一种莱鲍迪苷KA的制备方法
阅读：458发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种莱鲍迪苷KA的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且莱鲍迪苷KA是一种天然来源的低热量、高 甜度 的新型四环二萜类甜味化合物，其在甜叶菊中的含量极低，难以大量、绿色、低成本获得。本 发明 通过利用糖基转移酶OleD及其同源蛋白建立了以容易大量获得的甜茶苷为底物定点糖基化合成莱鲍迪苷KA的绿色 生物 合成方法。通过优化反应条件实现了高纯度莱鲍迪苷KA的绿色生物制备。莱鲍迪苷KA的甜度与甜茶苷相当（ 蔗糖 甜度的300倍以上），但口味纯正，无后滞苦味，因而更适合作为 甜味剂 或矫味剂用于食品、饮料、药品、酒类、 营养保健品 、 调味品 、日用化工品、 口腔 卫生产品或 化妆品 等产品和领域。，下面是一种莱鲍迪苷KA的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种莱鲍迪苷KA的制备方法，其特征在于以UDP-葡萄糖为活性糖供体，使用UDP-G依赖型糖基转移酶OleD或者OleD的同源蛋白质定点糖基化修饰甜茶苷，制备得到莱鲍迪苷KA，所述UDP-G依赖型糖基转移酶OleD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述OleD的同源蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述UDP-G依赖型糖基转移酶OleD来源自Streptomyces antibioticus。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于使用大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌或链霉菌重组表达糖基转移酶及其同源蛋白或酶以制备莱鲍迪苷KA。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于向反应体系加入外源性活性糖供体UDP-葡萄糖；或由蔗糖-蔗糖合成酶-UDP-葡萄糖再生循环系统产生UDP-葡萄糖；或由细菌内源性UDP-葡萄糖合成途径产生UDP-葡萄糖；或设计改造后的UDP-葡萄糖合成途径产生UDP-葡萄糖。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于可用含糖基转移酶的细胞提取液构建反应体系；或用含糖基转移酶的菌体构建原位或静息细胞反应体系；或用固定化酶构建反应体系。
6.一种OleD同源蛋白质，其特征在于所述蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。
一种莱鲍迪苷KA的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 高热量食品和饮料过量摄取引起的肥胖、糖尿病和高血脂及其相关代谢疾病已成为困扰国际社会的重大健康难题，低(无)热量、非糖类甜味剂的研发越来越受重视。目前全球广泛使用的非糖类甜味剂数量较少，根据来源可分为两类：第一类为天然甜味剂，是指从自然界生物体中提取而得的产品如甜菊苷、罗汉果苷、甜茶苷、甘草甜素等。第二类为化学合成甜味剂，是指化学合成的一类具有甜味的化合物，如阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、甜蜜素等(Weihrauch M.R.et al.Ann Oncol,2004,15:1460-1465)。化学合成甜味剂可能对人体有致癌、致畸、致病等副作用，所以，近年来很多国家对化学合成甜味剂采取了严格管控措施，严禁在婴幼儿食品和饮料中添加。在此背景下，低或无热量、安全绿色的天然甜味剂受到了消费者的广泛接受和欢迎，成为人类理想的食品、饮料、药品、营养保健品、酒类等的添加剂(Carakostas M.C.et al.Food Chem Toxicol,2008,46:S1-S10；Lemus-Mondaca R.et al.Food Chem,2012,132:1121-1132.)。
