技术领域
[0001] 本
发明属
植物细胞工程领域，特别涉及一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株及制备方法及应用。
背景技术
[0002] 黄瓜在我国种植历史悠久，我国人民喜食黄瓜，种植类型多以刺瘤型黄瓜为主。黄瓜属葫芦科甜瓜属，雌雄同株、异花植物，依雌花性型特点可分为雌性系、非雌性系类型。随着人民生活
水平的提高，对新、奇、特蔬菜品种的要求越来越高，黄瓜种植呈现多元化趋势。雌性系光滑型水果黄瓜，其果型优美，口感清香，表皮光滑，色泽亮绿，受到消费者青睐，已成为我国黄瓜主要种植类型之一。最初水果黄瓜主栽品种为国外杂交品种，
种子价格高，随着我国水果黄瓜育种研究的开展，我国自己培育的新品种已逐渐替代国外品种，但由于我国水果黄瓜品种选育开展较晚，育种材料少，新品种在品质、抗性等方面亟待提高。
[0003] 单倍体育种技术是现代商业化育种重要手段之一，可以快速创制优异育种純系、缩短育种周期、提高育种效率。单倍体植株通常由雌配子体或雄配子体发生分裂、发育而来，基因型纯和，自然或人工加倍获得的双单倍体植株，可作为育种纯系直接用于品种选育。自上世纪九十年代以来，研究者对单倍体植株的诱导技术进行了大量研究：花药或花粉小孢子培养是主要方法，研究者相继在白菜、花椰菜、甘蓝、辣椒、茄子等蔬菜获得成功，且实现规模化应用；
辐射花粉
授粉方法是另一种比较有效的方法，研究较多，研究者在小麦、
马铃薯、番茄、黄瓜、甜瓜等都有成功的报道，但规模化应用较少；另一种主要方法为未受精子房培养。未受精子房培养于1976年首次在
大麦获得成功，由于黄瓜小孢子培养较难成功，许多研究者开展了黄瓜未受精子房培养方法研究。
[0004] Dirks(1996年)申报美国
专利，在世界上首次通过未受精子房培养方法，以荷兰光滑型水果黄瓜为材料，诱导获得黄瓜单倍体植株，单倍体胚胎平均发生率为50％。但其技术存在以下不足：1.单倍体胚胎发生的诱导培养基需根据供体材料的单性结实能
力，调整生长素及细胞分裂素浓度，存在明显的基因型差异。2.大部分再生小植株为单倍体，单倍体植株不能正常结籽，育种中无法应用，其专利文件指出必须用秋水仙
碱或其它方法诱导
染色体加倍获得双单倍体植株，才能用于育种。秋水仙碱是目前用于植株倍性加倍的常用
试剂，黄瓜
幼苗对其敏感，易产生毒害造成死苗，且加倍过程时间长、效率低。
[0005] 匈牙利学者Gemes Juhasz(2002年)报道通过未受精子房培养方法获得黄瓜单(双单)倍体再生植株，其方法是将未受精子房接种在添加TDZ 0.02％和
蔗糖4％的CBM基本培养基上，35℃高温黑暗处理2-4天后，转入添加0.2mg/L 6-BA、0.05mg/LNAA、3％蔗糖的CBM基本培养基中，6-12周后可见胚胎，将胚胎继代培养在无
激素3％蔗糖的CBM基本培养基，长成小植株。该方法获得最高单倍体胚胎发生率为18.7％，植株再生率为7.1％，87.7％的再生植株为单倍体。由于没有有效的加倍方法，仅24％的单倍体植株被加倍为混倍体植株(Gemes Juhasz，2006年)，其最终获得用于育种的双单倍体植株较少。
[0006] 泰国学者A.Sorntip(2017年)报道以泰国鲜食黄瓜F1代商品种Chai Lai和Big C为供体材料进行未受精子房培养，研究了胚状体诱导、分化、再生过程中的最适培养基对植株再生的影响，认为基因型及诱导培养基对胚状体的产生影响较小，在胚状体分化过程中使用D2培养基：基本培养基为MS，添加生长素NAA0.05mg/L,细胞分裂素BA0.2mg/L，Triacontanol(TRIA)0.02mg/L,Proline(Pro)100mg/L,ABA 20mg/L,AgNO3 2mg/L,Sucrose 30g/L,gelrite 3g/L，再生过程中使用MST3+培养基：基本培养基为MS,添加生长素IBA
0.05mg/L,细胞分裂素TDZ 1mg/L，以及赤霉素GA3 0.5mg/L,脱落酸ABA 0.1mg/L，同时添加TRIA、Polyvinylpyrrolidone、Proline、Glutathione、AgNO3、Coconut water、Tomato、Khai banana等成分，获得最高胚状体诱导率为59.89％,获得的10个再生植株中，双单倍体植株6株。该方法存在胚状体诱导率低、获得再生植株少等问题。
