本发明涉及利用DNA重组技术来改变植物碳水化合物的代谢， 其中所用的重组DNA，以及改变了基因组成的植物或植物部分。所 说的植物可用来提取特异的碳水化合物，或换句话说，它们可加工 成食品，饲料，或其成分等，在加工过程中由于所述碳水化合物的 存在使上述产品具有改善的性能。

海藻糖是D-葡糖基D-葡糖苷的俗称，它是由两个α-，α，β- 和β，β-连接的葡萄糖分子组成的双糖。海藻糖，尤其是α-海藻糖 (1-O-α-D-吡喃葡糖基)-1’-O-α-D-吡喃葡糖是广泛存 在的天然双糖。

海藻糖的化学合成是困难的(需要保护基团)，而且效率低。目 前海藻糖的天然来源是蘑菇和啤酒酵母，它们能够积累占干重10％ 以上的海藻糖。但由于高活性的海藻糖酶所引起的海藻糖的快速代 谢使得生产受到妨碍。Elkein A.D.(1974，Adv.Cavbohydrate Chem. and Biochem.30 227-256)有一篇关于双糖海藻糖的存在和代谢的 综述，尤其是活的机体中的α，α-海藻糖。据报道在植物中，海藻 糖在一些低等植物种类中存在，也存在于一些较高等植物种类中，包 括种子植物蓝刺头E.persicus，苔草C.branescens；水青冈F.silvaticus。 但是，这些结果始终没有被其它作者进一步确证过。(如Kendall等， 1990，Phytochemistry 29，No.8，2525-2528)。例如，Kendall等 (同上)关于海藻糖在spersicus中的存在，指出其存在只在 蒿 (Carum carvi)种子里明确证实。Cegla等(1977，J.Am.Oil Chem. Soc.54，150 et seq)的一篇海藻糖存在于向日葵中的报告被Kandler 等在1990年提出疑问(在The Biochemistry of Plants Vol 3.Carbohy- drates：Structure and Function；Preiss，J.，ed.，P.228，Academic Press 中)。海藻糖存在于山毛榉(Fagus Syluaticus)和卷心菜中的报告还 没有其他作者证实(Kendlall等.，1990同上，和其中的参考文献)。

尽管海藻糖在高等植物中是很少见的，但据报道在许多被调查 的植物种类中存在着海藻糖降解活性。发现稳定的高海藻糖酶活性 在三种小麦品系，木波罗(Jack pine)和Selaginella lepidophylla中存 在。稳定的、低海藻糖酶活性存在于苜蓿、黑墨西哥甜玉米和白云杉 中。不稳定的中等海藻糖酶活性存在于两种不同的canola悬浮液中， 但这些可能不能归于特异的海藻糖酶活性。据报道，大麦、雀麦草、 大豆和黑云杉中根本不含有海藻糖酶活性(Kendall，1990，同上)。

据信在能产生海藻糖的机体中，海藻糖是作为6-磷酸酯被生 物合成的，而它的贮存形式则是游离的糖。因此，认为在产生和/或 贮存海藻糖的机体中含有磷酸酯酶，它能够裂解海藻糖6-磷酸酯 (Elbein，1974，同上)。在较高等植物中，几乎不知道特异性的海藻 糖磷酸酯的磷酸酯酶的存在。

国际专利申请书WO 93/17093 A1，于1993年9月2日公布，它 描述了在酵母中转入编码海藻糖磷酸酯合成酶的酵母基因，产生海 藻糖。它提出，利用这些酵母基因高等植物也可产生海藻糖，但没 有确切表明在植物中产生海藻糖。应注意的是WO 93/17093的公布 早于本申请的申请日，但晚于本申请的优先权日。

本发明提出了一种在植物宿主中产生海藻糖的方法，这种产生 是由于在所述的植物宿主中存在依次包含以下序列的植物可表达的 基因： (a)在所述的植物宿主中起作用的转录起始区， (b)编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和选择性的 (c)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列。

