【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、デキストランの新規な製造方法に関し、詳しくはデキストラン前駆体およびデキストラン合成酵素を反応媒体中に共存させ、それにショ糖溶液を連続添加することにより、出発原料のデキストラン前駆体より大きな重量平均分子量を有するデキストランを直接高収率で製造するデキストランの新規な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】デキストランのうち例えば重量平均分子量約４，０００〜１００，０００のデキストランは、デキストラン硫酸、デキストラン鉄、血漿増量剤の原料として有用である。 さらにまた、各種食品用の原料としても応用することが可能であるが、このようなデキストランを製造する方法には、従来、ロイコノストック・メセンテロイデスなどの菌を用いて発酵により生産した高分子デキストラン（分子量１００万以上）を酸、アルカリあるいはデキストラン分解酵素を用いて加水分解する方法、さらに超音波などにより、物理的に分解する方法が採用されてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これら従来の方法はいずれも高度な分画技術を必要とする上に低分子デキストランが収率良く得られない、あるいは分子量分布が広くなるなどの欠点があり、改良が求められていた。 又、特公昭６０−６６３１号公報には、デキストラン合成酵素と同分解酵素を同時に作用させて低分子デキストランを直接的に製造する方法が示されているが、この方法では性質の異なる二種類の酵素を同時に用いるため、反応溶液の温度やｐＨ さらには酵素活性比などが変わると、
生成する低分子デキストランの分子量が変化しやすく、
反応条件の厳密な管理が必要となり、実用上、問題があった。

【０００４】本発明者らは、ショ糖から分子量分布の狭いデキストランを直接、高収率で製造する方法について種々検討した結果、デキストラン前駆体とデキストラン合成酵素を反応媒体中に共存させ、これにショ糖溶液を連続添加することにより、デキストラン前駆体にグルコースが転移して、デキストランの分子量分布が広がることなく、経時的に分子量が大きくなり、このため一定の分子量を有するデキストランを効率よく製造することができることを知り、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明はデキストラン合成酵素の存在下、デキストラン前駆体にショ糖溶液を連続添加することにより、出発原料のデキストラン前駆体より大きな重量平均分子量を有するデキストランの製造法である。

【０００６】本発明に用いるデキストラン前駆体はグルコースの転移により、より大きな分子量のデキストランになり得るものを意味し、そのような例としてグルコシル残基の数が２以上、好ましくは２〜４０のオリゴ糖（グルコシル残基の数が２〜１０）もしくは低分子デキストラン（グルコシル残基の数が１１〜４０）であり、
そのような例として、例えば、グルコシル残基が２であるイソマルト−スのようなグルコシル残基が２〜１０、
好ましくは２〜５のオリゴ糖、デキストラン合成酵素であるデキストランシュクラーゼを３０〜７０ｗ／ｖ％程度のショ糖溶液に作用させ、低分子デキストラン（重量平均分子量約１，０００〜７，０００）を生成せしめたもの、またはそれを更に分画精製したもの、あるいは発酵などの方法で製造した高分子デキストランを酸やデキストラン分解酵素などで加水分解したもの、またはそれを更に分画精製したものなどを挙げることができる。

【０００７】本発明に用いるデキストラン合成酵素としては、公知の酵素を使用することができる。 。 そのようなデキストラン合成酵素の好ましい例として、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−５１２
株、Ｂ−５１２Ｆ株等のの生産する公知のデキストランシュクラーゼなどが挙げられる。

【０００８】ここで、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５１２株、Ｂ−５１２Ｆ株等を使用するデキストラン合成酵素の生産例を示すと、次の通りである。 培地にはこの菌が同化しうる炭素源、窒素源を用いれば良いが、通常１〜５％程度のショ糖を必須成分とし、窒素源として、酵母エキス、ぺプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、大豆粉、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等が用いられる。 また、その他必要に応じてリン酸もしくはその塩、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩類を添加する。 培養温度は菌が生育する範囲であればよいが、一般に２０〜３０℃の範囲が適当である。 ｐＨは５〜８の範囲とし、培養はごくわずかの通気によるか、または通気せずに行い、培養時間は１０〜３０時間程度が適当である。 次に発酵を終了したデキストラン合成酵素を含む培養液を遠心分離あるいは膜分離により除菌して使用する。 なお、必要に応じて限外ろ過法、溶媒沈殿法、硫安塩析法、ゲルろ過法等の常法に従って部分精製あるいは精製したものを使用しても良い。

