Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagens zur Bestimmung von Fructose und Fructose enthaltenden Glykosiden, insbesondere in Gegenwart von im Überschuß vorliegenden anderen Kohlehydraten.

Die Bestimmung von Kohlehydraten gehört in der Lebensmittelchemie zu den elementaren analytischen Aufgaben. Es gibt eine große Zahl von analytischen Methoden, welche zur Ermittlung der Kohlehydratzusammensetzung angewendet werden. Eine Zusammenfassung findet sich im "Handbuch der Lebensmittelchemie" II/2 (1967), Springer-Verlag. Die bekannten Analysenverfahren weisen jedoch den Nachteil einer sehr aufwendigen und umständlichen Durchführung auf, wenn es gilt, nicht nur die Summe aller Kohlehydrate - meist über physikalische oder physiko-chemische Verfahren - zu ermitteln (z. B. Extraktgehalt über Refraktometrie, Dichtebestimmung oder Polarimetrie), sondern auch eine Selektivierung der verschiedenen Kohlehydratbestandteile anzustreben.

Die wichtigsten Zucker in der Lebensmittelchemie sind Glucose, Fructose und Saccharose. Wegen des Mangels an chemischen Methoden zur Bestimmung von Glucose und Fructose nebeneinander wird im Bereich der Lebensmittelchemie zumeist die Summe beider Zucker bestimmt und dieser Meßwert als "Reduktionszucker" oder "reduzierende Zucker" zur Beurteilung von Lebensmitteln herangezogen. Ausdruck dieser analytischen Schwäche sind sehr viele Lebensmittelgesetze und Verordnungen, in denen gerade diese Zuckerformen verankert sind (Weingesetz, Fruchtsaft-Verordnung, Verordnung über Obsterzeugnisse).

In vielen Fällen ist die Bestimmung des Extraktgehalts (über Trockenverlust bestimmt) durchaus repräsentativ für den Gehalt an reduzierenden Zuckern oder man bedient sich der Luff/Schoorl-Methode (Chem. Weekbl. 9, 678, 7o6 (1912); ZUL 57, 566 (1929)), mit der man die reduzierenden Eigenschaften der Monosaccharide zur Gehaltsbestimmung auswerten kann.

Sehr störanfällig wird dieses Verfahren jedoch dann, wenn auch andere reduzierende Komponenten im Lebensmittel vorliegen (Vitamin C in Fruchtsäften, Galacturonsäure, Reduktone in Wein; siehe G. Baumann und K. Gierschner, Ind. Obst- und Gemüseverwertung, 56, 165 (1971)). In solchen Fällen wird eine spezifische Bestimmung der Glucose und der Fructose unerläßlich. Zwar sind auch Methoden bekannt, um eine solche Differenzierung vornehmen zu können (z. B. alkalische Jod-Methode), doch sind diese störanfällig.

Eine wesentliche Verbesserung bei der Fructosebestimmung brachte die Anwendung einer enzymatischen Methode, welche in den letzten Jahren immer stärkere Verbreitung fand. Sie beruht auf der Phosphorylierung der Fructose mit ATP in Gegenwart von Hexokinase und Phosphoglucoseisomerase und Bildung von Glucose-6-phosphat und dessen Bestimmung mit seiner Dehydrogenase und NADP. Aber auch diese Methode ist in der einfachen Form nur dann anwendbar, wenn die Konzentrationen von Glucose und Fructose in Verhältnissen von 1 : o,o3 bis 1 : 3o vorliegen. Außerhalb dieses Bereichs liegende Konzentrationsverhältnisse zwingen auch bei Anwendung der enzymatischen Methodik dazu, ergänzende Techniken anzuwenden, z. B. die Beseitigung einer Zuckerkomponente. Überschüssige Glucose kann neben geringen Mengen Fructose mit Hilfe von Glucoseoxidase (GOD) völlig entfernt werden, so daß die anschließende Messung von Fructose möglich wird (H. U. Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse" 1974, Verlag-Chemie, Weinheim, S. 1349). Bei extremen Überschüssen von Glucose neben geringen Fructosekonzentrationen dagegen ist eine völlige Entfernung der Glucose nicht möglich (H. O. Beutler, G. Michal, G. Beinstingl: Deutsche Lebensm. Rundschau 1978). In diesen Fällen kann die Glucosekonzentration bei Anwendung des GOD-Verfahrens lediglich auf eine Restkonzentration gesenkt werden, wonach dann eine meßfähige Konzentration beider Zuckerkomponenten resultiert.