本发明的另一具体实施方案包括由于在所述植物宿主中存在依 次包含以下序列的植物可表达基因使得植物宿主产生海藻糖： (d)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (e)编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和选择性的 (f)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列，和

依次包含以下序列的植物可表达的基因： (a)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (b)编码一种RNA序列的DNA序列，这一RNA序列至少和编码所 述植物宿主中天然存在的蔗糖磷酸酯合成酶(SPS)的RNA序列部 分互补，和选择性的 (c)在所述植物中起作用的转录终止序列。

本发明的另一实施方案包括由于在所述植物宿主中存在以下基 因使得植物宿主产生海藻糖：

依次包含以下序列的植物可表达的基因 (d)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (e)编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和选择性的 (f)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列，和 依次包含以下序列的植物可表达的基因： (a)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (b)编码一种RNA序列的DNA序列，这一RNA序列至少和编码所 述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部 分互补，和选择性的 (c)在所提植物宿主中起作用的终止序列。

本发明的另一具体实施方案包括由于在所述植物宿主中存在以 下基因使得植物宿主产生海藻糖：

依次包含以下序列的植物可表达的基因 (a)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (b)编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和选择性的 (c)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列，

和依次包含以下序列的植物可表达的基因： (d)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (e)编码一种RNA序列的DNA序列，这一RNA序列至少和编码所 述植物宿主中天然存在的蔗糖磷酸酯合成酶的RNA序列部分互补， 和选择性的 (f)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列，

和依次包含以下序列的植物可表达的基因： (g)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (h)编码一种RNA序列的DNA序列，这一RNA序列至少和编码所 述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部 分互补，和选择性的 (i)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列。

本发明还涉及在海藻糖生产方法中所使用的植物可表达的基 因，还涉及植物可表达基因的组合，以及克隆质粒、转化载体、微 生物及包含本发明植物可表达基因的个体植物细胞。

本发明还提供一重组的植物DNA基因组，其中含有非天然存在 的植物可表达的海藻糖磷酸酯合成酶基因。本发明还包括一重组的 植物DNA基因组，其中含有非天然存在的植物可表达的海藻糖磷酸 酯合成酶基因，除此之外还有能抑制SPS活性生物合成的植物可表 达基因，和/或抑制AGP酶活性生物合成的植物可表达基因。

本发明还提供了获得可产生海藻糖的植物的方法，包括以下步 骤： (1)向受体植物细胞中引入包含以下序列的植物可表达的基因： (a)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (b)编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列， (c)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列，

及包含以下序列的植物可表达的基因： (d)在所述植物宿主中起作用的转录起始区， (e)在所述植物宿主中有功能的编码可选择标记基因的DNA序列， 和选择性的 (f)在所述植物宿主中起作用的转录终止序列， (2)在允许选择选择性标记基因之存在的条件下，从一转化细胞生 成植物。

本发明还包括那些遗传上发生改变后，可产生增长水平海藻糖 的植物。

本发明还包括具有含本发明植物可表达基因的重组DNA基因 组的那些植物。

本发明还包括在重组DNA基因组中含本发明植物可表达基因， 并能产生海藻糖的那些植物。

本发明还包括根据本发明含有重组DNA基因组并表现出增强 的抗旱性的那些植物。

本发明还涉及根据本发明的那些植物的某部分，例如细胞或原 生质体或其培养物，花，果实，叶，花粉，根(包括发根培养物)， 种子，茎，块茎(包括所谓的微块茎)等等。

本发明还涉及到保存含有海藻糖的植物或植物某部分的方法， 它包括以下步骤： (1)培养本发明产生海藻糖的植物， (2)收获含有海藻糖的植物或植物的某部分 (3)风干植物或植物的某部分，或者 (4)冷冻干燥植物或植物的某部分。

本发明还包括根据本发明的方法保存的植物和植物的某部分。

本发明还包括生产海藻糖的方法，它包括以下步骤： (1)培养由于重组植物DNA基因组而能产生增长水平海藻糖的植 物， (2)收获所述植物或植物的某部分， (3)从所述的植物或植物的某部分中分离海藻糖。