[0003] 甜茶苷又名甜茶素(Rubusoside，如图所示)是蔷薇科植物甜茶(Rubus Suavissmus S,Lee)产的一种四环二萜苷化合物，分子式C32H50O13，甜度为蔗糖的300倍，热值不足蔗糖的1％(何伟平.广西轻工业,1999,1:1-5.)。甜茶苷对热和酸稳定，食用后不会导致龋齿、心血管、肥胖、糖尿病等疾病，是一种高甜度、低热能和具有保健功能的天然甜味剂，已被应用于食品、饮料和保健品等领域(司佳,等.食品科技,2013,38:262-266)。但是，甜味不纯、具有后滞苦味是甜茶苷的最大缺点，限制了其广泛应用。
[0004]
[0005] 2014年Ibrahim MA等首次从甜叶菊中分离纯化和结构表征了甜菊苷的同分异构体莱鲍迪苷KA(rebaudioside KA，如图所示)，其分子式为C38H59O18，甜度为蔗糖的数百倍，热值不足蔗糖的1％，甜味纯正且无后滞苦味，是一种理想的天然甜味剂。但是，由于莱鲍迪苷KA在甜叶菊中的含量极低，难以通过分离纯化法大量制备，且目前无法采用合成生物学策略或化学方法合成(Ibrahim M.A.et al.J Nat Prod,2014,77:1231-1235)。因此，受到可获得性的限制，目前莱鲍迪苷KA尚未被作为甜味剂添加使用，但根据其甜度及性质将可作为添加剂用于食品(如糖果、巧克力、蜜饯、糖制糕点、蛋糕、腌渍品、健康食品等)、饮料(可乐、咖啡、果汁、凉茶、罐头、碳酸饮料、功能饮料、营养饮料、能量饮料、茶饮料、含气低酒精饮料等)、药品(药品的矫味剂、甜味剂等)、酒类(红酒、米酒、黄酒、水果酒、冰酒等)、营养保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、叶酸制品、膳食纤维制品、维生素制品、蛋白质粉制品、补钙制品、胶原蛋白粉制品、鱼油制品、微量元素制品、补血剂等)、调味品(果酱、甜醋、料酒、饴糖、蜜饯果脯等)、日用化工品(果胶、香皂、香烟等)、口腔卫生产品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妆品。
[0006] 糖基转移酶是催化单糖基团从糖基供体向受体底物转移并形成糖苷键的一类酶，属于化合物糖基化修饰的主要酶类。根据糖基供体不同，糖基转移酶可分为NDP-糖(如NDP-葡萄糖、NDP-半乳糖、NDP-麦芽糖、NDP-葡萄糖醛酸等)依赖的Leloir GTs和非NDP-糖(可溶性淀粉、蔗糖或糊精等)依赖的Non-Leloir GTs两种类型(Breton C.et al.Curr Opin Struc Biol,1999,9:563-571.)。与化学糖基化修饰方法相比，糖基转移酶催化的糖基化修饰反应具有更强的位点选择性和立体选择性。因此，目前糖基转移酶已被广泛应用于改善药物分子水溶性、提高生物活性(Wei W.et al.Mol Plant,2015,8:1412-1424.)以及甜味剂口味改进和增加甜度等方面(Danieli B.et al.Helv Chim Acta,1997,80:1153-1160.)。
[0007] 鉴于莱鲍迪苷KA仅在19位比甜茶苷多一个以β-1，2-糖苷键连接的葡萄糖基的结构特征和糖基转移酶可以催化糖基化修饰的优势，荷兰帝斯曼集团(DSM)和美国Conagen公司近期分别利用UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶HV1、EUGT11、UGT76G1等(WO2016151046、WO2016146711、WO2016168413、US20160153018)采用甜茶苷葡萄糖基修饰而开发了莱鲍迪苷KA的生物合成技术。但是，由于前述专利中所用的糖基转移酶的底物选择性不强，在生成莱鲍迪苷KA的同时，进一步催化莱鲍迪苷KA葡萄糖基修饰生成莱鲍迪苷E，反应过程也无法控制，所以最终产物为莱鲍迪苷KA和E的混合物。同时，二个产物结构类似，分离难度大，成本高，不适合工业化应用。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于采用底物专一性强的糖基转移酶建立一种绿色、专一、经济的天然甜味剂莱鲍迪苷KA的生物合成新方法，大量获得纯度大于95％的莱鲍迪苷KA。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：
