567] 11.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述酵母属于选自酿酒酵母、毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母、浅白隐球酵母、产油油脂酵母、斯达油脂酵母、圆红冬孢酵母、黏红酵母、普鲁兰丝孢酵母和解脂耶氏酵母的物种，优选地所述酵母细胞是酿酒酵母细胞或解
脂耶氏酵母细胞，最优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞。

[0568] 12.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞：

[0569] i)表达与如SEQ ID NO:10中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶相同或具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；并且

[0570] ii)表达与如SEQ ID NO:25中所示的来自棉铃虫的脂肪酰基-CoA还原酶相同或具有至少80％同源性的脂肪酰基-CoA还原酶；并且

[0571] iii)表达或过表达与如SEQ ID NO:21中所示的来自酿酒酵母的乙酰基转移酶相同或具有至少75％同源性的乙酰基转移酶。

[0572] 13.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中与野生型酵母细胞相比，过表达所述乙酰基转移酶。

[0573] 14.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码所述去饱和酶、所述脂肪酰基-CoA还原酶或所述乙酰基转移酶的基因包含在所述酵母细胞的基因组内或包含在所述酵母
细胞内包含的一种或多种载体内。

[0574] 15.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达或过表达硫酯酶。

[0575] 16.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述硫酯酶与如SEQ ID NO:23中所示的来自湿地萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:42中所示的来自大肠杆菌的硫酯
酶具有至少60％同源性，优选地所述硫酯酶与如SEQ ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶
或与如SEQ ID NO:42中所示的来自大肠杆菌的硫酯酶具有至少60％同源性。

[0576] 17.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞还表达具有经修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体，其中所述变体优选地结合较短的脂肪酸。

[0577] 18.根据前述项目中任一项的酵母细胞，所述酵母细胞还具有导致一种或多种脂肪酶的活性部分或完全丧失的突变。

[0578] 19.根据项目18的酵母细胞，其中所述一种或多种脂肪酶与如SEQ ID NO:72中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶2、如SEQ ID NO:73中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶7或如SEQ
ID NO:74中所示的解脂耶氏酵母的脂肪酶8具有至少60％同源性。

[0579] 20.根据项目18至19中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞是解脂耶氏酵母，并且所述一种或多种脂肪酶选自如SEQ ID NO:72中所示的脂肪酶2、如SEQ ID NO:73中所示
的脂肪酶7和如SEQ ID NO:74中所示的脂肪酶8。

[0580] 21.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码所述去饱和酶、所述脂肪酰基-CoA还原酶、所述乙酰基转移酶或所述硫酯酶的基因中的至少一种以高拷贝数存在。

[0581] 22.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码所述去饱和酶、所述脂肪酰基-CoA还原酶、所述乙酰基转移酶或所述硫酯酶的基因中的至少一种处于诱导型启动子的控
制下。

[0582] 23.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码所述去饱和酶、所述脂肪酰基-CoA还原酶、所述乙酰基转移酶或所述硫酯酶的基因中的至少一种针对所述酵母细胞进行
了密码子优化。

[0583] 24.一种用于在酵母细胞中产生去饱和脂肪酸和任选地去饱和脂肪酰基乙酸酯的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵
母细胞表达：

[0584] i)至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；和

[0585] ii)至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；以及

[0586] iii)任选地，能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶，从而产生所述去饱和脂肪酰基乙酸酯；

[0587] 其中所述去饱和酶对十四烷酰基-CoA的特异性高于对十六烷酰基-CoA的特异性和/或其中所述脂肪酰基-CoA还原酶对去饱和十四烷酰基-CoA的特异性高于对去饱和十六
烷酰基-CoA的特异性。

[0588] 25.根据项目24的方法，其中所述酵母细胞如项目1至23中任一项所定义。

[0589] 26.根据项目24至25中任一项的方法，其中去饱和十四烷酰基-CoA与去饱和十六烷酰基-CoA的比率为至少0.1，如至少0.2、如至少0.3、如至少0.4、如至少0.5、如至少0.75、如至少1、如至少2、如至少3、如至少4、如至少5、如至少6、如至少7、如至少8、如至少9、如至少10、如至少12.5、如至少15。

[0590] 27.根据项目25至26中任一项的方法，其中所述方法产生滴度为至少1mg/L如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少
4g/L、如至少5g/L或更高的去饱和脂肪醇。

[0591] 28.根据项目25至27中任一项的方法，其中所述方法产生滴度为至少1mg/L如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少
4g/L、如至少5g/L或更高的链长为14的去饱和脂肪醇。

[0592] 29.根据项目25至28中任一项的方法，其中所述方法产生滴度为至少1mg/L如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少
4g/L、如至少5g/L或更高的去饱和脂肪酰基乙酸酯。

[0593] 30.根据项目25至29中任一项的方法，其中所述方法产生滴度为至少1mg/L如至少1.5mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少750mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少
4g/L、如至少5g/L或更高的链长为14的去饱和脂肪酰基乙酸酯。

[0594] 31.根据项目25至30中任一项的方法，其中所述去饱和脂肪酰基乙酸酯包含至少1％如至少1.5％、如至少2％、如至少2.5％、如至少3％、如至少3.5％、如至少4％、如至少
4.5％、如至少5％、如至少7.5％、如至少10％的链长为14的去饱和脂肪酰基乙酸酯。

[0595] 32.根据项目25至31中任一项的方法，其中所述酵母细胞还能够表达硫酯酶。

[0596] 33.根据项目25至32中任一项的方法，其中所述硫酯酶与如SEQ ID NO:23中所示的来自湿地萼距花的硫酯酶、与如SEQ ID NO:38中所示的来自萼距花的硫酯酶、与如SEQ
ID NO:40中所示的来自香樟的硫酯酶或与如SEQ ID NO:42中所示的来自大肠杆菌的硫酯
酶具有至少60％同源性。

[0597] 34.根据项目25至33中任一项的方法，其还包括回收所述去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯的步骤。

[0598] 35.根据项目25至34中任一项的方法，其还包括将所回收的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪酰基乙酸酯配制到信息素组合物中的步骤。

[0599] 36.根据项目25至35中任一项的方法，其中所述信息素组合物还包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。

[0600] 37.一种用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：

[0601] i)编码至少一种能够在碳链长为14的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和

[0602] ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及

[0603] iii)任选地，编码能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪酰基乙酸酯的乙酰基转移酶的第三多核苷酸，

[0604] 其中任选地，所述第一多核苷酸、所述第二多核苷酸和/或所述第三多核苷酸处于启动子的控制下。

[0605] 38.一种部件试剂盒，其包含：

[0606] a)根据项目1至24中任一项的酵母细胞和使用说明书；和/或

[0607] b)根据项目37的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及

[0608] c)任选地，待修饰的酵母细胞。

[0609] 39.一种通过根据项目25至36中任一项的方法可获得的去饱和脂肪醇。

[0610] 40.一种通过根据项目35至36中任一项的方法可获得的去饱和脂肪酰基乙酸酯。

[0611] 41.根据项目1至24或39中任一项的去饱和脂肪醇的用途。

[0612] 42.根据项目1至24或40中任一项的去饱和脂肪脂肪酰基乙酸酯的用途。

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在酵母中产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪酰基乙酸酯

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