Auch die Ermittlung des Gehalts an anderen Fructoseeinheiten enthaltenden Kohlehydraten, wie z. B. Saccharose (Glucosylfructose) bereitet Schwierigkeiten, wenn ungünstige Zuckerverhältnisse vorliegen. Im allgemeinen kann Saccharose durch ein polarimetrisches Verfahren hinreichend spezifisch bestimmt werden (optischer Drehwert einer Lösung vor und nach Inversion). Dieses Verfahren versagt aber in Gegenwart hoher Konzentrationen anderer Zucker oder von Polysacchariden. So ist es nicht möglich, mit jener Methode kleine Saccharosekonzentrationen neben hohen Anteilen von Stärke in Kindernahrungsmitteln oder diätetischen Lebensmitteln zu bestimmen. Hier würde die enzymatische Methode unter Verwendung von ß-Fuctosidase zur Saccharosemessung geeignet sein. Dieses Verfahren wiederum ist wenig anwendbar, wenn im Lebensmittel außerdem hohe Konzentrationen von Malzextrakt und Glucose vorliegen. Bei ungünstigen Verhältnissen von Saccharose und anderen Kohlehydraten muß daher - auch bei Anwendung enzymatischer Meßtechniken - eine aufwendige Probenvorbereitung vorangehen, bevor die Saccharose bestimmt werden kann.

In der klinischen Chemie wird zu bestimmten diagnosti-. schen Zwecken die Ermittlung der Fructosekonzentration nützlich sein. Da diese Konzentration im Blut sehr niedrig gegenüber der gleichzeitig hohen Konzentration von Glucose vorliegt, kann eine Messung jener Konzentration nur mit hohem Aufwand erfolgen.

Bei der Inulin-Clearance ist die Bestimmung von Inulin im Blut wünschenswert. Nach Hydrolyse des Inulins (Polyfructose, Fructosan) durch Säurebehandlung oder durch Inulinase erhält man das Hydrolyseprodukt Fructose, aus dessen Konzentration auf den Inulingehalt geschlossen werden kann.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Fructose zu schaffen, welches die obigen Nachteile nicht aufweist und sich insbesondere in Gegenwart von im Überschuß vorliegenden anderen Kohlehydraten, wie Zuckern oder Polysacchariden, durchführen läßt. Dieses Verfahren soll auch zur Bestimmung von aus anderen Kohlehydraten freigesetzter Fructose geeignet sein und damit die Bestimmung derartiger fructosehaltiger Kohlehydrate ermöglichen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Fructose und Fructose enthaltenden Glykosiden, insbesondere in Gegenwart von im Überschuß vorliegenden anderen Zuckern oder Polysacchariden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die gegebenenfalls zuerst aus dem Glykosid in Freiheit gesetzte Fructose mit UDPG und Saccharosesynthetase umgesetzt wird unter Bildung von UDP, welches in an sich bekannter Weise bestimmt wird.

überraschenderweise gelingt es erfindungsgemäß, Fructose und fructosehaltige Glykoside unabhängig von der Konzentration anderer Zucker oder Kohlehydrate zu bestimmen. Beispielsweise wurde gefunden, daß auch in großem Überschuß vorliegende Cellulose, Pentosane, Hemicellulosen, Mannane, Galactane, Inulin, Laevan, Raffinose, Saccharose, Lactose, Maltose, Glucosephosphat, Mannose, Mannosephosphat, Mannit, Mannitphosphat, Galactose, Galactosephosphat, Fructosephosphat, Sorbit, Sorbitphosphat, Inosith, Pentosen, wie Ribose, Arabinose und Xylose, Pentosephosphat, Erythrit und Erythritphosphat nicht stören. Dies ist um so überraschender, als nach Angaben der Literatur auch andere Kohlehydrate, wie z. B. Fructose-6-phosphat, von der Saccharosesynthetase umgesetzt werden. Ebenso erstaunlich ist, daß die Fructosebestimmung auch durch einen hohen Überschuß an Saccharose, welche ja Reaktionsprodukt ist, nicht gestört wird.

Im übrigen war durchaus nicht vorhersehbar, daß die Sacharosesynthetase sich überhaupt zur Fructosebestimmung eignen würde, zumal dieses Enzym schon seit mehr als 2o Jahren bekannt ist, ohne daß man eine solche Verwendung bisher in Betracht gezogen hat.

