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L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

阅读：252发布：2020-05-08

专利汇可以提供L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用易错PCR和CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除L-苏氨酸合成竞争途径关键基因dapA和敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdh后，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-苏氨酸合成相关基因thrA的启动子序列PthrA，构建得到5株重组菌ECT1、ECR2、ECT3-1～ECT3-3，其中ECT3-2使得L-苏氨酸的发酵罐产量得到了显著提高，达到了120g/l，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸奠定了基础。，下面是L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中，敲除了二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA和苏氨酸脱氢酶编码基因tdh。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌还将高丝氨酸脱氢酶thrA启动子序列PthrA突变为如SEQ ID NO.6～8所示的序列中一种。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌CICC20905。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的dapA基因的核苷酸序列如ECK2474所示，tdh基因的核苷酸序列如ECK3606所示。
5.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的thrA基因的核苷酸序列如ECK0002所示。
6.一种权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建序列突变启动子的整合片段：合成含PmthrA基因的thrA上下游同源臂片段融合得到片段mthrA-(1-3)；
(2)构建重组质粒：分别将3个重组片段mthrA-(1-3)与含有sgRNA的线性化载体连接，得到含有mthrA-1、mthrA-2和mthrA-3的重组质粒；
(3)构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，重组质粒pTDAP转化大肠杆菌中得到重组大肠杆菌ECT-1，将重组质粒pTTDH转化大肠杆菌ECT-1，得到重组大肠杆菌ECT-2，将重组质粒pT-thrA(1-3)分别转化大肠杆菌ECT-2，去除外源质粒，得到重组大肠杆菌ECT3-(1-3)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的线性化载体包括lpTdap或lpTtd或pT-thrA。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含cas9蛋白的质粒包括pCas9质粒。
9.权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养50～70h得到所述的L-苏氨酸，所述的发酵培养基(g/L)：蔗糖25～35，磷酸二氢钾1.5～2.0，甜菜碱1.3～1.8，氯化钾0.3～0.7，硫酸铵3～7，七水硫酸镁0.8～1.2，玉米浆干粉2～4，FeSO4·7H2O0.08～0.12，MnSO4·H2O0.08～0.12。

说明书全文

L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。

[0003] 大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。

[0004] 近年来，随着合成生物学的发展，人工合成功能元件在代谢工程领域显示出巨大应用潜力。细胞的代谢通量主要受到转录水平的调控，而启动子是转录水平的重要调控元件，因此，启动子被列为合成生物学的重要功能元件之一。

[0005] 易错PCR通过调整PCR反应体系中镁离子浓度、加入锰离子、改变4种dNTPs浓度、加入保真性差的DNA聚合酶等，来增加扩增的突变率，从而引入突变位点。易错PCR是简单、有效的体外随机诱变技术，是获得序列多样性的有效方法。易错PCR引入的突变是随机突变，可以发生在启动子区域的任何位置，为构建较大的文库提供了保证。

[0006] 目前生产L-苏氨酸的大肠杆菌，L-苏氨酸的产量还不够高，不能满足工业生产的需求。

发明内容

[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供一种L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌，以大肠杆菌CICC20905为出发菌株，敲除L-苏氨酸合成竞争途径关键基因dapA和敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdh后，利用基因随机突变试剂盒随机突变L-苏氨酸合成相关基因thrA的启动子序列PthrA，并筛选出最适组合得到高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌。

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中，敲除了二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA和苏氨酸脱氢酶编码基因tdh。

[0009] 进一步地，所述的重组大肠杆菌还将高丝氨酸脱氢酶thrA启动子序列PthrA突变为如SEQ ID NO.6～8所示的序列中一种。

[0010] 进一步地，所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌CICC20905。

[0011] 进一步地，所述的dapA基因的核苷酸序列如ECK2474所示，tdh基因的核苷酸序列如ECK3606所示。

[0012] 进一步地，所述的thrA基因的核苷酸序列如ECK0002所示。

[0013] 本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

[0014] (1)构建序列突变启动子的整合片段：合成含PmthrA基因的thrA上下游同源臂片段融合得到片段mthrA-(1-3)；

[0015] (2)构建重组质粒：分别将3个重组片段mthrA-(1-3)与含有sgRNA的线性化载体连接，得到含有mthrA-1、mthrA-2和mthrA-3的重组质粒；