【０００９】このようにして調製したデキストラン合成酵素を本発明の反応に使用する。

【００１０】本発明の反応は、まず、デキストラン前駆体とデキストラン合成酵素を水に溶解して反応媒体を調製する。 この反応媒体に含まれるデキストラン前駆体の濃度範囲としては、０．１〜５０ｗ／ｖ％が適当であり、より好ましくは、１〜２０ｗ／ｖ％である。 またデキストラン合成酵素の添加量は、反応媒体に連続添加するショ糖溶液のショ糖の量により決定され、１時間当たりに添加されるショ糖１ｇ当たり１０単位以上が適当であり、より好ましくは１５０〜３００単位とするのが良い。 ここで、デキストラン合成酵素１単位とは、ショ糖濃度１０％、ｐＨ５．２、反応温度３０℃の条件で１分間に１μｍｏｌのフラクトースを遊離する酵素量を意味する。

【００１１】次に、デキストラン前駆体およびデキストラン合成酵素を含有する反応媒体に連続添加するショ糖溶液に含まれるショ糖の濃度は１〜３０ｗ／ｖ％が適当であり、より好ましくは５〜２０ｗ／ｖ％であり、連続添加の速度および時間は目的とするデキストランの分子量に応じて調整すればよい。

【００１２】また、酵素反応のｐＨは４〜８、より好ましくは５〜６であり、また温度は１０〜４０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。

【００１３】反応が終了した後、目的とするデキストランを得る方法としては、エチルアルコールやアセトンなどの有機溶媒を用いて分別沈殿する方法やゲルろ過クロマトグラフィーなどの分画操作を経て分別する方法など通常の方法を用いることができるが、より簡便な方法として、目的とするデキストランの分子量に応じて限外ろ過膜を適宜選択して、例えば目的物のうち、比較的低分子量のデキストランを得る場合には反応液を分画分子量３０万の限外ろ過膜で処理し、高分子デキストランを除去した後、分画分子量１万の限外ろ過膜で処理し、低分子部分を除去することにより目的のデキストランを得ることが可能である。

【００１４】

【実施例】以下、実施例に従って本発明をさらに詳細に説明する。 なお、下記実施例における反応液中に生成するデキストランの分析は下記の分析条件で高速液体クロマトグラフィーにより行った。

【００１５】（分析方法） カラム： 東ソ−製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００Ｐ ｗｘＬ
（７．８ｍｍＩＤ×３０ｃｍ） 溶離液： 蒸留水 流速： ０．７ｍｌ／ｍｉｎ 温度： ６０℃ 検出器： 示差屈折計 重量平均分子量を測定するための標準物質としては分子量既知の市販のデキストランを使用する。

【００１６】製造例 ロイコノストック・メセンテロイデスＮＲＲＬ Ｂ−５
１２株をショ糖２．５％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ ２％、Ｍ _n ＳＯ ₄・５ Ｈ ₂ Ｏ
５ｐｐｍを含む培地（ｐＨ ７．３）６２．５ｍｌに接種し、２５℃で２４時間振とう培養した。 同培養液の全量を１２５０ｍｌの前記培地を入れたジャーファーメンターに移植し、２３℃で２１時間攪拌（２００ｒｐｍ）
培養した。 なお、培養中のｐＨ を７．３に制御するために、水酸化ナトリウム６％、ショ糖４０％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ ２％、Ｍ
_n ＳＯ ₄・Ｈ ₂ Ｏ ５ｐｐｍを含む培地を加えた。 培養終了後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）により除菌し、低温下で分画分子量１０万の限外ろ過膜を用い、５倍量の酢酸緩衡液（ｐＨ ５．２）で脱塩、濃縮し、デキストラン合成酵素を得た。

【００１７】極限粘度の測定 低分子デキストランの極限粘度はウベローデ粘度計を用いて次式に従って求めた。

【００１８】実施例１ ５０ｗ／ｖ％ショ糖溶液２ｍｌに製造例で得られたデキストラン合成酵素を３単位となるように添加し、ｐＨ
５．２、３０℃で２４時間静置し、デキストラン前駆体となる低分子デキストランを合成した。 この溶液にデキストラン合成酵素をさらに１５０単位添加し、全量を１
０ｍｌとし、この液に１０ｗ／ｖ％ショ糖溶液（ｐＨ
５．２）を１０ｍｌ／ｈの速度で連続添加した。 なお、
反応液は絶えず攪拌し、添加されたショ糖が十分混合されるようにした。 ５時間ショ糖溶液を連続添加した後、
反応液を加熱し、酵素を失活させた後、分画分子量１０
万の限外ろ過膜で高分子を、分画分子量１万の限外ろ過膜で低分子を除くと、重量平均分子量２４，０００、極限粘度の０．１６の低分子デキストランが１．５５ｇ
（対ショ糖収率２６％）得られた。

