基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造专利检索-酿酒酵母生物学专利检索查询-专利查询网

基于酿酒 酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造

阅读：148发布：2020-05-13

专利汇可以提供基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明设计并构建了适用于酿酒酵母的sgRNA文库(该sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA)，将该sgRNA文库应用于环境条件诱导的酿酒酵母适应性进化过程中，通过将CRISPR/Cas9系统的高效定向编辑与环境条件诱导的适应性进化联合，特别是借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，大大推动了酿酒酵母的整体进化，获得了具备多重抗逆性(抵抗工业物料压力、温度压力和乙醇压力)的工业酿酒酵母。，下面是基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于提高酿酒酵母抗逆性的sgRNA文库，所述sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA，其中，
所述抗逆调控库包含热激蛋白基因、泛素系统基因、蛋白酶体基因、抗高渗调节基因、pH响应调节基因、蛋白质平衡基因、蛋白质质量控制系统基因、分子伴侣基因、抗氧化防御系统基因、超氧化物歧化酶基因、自噬系统基因；
所述细胞生长及代谢调控库包含翻译后调控基因、转录调控基因、抑制调控基因、衰老调控基因、同源保守区基因、糖酵解调控基因、线粒体生物合成调控基因、URS2负调控基因、细胞周期调控基因、核糖核酸酶系统基因、细胞膜调控基因、核糖核酸聚合酶调控基因；以及
所述分子及转录水平调控库包含SR蛋白激酶基因、Gal系统基因、信号转导基因、金属硫蛋白多路调控基因、亮氨酸拉链式二聚体基因、钙调系统基因、氮调节基因、组蛋白调节基因、核内RNA前体下调基因、嘧啶通路调节基因、多肽逆行调控基因、血红素生物合成途径调控基因、磷酸丙酮酸水合酶(烯醇酶)调节基因、多肽氧调节基因。
2.如权利要求1所述的sgRNA文库，其中，针对每个基因设计6个sgRNA；优选地，针对每个基因的起始密码子上游300bp区域设计2个sgRNA，并针对每个基因的CDS区5％-65％范围设计4个sgRNA。
3.如权利要求1或2所述的sgRNA文库，其中，所述sgRNA的长度为20nt。
4.包含如权利要求1-3中任一项所述的sgRNA文库的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶和酿酒酵母细胞；
优选地，所述试剂盒进一步包含克隆载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂或上述物质的任意组合。
6.利用如权利要求1-3中任一项所述的sgRNA文库获得酿酒酵母CRISPR文库的方法，所述方法包括：
(1)将所述sgRNA文库转化至过表达NHEJ通路相关基因并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；
(2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入培养基中进行培养，得到酿酒酵母培养液；
(3)过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母培养液，获得菌浊液，当活菌率为15-20％时进行下一轮转化；
(4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，将其过夜活化后，筛选出上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母，以所述sgRNA已丢失的酿酒酵母作为种子再次进行步骤(1)中的sgRNA文库转化；并重复步骤(2)及步骤(3)；
(5)经至少3轮上述步骤后，过滤步骤(4)中得到的酿酒酵母培养液，获得菌浊液，离心菌体后去除上清液，将菌体重悬并涂布于平板上进行培养，得到酿酒酵母CRISPR文库。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述NHEJ通路相关基因包括DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述sgRNA文库转化至过表达DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；
(2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入添加了0-6％乙醇的液化醪液体培养基中，于30-32℃、140-200rpm(优选150-190rpm，更优选160-180rpm，特别优选170rpm)摇床培养16-24h后，升温至35-37℃继续培养12-36h(优选16-32h，更优选20-28h，特别优选24h)，得到酿酒酵母液化醪培养液；
(3)过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，当活菌率为15-20％时进行下一轮转化；
(4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，使用Cas9质粒抗性的YPD培养基过夜活化后，用含1％-3％(优选1.5％-2.5％，更优选1.8％-2.2％，特别优选
2％)半乳糖的YP培养基培养过夜筛选出上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母，以所述sgRNA已丢失的酿酒酵母作为种子再次进行步骤(1)中的sgRNA文库转化；并重复步骤(2)及步骤(3)；
(5)经至少3轮上述步骤后，过滤步骤(4)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，离心菌体后去除上清液，用无菌山梨醇溶液将菌体重悬并涂布于液化醪平板，于35-37℃(优选37℃)恒温培养2-3天，得到酿酒酵母CRISPR文库。
9.利用如权利要求6-8中任一项所述的方法获得的酿酒酵母CRISPR文库。
10.利用如权利要求9所述的酿酒酵母CRISPR文库对酿酒酵母进行适应性进化以提高其抗逆性的方法，所述方法包括：
在复合选择压力下对所述酿酒酵母CRISPR文库进行筛选，其中，所述选择压力选自于工业物料压力、温度压力和乙醇压力。

说明书全文

基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造

技术领域

[0001] 本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CRISPR文库的设计与构建以及应用该文库促进微生物适应性进化的方法，属于生物化工领域。

背景技术

[0002] 目前工业生物技术产品的年产值在逐年增长，在国民经济中占有很高比重，其中，微生物发酵是工业生物技术的主要组成部分。然而，现有发酵工业中，工业微生物常受高糖、高温、产物积累等发酵微环境胁迫。例如，包括酿酒酵母在内的酵母是生物产业领域非常重要的微生物细胞工厂，具有易培养、细胞生长周期短、遗传背景清晰等优点，是理想的真核生物模式菌种。作为工业生产的优良菌种，酿酒酵母能通过糖酵解途径将葡萄糖转化为乙醇。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母被改造成工程菌用于生产各类天然产物，使酿酒酵母的应用性更为广泛。就此而言，发酵微环境胁迫会对酵母细胞产生多种影响，如错误折叠蛋白的积累、氧化磷酸化的解偶联、质膜与细胞骨架结构的破坏以及细胞蛋白分泌途径的缺失等，这些都严重影响酵母细胞的生长及代谢。提高酿酒酵母的鲁棒性，使其在多变的培养环境、较高的发酵温度下仍保持正常的生长代谢活力，成为改进酵母发酵工艺的重中之重。