[0016] (3)构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，重组质粒pTDAP转化大肠杆菌中得到重组大肠杆菌ECT-1，将重组质粒pTTDH转化大肠杆菌ECT-1，得到重组大肠杆菌ECT-2，将重组质粒pT-thrA(1-3)分别转化大肠杆菌ECT-2，去除外源质粒，得到重组大肠杆菌ECT3-(1-3)。

[0017] 进一步地，在步骤(2)中，所述的线性化载体包括lpTdap或lpTtd或pT-thrA。

[0018] 进一步地，所述的含cas9蛋白的质粒包括pCas9质粒。

[0019] 本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。

[0020] 进一步地，所述的应用是将所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养50～70h得到所述的L-苏氨酸，所述的发酵培养基(g/L)：蔗糖25～35，磷酸二氢钾1.5～2.0，甜菜碱1.3～1.8，氯化钾0.3～0.7，硫酸铵3～7，七水硫酸镁0.8～1.2，玉米浆干粉2～4，FeSO4·
7H2O0.08～0.12，MnSO4·H2O0.08～0.12。

[0021] 本发明的有益效果是：

[0022] (1)本发明通过对L-苏氨酸生物合成途径相关基因的改造，构建得到5株重组菌ECT1、ECR2、ECT3-1～ECT3-3，其中ECT3-2使得L-苏氨酸的产量得到了显著提高，发酵罐产量达到了120g/l，是原始菌株的的产量的2倍。

[0023] (2)本发明提供了一种改造微生物中L-苏氨酸生物合成途径提高L-苏氨酸产量的方法，为构建L-苏氨酸的高产菌株提供了理论依据。附图说明

[0024] 图1为重组DAP片段大肠杆菌的菌落PCR凝胶验证结果。

[0025] 图2为重组TDH片段大肠杆菌的菌落PCR凝胶验证结果。

[0026] 图3为重组质粒的菌落PCR凝胶验证结果。

[0027] 图4为突变启动子表达绿色荧光蛋白时相对荧光强度。

具体实施方式

[0028] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0029] 本发明的大肠杆菌CICC 20905为高产L-苏氨酸大肠杆菌，在专利CN201811465330.2中公开。

[0030] 重组大肠杆菌种子培养及发酵：

[0031] 平板培养基(g/L)：蔗糖1，牛肉膏10，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，pH调至7.0。

[0032] 种子培养基(g/L)：蔗糖20，酵母浸膏4，蛋白胨5，硫酸铵3，七水硫酸镁1，磷酸二氢钾2。

[0033] (二)发酵罐条件下的发酵方法：

[0034] 种子培养基(50L罐装13L)配方如表1所示。

[0035] 表1种子培养基配方

[0036]配料浓度(g/L)
蔗糖(分消) 30
硫酸铵 5
磷酸二氢钾 2
七水硫酸镁 1
玉米浆干粉 3
FeSO4·7H2O 0.1
MnSO4·H2O 0.1

[0037] 备注：121℃，13min灭菌，灭菌完毕调pH至7.0。

[0038] 2发酵

[0039] 培养基配方如表2所示。

[0040] 表2发酵培养基配方

[0041] 配料浓度(g/L)蔗糖(单独灭菌) 30
磷酸二氢钾 1.7
甜菜碱 1.5
氯化钾 0.5
硫酸铵 5
七水硫酸镁 1
玉米浆干粉 3
FeSO4·7H2O 0.1
MnSO4·H2O 0.1

[0042] (三)L-苏氨酸的测定方法：

[0043] 1)样品处理：取1mL发酵液，离心去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液适当稀释后12000rpm，离心10min，然后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。