[0007] 我国研究者多以刺瘤型黄瓜为供体材料，进行未受精子房培养技术的相关研究。杜胜利(2001年)以国内刺瘤型黄瓜(非雌性系)为材料，研制成功黄瓜未受精子房培养技术，获得单(双单)倍体植株，其中80％为双单倍体再生植株。2007年，该技术获得国家发明专利。在后续研究中发现，由于供体材料基因型差异，应用该技术很难对雌性系光滑型水果黄瓜进行单倍体胚胎诱导，胚胎诱导率、再生植株率低。
[0008] 陈晓鹏(2005年)以刺瘤型黄瓜为供体材料，获得了较高的胚胎发生率，但未报道单(双单)倍体植株再生情况。王烨(2008年)以两个刺瘤型黄瓜、1个无刺类型为材料，研究了高温预处理、不同激素种类及浓度对胚状体发生的影响，其中刺瘤型黄瓜获得胚状体，无刺型黄瓜(水果黄瓜类型)未获得胚状体。刁卫平(2008年)以刺瘤型、光滑型黄瓜为材料，从子房发育时期、热激处理时间、TDZ和AgNO3对黄瓜未授粉子房培养过程中胚发生的影响，获得较高的单倍体胚发生率，最高为80％以上，但未报道植株再生情况。在后续研究中刁卫平(2009年)以刺瘤型黄瓜、华南型黄瓜为材料，对胚状体分化及再生植株倍性进行研究，获得的40株再生植株中，92.5％为华北刺瘤型黄瓜，未报道雌性系水果黄瓜双单倍体植株再生情况。李建欣(2012年)报道以刺瘤型黄瓜为材料，通过未受精子房培养方法获得再生植株，单倍体胚胎最高发生
频率为87.5％，植株再生频率最高为10％。
[0009] 综上，有关雌性系光滑型水果黄瓜未受精子房培养虽有较高的胚胎发生率报道，但双单倍体再生植株率低，高效方法尚未见。
发明内容
[0010] 本发明的目的是克服
现有技术的不足，提供一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株。
[0011] 本发明的第二个目的是提供一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株的制备方法。
[0012] 本发明的第三个目的是提供一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株作为育种纯系应用于黄瓜育种的应用。
[0013] 本发明的技术方案概述如下：
[0014] 一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)引进雌性系光滑型水果黄瓜F1商品种，通过黄瓜未受精子房培养筛选培养基进行培养，筛选高频胚胎发生率的商品种；
[0016] (2)将步骤(1)筛选出的高频胚胎发生率所述F1商品种，和其它的雌性系光滑型水果黄瓜F1商品种分别种植于田间，开花期杂交授粉，杂交后代为包含高频胚胎发生率基因的黄瓜供体基因
型材料；
[0017] (3)通过黄瓜未受精子房培养技术，得到雌性系黄瓜双单倍体再生植株。
[0018] 黄瓜未受精子房培养筛选培养基的配方为：KNO3 750mg，NH4NO3 300mg MgSO4.7H2O 75mg，CaCl2.2H2O 165mg，KH2PO4 420mg，(NH4)2SO4 150mg，Mn SO4 15mg，Zn SO4 10mg，H3BO3 7.2mg，KI 1.5mg，Fe SO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇150mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 2.0mg，烟酸5.0mg，甘
氨酸5.0mg.细胞分裂素2.5mg，维生素H
0.1mg，
水解乳蛋白10mg，蔗糖30g，琼脂7.0g，加水至1L，pH5.8，所述黄瓜未受精子房培养筛选培养基简称为S5。
[0019] 步骤(3)所述黄瓜未受精子房培养技术为：将步骤(2)获得的黄瓜供体基因型材料种植于
温室或大棚，在开花期采集开花前2-4天的未受精子房，表面灭菌，横切或纵切后，接种在诱导培养基上进行未受精子房培养，出现胚状体、幼芽或胚性愈伤组织后，培养物继代到分化培养基中继续培养，得到雌性系黄瓜双单倍体再生植株。
[0020] 诱导培养基的配方为：KNO3 300mg，NH4NO3 600mg，MgSO4·7H2O 135mg，CaCl2·2H2O 100mg，KH2PO4 90mg，NH4SO4 50mg，Mn SO4 3mg，Zn SO4 3.5mg，H3BO3 3.5mg，KI 3.0mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇100mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6