本发明还包括生产海藻糖的方法，它包括以下步骤： (1)培养由于重组植物DNA基因组而能产生增长水平海藻糖的植物 细胞， (2)从所述植物细胞培养物中分离海藻糖。

本发明还提供了一种分离的编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的核 酸序列。优选的分离核酸序列是从大肠肝菌中获得的，尤其优选SEQ IDNO 2所表示的分离核酸序列。另一优选的实例包括编码如SE- QIDNO 3中氨基酸序列的核酸序列。

下面的附图将进一步说明本发明。 图1：植物次生组织中部分蔗糖和淀粉生物合成途径的示意图。本图 表示在叶片中通过光合作用产生的碳水化合物通过韧皮组织以蔗糖 形式来运输。进入次生组织后，它被与膜结合的转化酶水解产生单 糖葡萄糖和果糖。通过一些酶促步骤的作用，如这里粗略所示这些 单糖被转化成淀粉和/或蔗糖。葡萄糖的代谢物G6P和UDPG被认 为可作为TPS-酶的底物，这种酶是通过将植物可表达的otsA基因 通过基因工程方法引入植物而得到的。本图表示了如何通过降低 SPS酶和AGP酶的水平增加作为底物的UDPG和G6P数量。它们的 抑制作用用X标明。 图2.来自Kohara等(1987)的EMBL4克隆7F11的示意图，它包含 大肠杆菌otsBA操纵子。18.8kb的插入子用阴影表示。用来克隆otsA 基因的EcoRV和HindIII限制性酶切位点以及它们相对于插入子左 手位点的、以kb计的距离也被标出。标出了otsA和B基因，箭头表 示转录的方向(见图8，扩展图)。 图3：克隆的马铃薯SPS cDNA序列。划线部分：被用作PCR扩增反 应的寡聚核苷酸的玉米SPS cDNA序列。 图4：二分载体pMOG644的示意图。 图5显示克隆在pMOG 579中的两个片段的部分pTiB6的限制性酶 切图谱。 图6：用来在农杆菌菌株MOG101中构建无T区辅助质粒的 pMOG579的示意图。 图7表示载体pMOG180的示意图。 图8来自Kohara等(1987)的EMBL4克隆7F11的扩展图，包含大 肠杆菌otsBA操纵子。标出了TPS开放读码框架(ORF)的位置。 (*：在Kohara等的图中没有的HindIII位点)。 图9：二分载体pMOG799的示意图 图10：二分载体pMOG801的示意图。 图11：二分载体pMOG802的示意图。

本发明一个优选实施方案包括在块茎中能产生海藻糖的马铃薯 植物，这是由于在马铃薯植物中存在着植物可表达的基因，该基因 依次包括以下序列： (a)来自于CaMV 355RNA的转录起始区，在此起始区上游一侧有一 双重增强子， (b)编码海藻糖磷酸酯合成酶的DNA序列，这是位于大肠杆菌otsBA 操纵子中的 otsA基因的编码区， (c)从农杆菌属的胭脂氨酸(nos)合成酶基因中获得的转录终止序 列。含有植物可表达TPS基因的转基因植物的块茎中产生海藻糖， 而缺乏这种基因的对照植物则不能产生。很明显，转基因的块茎产 生的海藻糖磷酸酯被转化成了海藻糖。因为马铃薯中似存在海藻糖 磷酸酯磷酸酯酶活性，显然不必提供这一酶活性。

图1还表示出提高TPS底物的方法。为了这个目的，两个影响 葡萄糖-6磷酸(G6P)和UDPG的基因和反义SPS基因及反义AGP 酶基因在CaMV 355启动子控制下已被克隆到植物宿主中进行表 达。如果是引入到含有本发明植物可表达TPS基因的植物宿主中， 则能提高用作底物的TPS含量，因此能增加海藻糖的合成。本领域 技术人员很容易想到用其它的反义基因阻止蔗糖或淀粉的合成，以 提高底物的含量。