[0003] 目前工业上主要通过发酵工艺优化(例如培养条件的人为调控)来降低胁迫，但该方法不仅增加发酵成本，而且消耗资源。因此，从源头出发提高工业微生物自身的抗逆性可有效抵抗胁迫，可以更好地发挥其作用。对此，虽然近年来国内外通过微生物的抗逆机制进行理性设计和适应性进化能够使微生物具有一定的抗逆性，但所得成果比较局限，主要集中于细胞单一抗逆性研究(例如耐高温胁迫或耐乙醇胁迫等)，难以获得响应工业发酵微环境的多重抗逆性，并且当前研究多以实验室模式菌株为研究对象，在实际工业应用中仍然受到限制。

[0004] 整体来说，迄今为止，就提高微生物本身的抗逆性而言，国内外学者主要从适应性进化和基于现有抗逆机制进行理性设计这两方面开展了研究。近几年已经开发了结合原生质体融合的基因组重排技术(Genome shuffling)、改造基因组范围转录调控程序的全局转录机制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)、基因组复制工程辅助的连续进化(Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)、基因组多重位点自动改造技术(Multiplex automated genome engineering，MAGE)等育种技术来提高微生物的抗逆性。

[0005] 虽然目前基于环境条件诱导的传统适应性进化技术在提高微生物抗逆性方面呈现出一定效果，但如上所述，这种单一环境条件的传统适应性进化技术耗时、低效、工作量大；另一方面，基于现有抗逆机制进行理性设计，即，基于分子层面的构建方法针对性强，但不同胁迫环境响应不同的耐受机制，且不同耐受机制间又存在错综复杂的交互关系，造成针对某一耐受机制的理性设计结果往往并不显著，同时也并非所有的微生物特性都能通过理性的技术进行改造，缺乏一定的普适性。

[0006] DNA作为携带遗传信息的载体，其容易发生持续性损伤，其中最严重的损伤就是DNA双链断裂(Double strand break，DSB)，双螺旋结构会一分为二。如果细胞中类似的DNA损伤不能被有效修复的话，重要的遗传信息就会出现缺失，这时候就会伴随细胞死亡的发生，或者诱发永久性的遗传改变以及细胞转化。相应地，快速准确地修复DSB对维持基因组稳定性起着至关重要的作用。真核生物细胞通过一系列复杂的信号转导途径激活对DSB的修复以恢复DNA中的遗传信息，其在精确性和复杂性上存在一定差异，其中最重要的两种方式是同源重组(homologous recombination，HR)修复和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)修复。HR修复能够利用姐妹染色体中完全相同的遗传信息来以较高的准确率修复损伤的DNA；然而经修复的子代拷贝仅会在分裂的细胞中存在，在细胞分裂之前遗传信息就会被复制，并且HR修复仅发生在DNA经历或完成复制的S期和G2期。相比而言，NHEJ修复无需模板，能够尽可能快速地将两个断裂末端进行连接，并且可在整个细胞周期发生，从而成为哺乳动物细胞中修复DSB的主要方式。

[0007] 事实上，适应性进化的过程即为通过外界压力导致细胞内DNA发生诸如DSB等极为严重的损伤，然后依赖微生物自身普遍存在的DNA修复机制进行修复的过程。在修复过程中，特别是在只基于断裂末端的结构而无需模板的NHEJ修复过程中，可能出现插入、缺失、碱基改变等情况，进而使细胞呈现多种表型。对此，如果能够设法促进微生物细胞内DNA发生损伤并进行修复的进程，则可大大推动适应性进化的进展。

[0008] 成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)作为细菌和古细菌的“免疫系统”广泛存在于细菌和古细菌基因组中。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括三个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。该间隔序列(spacer)记录了之前入侵的外源DNA。在表达阶段，CRISPR基因座被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(称为pre-crRNA)，该前体被Cas9的核酸内切酶结构域剪切并进一步加工成小crRNA。成熟crRNA与Cas蛋白形成Cas9-tracrRNA:crRNA复合体。在干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas9-tracrRNA:crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA发生断裂，从而使入侵的靶标DNA失去原有功能。酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR/Cas9系统是分子生物学和细胞生物学中最常用的CRISPR/Cas系统。Cas9蛋白在crRNA的成熟和对靶DNA的剪切中发挥重要作用。在该系统中，反式编码小RNA(trans-encoded small RNA，tracrRNA)扮演了导向的角色。
Jinek等将tracrRNA与spacer RNA组合为sgRNA分子，将其与Cas9进行混合，发现能够正确地对目标DNA进行切割(Pennisi E，The CRISPR craze，Science 341(6148)：833-836，
2013；A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity，Jinek等，337(6096)：816-821)。

[0009] 考虑到CRISPR/Cas9系统能够特异性地对基因组进行高效编辑，倘若能够将环境条件诱导的传统适应性进化策略的优势与新一代基因组编辑技术CRIPSR/Cas9的高效性相结合，从而加速菌株的适应性进化过程，在提高其它工业微生物对发酵微环境的抗逆性及生产性能方面具有重要的参考价值，对高效低耗的生物发酵产业也具有重要的推动作用。

[0010] 目前，尽管CRISPR/Cas9系统的应用愈加广泛和深入，但本领域还尚未提出利用CRISPR/Cas9系统作为工具，通过构建sgRNA文库并利用酵母细胞自身的NHEJ修复机制对酵母细胞基因组中多个目标基因同时进行编辑，由此促进酵母的适应性进化过程并可期待获得响应工业发酵微环境的多重抗逆性的酵母抗逆性改造方法。

发明内容

[0011] 为解决上述技术问题，本发明人进行了深入研究，开发出一种具有普适性的微生物快速进化筛选方法。具体而言，本发明设计并构建了适用于酿酒酵母的sgRNA文库，将该sgRNA文库应用于环境条件诱导的酿酒酵母适应性进化过程中，通过将CRISPR/Cas9系统的高效定向编辑与环境条件诱导的适应性进化联合，特别是借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，大大推动了酿酒酵母的整体进化，获得了具备多重抗逆性的工业酿酒酵母，由此完成了本发明。

[0012] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于提高酿酒酵母抗逆性的sgRNA文库，所述sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA，其中，[0013] 所述抗逆调控库包含热激蛋白基因、泛素系统基因、蛋白酶体基因、抗高渗调节基因、pH响应调节基因、蛋白质平衡基因、蛋白质质量控制系统基因、分子伴侣基因、抗氧化防御系统基因、超氧化物歧化酶基因、自噬系统基因；