[0044] 2)分析方法：OPA硼酸柱前衍生化，9.478min洗脱峰为苏氨酸

[0045] 3)色谱条件：

[0046] (1)色谱柱：色谱柱C18(250×4.6)mm

[0047] (2)柱温：40℃

[0048] (3)流动相A：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后加入5mL四氢呋喃，混合后备用。流动相B：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后备用。

[0049] (4)流速：1.0ml/min；

[0050] (5)紫外检测器：338nm；

[0051] (6)柱温：40℃；

[0052] 下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。

[0053] 设计引物序列参照表3。

[0054] 表3引物序列表

[0055]

[0056] 实施例1：重组片段的构建

[0057] 根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-DAP-1F、pT-DAP-1R、pT-DAP-2F和pT-DAP-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中分别扩增dapA基因两侧同源臂基因序列各600bp，得到片段DAP1和DAP2(序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)；将根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-TDH-1F、pT-TDH-1R、pT-TDH-2F和pT-TDH-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中分别扩增tdh基因两侧同源臂基因序列各600bp，得到片段TDH1和TDH2(序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)。

[0058] 实施例2：重组质粒的构建

[0059] 根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-dap-F、pT-dap-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体lpTdap。将片段DAP1、DAP2和lpTdap连接构建重组质粒pTDAP。根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-tdh-F、pT-tdh-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体lpTtdh。将片段TDH1、TDH2和lpTtdh连接构建重组质粒pTTDH。

[0060] 实施例3：重组DAP片段大肠杆菌的构建

[0061] 将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC20905。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌ECC9，随后将重组质粒pTDAP转化大肠杆菌ECC9，筛选确认片段DAP1和DAP2成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTDAP，选用引物pT-DAP-1F与pT-DAP-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带(参见图1)，测序正确后，得到dapA基因被敲除的重组大肠杆菌ECT-1。

[0062] 实施例4：重组TDH片段大肠杆菌的构建

[0063] 将重组质粒pTTDH转化大肠杆菌ECT-1，筛选确认片段TDH1和TDH2成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTTDH，选用引物pT-TDH-1F与pT-TDH-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带(参见图2)，测序正确后，得到tdh基因被敲除的重组大肠杆菌ECT-2。

[0064] 实施例5：启动子文库的构建

[0065] 以大肠杆菌CICC 23604基因组为模板，采用引物thrA.FOR和thrA.REV以及Quick Mutation基因随机突变试剂盒扩增thrA基因的上游启动子序列PthrA(序列如SEQ ID NO.5所示)，PCR条件：94℃，3min预变性，然后94℃，变性30s，55℃，退火30s，72℃，延伸0.5min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到PthrA不同序列的混合启动子片段PmthrA。

[0066] 实施例6：含不同启动子序列载体的获得

[0067] 将含有eGFP的载体pET-20b(EMD Biosciences(Novagen)公司购得)采用引物ZTthrA.FOR,ZTthrA.REV线性化，PCR条件：98℃，3min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共34个循环，切胶回收大小正确的片段，得到线性化载体片段ZTthrA。将载体片段与实施例5中得到的混合启动子片段分别连接后转化大肠杆菌JM109，提取混合质粒。

[0068] 实施例7：混合质粒的转化

[0069] 将实施例6中得到的混合质粒转化到大肠杆菌ECT-2感受态细胞中。具体步骤为：

[0070] (1)将实施例6中构建好的质粒电转化大肠杆菌ECT-2的感受态细胞，添加量为100-200ng，电转化条件：电压25kV，电击时间5ms，37℃复苏2h涂布终浓度为10μg/mL的氨苄霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养12h。氨苄霉素抗性呈阳性的为转化成功的大肠杆菌。

[0071] (2)挑选平板上长出的单菌落，利用引物THRAYZ.FOR，THRAYZ.REV进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为1000bp(参见图3)。并进行测序。