虽然本发明详细描述的是马铃薯在CaMV 35S启动子作为转录 起始区的控制下表达大肠杆菌的植物可表达海藻糖磷酸酯合成酶基 因，但本领域技术人员很清楚，其它种子植物也同样适用来生产海 藻糖。优选的种子植物中的植物宿主是被子植物，尤其是双子叶植 物，代表性的科尤其包括茄科，和单子叶植物，代表性的科尤其包 括禾本科。适当的宿主植物，如本发明说明书中所定义，包括这样 的植物(还有所述植物的某部分及细胞)和它们的后代，运用重组 DNA技术已使它们在遗传上发生了改变导致或增强有关植物或植 物器官中海藻糖的产生。这些植物可直接使用(例如：那些产生可 食部分的植物)或海藻糖从所述宿主中提纯后再使用(从那些可食 及不可食植物宿主中)。根据本发明具有可食部分的农作物包括那些 产花植物如花椰菜(Brassica olercaea)，洋蓟(cynara scolymus)；产果 实植物，如苹果(Malus，如domesticus)，香蕉(Musa，如 acuminata)，浆果(如茶藨子属，Ribes，如rubrum)，樱桃(如甜樱 桃，Prunus，如avium)，黄瓜(Cucumis，如sativus)，葡萄(Vitis，如 vinifera)，柠檬(Citrus limon)，甜瓜(Cucumis melo)，坚果(如胡桃， Juglans，如regia；花生，Arachis hypogeae)，桔子(Citrus，如 maxima)，梨(Pyra，如，communis)，辣椒(Sohnum，如capsicum)， 李子(Prunus，如domestica)，草霉(Fragaria，如moschatu)，西红柿 (Lycopersicon，如esculentum)；产叶植物如苜蓿(Medicago stativa)，卷 心菜(如Brassica oleracea)，苣荬菜(Cichoreum，如endivia)，韭葱 (Allium porrum)，生菜(lactuca sativa)，菠菜(Spinaciaoleraceae)，烟 草(Nicotiana tobacum)；产根植物如竹芋(Maranta arundinacea)，甜 菜(Beta vulgaris)，胡萝卜(Daucus carota)，木薯(Manihot esculenta)，芜菁(Brassica rapa)，小萝卜(Raphanus sativus)，薯蓣属 (Dioscorea esculenta)，甘薯(Ipomoea batatas)；和产种子植物，如蚕 豆(Phaseolus vulgaris)，豌豆(Pisum sativum)，大豆(Glycin max)， 小麦(Triticum aestium)，大麦(Hordeum vulgare)，玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)；产块茎植物，如球茎甘蓝(Brassica oler- aceae)，马铃薯(Solanum tuberosum)等等。由于植物可表达的海藻 糖磷酸酯合成酶基因的存在，使得可食部分在其中有更高海藻糖水 平存在下可通过干燥来保存。通过把编码TPS活性的DNA置于植 物器官或组织特异性启动子的控制下来产生更高水平的海藻糖是非 常用益的；启动子的选择可由本领域技术人员很容易地确定。

可使用任何置于植物细胞中DNA表达所必需的调控元件控制 下的海藻糖磷酸酯合成酶基因(特异性或组成性地)，只要它能够产 生有活性的海藻糖磷酸酯合成酶活性。SEQIDNO 2所示的核酸序 列，及事实上任何根据本发明编码海藻糖磷酸酯合成酶活性的开放 读码框架，都可改变，但不一定会改变其所编码蛋白的氨基酸序列。 这个事实是由遗传密码的简并性造成的。那么编码海藻糖磷酸酯合 成酶活性的开放读码框架可调整成所选宿主植物惯用的密码子。

SEQIDNO 2所示的分离的核酸序列，可通过将其它来源的DNA 和从大肠杆菌基因中获得的DNA-或RNA-片段杂交的方法，用于 鉴定其它机体中的海藻糖磷酸酯合成酶活性并分离它们。优选地，这 些DNA序列通过严格条件下的杂交来筛选(如温度和杂交混合物的 离子强度)，条件是否严格也依赖于杂交的性质，如DNA：DNA， DNA：RNA，RNA：RNA，还有最短的杂交片段的长度。本领域技术 人员能很容易地建立一严格杂交体系。