2.0mg，烟酸2.0mg，甘氨酸1.0mg，腺苷甲硫氨酸50mg，生长素为0.1mg，细胞分裂素为3.2mg，蔗糖30g，琼脂7g，加水至1L，pH 5.8，所述诱导培养基简称为S7，所述细胞分裂素为腺嘌呤、
6-苄基腺嘌呤、激动素、玉米素和噻苯隆中的两种。
[0021] 分化培养基的配方为：包含蔗糖和琼脂的MS基本培养基41.74g，生长素为0.06mg，细胞分裂素为0.2mg，加水至1L，pH5.8，所述分化培养基简称为D9。
[0022] 进行未受精子房培养的步骤为：置于
培养箱内30-33℃，暗培养7-10天；置于培养室28-32℃，光照14小时/黑暗10小时，光照强度为600-1200lux，培养。
[0023] 上述制备方法制备的雌性系黄瓜双单倍体再生植株。
[0024] 上述雌性系黄瓜双单倍体再生植株作为育种纯系应用于黄瓜育种。
[0025] 本发明的优点：
[0026] 1.黄瓜未受精子房培养的供体材料，以高频胚胎发生率品种为媒介，经杂交组合配制后实现了“高频基因”的重新整合，利于胚胎发生率的提高及双单倍体植株的高效再生。2.本发明研制的未受精子房培养诱导培养基、分化培养基组成及浓度及培养方法不同于已有研究，不需要依据供体材料差异，调整培养基组成，胚胎发生率及植株再生率高，胚胎发生率为50％-80％，植株再生率最高达12％，尤其适合雌性系光滑型水果黄瓜；3.应用本发明技术体系进行雌性系光滑型水果黄瓜未受精子房培养，双单倍体再生植株比例高，为60％-80％，再生植株不需进行染色体加倍处理，避免了单倍体植株加倍过程死苗，不能自交留种。4.可高效获得黄瓜双单倍体再生植株，筛选获得的优异纯系可直接用于黄瓜育种。
附图说明
[0027] 图1为雌性系光滑型水果黄瓜未受精子房培养胚状体及胚性愈伤组织。
[0028] 图2为雌性系光滑型水果黄瓜未受精子房培养获得的再生小植株。
具体实施方式
[0029] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步的说明。
[0030] 实施例1
[0031] 黄瓜未受精子房培养筛选培养基(S5)的配方为：KNO3 750mg，NH4NO3 300mg，MgSO4·7H2O 75mg，CaCl2.2H2O 165mg，KH2PO4 420mg，(NH4)2SO4 150mg，Mn SO4 15mg，Zn SO4 10mg，H3BO3 7.2mg，KI 1.5mg，Fe SO4.7H2O 27.8mg，Na2EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇150mg，维生素B1 1.0mg，维生素B6 2.0mg，烟酸5.0mg，甘氨酸5.0mg，6-苄基腺嘌呤(细胞分裂素)
2.5mg，维生素H 0.1mg，水解乳蛋白10mg，蔗糖30g，琼脂7.0g，加水至1L，pH5.8，按常规方法制成培养基。
[0032] 实施例2
[0033] 诱导培养基(S7)的配方为：
[0034] KNO3 300mg，NH4NO3 600mg，MgSO4·7H2O 135mg，CaCl2·2H2O 100mg，KH2PO4 90mg，NH4SO4 50mg，Mn SO4 3mg，Zn SO4 3.5mg，H3BO3 3.5mg，KI 3.0mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇100mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 2.0mg，烟酸2.0mg，甘氨酸1mg，腺苷甲硫氨酸50mg，
萘乙酸(生长素)0.1mg，腺嘌呤(细胞分裂素)3.0mg，噻苯隆(细胞分裂素)0.2mg，蔗糖30g，琼脂7g，加水至1L，pH 5.8，按常规方法制成培养基。
[0035] 实施例3
[0036] 分化培养基(D9)的配方为：
[0037] 包含蔗糖和琼脂的MS基本培养基41.74g，吲哚乙酸(生长素)0.06mg，玉米素(细胞分裂素)0.2mg，加水至1L，pH5.8，按常规方法制成培养基。
[0038] 实施例4
[0039] 一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株的制备方法，包括如下步骤：