[0014] 所述细胞生长及代谢调控库包含翻译后调控基因、转录调控基因、抑制调控基因、衰老调控基因、同源保守区基因、糖酵解调控基因、线粒体生物合成调控基因、URS2负调控基因、细胞周期调控基因、核糖核酸酶系统基因、细胞膜调控基因、核糖核酸聚合酶调控基因；以及

[0015] 所述分子及转录水平调控库包含SR蛋白激酶基因、Gal系统基因、信号转导基因、金属硫蛋白多路调控基因、亮氨酸拉链式二聚体基因、钙调系统基因、氮调节基因、组蛋白调节基因、核内RNA前体下调基因、嘧啶通路调节基因、多肽逆行调控基因、血红素生物合成途径调控基因、磷酸丙酮酸水合酶(烯醇酶)调节基因、多肽氧调节基因。

[0016] 优选地，针对每个基因设计6个sgRNA；更优选地，针对每个基因的起始密码子上游300bp区域设计2个sgRNA，并针对每个基因的CDS区5％-65％范围设计4个sgRNA。优选地，所述sgRNA的长度为20nt。

[0017] 根据本发明的第二方面，本发明提供了包含如本发明的第一方面所述的sgRNA文库的试剂盒。

[0018] 优选地，所述试剂盒进一步包含sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶和酿酒酵母细胞。优选地，所述试剂盒进一步包含克隆载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂或上述物质的任意组合。

[0019] 根据本发明的第三方面，本发明提供了利用如本发明的第一方面所述的sgRNA文库获得酿酒酵母CRISPR文库的方法，所述方法包括：

[0020] (1)将所述sgRNA文库转化至过表达NHEJ通路相关基因并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；

[0021] (2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入培养基中进行培养，得到酿酒酵母培养液；

[0022] (3)过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母培养液，获得菌浊液，当活菌率为15-20％时进行下一轮转化；

[0023] (4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，将其过夜活化后，筛选出上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母，以所述sgRNA已丢失的酿酒酵母作为种子再次进行步骤(1)中的sgRNA文库转化；并重复步骤(2)及步骤(3)；

[0024] (5)经至少3轮上述步骤后，过滤步骤(4)中得到的酿酒酵母培养液，获得菌浊液，离心菌体后去除上清液，将菌体重悬并涂布于平板上进行培养，得到酿酒酵母CRISPR文库。

[0025] 优选地，所述NHEJ通路相关基因包括DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因。

[0026] 优选地，在根据本发明的第三方面的实施方式中，利用如本发明的第一方面所述的sgRNA文库获得酿酒酵母CRISPR文库的方法包括：

[0027] (1)将所述sgRNA文库转化至过表达DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；

[0028] (2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入添加了0-6％乙醇的液化醪液体培养基中，于30-32℃、140-200rpm(优选150-190rpm，更优选160-180rpm，特别优选170rpm)摇床培养16-24h后，升温至35-37℃继续培养12-36h(优选16-32h，更优选20-28h，特别优选24h)，得到酿酒酵母液化醪培养液；

[0029] (3)过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，当活菌率为15-20％时进行下一轮转化；

[0030] (4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，使用Cas9质粒抗性的YPD培养基过夜活化后，用含1％-3％(优选1.5％-2.5％，更优选1.8％-2.2％，特别优选2％)半乳糖的YP培养基培养过夜筛选出上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母，以所述sgRNA已丢失的酿酒酵母作为种子再次进行步骤(1)中的sgRNA文库转化；并重复步骤(2)及步骤(3)；

[0031] (5)经至少3轮上述步骤后，过滤步骤(4)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，离心菌体后去除上清液，用无菌山梨醇溶液将菌体重悬并涂布于液化醪平板，于35-37℃(优选37℃)恒温培养2-3天，得到酿酒酵母CRISPR文库。

[0032] 根据本发明的第四方面，本发明提供了利用如本发明的第三方面所述的方法获得的酿酒酵母CRISPR文库。

[0033] 根据本发明的第五方面，本发明提供了利用如本发明的第四方面所述的酿酒酵母CRISPR文库对酿酒酵母进行适应性进化以提高其抗逆性的方法，所述方法包括：在复合选择压力下对所述酿酒酵母CRISPR文库进行筛选，其中，所述选择压力选自于工业物料压力(例如由乙醇工业发酵过程中的抑制物造成的压力)、温度压力和乙醇压力。

[0034] 有益效果

[0035] 本发明精妙且独创地联合精准基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统的“反向设计”，借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，并在工业发酵物料及发酵微环境的选择压力下，不断富集稳定的多重抗逆改造菌株。通过对适用于工业微生物的CRISPR/Cas9基因组编辑系统的构建，本发明助推了工业微生物的抗逆性进化，提供了一种具有普遍应用价值的工业微生物抗逆改造技术平台，实现了工业微生物在发酵微环境中的系统最优化，提高了其发酵生产性能。

具体实施方式

[0036] 1.关于CRISPR/Cas9基因组编辑系统

[0037] 就CRISPR/Cas9系统而言，本领域已知的是，可针对具有任意序列的任意DNA片段设计合成相应的sgRNA。Cas9蛋白可在该sgRNA的导向下对该位点进行酶切。可将本领域已知的设计并合成适用于Cas9的sgRNA的方法用于本发明方法中，设计并合成用于引导Cas9的sgRNA。

[0038] 具体而言，Cas9核酸酶的作用位点完全取决于所设计的sgRNA序列。由于sgRNA通常为约20nt，远大于限制性内切酶所识别的6-8bp的序列，因此特异性大大提高。并且，由于可针对任意的DNA序列设计所匹配的sgRNA，因此理论上能够针对基因组上的任何位点实施操作。利用CRISPR/Cas9使得酿酒酵母基因组上的一个或多个位点发生双链断裂，从而能够全方位促进在随后的非同源末端连接(NHEJ)修复过程中针对基因组上的多个位点实施插入、删除和/或替换等。