分离海藻糖磷酸酯合成酶活性的来源包括微生物(如：细菌，酵 母，真菌)，植物，动物等等，从其它来源分离编码海藻糖磷酸酯合 成酶活性的DNA序列可使用与本发明产生海藻糖类似的方法。

本发明还包括改变SEQIDNO 2中所示的核酸序列而获得的核 酸序列，通过突变一个或多个密码子会引起所编码蛋白的氨基酸的 改变，只要氨基酸序列的突变不会完全丧失海藻糖磷酸酯合成酶活 性。

原则上，任何植物宿主都适于与任何植物可表达的海藻糖磷酸 酯合成酶基因组合。如果有其它来源的海藻糖基因，可采用此处所 述的相似的方法来获得植物可表达的海藻糖磷酸酯合成酶基因组 合。

抑制内源性基因以增加海藻糖磷酸酯合成酶的可用底物水平， 如此处所例举的抑制内源性蔗糖磷酸酯合成酶基因和ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶基因。可用许多方法来进行，而方法的选择对本发明 来说不是至关重要的。优选的基因抑制是通过所谓的“反义方法”来 完成的。其中，DNA序列被表达产生一RNA，这一RNA至少部分 地和编码将要被阻断酶活性的RNA互补(如实施例中的AGP酶或 SPS)。优选使用同源反义基因，因为它们比异源基因更有效。用玉 米SPS-基因序列作为探针从马铃薯中分离反义SPS基因足以证明 这个策略的可行性。这并不意味着实施本发明必须要求使用同源反 义片段。阻断不想要的酶合成的一种可供选择的方法是将存在于植 物宿主的该内源基因的附加拷贝导入植物宿主的基因组。经常可看 到这样一个基因的附加拷贝可使此内源基因沉默：在文献中，这种 效应被称作共抑制效应或共抑制。

原则上，双子叶和单子叶植物都可以被转化，都可通过将本发 明植物可表达的基因导入受体细胞而发生改变，并长成一株含有并 表达植物可表达基因的新植物，本发明优选的是那些能将海藻糖磷 酸酯转化成海藻糖，并不含有或几乎不含有海藻糖降解活性的植物。 可以理解，那些缺乏将海藻糖磷酸酯转化成海藻糖活性的植物也包 括在本发明中。这些植物可通过引入编码磷酸酯酶的额外基因加以 改变，使其能将海藻糖磷酸酯转化成海藻糖。原则上，那些含有海 藻糖酶的植物也可考虑，因为可通过抑制这些酶活的方法，使其适 于产生海藻糖，例如采用反义方法抑制编码这些酶的基因的表达。

只要是基因稳定地整合到所述植物细胞的基因组中，那么将植 物可表达的海藻糖磷酸酯合成酶基因引入到受体植物细胞的方法不 是极其重要的，除了使用农杆菌属的菌株以外，还可采用其它各种 已有技术将DNA导入植物细胞，如：使用钙/聚乙二醇方法的原生 质体转化，电穿孔和微注射或(包被)粒子轰击(Potrykus，1990，Bio/ Technol.8，535-542)。

除了这些所谓直接DNA转化方法外，包含载体的转化系统也已 广泛采用，如病毒载体(如来自花椰菜花叶病毒(CaMV))和细菌载 体(如来自农杆菌属(Potrykws，1990，Bio/Technol，8，535-542)。 经过选择和/或筛选，转化过的原生质体，细胞或植物某部分可采用 本领域中已知的方法再生整株植物(Hcrsch等.，1985，Scienco 225， 1229-1231)。