Für die Messung des bei der Reaktion neben Saccharose gebildeten UDP kommen verschiedene Methoden in Betracht. Bevorzugt wird die an sich bekannte Umsetzung von UDP mit Phosphoenolpyruvat (PEP) in Gegenwart von Pyruvatkinase (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) sowie NADH unter Bildung von NAD. Dieses Verfahren läßt sich durch folgende Reaktionsgleichungen veranschaulichen:

Die photometrisch meßbare Umwandlung von NADH zu NAD ist proportional der Fructosekonzentration. Andere Möglichkeiten der UDP-Bestimmung beruhen auf der Phosphorylierung mit einem Phosphatdonator, wie ATP, in Gegenwart der entsprechenden Kinase und Messung des entphosphorylierten Phosphatdonators, wie ADP, nach bekannten Methoden. Auch gebildetes UTP kann gemessen werden.

Eine weitere, auf diesem Prinzip beruhende Ausführungsform besteht in der Phosphorylierung mit Formylphosphat in Gegenwart von Formiatkinase (E.C. 2.7.2.6) unter Bildung von Ameisensäure, welche beispielsweise wiederum mit Formiatdehydrogenase (E.C. 1.2.1.2) in Gegenwart von NAD umgesetzt werden kann unter Bilding von NADH, welches in üblicher Weise gemessen wird.

Ein anderes, auf diesem Prinzip beruhendes Beispiel besteht in der Phosphorylierung mit Arginylphosphat in Gegenwart von Argininkinase (E.C. 2.7.3.3), Spaltung des gebildeten freien Arginins mit Arginase (E.C. 3.5.3.1) unter Bildung von Harnstoff, der in üblicher Weise bestimmt wird, beispielsweise durch Spaltung mit Urease (E.C. 3.5.1.5) unter Bildung von Ammoniak, welcher gemessen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird, wie bei enzymatischen Bestimmungsmethoden üblich, in gepufferter wäßriger Lösung durchgeführt. Im allgemeinen erweist sich dabei ein pH-Bereich zwischen 6 und 1₀,5 als geeignet. Hinsichtlich der Art des Puffers bestehen keine Beschränkungen. Bevorzugt werden Glycinpuffer, Glycylglycinpuffer, Tris-Puffer und TRA-Puffer. Ferner wird die Umsetzung zweckmäßig in Gegenwart von Magnesiumionen vorgenommen, beispielsweise in Gegenwart von Magnesiumchlorid.

Wie bereits erwähnt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Bestimmung von Fructose selbst, sondern auch zur Bestimmung von anderen, Fructose enthaltenden Kohlehydraten, aus denen sich die Fructose quantitativ abspalten läßt, so daß die freigesetzte Fructose ein Maß für die Menge des Kohlehydrats darstellt. Zu derartigen Kohlehydraten gehören beispielsweise Disaccharide, Trisaccharide, Tetrasaccharide, Pentaosen und Polysaccharide. In der folgenden Tabelle sind Beispiele für derartige Fructoseeinheiten enthaltende Kohlehydrate aufgeführt unter Angabe ihrer Struktur, für die Spaltung geeigneter Enzyme und Vorkommen. Soweit keine spezifische Spaltungsenzyme zur Verfügung stehen, kann die Spaltung chemisch erfolgen, beispielsweise durch Säurehydrolyse nach üblichen Methoden. Ein Beispiel hierfür ist die Hydrolyse mit verdünnter Perchlorsäure.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Fructose und Fructose enthaltenden Glykosiden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es UDPG, Saccharosesynthetase, Puffersubstanz und ein System zur Bestimmung von UDP enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Reagens besteht das System zur Bestimmung von UDP aus Phosphoenolpyruvat, Pyruvatkinase, Lactatdehydrogenase und NADH.

Besonders günstige Ergebnisse bei Verwendung dieses bevorzugten Systems werden mit einem Reagens erhalten, welches

• o,o5 bis 1o U/ml Saccharosesynthetase,
• o,o5 bis 5o U/ml Pyruvatkinase,
• o,o5 bis 5o U/ml Lactatdehydrogenase,
• 1 bis 15 mMol/1 UDPG,
• o,1 bis 1o mMol/1 Phosphoenolpyruvat,
• o,1 bis 1 mMol/1 NADH und
• o,o5 bis o,5 Mol/l Puffer, pH 6 bis 1₀,5,
• bezogen auf fertige Testlösung,
• enthält.