[0039] 本领域知晓针对特定序列设计sgRNA以及体外转录获得sgRNA的方法。可利用在线的CRISPR设计工具来设计sgRNA序列并人工合成所对应的sgDNA序列，所述设计工具例如为http://www.biootools.com/en/或http://crispr.mit.edu/等。随后将sgDNA连入sgRNA克隆载体，或通过重叠延伸获得sgRNA转录模板，并利用T7RNA聚合酶和sgRNA克隆载体实施体外转录来获得目的sgRNA片段。另一方面，也可使用商购的试剂盒实施sgRNA的合成，例如使用T7Quick High-Yield RNA synthesis Kit(NEB)、sgRNA体外转录和筛选试剂盒(Clontech，Cat.No.631439)、T7sgRNA MICscriptTM KIT/sgRNA synthesis product(Biomics Biotech)或Epicenter ASF3257体外转录试剂盒。或者，还可通过将sgRNA序列组装到可商购获得的sgRNA表达质粒上并直接以质粒形式转入酿酒酵母的方式来获得sgRNA，在此情况之下，无需进行体外转录过程。

[0040] 根据本发明的一些实施方式，在所需利用的sgRNA数量较多的情况下，可以在芯片上高通量合成用于形成sgRNA文库的sgRNA。

[0041] 2.关于分子克隆技术

[0042] 在传统的分子克隆技术中，一般利用“酶切-连接”的方式将目的DNA与载体进行连接：首先通过限制性酶切在目的DNA和载体DNA上制造互补的黏性末端或者平末端，再用连接酶将二者连在一起，生成带有目的DNA的载体，也称为重组载体(Nathans D.等，1975，Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules，Annu.Rev.Biochem.44：273-93)。限制性内切酶特异性地识别靶DNA序列(即酶切位点)。因此，为了能够对多个目的DNA片段进行操作，常用的工程化及商业化的载体通常具有多克隆位点，且针对目的DNA片段的操作(例如插入、替换和/或删除)大多在多克隆位点处进行。

[0043] 作为改进，基于酶切-连接的Biobrick方法利用同尾酶实现片段的逐级组装(Sleight S.C.等，In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering.Nucleic Acids Res，2010，38(8)：2624-36)。该方法仅使用4个限制性内切酶EcoRI、XbaI、SpeI以及PstI即可完成任意数量片段的组装，省去了挑选合适的限制性内切酶的复杂过程。然而，每操作一个片段仍需要进行一系列的酶切连接、转化和克隆筛选。该方法不能同时实现多个片段的拼接。目前最有效的DNA操作方法为Gibson拼接(Gibson Assembly)。该方法的原理在于，将20～80bp的短重叠序列添加至各待连接的片段(例如需要首尾相连的多个DNA片段)的末端，重叠序列的设置用于保证各片段的组装顺序。在50℃的孵育温度下，Gibson拼接混合物中的DNA外切酶从5'端降解部分核苷酸产生黏性末端，从而待拼接的两相邻片段的重叠区之间可以通过退火而互补，然后在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下将缺口补齐，形成完整的双链DNA，实现无痕拼接(Gibson,D.G.等，Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nature methods 6，343-345，2009)。Gibson拼接技术不区分载体片段和目的片段，其优势在于简便快速、能直接使用PCR片段、不需要回收步骤、且可以处理多个片段。

[0044] 根据本发明的一些实施方式，通过Golden Gate Cloning技术获得本发明的sgRNA文库。具体而言，IIs型限制性内切酶(例如BsaI、BbsI、BsmBI和SapI等)是一类特殊的限制性内切酶，与分子生物学最常用的II型限制性内切酶(识别位点为回文对称序列，切割位点与识别序列重叠)不同，其识别位点是一个非回文对称的序列，而切割位点位于识别位点的外侧。因此，当经IIs型限制性内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点不复存在，在后续酶切连接反应中也不会再次被切割，从而达到“焊死”的效果。Golden Gate Cloning技术就是利用IIs型限制性内切酶的这一特性，在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一限制性内切酶产生不同的粘性末端，从而一次性组装多个片段，克服了传统多片段组装中需要同时使用多个不同限制性内切酶的不足。相对于Biobrick技术而言，该技术的最大特点是不会引入任何额外的“疤痕”，从而实现了DNA片段的无痕连接。

[0045] 3.关于酿酒酵母菌株的筛选

[0046] 对于连接和转化步骤，本领域技术人员熟知将一个或多个线性DNA片段转化入酵母细胞的方法。例如，可采用传统的乙酸锂转化、原生质体转化或电转化的方法。上述方法的步骤和材料例如在《精编分子生物学实验指南(第5版)》(2008年)第509-514页描述。也可采用商购的试剂盒，例如Sigma-Aldrich的酵母转化试剂盒(Cat.No.YEAST1-1KT)。

[0047] 筛选获得带有重组载体的酵母转化子的技术为本领域技术人员已知。对于不带有筛选标记的重组载体，可采用对一个或多个目的片段进行扩增的单重或多重PCR对转化子进行检测，从而筛选出带有重组载体的转化子。然而，也可使得重组载体带有抗生素抗性基因或营养缺陷筛选标记，从而转化子能够在添加有抗生素或不含某种必须营养成分的选择性培养基上生长。通过这样的方法筛选带有重组载体的酵母转化子可进一步降低假阳性率。当重组载体另外包含编码报告子蛋白的DNA片段时，可通过检测报告基因的表达来筛选阳性克隆，所述报告子蛋白例如为荧光蛋白、萤光素酶或用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶。

[0048] 在酿酒酵母的适应性进化过程中，可以使用液化醪液体培养基来对酿酒酵母进行培养。在本发明一些优选实施方式中，所述液化醪来源于淀粉质生物质。所述来源于淀粉质生物质的液化醪可为本领域中用于工业乙醇发酵的液化醪。在本发明一些优选实施方式中，所述淀粉质生物质可选自于玉米、木薯、小麦、水稻、甘蔗和甜高粱等。在本发明一些更优选的实施方式中，所述淀粉质生物质优选为玉米。