[0009] 一种莱鲍迪苷KA的制备方法，以UDP-葡萄糖为活性糖供体，使用UDP-G依赖型糖基转移酶OleD或者与OleD氨基酸序列同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白质定点糖基化修饰甜茶苷，制备得到莱鲍迪苷KA，所述糖基转移酶OleD为来源自Streptomyces antibioticus的UDP-G依赖型糖基转移酶，优选UDP-G依赖型糖基转移酶OleD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010] 本发明所述同源性大于或等于69.5％的酶或蛋白质如HXSW-GT-09(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、HXSW-GT-10(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)和HXSW-GT-11(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。HXSW-GT-09、HXSW-GT-10和HXSW-GT-11为基于序列、结构和催化机制改造所获得的OleD突变体。本发明所述的制备方法，合成OleD及其同源蛋白基因后，利用相应的表达载体构建大肠杆菌工程菌株、酵母菌工程菌株、枯草芽孢杆菌表达菌株、乳酸菌表达菌株、链霉菌表达菌株，用于糖基转移酶的重组表达。
[0011] 本发明所述的制备方法，可以以UDP-葡萄糖、蔗糖-蔗糖合成酶-UDP-葡萄糖再生循环系统或细菌内源性UDP-葡萄糖生物合成体系或设计改造后的UDP-葡萄糖生物合成体系(Mao Z.C.et al,Biotechnol Prog,2006,22:369-374；Oh J.S.et al.KSBB J,2008,23:474-478；Rodríguezdíaz J.et al.J.Biotechnol,2011,154:212-215；Ruffing A.et al.Mirob Cell Fact,2006,5:25；Yan Y.et al.Biotechnol Bioeng,2008,100:126-140)作为活性糖供体的来源。即可以向反应体系加入外源性UDP-葡萄糖，也可以由蔗糖-蔗糖合成酶-UDP-葡萄糖再生循环系统或内源性UDP-葡萄糖合成途径产生。
[0012] 本发明以催化甜茶苷的糖基化修饰定义OleD及其同源蛋白的酶活力。在相同的反应体系条件下，考察OleD及其同源蛋白催化甜茶苷定点葡萄糖基修饰制备莱鲍迪苷KA的效率。
[0013] 本发明所述的制备方法，可以以游离的OleD及其同源蛋白、固定化OleD及其同源蛋白或表达OleD及其同源蛋白的细菌细胞作为生物催化剂，催化莱鲍迪苷KA的生物合成。
[0014] 进一步的，本发明所述方法可用含糖基转移酶的细胞提取液构建反应体系；或用含糖基转移酶的菌体构建原位或静息细胞反应体系；或用固定化酶构建催化体系。
[0015] 本发明所述的一个优选的方案，反应的pH为6.0-14.0，优选11.0；反应的温度为15-40℃，优选30℃；甜茶苷和UDP-葡萄糖的摩尔浓度比值为1:0.5-1:10，优选1:6；反应时间为2-72小时，优选16小时。
[0016] 本发明所述的一个优选的方案，在酶活力0.5U/ml条件下，底物甜茶苷的浓度为1-100mg/ml，优选15mg/ml，最佳底物浓度(mg/ml)和酶活力(U/ml)比值为2：1～50：1。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一类与OleD同源性超过69.5％的同源蛋白质，所述蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。
[0018] 莱鲍迪苷KA的甜度为蔗糖300倍左右，且口味纯正无后滞苦味，热量不足蔗糖的1％。莱鲍迪苷KA可溶于水和乙醇水溶液，可作为甜味剂或矫味剂添加至食品(如糖果、巧克力、蜜饯、糖制糕点、蛋糕、腌渍品、健康食品等)、饮料(可乐、咖啡、果汁、凉茶、罐头、碳酸饮料、功能饮料、营养饮料、能量饮料、茶饮料、含气低酒精饮料等)、药品(药品的矫味剂、甜味剂等)、酒类(红酒、米酒、黄酒、水果酒、冰酒等)、营养保健品(酵素、蜂蜜、奶制品、叶酸制品、膳食纤维制品、维生素制品、蛋白质粉制品、补钙制品、胶原蛋白粉制品、鱼油制品、微量元素制品、补血剂等)、调味品(果酱、甜醋、料酒、饴糖、蜜饯果脯等)、日用化工品(果胶、香皂、香烟等)、口腔卫生产品(口香糖、牙膏、涑口水等)或化妆品。
