【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はショ糖から低分子デキストランを製造する方法に関し、更に詳しくは、高濃度のショ糖溶液にデキストラン合成酵素を作用させた反応液に新たに高濃度のショ糖溶液とデキストラン合成酵素を含む溶液を添加し、再度反応を行わせ、必要に応じて、
この操作を繰り返すことを特徴としたショ糖から直接低分子デキストランを高収率で製造する新規な方法に関する。 本発明の目的は、反応で生成するデキストランを加水分解する工程を必要とせず、デキストラン合成酵素を用いて直接目的とする低分子量のデキストランを工業的に有利に製造する方法を提供するものである。 本発明で製造される低分子デキストランは、デキストラン硫酸、
デキストラン鉄および血漿増量剤の原料として有用である。 さらにまた、各種食品用の原料としても応用することが可能である。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来、低分子量のデキストランを製造する方法には、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などの菌を用いて、発酵により生産した高分子量のデキストラン（分子量１００万以上）を酸、アルカリあるいはデキストラン分解酵素を用いて加水分解する方法、さらに超音波などにより、物理的に分解する方法が採用されてきたが、これらの方法はいずれも目的とする分子量のデキストランが収率よく得られない、あるいは、操作が煩雑になるなどの欠点があり改良がもとめられていた。 又、特公昭６
０−６６３１には、デキストラン合成酵素と同分解酵素を同時に作用させて低分子デキストランを直接的に製造する方法が示されているが、この方法では、性質の異なる二種類の酵素を同時に用いるため、反応溶液の温度やｐＨさらには酵素活性比などが変わると、生成する低分子デキストランの分子量が変化しやすく、反応条件の厳密な管理が必要となり、実用上、問題があった。

【０００３】一方、デキストラン合成酵素のみを用いて、低分子デキストランを直接的に製造する方法としては、反応液にショ糖とともにグルコースのアクセプターとしてマルトースを添加しておき、この溶液にデキストラン合成酵素を作用させる方法が知られている。 しかし、この方法ではマルトースの添加量が多くなると生成するデキストランの分子量が小さくなりすぎ、またマルトースの添加量が少ない場合には低分子量のデキストランと共に高分子量のデキストランが相当量生成し、低分子デキストランの収率が低くなるため実用面では問題があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、高濃度のショ糖溶液にデキストラン合成酵素をｐＨ４〜８、１０〜４
０℃で作用させる第一工程と、第一工程により得られる反応液に新たに高濃度のショ糖溶液とデキストラン合成酵素を含む溶液を添加反応させる第二工程を１回以上含むことを特徴とする低分子デキストランの製造法である。

【０００５】本発明の特徴は、反応に使用するショ糖濃度を高くすることにより高分子量のデキストランの生成を低く抑えることと、反応を逐次的に行い、第一段階の反応工程が終了した液に、新たに高濃度のショ糖と適当量のデキストラン合成酵素を含む溶液を加え、第二工程の反応を行わせ、必要に応じてこれらの工程を繰り返す点にある。 すなわち、これらの反応を段階的に行わせることにより、最初に少量生成した高分子量のデキストランは相対的に減少し結果的に本発明の目的とする低分子量のデキストランが高い収率（対ショ糖当たりの理論収率７０％以上）で得られるのである。

【０００６】本発明でいう「低分子デキストラン」とは平均分子量が４，０００から１００，０００程度（重量平均分子量を意味する。以下同じ）のものを指す。

【０００７】本発明に用いるデキストラン合成酵素は公知であり、低分子デキストラン合成の反応条件下で活性を示し、例えば、ｐＨ４〜８、温度１０〜４０℃程度の範囲で酵素活性を示すものであれば使用可能である。 このようなデキストラン合成酵素の好ましい例としてロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の生産する公知のものが挙げられる。

【０００８】デキストラン合成酵素としてロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍ
ｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の生産するものを用いる場合、デキストラン合成酵素の調製は一般的には次のように行われる。 すなわち、デキストラン合成酵素の生産菌株としてロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を使用し培地にはこの菌が同化しうる炭素源、窒素源、無機塩を用いればよいが、通常、１〜５％程度のショ糖を必須成分とし、これに酵母エキス、ペプトン、大豆粉、硫酸アンモニウムなどの有機および無機窒素加成物および、マグネシウム、カルシウム、燐酸塩類などを必要に応じて添加する。 培養温度は菌が生育する範囲であればよいが、一般に２０〜３０℃の範囲が好適である。 ＰＨ
は５〜８の範囲とし、培養はごくわずかの通気によるかまたは通気せずに行い、培養時間は、１０〜３０時間程度が適当である。

【０００９】次に発酵を終了したデキストラン合成酵素を含む培養液を遠心分離あるいは膜分離により除菌して使用する。 なお、必要に応じてエチルアルコール、アセトン、硫安などにより分画を行い、部分精製して用いることも可能である。 この様にして調製したデキストラン合成酵素を用いて、ショ糖から直接低分子デキストランを合成する。