[0049] 相应地，所述来源于淀粉质生物质的液化醪可根据本领域中所公开的方法来制备。其中，以玉米作为示例，玉米液化醪可按照以下方法进行制备：将玉米粉与水(料水质量比为1:1.7-1:2.1)调配成均一的粉浆并在40-60℃(优选45-55℃、更优选50℃)下在水中浸泡1-3h(优选1.5-2.5h、更优选2h)使淀粉吸水膨胀，然后加入淀粉酶(例如生料淀粉酶，例如购自诺维信的生料复合酶50103)在50-70℃(优选55-65℃、更优选60℃)下液化0.5-2h(优选0.75-1.5h、更优选1-1.25h、特别优选1h)，从而获得玉米液化醪。在本发明一些优选实施方式中，所述液化醪(例如玉米液化醪)的干物占比为29-32wt％，更优选为30wt％。

[0050] 在本发明中，干物(也可称为干固)是指将测试样品在规定温度和时间内进行干燥，当烘至恒重时，烘干后的质量占烘前的样品质量的百分数。测量干物采用的温度可为130℃左右，干燥时间可为40分钟以上。

[0051] 在本发明一些优选实施方式中，可通过在所述液化醪(例如玉米液化醪)中添加尿素、糖化酶(一种淀粉外切酶，能使淀粉从非还原性末端逐一水解α-1,4-葡萄糖苷键，产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6-葡萄糖苷键，转化成葡萄糖)和抗生素(破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期杀死细菌，在乙醇工业生产中起到抑制杂菌生长的作用，例如青霉素和链霉素)来获得液化醪液体培养基。在本发明一些优选实施方式中，还可在所述液化醪中添加蛋白酶(可以水解淀粉质生物质中的蛋白，增加醪液中α-氨基酸含量，为酵母细胞的生长、繁殖提供丰富的氮源)。

[0052] 在本发明的实施方式中，所使用的酿酒酵母原始菌株可以为任何酿酒酵母菌株。在本发明一些优选实施方式中，所使用的酿酒酵母原始菌株可以为市售的酿酒酵母菌株。
在本发明一些更优选的实施方式中，所使用的酿酒酵母原始菌株为酿酒酵母S288C。

[0053] 4.关于试剂盒

[0054] 本发明还提供了用于方便有效地实施本发明所述的对酿酒酵母进行适应性进化以提高其抗逆性的方法的试剂盒。所述试剂盒包含如本发明的第一方面所述的用于提高酿酒酵母抗逆性的sgRNA文库以及任选的sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶和酿酒酵母细胞。根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒还可包含克隆载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂或上述物质的任意组合。

[0055] 实施例

[0056] 下文描述了本发明的示例性实施方式，本领域技术人员应该明了的是，以下实施方式并不限制本发明的特定实施方式，应理解为包括本发明的精神和范围内的所有变体、等同物或替代物。多种调整和其它实施方式在本领域普通技术人员的能力范围内，并预期落入本发明的范围内。

[0057] 除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如可利用下列著作中描述的标准程序来实施：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1995)；以及Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等著，John Wiley and Sons，Inc.)。

[0058] 除非另有说明，下文所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

[0059] 试剂和方法

[0060] 酿酒酵母真实物料适应性进化

[0061] (1)将针对各亚库(即抗逆调控库、细胞生长及代谢调控库、分子及转录水平调控库，参见下文表1-表3)中的基因的sgRNA(本文中也称为“如本发明的第一方面所述的sgRNA文库”或“本发明的sgRNA文库”或“sgRNA文库”)转化至过表达NHEJ通路相关基因(包括DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因，但本发明不限于此)并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；

[0062] (2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入添加了0-6％乙醇的液化醪液体培养基中，于30-32℃、170rpm摇床培养16-24h后，升温至35-37℃继续培养24h，得到酿酒酵母液化醪培养液；

[0063] (3)使用无菌纱布过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，使用血球计数板观察活菌率，直至得到活菌率为15-20％的菌浊液用于进行下一轮转化；

[0064] (4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，使用含400μg/ml G418的YPD培养基过夜活化后，用含2％半乳糖的YP培养基培养过夜筛选出上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母(在半乳糖培养基中可以存活的酿酒酵母即为上一轮转入的sgRNA已丢失的酿酒酵母)，以所述sgRNA已丢失的酿酒酵母作为种子再次进行步骤(1)中的sgRNA文库转化；并重复步骤(2)及步骤(3)；

[0065] (5)经至少3轮上述步骤后，使用无菌纱布过滤步骤(4)中得到的酿酒酵母液化醪培养液，获得菌浊液，离心菌体后去除上清液，用1M无菌山梨醇溶液将菌体重悬并涂布于液化醪平板，于37℃恒温培养箱培养2-3天后，挑出平板上直径较大的单克隆在96孔板中用YPD培养基培养过夜后加30％甘油保存于-80℃，得到适应该筛选条件的酿酒酵母CRISPR文库。

[0066] 酿酒酵母高温乙醇发酵培养

[0067] (1)取保存于-80℃的酿酒酵母CRISPR文库的改造菌株的菌液50μL，接种于含3mL液化醪液体培养基的深孔板中，覆透气膜及封口膜，并在每孔加透气装置，于30-32℃(优选31-32℃，特别优选32℃)、400-600rpm(优选450-550rpm，特别优选500rpm)摇床培养12-36h(优选16-32h，更优选20-28h，特别优选24h)；

[0068] (2)升温至35-37℃(优选36-37℃，特别优选37℃)继续摇床培养，每隔24h取样(样品的获得方法为：取出多孔板以3500rpm离心5min，取50μL上清液使用高效液相色谱检测其糖含量及乙醇产量)；

[0069] (3)72h后结束发酵(每组实验重复3次)。

[0070] 液化醪液体培养基的配制：

[0071] 取出-20℃冰箱保存的液化醪于56℃水浴锅化冻，量取100mL至摇瓶中，加入0.3876g/L尿素、350μL/L苏宏GA475糖化酶、0.010g/L青霉素、0.050g/L链霉素，混匀。其中，将玉米粉在50℃下浸泡2小时，向其中加入生料淀粉酶(购自诺维信的生料复合酶50103，但不限于此，也可使用其它类似功能的生料淀粉酶)于60℃下液化60min，转速60rpm，干物占比为29-32wt％，pH 4.5，即为液化醪。