Die vorstehenden Konzentrationsangaben beziehen sich auf das fertige Testreagens in gelöster Form. Neben den angeführten Bestandteilen kann das Reagens noch Magnesiumsalze, Stabilisatoren, Aktivatoren für die Enzyme enthalten. Derartige Substanzen sind dem Fachmann bekannt und für enzymatische Reagenzien üblich. Das Reagens liegt vorzugsweise in Trockenform vor, beispielsweise in lyophilisiertem Zustand, da es in dieser Form haltbarer ist als in gelöstem Zustand. Desgleichen kann das Reagens einen festen, vorzugsweise blattförmigen oder streifenförmigen Träger aufweisen, welcher mit dem Reagens imprägniert ist, unter Bildung eines sogenannten "Teststreifens". Geeignet sind die für Teststreifen gebräuchlichen Träger, wie Papier, poröse Plastikfolien u. ä.

In einer weiteren Ausführungsform besteht das System zur Bestimmung von UDP aus einem Phosphatdonator, z. B. ATP, Formylphosphat oder Arginylphosphat, der entsprechenden Kinase, z. B. ATP-Kinase, Formiatkinase oder Argininkinase, und einem Reagens zur Bestimmung des entphosphorylierten Phosphatdonators.

Die Erfindung eignet sich grundsätzlich zur raschen und einfachen störungsfreien Bestimmung von Fructose jeglicher Herkunft. Besonders geeignet ist das Verfahren zur Bestimmung der Fructose in biologischen Substanzen, wie Lebensmitteln, Körperflüssigkeiten und dergleichen. Ein besonderer Vorteil ist darin zu sehen, daß die Bestimmung auch in Gegenwart großer Überschüsse anderer Kohlehydrate durchführbar ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Die in den Beispielen und in der vorangehenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen sind in der folgenden Liste zusammengefaßt und erläutert:

B e i s p i e l 1

Allgemeine Bestimmung von Fructose aus wäßriger Lösung: Meßtemperatur: 25°C, Meßwellenlänge: 365 nm, 1 cm Küvetten, Testvolumen: 3,12 ml.

mischen, ca. 3o Minuten inkubieren, nach Stillstand de Extinktionsabnahme Extinktion der Probe und des Leerwerts (E2) messen. Berechnung von ΔE aus den Extinktionsdifferenzen. Aus der Differenz ergibt sich der Fructosegehalt der Probe nach der Formel:

B e i s p i e l 2

Bestimmung von Saccharose in reiner Lösung. Meßtemperatur: 25⁰C, Meßwellenlänge: 365 nm, 1 cm Küvetten, Testvolumen: 3,34 ml.

mischen, ca. 3o Minuten inkubieren, nach Stillstand der Extinktionsabnahme Extinktion der Probe gegen Extinktion des Leerwerts messen (E2). Berechnung von ΔE aus den Extinktionsdifferenzen. Aus der Differenz ergibt sich der Saccharosegehalt nach der Formel:

B e i s p i e l 3

Bestimmung von geringen Fructosekonzentrationen neben 2oo-fachen Überschüssen an Glucosekonzentrationen. Meßtemperatur: 25°C, Meßwellenlänge: 365 nm, 1 cm Küvetten, Testvolumen: 3,12 ml.

mischen, ca. 3o Minuten inkubieren, nach Stillstand der Extinktionsabnahme Extinktion der Probe und Extinktion des Leerwerts messen (E2). Berechnung von Δ E aus den Extinktionsdifferenzen. Aus der Differenz ergibt sich der Fructosegehalt der Probe nach der Formel:

B e i s p i e l 4

Bestimmung von Inulin im Serum. Durch Hydrolyse mit Säure wird Inulin quantitativ zu Fructose hydrolysiert, welche dann bestimmt wird. Hydrolysetemperatur: 8o^oC, Meßtemperatur: 25°C Meßwellenlänge: 365 nm, 1 cm Küvetten, Testvolumen: 3,22 ml.

mischen, ca. 3o Minuten inkubieren, nach Stillstand der Extinktionsabnahme Extinktion der Probe und des Leerwerts (E2) messen.

Berechnung von ΔE aus den Extinktionsdifferenzen. Aus der Differenz ergibt sich der Inulingehalt nach der Formel:

• a) Faktor, aus der Volumenkontraktion des Blutes nach Enteiweißung berechnet.
• b) Faktor, welcher den durchschnittlichen Glucosegehalt von 4 % in Inulin berücksichtigt.

Bei Anwesenheit von freier Fructose im Blut muß diese in einem getrennten Testansatz ohne Perchlorsäurebehandlung bestimmt werden.

Die übrigen Reaktionsbedingungen entsprechen denen von Beispiel 1.