[0040] (1)引进雌性系光滑型水果黄瓜F1商品种：以色列海泽拉公司萨那、拉齐奥；荷兰瑞克斯旺公司戴多星、康德、22-33和22-36，通过黄瓜未受精子房培养筛选培养基(S5)进行培养，筛选高频胚胎发生率的商品种22-33；
[0041] (2)将步骤(1)筛选出的高频胚胎发生率所述F1商品种22-33，和其它的雌性系光滑型水果黄瓜F1商品种(荷兰瑞克斯旺公司戴多星、康德、萨博格、托尼等)分别种植于田间，开花期杂交授粉，杂交后代均为包含高频胚胎发生率基因的黄瓜供体基因型材料；
[0042] 获得的供体基因型材料为：22-33*戴多星，22-33*康德，22-33*萨博格；22-33*托尼；
[0043] (3)通过黄瓜未受精子房培养技术：将步骤(2)获得的黄瓜供体基因型材料种植于温室，在开花期采集开花前3天的未受精子房，表面灭菌，横切或纵切后，接种在诱导培养基S7上进行未受精子房培养，具体步骤为：置于培养箱内32℃、暗培养7天；置于培养室28℃，光照14小时/黑暗10小时，光照强度为1200lux，培养，出现胚状体(见图1)，胚状体继代到分化培养基D9中，继续培养，得到雌性系黄瓜再生小植株(见图2)。未受精子房培养胚胎发生及植株再生情况(见表1)。
[0044] 表1：配制的供体基因型材料未受精子房培养胚胎发生及植株再生情况
[0045] 供体基因型 接种子房数(个) 胚胎发生率(％) 植株再生率(％) 双单倍体植株比例(％)22-33*萨博格 500 70 10 70
22-33*康德 380 80 12 80
22-33*戴多星 400 60 11 64
22-33*托尼 500 70 9 73
拉齐奥*戴多星 400 50 9 61
拉齐奥*康德 400 70 12 71
拉齐奥*萨博格 500 65 11 71
拉齐奥*托尼 500 75 10 70
[0046] 雌性系黄瓜再生小植株的倍性鉴定
[0047] (1)形态学鉴定：依据田间形态学指标进行雌性系黄瓜再生小植株的倍性鉴定。单倍体植株生长缓慢；
叶片较小；雄花花瓣小且深裂，常不能正常开放，花粉不育；子房及雌花花冠均较小。双单倍体植株与正常二倍体植株形态相同，叶片正常大小；雌雄花形态正常，开放正常，花粉可育。
[0048] (2)遗传学观察：双单倍体植株自交留种后，经多代种植、反复观察发现，90％以上双单倍体株系性状
稳定性及一致性好，可作为育种纯系。
[0049] 实施例5
[0050] 一种雌性系黄瓜双单倍体再生植株的制备方法，包括如下步骤：
[0051] (1)同实施例4的(1)；
[0052] (2)将步骤(1)筛选出的高频胚胎发生率所述F1商品种拉齐奥，和其它的雌性系光滑型水果黄瓜F1商品种(荷兰瑞克斯旺公司戴多星、康德、萨博格、托尼等)分别种植于田间，开花期杂交授粉，杂交后代均为包含高频胚胎发生率基因的黄瓜供体基因型材料；
[0053] 获得的供体基因型材料为：拉齐奥*戴多星，拉齐奥*康德，拉齐奥*萨博格；拉齐奥*托尼；
[0054] (3)通过黄瓜未受精子房培养技术：将步骤(2)获得的黄瓜供体基因型材料种植于大棚，在开花期采集开花前2天的未受精子房，表面灭菌，横切或纵切后，接种在诱导培养基上进行未受精子房培养，具体步骤为：置于培养箱内30℃，暗培养10天；置于培养室30℃、光照14小时/黑暗10小时，光照强度为800lux，培养，出现幼芽，幼芽继代到分化培养基D9中，继续培养，得到雌性系黄瓜双单倍体再生植株。未受精子房培养胚胎发生及植株再生情况(见表1)。
[0055] 用途：
[0056] 本发明研制的技术方法，在育种实践中属于单倍体育种技术。单倍体育种技术对于创新育种材料、提高育种效率具有重要作用，已成为现代商业化育种的重要手段。通过上述方法获得的双单倍体再生植株，经田间筛选后可作为育种纯系，直接应用于黄瓜育种，材料创制周期由常规育种3-4年，缩短为当年获得纯合育种材料，育种效率大幅提升。有利于获得隐性基因控制的重要农艺性状特异育种材料，用常规育种高代自交的方法难以获得。
[0057] 雌性系黄瓜双单倍体再生植株，田间性状表现一致，性状纯合率达90％以上，经抗病性、抗逆性、商品性等鉴定体系的综合评价，可获得在抗病、早熟性、果形、果色、
果皮亮度、果实整齐性、持续结瓜能力、耐寒性等方面表现优异的雌性系黄瓜双单倍体育种纯系。表现优异的双单倍体育种纯系可直接应用于黄瓜新品种选育。