[0019] 本发明具有如下优点：
[0020] OleD一种是来源自链霉菌Streptomyces antibioticus的UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶，在体内的天然底物是竹桃霉素、红霉素和泰乐菌素，能够将葡萄糖从UDP-葡萄糖上定点转移至上述大环内酯类抗生素去氧糖胺结构的2-OH，形成β-1，2-糖苷键(Quiros LM,et al.J Biol Chem,1995，27:18234-18239.)。因此，为避免DSM和Conagen上述专利技术存在多种产物的缺陷，本发明采用底物专一性强的UDP-葡萄糖依赖型糖基转移酶OleD及其同源蛋白定点葡萄糖基修饰甜茶苷以制备单一的莱鲍迪苷KA，无副产物，反应条件简单易控，便于产物纯化及工业化放大。
[0022] 图1为OleD及其同源蛋白HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12合成莱鲍迪苷KA的HPLC图谱。
[0023] 图2为莱鲍迪苷KA的1H-NMR图谱。
[0024] 图3为莱鲍迪苷KA的13C-NMR图谱。
[0025] 图4为莱鲍迪苷KA的DEPT图谱。
[0026] 图5为莱鲍迪苷KA的HMBC图谱。
[0027] 图6为莱鲍迪苷KA的HMQC图谱。
[0028] 图7为莱鲍迪苷KA的NOSEY图谱。
具体实施方式
[0029] 以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
[0030] 实施例1糖基转移酶在大肠杆菌中重组表达
[0031] 设计OleD同源蛋白：HXSW-GT-09和HXSW-GT-10是基于OleD结构和催化机制选择多个关键氨基酸残基突变所获得；HXSW-GT-11和HXSW-GT-12是基于多重序列比对和OleD结构进行关键氨基酸残基突变和UDP-葡萄糖或底物结合相关部位的motif重组所获得。HXSW-GT-09(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)、HXSW-GT-10(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、HXSW-GT-11(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)、HXSW-GT-12(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)。
[0032] 将糖基转移酶OleD(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)及上述OleD同源蛋白的基因委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并分别利用pET22b(+)构建表达质粒pET22b-oled、pET22b-HXSW-gt09、pET22b-HXSW-gt10、pET22b-HXSW-gt11、pET22b-HXSW-gt12。将上述重组表达质粒分别转入E.coli BL21表达宿主，得到5种E.coli工程菌株，分别命名为pOleD、pGT-09、pGT-10、pGT-11和pGT-12。
[0033] 将5株E.coli工程菌分别接种至50mL的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、220rpm振摇过夜培养获得相应种子液。将种子液按5％接种量转接至LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振摇培养至OD600＝0.8±0.1时，加入诱导剂IPTG使其终浓度为0.4mM，在16℃条件下，诱导培养12小时，即实现糖基转移酶的异源表达。SDS-PAGE分析pOleD、pGT-
09、pGT-10、pGT-11和pGT-12工程菌中的糖基转移酶可溶性表达情况，结果如表1所示。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12均能可溶性表达，含量分别占总可溶蛋白的20％、22％、18％、7％和23％。