【００１９】実施例２ ７０ｗ／ｖ％ショ糖溶液１．４３ｍｌに製造例で得られたデキストラン合成酵素を３単位となるように添加し、
ｐＨ５．２、３０℃で２４時間静置し、デキストラン前駆体となる低分子デキストランを合成した。 この溶液にデキストラン合成酵素をさらに１５０単位添加し、全量を１０ｍｌとした。 この液に２０ｗ／ｖ％ショ糖溶液（ｐＨ５．２）を５ｍｌ／ｈの速度で連続添加した。 なお、実施例１と同様、反応液は絶えず攪拌した。 ４時間ショ糖溶液を連続添加した後、反応液を加熱し、酵素を失活させた後、分画分子量１０万の限外ろ過膜で高分子を、分画分子量５千の限外ろ過膜で低分子を除くと、重量平均分子量９，６００、極限粘度の０．０９の低分子デキストランが１．８３ｇ（対ショ糖収率３７％）得られた。

【００２０】実施例３ ５０ｗ／ｖ％ショ糖溶液２ｍｌに製造例で得られたデキストラン合成酵素を３単位となるように添加し、ｐＨ
５．２、３０℃で２４時間静置し、デキストラン前駆体となる低分子デキストランを合成した。 この溶液にデキストラン合成酵素をさらに４５０単位添加し、全量を１
０ｍｌとした。 この液に１０ｗ／ｖ％ショ糖溶液（ｐＨ
５．２）を３０ｍｌ／ｈの速度で連続添加した。 なお、
実施例１と同様、反応液は絶えず攪拌した。 ８時間ショ糖溶液を連続添加した後、反応液を加熱し、酵素を失活させた後、分画分子量３０万の限外ろ過膜で高分子を、
分画分子量１万の限外ろ過膜で低分子を除くと、重量平均分子量４０，０００、極限粘度の０．２２の低分子デキストランが６．２２ｇ（対ショ糖収率２５％）得られた。

【００２１】実施例４ ５０ｗ／ｖ％ショ糖溶液１ｍｌに製造例で得られたデキストラン合成酵素を１．５単位となるように添加し、ｐ
Ｈ５．２、３０℃で２４時間静置し、デキストラン前駆体となる低分子デキストランを合成した。 この溶液にデキストラン合成酵素をさらに４５０単位添加し全量を１
０ｍｌとした。 この液に１０ｗ／ｖ％ショ糖溶液（ｐＨ
５．２）を３０ｍｌ／ｈの速度で連続添加した。 なお、
実施例１と同様、反応液は絶えず攪拌した。 ８時間ショ糖溶液を連続添加した後、反応液を加熱し、酵素を失活させた後、分画分子量３０万の限外ろ過膜で高分子を、
分画分子量１万の限外ろ過膜で低分子を除くと、重量平均分子量６７，０００、極限粘度の０．２８の低分子デキストランが４．７８ｇ（対ショ糖収率１９％）得られた。

【００２２】実施例５ イソマルトオリゴ糖（イソマルト９００：日研化学製）
を固形分として０．１５ｇと製造例で得られたデキストラン合成酵素４５０単位を添加し、全量を１０ｍｌとし、この溶液に１０ｗ／ｖ％ショ糖溶液（ｐＨ５．２）
を３０ｍｌ／ｈの速度で連続添加し、３０℃で反応を行った。 なお、実施例１と同様、反応液は絶えず攪拌した。 ７時間ショ糖溶液を連続添加した後、反応液を加熱し、酵素を失活させた後、分画分子量１０万の限外ろ過膜で高分子を、分画分子量１万の限外ろ過膜で低分子を除くと、重量平均分子量２７，８００の低分子デキストランが高収率で得られた。

【００２３】

【発明の効果】本発明は、デキストラン合成酵素の存在下、デキストラン前駆体にショ糖溶液を連続添加反応させることにより、デキストラン前駆体にグルコースを転移させ、所望する分子量のデキストランを得ることができる

【００２４】本発明の方法は、比較的低分子のデキストラン、例えば重量平均分子量約４，０００〜１００，０
００、好ましくは約９，０００〜７０，０００のデキストランを製造する場合に最も好適な結果が得られる場合が多い。 すなわち得られるデキストランは、分子量分布の狭いデキストランを高収率で生成せしめるものであり、デキストランを精製する場合、例えば目的とするデキストランの分子量に応じて限外ろ過膜を選択し、反応液を処理するだけで精製が可能であるという利点がある。 また反応時間に応じてデキストランの分子量がコントロールできることから、従来の方法に比べ簡単かつ効率的に製造でき、その適応範囲も広くなる。