【００１０】この反応に用いる高濃度のショ糖溶液とは、好ましくは３０〜７０％ｗ／ｖのものをいう。 ３０
％ｗ／ｖより低くなると、高分子量のデキストランの生成量が多くなり、その結果、目的とする低分子量のデキストランの収率が低くなる。 又、７０％重量より高くなると反応速度が低下し、反応に長時間を要するため好ましくない。

【００１１】第一工程の反応条件はｐＨ４〜８、温度１
０〜４０℃、反応時間５〜４８時間である必要がある。
そうでなければ本発明の目的とする低分子デキストランが得られないからである。 上記の範囲内で、反応時間は酵素の使用量などにより調整することができる。

【００１２】第二工程の反応条件はｐＨ４〜８、温度１
０〜４０℃程度であれば良く、反応時間は酵素の使用量などにより調整することができる。

【００１３】本発明の製造法により得られる低分子デキストランの分子量は、第二工程において新たに加えるショ糖の濃度と第二工程の繰り返し回数によって決定される。 すなわち、第二工程において新たに加えるショ糖の濃度が高くなるほど、得られる低分子デキストランの分子量は小さくなり、第二工程の繰り返し回数が多くなるほど、得られる低分子デキストランの分子量は大きくなる。 したがって、本発明では、目的とする低分子デキストランの分子量に応じてショ糖の濃度および繰り返しの回数を選択すればよい。 又、高濃度のショ糖溶液にデキストラン合成酵素を作用させた第一工程の反応終了後の反応液に、新たに高濃度のショ糖とデキストラン合成酵素を含む溶液を加える第二工程の反応を行わせる場合、
新たに加えるショ糖溶液の量は、元の反応液に対し、固形分で半量から３０倍量程度が適当であり、新たに加えるショ糖溶液の濃度は、元の反応液と同じ濃度である必要はなく、前述の濃度すなわち３０〜７０％ｗ／ｖであればよい。

【００１４】反応終了後、目的とする低分子デキストランを得るには、通常用いられている方法を用いればよく、例えば、反応液にエチルアルコールを添加し、その濃度の違いにより、目的とする分子量の低分子デキストランを分画調製すればよい。 又、反応液にはフラクトースやロイクロースおよび未反応のショ糖が含まれるが、
これらを分離せず反応液を必要に応じて脱塩、脱色などを行い、そのまま食品用の素材などに応用することも可能である。

【００１５】

【発明の効果】本発明ではデキストラン合成酵素を単独で高濃度のショ糖溶液に作用させて高分子量のデキストランの生成量を低く抑え、直接的に目的とする低分子量のデキストランを製造する方法を提供するものであり、
反応液の温度やｐＨさらには、酵素活性の管理を容易にし、従来法に比べ簡単かつ能率的に、さらに、平均分子量４，０００から１００，０００程度の範囲の低分子デキストランを分子量分布の幅を小さく、且つ高収率で得ることができる。

【００１６】またこの発明者等は、重量平均分子量４，
０００〜２０，０００のデキストランは抗う蝕性が特に大であることを見出し、しかもこの範囲の分子量のデキストランは低粘度で食品に用いる場合使いやすいことを見出した。 従って、分子量４，０００〜２０，０００のデキストランを通常の甘味剤（例えば、ショ糖、グルコース、フラクトース等）と混合して使用することにより、すぐれた抗う蝕性の甘味剤として使用することができる。 この場合、分子量４，０００〜２０，０００のデキストランと甘味剤との混合割合は１：１〜１：１．９
である。

【００１７】重量平均分子量４，０００〜２０，０００
のデキストランを含有する甘味剤の抗う蝕性としての有用性を示すための試験を行った。 デキストランの分子量と不溶性グルカン（歯垢）の抑制
作用平均分子量５０４〜４７６，０００のデキストランを用いて虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ
ｓ）の不溶性グルカン合成酵素に対する阻害作用を以下の方法で検定した。

【００１８】（酵素の調整）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｍｕｔａｎｓ ＮＣＴＣ １０４４９株をＢＨＩ
（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地で３７℃、ｐＨ７．０で１８時間嫌気培養し遠心分離により菌を除いた後、硫安を加え、酵素を沈殿させる。 これをｐＨ７．０のりん酸緩衝液に溶解し、透析した液を不溶性グルカン合成酵素の粗酵素液とする。

【００１９】（阻害作用の検定）１％シュクロース溶液（ｐＨ７．０）に各分子量のデキストランを１％となるように加え、これに粗酵素液を加え、３５℃で２０時間反応させた時の６６０ｎｍの吸光度を測定し、検体燭度とする。 一方、デキストランの代わりに水を加え、同様に反応させた時の６６０ｎｍの吸光度を対照燭度とし、
下記の式で不溶性グルカンの生成抑制率を求めた。