09、pGT-10、pGT-11和pGT-12工程菌中的糖基转移酶可溶性表达情况，结果如表1所示。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12均能可溶性表达，含量分别占总可溶蛋白的20％、22％、18％、7％和23％。
[0034] 表1糖基转移酶种类和信息
[0035]
[0036] 实施例2糖基转移酶在酵母菌中重组表达
[0037] 将糖基转移酶OleD及其同源蛋白基因分别构建至毕赤酵母蛋白表达载体pPIC9K，然后将重组表达质粒电击转化至毕赤酵母GS115，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册筛选阳性转化子(G418抗性筛选)。挑选单克隆接种于LB培养基，30℃过夜培养获得菌液，按1％接种量(v/v)接至BMGY培养基，30℃、250rpm培养48h，离心收集菌体，然后菌体重悬并转接至BMMY中，30℃、250rpm条件下甲醇诱导表达5天。诱导表达完成后SDS-PAGE分析培养基上清液中目标蛋白的表达情况，筛选相应的阳性菌株，再从培养基pH值、诱导温度以及甲醇浓度三个方面初步优化表达条件。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12在毕赤酵母GS115中的表达量分别为0.28μg/ml、0.27μg/ml、0.21μg/ml、0.23μg/ml、0.25μg/ml，验证了糖基转移酶在酵母菌中表达的可行性。
[0038] 实施例3糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中重组表达
[0039] 将糖基转移酶OleD及其同源蛋白基因分别构建至枯草芽孢杆菌分泌表达载体pHT43，化学法将重组表达质粒转化至枯草芽孢杆菌WB800，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。挑取阳性菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.5时，加入IPTG诱导过夜，离心获得培养基上清，SDS-PAGE分析上清液中目标蛋白的表达情况。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12在枯草芽孢杆菌WB800中的分泌表达量高于酵母菌，分别为为0.33μg/ml、0.31μg/ml、
0.27μg/ml、0.25μg/ml、0.28μg/ml，验证了糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中表达的可行性。
0.27μg/ml、0.25μg/ml、0.28μg/ml，验证了糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中表达的可行性。
[0040] 实施例4糖基转移酶在乳酸菌中重组表达
[0041] 将糖基转移酶OleD及其同源蛋白基因分别构建至乳酸菌食品级表达载体pNZ8148，将重组表达质粒电转至乳酸菌NZ9000，在含氯霉素的GM17培养基中筛选阳性菌株。将阳性菌株接种至新鲜GM17培养基培养至OD600＝0.6时，加入乳酸链球菌肽诱导，SDS-PAGE分析目标蛋白的表达情况。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12在乳酸菌WB800中的表达量高于枯草芽孢杆菌，分别为为0.54μg/ml、0.57μg/ml、0.42μg/ml、0.19μg/ml、0.38μg/ml，验证了糖基转移酶在乳酸菌中表达的可行性。
[0042] 实施例5糖基转移酶在链霉菌中重组表达
[0043] 将糖基转移酶OleD及其同源蛋白基因分别构建至链霉菌游离表达质粒载体pWHM7，通过大肠杆菌-链霉菌属间结合转移的方法转化至变铅青链霉菌TK24(S.lividans TK24)，筛选阳性菌株后，发酵培养，通过测定S.lividans TK24转化子催化甜茶苷的糖基化修饰来评价糖基转移酶基因的表达水平(产物的HPLC分析方法见实施例6)。结果显示，糖基转移酶OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10和HXSW-GT-11能够催化甜茶苷糖基化，产物的产率分别为53.1％、50.7％、5.8％、11.5％，而HXSW-GT-12无催化功能，验证了糖基转移酶在链霉菌中表达的可行性。