[0072] 液化醪固体平板的配制：

[0073] 配制浓度为10wt％的琼脂溶液，121℃高温灭菌20min。倒平板时，取出-20℃冰箱保存的液化醪于56℃水浴锅化冻，并将琼脂冷却至60℃左右，取50ml热液化醪倒入10mL热琼脂溶液中混匀，并加入0.3876g/L尿素、0.010g/L青霉素、0.050g/L链霉素，混匀后倒平板。使用时，以每块平板30mL为准将350μL/L苏宏GA475糖化酶均匀涂布至平板平面上，然后再涂布菌液。其中，液化醪配制方式如上所述。

[0074] YPD液体培养基的配制：

[0075] 2wt％葡萄糖、2wt％蛋白胨、1wt％酵母粉以及余量的水，pH 7.0。

[0076] 实施例中涉及的高保真PCR使用Primestar DNA聚合酶(购于Takara)，涉及的基因组PCR使用2×EasyTaq PCR SuperMix(购于Transgen)，所用PCR条件参考相应试剂说明书。实施例中涉及的DNA凝胶电泳切胶回收使用胶回收试剂盒(购于OMEGA)，涉及的大肠杆菌质粒提取使用质粒提取试剂盒(购于QIAGEN)，涉及的酿酒酵母基因组DNA提取使用酵母基因组DNA提取试剂盒(购于TIANGEN)。实施例中涉及的Golden Gate组装的IIs类限制性内切酶为Esp3I(购于NEB)和BsaI(购于NEB)，连接酶为T4DNA连接酶(购于NEB)。本领域技术人员知晓的是，实施例中涉及的Golden Gate组装也可以使用可从不同公司商购得到的Golden Gate试剂盒或酶及与之匹配的缓冲液来完成。

[0077] 实施例1 sgRNA文库的设计与构建

[0078] 根据NCBI数据库所收录的信息，酿酒酵母S288C全基因组包含6445个基因。根据筛选目的的不同，可设计全基因组sgRNA文库或仅针对部分基因组合挑选合适的亚库进行设计与构建。考虑到工业酿酒酵母菌株抗逆性改造有着特定的需求，若基因编辑范围太广则工作量成倍增加并且获得所需改造株的概率也会相应降低，因此，为确保基因编辑的定向性和可控性，在进行全面深入的分析研究后，本实施例特定选择了酿酒酵母调控相关的基因及序列进行sgRNA设计，并依据菌株改造目的及基因相关功能将所选择的基因分为抗逆调控库(Stress resistance regulation library，SRR-sub1)、细胞生长及代谢调控库(Cell growth and metabolism regulation library，CGMR-sub2)以及分子及转录水平调控库(Molecular and Translation level regulation library，MTLR-sub3)三个亚库。

[0079] 通过NCBI等数据库匹配基因注释关键字获得与各亚库中的条目名对应的基因，各亚库的详情示于下表1-表3中。

[0080] 表1亚库1-抗逆调控库

[0081]

[0082] 表2亚库2-细胞生长及代谢调控库

[0083]

[0084] 表3亚库3-分子及转录水平调控库

[0085]

[0086] 借助金唯智公司本地化平台CRISPRWiz，根据以下原则进行每个基因的sgRNA设计，每条sgRNA的长度为20nt：

[0087] 将每个基因设计区域分为两部分：区域一为起始密码子上游300bp区域，区域二为CDS区5％-65％范围。针对以上两个区域设计出所有的sgRNA作为候选sgRNA。在候选sgRNA的基础上，再依次依据如下原则进行sgRNA打分：(1)脱靶(off-target)率低；(2)没有连续4个以上碱基的重复；(3)靠近5’端优先(此条只针对CDS区，对起始密码子上游300bp区域忽视此条)；(4)如果两个sgRNA存在重叠，重叠部分最多不超过15nt(尽量保证sgRNA在设计区域内均匀分布)。

[0088] 基于以上标准进行sgRNA打分后，在每个基因的区域一中选择2条评分最高的sgRNA、区域2中选择4条评分最高的sgRNA，共6条sgRNA。如果区域一中选不出得分较高的sgRNA，则在区域二中补够6条sgRNA；若因某些基因较短而设计不够6条sgRNA，则针对这部分基因以实际设计的条数为准。在获得所有基因的sgRNA后，依据基因亚库将sgRNA同样分为3个亚库，为每个亚库设计特定的接头，用于亚库的拆分(表4)。

[0089] 表4各sgRNA亚库名称及接头和酶切位点序列设计

[0090]

[0091] SRR-sub1左接头：TACGACGACTCACTATAGCG(SEQ ID NO.1)

[0092] SRR-sub1右接头：GCTAGTTAATGCTCACGGGC(SEQ ID NO.2)

[0093] CGMR-sub2左接头：AGGAGCATGCCAGTGTTCAG(SEQ ID NO.3)

[0094] CGMR-sub2右接头：CATCGCTGCAGGATCTACAT(SEQ ID NO.4)

[0095] MTLR-sub3左接头：GACTCGTTCCTTAGACAAGC(SEQ ID NO.5)

[0096] MTLR-sub3右接头：GTGACAGGTCTCGGACGTAA(SEQ ID NO.6)各亚库通用酶切位点1：CGTCTCAGATC(SEQ ID NO.7)

[0097] 各亚库通用酶切位点2：GTTTCGAGACG(SEQ ID NO.8)

[0098] 由金唯智公司通过同一块芯片合成上述三个sgRNA亚库。

[0099] 以合成得到的混合核苷酸(Oligo pool)片段干粉用10μl ddH2O溶解作为母液，取1μl稀释10倍后作为模板使用，剩余母液于-80℃保存，分别进行三个亚库靶序列的扩增，每次扩增用3μl模板，其中亚库SRR-sub1使用引物SP1-F及SP1-R；亚库CGMR-sub2使用引物SP2-F及SP2-R；亚库MTLR-sub3使用引物SP3-F及SP3-R(表5)。为尽量减少PCR过程中可能出现的不平均扩增，仅进行10个PCR循环。PCR反应条件如下：使用PrimeStar标准反应程序，其中解链98℃5s，退火55℃10s，72℃延伸10s，共10个循环。

[0100] 表5扩增各亚库靶序列的引物及其序列

[0101]