【００２０】

【００２１】

【実施例】以下、実施例に従って本発明をさらに詳細に説明する。 デキストラン合成酵素の力価の測定は１１．
１％ｗ／ｖのショ糖溶液０．９ｍｌに酵素液０．１ｍｌ
を加え、ｐＨ５．２，３０℃で１０分間反応させ遊離してくる還元糖をソモギー・ネルソン（Ｓｏｍｏｇｙｉ・
Ｎｅｌｓｏｎ）法で定量し、この条件で６０分間に１ｍ
ｇのショ糖をデキストランに変換させるのに要する酵素量を１単位とした。 下記実施例における反応液中に生成するデキストランの分析は下記の分析条件で高速液体クロマトグラフィーにより行った。

【００２２】（分析条件） カラム：東ソー製ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷ _XL （７．
８ _mm ＩＤ×３０ _cm ） 溶離液：蒸留水 流速 ：０．７ _ml ／ _min温度 ：６０℃ 検出器：示差屈折計

【００２３】製造例 ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏ
ｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ Ｂ
−５１２株をショ糖２％、酵母エキス１％、ペプトン０．５％、リン酸ニカリウム２％、微量の金属塩を含む培地に接種し、２５℃で２４時間静置培養した。 培養終了後、遠心分離（１００００ｒｐｍ．１０分間）し、除菌後、低温下で培養液に対して、３７．５％量のエチルアルコールを少量ずつ添加し、直ちに遠心分離（１００
００ｒｐｍ． １０分間）しデキストラン合成酵素を沈殿物として得た。

【００２４】実施例１〜３ ５０％w/v ショ糖溶液３０ｍｌに製造例で得られたデキストラン合成酵素をショ糖１ｇ当たり６０単位となるように添加し、ｐＨ５．２，２５℃で２４時間静置し、低分子デキストランの第一工程の合成反応を行った。 反応が終了した後、この反応液５ｍｌをとり、反応液の固形分に対し１０倍量の２０〜６０％w/v ショ糖溶液５０ｍ
ｌとデキストラン合成酵素を新たに加えるショ糖に対し１ｇ当たり６０単位となるように加え、第一工程の反応液と混合し、同様な反応条件で２４時間静置し、低分子デキストランの第二工程の合成反応を行った。 結果は、
表１のとおりであり、第二工程の低分子デキストランの合成反応を行う時に新たに加えるショ糖溶液の濃度が低くなると、高分子のデキストランの生成量が増加し、目的とする低分子デキストランの収量が低下することがわかる。

【００２５】 表１ ショ糖濃度％ｗ／ｖ 高分子デキストラン 低分子デキストラン 第一工程 第二工程 収率％ 収率％ 平均分子量 対照例 ５０ ２０ ３５．９ ５２．７ １３，０００ 実施例 １ ５０ ３０ １４．８ ７３．８ １５，６００ ２ ５０ ４０ ６．３ ８０．２ １２，３００ ３ ５０ ６０ ２．１ ８０．２ ５，４００ 高分子デキストラン；分子量数十万以上 収率；理論収率 対ショ糖４７．４％として計算

【００２６】実施例４ ５０％w/v のショ糖溶液３０ｍｌに製造例で得たデキストラン合成酵素９００単位を添加しｐＨ５．２，２５℃
で２４時間静置し、低分子デキストランの第一工程の合成反応を行った。 反応が終了した後、この反応液に新たに５０％w/v ショ糖溶液９０ｍｌとデキストラン合成酵素２７００単位を加え混合し、同様な反応条件で２４時間静置し低分子デキストランの第二工程の合成反応を行った。 この条件で得られた低分子デキストランの平均分子量は６，７００で収率は８２．３％であった。 組成は次のとおりであった。

【００２７】実施例５ 実施例４で得られた反応液（低分子デキストランの平均分子量６，７００）１０ｍｌに反応液の固形分当たり１
０倍量となる量の３０％w/v ショ糖溶液とデキストラン合成酵素９００単位を新たに加え混合しｐＨ５．２、２
５℃で２４時間静置し、再度低分子デキストランの合成反応を行った。 この反応で得られた低分子デキストランの平均分子量は１１，７００で収率は８２．３％であった。

【００２８】実施例６ ５０％ｗ／ｖのショ糖溶液１０００ｇに製造例で得たデキストラン合成酵素３００００単位を添加しｐＨ５．
２，２５℃で２４時間静置し、反応を行った。 反応が終了した後、この反応液に新たに５０％ｗ／ｖ ショ糖溶液３０００ｇとデキストラン合成酵素９００００単位を加え混合し、同様な反応条件で２４時間反応させた。 この反応液にフラクトース３７８０ｇを加え、溶解し、抗う蝕性甘味剤約７．８ｋｇを得た。 甘味剤の組成はおよそ次のとおりであった。

【００２９】実施例７ 実施例７と同様に反応を行った液４０００ｇを３０６０
ｇまで濃縮し、この液にフラクトース１６６０ｇを加え、溶解し、抗う蝕性甘味剤約４．７ｋｇを得た。 甘味剤の組成は次のとおりであった。

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