[0044] 实施例6糖基转移酶催化甜茶苷的糖基化
[0045] 鉴于糖基转移酶大肠杆菌表达的经济性、简便性和高效性，故本发明优选大肠杆菌表达系统进行后续的甜茶苷糖基化修饰条件考察。
[0046] 1mL反应体系中，底物甜茶苷为0.3mM，UDP-葡萄糖为1.2mM，0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，糖基转移酶粗酶液500μl，25℃振摇反应12小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入两倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析。以每毫升酶液每小时催化50μm底物甜茶苷消失的量定义为1U酶活力。OleD、HXSW-GT-09、HXSW-GT-10、HXSW-GT-11和HXSW-GT-12的活力分别是1.0U/ml、1.0U/ml、0.2U/ml、0.4U/ml和0U/ml。
[0047] HPLC检测条件：色谱柱：Agilent C18,5μm,150×4.6mm；流动相：A：超纯水(含0.1％甲酸)；B：乙腈(含0.1％甲酸)；分析时间：25min，进样量：20μL，柱温：35℃，检测波长：
220nm；流速：0.8ml/min，梯度洗脱：10％B-95％B。
220nm；流速：0.8ml/min，梯度洗脱：10％B-95％B。
[0048] 在上述HPLC分析条件下，甜茶苷的保留时间为13.9min，产物为11.5min，结果如图1所示。产物经制备高效液相制备后获得纯度98.5％的白色固体样品10mg，NMR图谱解析后确证产物即为莱鲍迪苷KA(如图2-7)。根据面积归一化法，计算糖基转移酶催化合成莱鲍迪苷KA的效率，结果如表2所示。OleD、HXSW-GT-09催化效率相当，HXSW-GT-12无催化功能，故在后续的反应条件考察中选择OleD和HXSW-GT-09作为考察对象。
[0049] 表2糖基转移酶催化合成莱鲍迪苷KA的效率
[0050]糖基转移酶 与OleD的氨基酸序列同源性 莱鲍迪苷KA产率
OleD 100％ 99.6％
HXSW-GT-09 98.3％ 99.5％
HXSW-GT-10 89.5％ 18.2％
HXSW-GT-11 69.5％ 23.8％
HXSW-GT-12 58.2％ 0
OleD 100％ 99.6％
HXSW-GT-09 98.3％ 99.5％
HXSW-GT-10 89.5％ 18.2％
HXSW-GT-11 69.5％ 23.8％
HXSW-GT-12 58.2％ 0
[0051] 实施例7静息细胞催化甜茶苷糖基化
[0052] 1mL反应体系中，底物甜茶苷为1mM，UDP-葡萄糖为4mM或不添加外源性UDP-葡萄糖，0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，含糖基转移酶的静息细胞重悬液(酶活力为0.5U)，25℃振摇反应12小时。反应结束后，加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。结果如表3所示。
[0053] 表3静息细胞催化合成莱鲍迪苷KA的效率
[0054]糖基转移酶 是否外加UDP-葡萄糖 莱鲍迪苷KA产率
OleD 是 86.3％
OleD 否 38.6％
HXSW-GT-09 是 84.9％
HXSW-GT-09 否 36.1％
OleD 是 86.3％
OleD 否 38.6％
HXSW-GT-09 是 84.9％
HXSW-GT-09 否 36.1％
[0055] 实施例8原位生物转化
[0056] 50mL的原位体系中，底物甜茶苷为1mM，UDP-葡萄糖为4mM或不添加外源性UDP-葡萄糖，调节发酵液pH至8.0，25℃振摇反应12小时。反应结束后，加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。结果如表4所示。
[0057] 表4莱鲍迪苷KA的原位生物合成
[0058]原位转化菌株 外加UDP-葡萄糖 莱鲍迪苷KA产率
pOleD 是 44.7％
pOleD 否 21.9％