[0102] 以经历琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化后的亚库片段与含sgRNA骨架的载体质粒为原料进行Golden Gate(Esp3I)组装。具体而言，在本实施例中，Golden Gate(Esp3I)组装采用NEB官网的标准方法使用Esp3I和T4连接酶来进行；所使用的缓冲液为NEB的Cutsmart Buffer(补充有1mM ATP)；所使用的反应条件为：37℃5分钟、16℃5分钟，循环20次，60℃5分钟，4℃保持，可直接进行转化(下一段的电击转化)。其中，载体质粒为在pSR42H载体(商业化载体)基础上进行改造，在其多克隆位点中插入sgRNA文库构建和使用所需的元件而获得的工程质粒，用于sgRNA的构建及表达。具体而言，该载体质粒包含：多个复制起始位点，分别用于在真核及原核生物细胞内表达；潮霉素B(HygR)抗性及氨苄霉素(AmpR)抗性标记，分别为用于酵母及大肠杆菌的筛选标记；半乳糖负筛选标记GAL10:GIN11M，用于质粒在酵母中的清除；SNR52启动子和sgRNA骨架，用于与靶序列串联成完整sgRNA表达序列，起到特定位点靶向作用；SNR52启动子和sgRNA骨架之间的ccdB大肠杆菌致死基因，用于提高大肠杆菌转化过程中的筛选阳性率。

[0103] 然后，使用大肠杆菌电击转化法将由Golden Gate(Esp3I)组装获得的三个sgRNA亚库的连接产物分别转化至大肠杆菌感受态细胞中，取转化复苏后1/1000稀释的细胞培养液涂板计数，剩余培养液经过夜放大培养后进行质粒大提，以确保所得质粒的丰富度。在用于计数的平板中挑取20个单克隆进行测序验证，确保其中sgRNA序列各不相同，而所提质粒即为构建完成的sgRNA文库。

[0104] 实施例2酿酒酵母菌株的改造

[0105] 为提高酿酒酵母在经CRISPR/Cas9系统编辑后进行DNA修复时利用NHEJ机制进行修复的概率，在酿酒酵母中过表达其内源与NHEJ通路相关的DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因。

[0106] 具体而言，按照由NCBI数据库获得的基因序列信息，使用高保真PCR扩增方法分别从酿酒酵母基因组中扩增DNL4、Lif1、Yku70、Yku80、Nej1、Mre11、Rad50和Xrs2基因的完整编码区序列，经测序验证之后，使用如实施例2中所述的Golden Gate(Esp3I)组装方法分别构建FBA1p-DNL4-CYC1t、PGK1p-Lif1-TPI1t、ENO2p-Yku70-FBA1t、TEF1p-Yku80-PGK1t、PGK1p-Nej1-TPI1t、ENO2p-Mre11-FBA1t、TEF1p-Rad50-PGK1t和FBA1p-Xrs2-CYC1t表达盒。各表达盒中涉及的启动子(FBA1p、PGK1p、ENO2p、TEF1p)和终止子(CYC1t、TPI1t、FBA1t、PGK1t)序列同样均为按照由NCBI数据库获得的基因序列信息，使用高保真PCR扩增方法分别从酿酒酵母基因组中扩增获得。

[0107] 使用Golden Gate(BsaI)组装方法(Golden Gate(BsaI)组装采用NEB官网的标准方法使用NEB的BsaI-HFv2和T4连接酶来进行，其它条件与Golden Gate(Esp3I)组装相同)将前4个基因表达盒与诺尔丝菌素抗性基因串联，两边加上酿酒酵母基因组多拷贝位点delta1和delta2序列(即，酿酒酵母基因组的delta位点(GenBank:X00393.1)1-239bp和240-487bp)作为同源臂；将后4个基因表达盒与博来霉素抗性基因串联，两端加上酿酒酵母基因组rDNA序列(即酿酒酵母基因组的NTS位点(GenBank:X00486.1)2471-1265bp和1266-
2510bp)作为同源臂；将上述两个片段依次电转化酿酒酵母(1.5kV，5ms，200W，25μF)，使其分别整合到酿酒酵母基因组的delta1-delta2位点和rDNA位点。通过基因组PCR证实上述两个片段成功整合至期望位点，将所得阳性工业酿酒酵母菌株命名为I-S.c-NHEJ。

[0108] 然后，通过电转化(1.5kV，5ms，200W，25μF)将Cas9表达质粒转化入上述I-S.c-NHEJ菌株。其中，Cas9表达质粒为在p414质粒(商业载体)基础上插入编码Cas9的基因而获得的工程质粒。该质粒包含：多个复制起始位点，分别用于在真核及原核生物细胞内表达；遗传霉素(G418)抗性及氨苄霉素(AmpR)抗性标记，分别为用于酵母及大肠杆菌的筛选标记；编码Cas9的基因。将所得阳性菌株命名为I-S.c-NHEJ-Cas9，即为过表达NHEJ通路相关基因并带有Cas9表达质粒的工业酿酒酵母。该工业酿酒酵母即为后续用于进行酿酒酵母CRISPR文库构建的底盘宿主菌。

[0109] 实施例3酿酒酵母CRISPR文库的构建

[0110] 为获得酿酒酵母CRISPR文库，用实施例1中获得的sgRNA文库电转化实施例2中获得的I-S.c-NHEJ-Cas9菌株。

[0111] 具体而言，取2μg sgRNA文库质粒轻轻加入一管电转化酵母感受态细胞中，加入体系不应超过感受态细胞体积的1/10；将加入质粒的感受态细胞移至2mm预冷电击杯中，以1.5KV、200W、25μF的条件电击5ms；立即加入1mL无抗YPD培养基，于30℃、150rpm摇床复苏
2h。

[0112] 取复苏后菌体以5000rpm离心5min，弃去上清，然后用500μL 1M山梨醇溶液重悬菌体，取2-5％涂布相应抗性YPD平板，用于验证各亚库质粒转化效果并计数。同时，将剩余菌液接种至添加了0-6％乙醇的液化醪液体培养基中，于30℃、170rpm培养24h，升温至37℃再培养24h。培养2天后的含菌液液化醪液体培养基逐渐散出酒香，取样镜检可见大量酵母细胞，经次甲基蓝染色后可观察到约20％的活菌率。使用无菌纱布过滤培养后的酿酒酵母液化醪培养液，去除液化醪中的固体获得菌浊液。按5％比例取上述菌浊液转接至含2％半乳糖的新鲜YPD培养基中过夜培养作为新一轮种子液，制作感受态细胞并再次转化sgRNA文库质粒。