[0072] 实施例8：重组菌株荧光强度的检测

[0073] 挑取测序正确的菌株各10株，进行96浅孔板培养37℃培养20h，采用酶标仪在523nm处检测每个重组菌株发酵液的荧光强度(参见图4)，提取RNA检测相对转录强度。

[0074] 实施例9：同源重组片段的构建

[0075] 在整合PthrA不同序列的混合启动子片段PmthrA的菌株中选取荧光强度较强的菌株，测序后选择3个不同的突变序列(序列分别如SEQ ID NO.6～8所示)，分别与thrA位点上游800bp的片段重新合成，设计引物thrA-1-F、thrA-1-R扩增；根据大肠杆菌CICC 23604基因组DNA序列信息，设计thrA-2-F和thrA-2-R，从大肠杆菌CICC 23604基因组中扩增thrA下游同源臂基因序列，将所得2个片段通过融合PCR技术融合得到重组片段mthrA-(1-3)。

[0076] 实施例10：同源重组质粒的构建

[0077] 根据载体pTarget序列信息，设计引物zhthrA-F、zhthrA-R，使用上述引物进行PCR，得到含有sgRNA的线性化载体pT-thrA，与重组片段mthrA-(1-3)连接构建重组质粒pT-thrA(1-3)。

[0078] 实施例11：重组PmthrA启动子大肠杆菌的构建

[0079] 将重组质粒pT-thrA(1-3)分别转化大肠杆菌ECT-2，得到替换了thrA基因原始启动子的重组大肠杆菌，选用引物thrA-1-F与thrA-1-R挑选转化子进行菌落PCR，出现1000bp条带后测序构建成功重组大肠杆菌，加入0.01M IPTG诱导，在30℃条件下培养24h可以去除pT-thrA(1-3)质粒，随后37℃培养24h即可去除pCas9质粒，命名为ECT3-(1-3)。

[0080] 实施例3、4及11中构建的菌株基因型见表4。

[0081] 表4菌株基因型

[0082]

[0083] 实施例12：利用重组PmthrA启动子菌株发酵生产L-苏氨酸

[0084] (1)种子液制备

[0085] 将出发菌株谷氨酸棒杆CICC20905及实施例3中构建得到的重组菌ECT1、实施例4中构建得到的重组菌ECT1和实施例11中构建得到的重组菌ECT3-(1-3)分别接种到种子培养基中。

[0086] 种子培养过程控制：

[0087] a)37℃，8～10h；

[0088] b)风量：0.4m3/h；

[0089] c)溶氧：前期20～40％，每次提转速20～50rpm；

[0090] d)转速：200～700rpm；

[0091] e)罐压：0.05～0.08MPa；

[0092] f)pH：氨水控制pH7.0；

[0093] g)接种量：10％，13L接种1.2L；

[0094] h)残糖控制在10g/L，约15g/L时开始补糖，一般7h开始补糖；

[0095] i)50L罐种子装量13L，溶氧100％，校正条件：600rpm，0.05MPa，0.4m3/h。

[0096] 结束标准：约培养8～10h。

[0097] (2)发酵培养

[0098] 将步骤(1)中得到的种子液转入发酵培养基，取发酵液测定L-苏氨酸的含量(参见表4)。

[0099] 灭菌完毕用调pH至7.0。灭菌：121℃，3min。过程控制：

[0100] 发酵初始体积20L，培养条件：

[0101] a)37℃；

[0102] b)风量：0.75m3/h；

[0103] c)溶氧：控制发酵过程DO在40％-60％；

[0104] d)转速：500rpm；

[0105] e)罐压：0.05～0.08MPa；

[0106] f)pH：氨水控制pH6.9。

[0107] g)接种量：20％，20L接种4L

[0108] h)残糖(总糖)：低于5g/L，开始补糖，以测定总糖含量控制补糖：目标5-8g/L。

[0109] 培养60h，取发酵液测定L-苏氨酸的含量，结果见表5。

[0110] 表5菌株发酵生产L-苏氨酸

[0111]

[0112] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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