pGT-09 是 45.4％
pGT-09 否 19.8％
pOleD 是 44.7％
pOleD 否 21.9％
pGT-09 是 45.4％
pGT-09 否 19.8％
[0059] 实施例9固定化酶催化合成莱鲍迪苷KA
[0060] 分别采用壳聚糖和明胶按照常规固定化酶制备方法制备固定化OleD和固定化HXSW-GT-09用于催化合成莱鲍迪苷KA。1mL反应体系中，底物甜茶苷为1mM，UDP-葡萄糖为4mM，0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，0.5U的固定化糖基转移酶，25℃振摇反应12小时。反应结束后，过滤除去固定化酶，滤液再用2倍体积甲醇处理后，离心进行HPLC分析，分析方法见实施例6。结果显示，固定化OleD和固定化HXSW-GT-09催化合成莱鲍迪苷KA的产率分别是
87.8％和84.9％。
87.8％和84.9％。
[0061] 实施例10蔗糖-UDP-葡萄糖再生循环系统I
[0062]
[0063] 采用蔗糖、蔗糖合成酶以及UDP组成UDP-葡萄糖再生体系用于糖基转移酶制备莱鲍迪苷KA。5mL反应体系中，底物甜茶苷为1mM，UDP为4mM，2.5U的糖基转移酶，蔗糖0.1M，蔗糖合成酶粗酶液2.5ml，反应体系的pH为8.0，25℃振摇反应12小时。反应结束后，煮沸离心除蛋白，再用两倍体积的甲醇处理后，离心进行HPLC分析，分析方法见实施例6。结果如表5所示。
[0064] 表5莱鲍迪苷KA的合成效率
[0065]糖基转移酶 蔗糖合成酶来源 莱鲍迪苷KA产率
OleD Arabidopsis thaliana 86.7％
OleD Vigna radiate 83.8％
HXSW-GT-09 Arabidopsis thaliana 84.4％
HXSW-GT-09 Vigna radiate 82.5％
OleD Arabidopsis thaliana 86.7％
OleD Vigna radiate 83.8％
HXSW-GT-09 Arabidopsis thaliana 84.4％
HXSW-GT-09 Vigna radiate 82.5％
[0066] 实施例11蔗糖-UDP-葡萄糖再生循环系统II
[0067] 利用pETDuet-1共表达载体构建糖基转移酶和蔗糖合成酶的共表达质粒，并获得相应共表达菌株pO-AtS、pO-VrS、pGT9-AtS、pGT9-VrS。共表达程序与实施例1相同，表达条件为0.5mM IPTG，20℃、12小时。表达完成后利用50ml菌液构建原位转化体系：底物甜茶苷为1mM，UDP为4mM，蔗糖0.1M，反应体系的pH调节至8.0，25℃振摇反应12小时。反应结束后，HPLC分析莱鲍迪苷KA的合成情况，分析方法见实施例6。结果如表6所示。
[0068] 表6莱鲍迪苷KA的合成效率
[0069]
[0070] 实施例12蔗糖-UDP-葡萄糖再生循环系统III
[0071] pO-AtS、pO-VrS、pGT9-AtS、pGT9-VrS按照实施例8的条件表达完成后，收集菌体，然后将菌体按照1:10比例用0.05M Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液稀释，构建静息细胞反应体系：底物甜茶苷为1mM，UDP为4mM，蔗糖0.1M，25℃振摇反应12小时。反应结束后，HPLC分析莱鲍迪苷KA的合成情况，分析方法见实施例6。结果如表7所示。
[0072] 表7莱鲍迪苷KA的合成效率
[0073]
[0074] 实施例13内源性UDP-葡萄糖合成系统
[0075] 利用pACYCDuet-1载体将UDP-葡萄糖合成途径中两个关键酶葡萄糖磷酸变位酶(Pgm)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(GalU)一并导入工程菌株pOleD和pGT-09，获得内源性UDP-葡萄糖合成途径改造的大肠杆菌菌株pOleD-P-G和pGT-09-P-G。诱导表达条件与实施例8相同。表达完成后利用50ml菌液构建原位转化体系：底物甜茶苷为1mM，葡萄糖0.05M，反应体系的pH调节至8.0，25℃振摇反应12小时。反应结束后，HPLC分析莱鲍迪苷KA的合成情况，分析方法见实施例6。结果如表8所示。
[0076] 表8莱鲍迪苷KA的合成效率
[0077]