[0113] 对I-S.c-NHEJ-Cas9菌株进行至少三轮转化和培养后，可以保证对酵母基因组的充分编辑，同时保证所得改造株文库的丰富度。在最后一轮液化醪液体培养基筛选后，为获得可分离的克隆，对所得菌浊液进行梯度稀释并选择10-2稀释的菌液100μL涂布添加有400μg/mL遗传霉素的液化醪平板，于37℃恒温培养箱培养3天。

[0114] 相比底盘宿主菌I-S.c-NHEJ-Cas9菌株，经sgRNA文库转化得到的改造株可生长为体积较大的菌落。这些改造株经过初步高温液化醪培养筛选(工业物料压力、温度压力和乙醇压力)后，具有与工业物料更为匹配的性能，因此可作为最终用于进行适应性进化以提高其抗逆性的改造株库。由于这些改造株是经sgRNA文库转化而得并且过表达NHEJ通路相关基因及带有Cas9表达质粒，将其命名为酿酒酵母CRISPR文库。

[0115] 实施例4酿酒酵母CRISPR文库的筛选

[0116] 在酿酒酵母CRISPR文库的筛选过程中，通过设定较高的培养温度以筛选高温情况下菌株乙醇产量高且残糖量低的菌株。

[0117] 使用 FXP移液工作站在96孔深孔板中加入YPD培养基并使用Q-Pix450系统挑取实施例3中得到的酿酒酵母CRISPR文库的单菌落至对应孔中，置于37℃、800rpm高速振荡培养箱中培养24h，作为种子液进行菌株保存并用于后续物料筛选。取4块24孔深孔板，每孔加入3mL(每孔总体积为10mL)液化醪液体培养基及一颗无菌玻璃珠，按序加入种子液，使其初始OD600保持在0.6左右。覆封口膜后使用微量透气装置补充氧气并减少酒精挥发。置于32℃、400rpm高速振荡培养箱中培养24h后升温至37℃再培养48h。取培养72h菌液上清，使用HPLC检测其乙醇产量。挑选其中不低于对照菌株I-S.c.-NHEJ-Cas9乙醇产量的菌株进行复筛，条件同上，并进行3次重复。

[0118] 结果是，对照菌株I-S.c.-NHEJ-Cas9在培养72h后乙醇浓度为101.7g/L；而由实施例3中得到的酿酒酵母CRISPR文库获得的菌株中乙醇产量最高的2株菌株在培养72h后乙醇浓度分别达到108.0g/L(提高了6.2％)及112.8g/L(提高了10.9％)。可见，本发明的酿酒酵母CRISPR文库可以在复合选择压力下适应性进化并表现出提高的抗逆性。

[0119] 实施例5酿酒酵母CRISPR文库的摇瓶验证

[0120] 考虑到24孔板体积较小，因此选择实施例4中得到的5株生产性能较为优异的菌株进行摇瓶验证。

[0121] 将选出的5株改造菌株、对照菌株I-S.c.-NHEJ-Cas9和底盘改造前的原始菌株(即，不过表达NHEJ通路相关基因并且不带有Cas9表达质粒的酿酒酵母菌株)接种YPD培养8
基活化过夜作为种子液，进行细胞计数，按0.125×10 个酵母/ml液化醪计算接种量，将种子液以6000rpm离心5min，无菌生理盐水洗一次，用无菌生理盐水悬浮至1mL，接种到150g液化醪液体培养基中。将各菌株置于32℃、150rpm振荡培养箱中培养12h后升温至35℃再培养
36h，再次降温至32℃再培养24h，以上述培养条件模拟实际燃料乙醇发酵过程中不控温时的温度条件；同时，原始菌株另做一组始终控温32℃的平行实验，模拟燃料乙醇发酵过程中控温较好的状态。取培养72h菌液上清，使用HPLC检测其乙醇产量。经HPLC检测可知，此时各菌株葡萄糖均已耗尽。

[0122] 结果是，对于模拟实际燃料乙醇发酵过程中不控温时的温度条件而言，对照菌株I-S.c.-NHEJ-Cas9在培养72h后乙醇体积浓度为12.19％(v/v)；而由实施例4中得到的菌株中乙醇产量最高的2株菌株在培养72h后乙醇体积浓度分别达到12.82％(v/v)(提高了5.17％)和12.71％(v/v)(提高了4.27％)；原始菌株在培养72h后乙醇体积浓度为12.21％(v/v)。此外，对于模拟燃料乙醇发酵过程中控温较好的状态(即恒温32℃)时，原始菌株在培养72h后乙醇体积浓度为12.68％(v/v)。

[0123] 由此可见，筛选到的改造株在升温环境下的乙醇产量已经达到甚至超过原始酵母菌株恒温32℃时的水平。可见，本发明的酿酒酵母CRISPR文库在扩大培养规模的条件下也可以适应性进化并表现出提高的抗逆性。

[0124] 工业实用性

[0125] 本发明联合精准基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统的“反向设计”，借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，并在工业发酵物料及发酵微环境的选择压力下，不断富集稳定的多重抗逆改造菌株。通过对适用于工业微生物的CRISPR/Cas9基因组编辑系统的构建，本发明助推了工业微生物的抗逆性进化，提供了一种具有普遍应用价值的工业微生物抗逆改造技术平台，实现了工业微生物在发酵微环境中的系统最优化，提高了其发酵生产性能。

[0126] 表6亚库1基因列表

[0127]

[0128]

[0129] 表7亚库2基因列表

[0130]

[0131]

[0132] 表8亚库3基因列表

[0133]

[0134]

标题	发布/更新时间	阅读量
一株酿酒酵母及其应用	2020-05-11	442
一株酿酒酵母及应用	2020-05-11	467
一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法	2020-05-13	388
耐酸酿酒酵母及其用途	2020-05-12	703
一株酿酒酵母及其应用	2020-05-12	665
酿酒酵母菌株及其在冰酒中的应用	2020-05-13	25
一种酿酒酵母及其应用	2020-05-11	891
一株酿酒酵母及其应用	2020-05-11	115
一种酿酒酵母发酵装置	2020-05-12	894
一种酿酒酵母的发酵罐	2020-05-11	31

基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造

基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：