[0078] 实施例14最佳反应pH值
[0079] 鉴于OleD催化甜茶苷糖基化的活性强于HXSW-GT-09，所以针对OleD进行反应条件优化。考察最佳反应pH值(5ml)：底物甜茶苷为23.4mM(15mg/ml)，UDP-葡萄糖为93.6mM，反应pH值为6.0～14.0，2.5U OleD粗酶液，25℃振摇反应12小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。不同pH条件下的莱鲍迪苷KA产率如表9所示。根据结果，OleD催化甜茶苷糖基化制备莱鲍迪苷KA的最佳pH为11.0。
[0080] 表9不同pH条件下的莱鲍迪苷KA产率
[0081] 反应pH 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0产率 2.57％ 14.89％ 27.62％ 34.71％ 47.31％ 63.26％ 58.81％ 23.27％ 7.18％[0082] 实施例15最佳反应温度
[0083] 考察最佳反应温度(5ml)：底物甜茶苷为23.4mM(15mg/ml)，UDP-葡萄糖为93.6mM，pH值为11.0，2.5U OleD粗酶液，分别于15～40℃振摇反应12小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。不同反应温度下的莱鲍迪苷KA产率如表10所示。根据结果，OleD催化甜茶苷糖基化制备莱鲍迪苷KA的最佳温度为30℃。
[0084] 表10不同反应温度下的莱鲍迪苷KA产率
[0085]反应温度 15℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃
产率 49.16％ 63.26％ 73.71％ 70.54％ 66.82％
产率 49.16％ 63.26％ 73.71％ 70.54％ 66.82％
[0086] 实施例16最佳UDP-葡萄糖用量
[0087] 考察最佳UDP-葡萄糖用量(5ml)：底物甜茶苷为23.4mM(15mg/ml)，UDP-葡萄糖为11.7-234mM，pH值为11.0，2.5U OleD粗酶液，分别于30℃振摇反应12小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。不同UDP-葡萄糖(UDPG)用量的莱鲍迪苷KA产率如表11所示。根据结果，OleD催化甜茶苷糖基化制备莱鲍迪苷KA的最佳UDP-葡萄糖用量为140.4mM，其与底物的最佳摩尔浓度比例为6:1。
[0088] 表11不同UDP-葡萄糖(UDPG)用量的莱鲍迪苷KA产率
[0089]
[0090] 实施例17最佳底物浓度和酶用量
[0091] 考察最佳底物浓度(5ml)：底物甜茶苷为1mg/ml-100mg/ml，UDP-葡萄糖为底物摩尔浓度的6倍，pH值为11.0，2.5U OleD粗酶液，分别于30℃振摇反应16小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。不同甜茶苷浓度条件的莱鲍迪苷KA产率如表12所示。根据结果并结合能量损耗等因素，OleD催化甜茶苷糖基化制备莱鲍迪苷KA的最佳底物浓度(mg/ml)和酶活力(U/ml)比值为30：1。
[0092] 表12不同甜茶苷浓度条件的莱鲍迪苷KA产率
[0093]
[0094]
[0095] 实施例18最佳反应时间
[0096] 考察最佳反应时间(5ml)：底物甜茶苷为15mg/ml，UDP-葡萄糖为140.4mM，pH值为11.0，2.5U OleD粗酶液，分别于30℃振摇反应4-72小时。反应结束后，加热除蛋白，再加入2倍体积甲醇处理，离心过滤获得的滤液进行HPLC分析，分析方法见实施例6。不同反应时间的莱鲍迪苷KA产率如表13所示。根据结果并结合能量损耗等因素，将OleD催化甜茶苷糖基化制备莱鲍迪苷KA的最佳反应时间定为16小时。
[0097] 表13不同反应时间的莱鲍迪苷KA产率
[0098] 反应时间 4hrs 8hrs 12hrs 16hrs 24hrs 36hrs 48hrs 72hrs产率 73.41％ 83.22％ 90.72％ 96.87％ 96.93％ 97.01％ 97.31％ 97.11％
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