已证明单子叶植物可用于转化，可以转化的细胞可再生成可育 的转基因植物。对这些作物来说可重复的组织培养系统和将遗传物 质导入植物细胞的有效方法的发展使转化容易进行。目前，转化单 子叶植物的优选方法是外植体或悬浮细胞的微粒轰击和直接DNA 摄入或电穿孔(Shimanoto等，1989，Nature 338，274-276)。通过 微粒轰击将编码phosphinothricin乙酰转移酶(一种灭活除草剂phos- phinothricin的酶)的吸水链霉菌 bar-基因导入玉米悬浮培养物的胚 胎发生细胞中，得到了转基因玉米植物(Gordon-Kamm，1990，Plant Cell，2，603-618)。将遗传物质导入到其它单子叶作物如小麦和大 麦的糊粉原生质体中也已有报导(Lec，1989，Plant Mol.Biol，13， 21-30)，由胚胎发生悬浮培养物已再生出小麦植物，这是通过只选 择成熟的、致密的节状胚胎发生愈伤组织来建立胚胎发生悬浮培养 物(Vasil，1990 Bio/Technol.8，429-434)。结合这些作物的转化 系统可使本发明能够应用到单子叶植物。这些方法也可应用在双子 叶植物的转化和再生中。

单子叶子物，包括商业上重要的作物如玉米，易于通过农杆菌 属的菌株进行DNA转移(欧洲专利159 418 B1；Gould J，Michel D， Hasegawa O，Ulian EC，Peterson G，Smith RH，(1991)Plant.Physiol. 95，426-434)。

关于宿主植物的选择，优选几乎没有或没有海藻糖降解活性的 植物种类。然而，表现出海藻糖酶活性的植物也不排除是产生海藻 糖的适当植物宿主，尽管如果这阻碍了海藻糖的积累可能必须要抑 制海藻糖酶的活性。这种抑制可用本领域中众所周知的和本说明书 中为其它目的所描述的反义方法来完成。

也应该清楚，本发明不拘限在使用CaMV 35启动子作为转录起 始区。控制植物可表达基因表达的适当的DNA序列(包括标记基 因)如转录起始区、增强子、非转录前导序列等等，都可从在植物 细胞中表达的任何基因衍生而来，如内源植物基因，在植物细胞中 自然表达的基因，如那些位于农杆菌野生型T-DNA上的基因，植 物病毒的基因，还有其它包含同真核转录起始共有序列一致的转录 起始区的真核基因。还可考虑组合各种启动子的功能部分或其合成 等同物的杂合启动子。除了组成型启动子外，诱导型启动子或在它 们表达方式中起调控作用的其它启动子如程序型或细胞型特异启动 子可用来控制本发明的植物可表达基因的表达，只要这些基因可在 含有TPS底物的植物某部分中表达。

为了选择或筛选转化细胞，优选将标记基因和根据本发明的要 转化到植物细胞中的植物可表达基因连接起来。在植物转化中适当 的标记基因的选择是普通技术人员能做到的；常规使用的标记基因 的例子有提供卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(EP-B 131 623)，从鼠肝中分离的提供谷胱甘肽衍生的除草剂抗性的谷胱甘肽 -S-转移酶基因(EP-A 256 223)，对谷氨酰胺合成酶抑制剂如 phosphinothficin提供超量表达抗性的谷氨酰胺合成酶基因(WO 87/ 05327)，提供对选择性试剂phosphinothricin抗性的来自绿色产色链 霉菌的乙酰转移酶基因(EP-A 275 957)，使耐N-膦酰甲基甘氨 酸、编码5-enolshikimate-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，提供 Bialaphos抗性的 bar基因(如WO 91/02071)等等。只要它在和选择 的植物细胞组合上是起作用的(如选择的)，标记的实际选择不是至 关重要的。

标记基因和目的基因不一定要连在一起，因为在植物转化中，非 连接基因的共转化也是一有效的方法(美国专利4,399,216)。

优选转化的植物材料，尤其对双子叶植物作物来说，是易转化 且具有好的再生能力的叶片(Horsch R.B.等.，(1985)Science 227， 1229-1231)。

而海藻糖的产生可通过采用植物可表达的海藻糖磷酸酯合成酶 基因作为唯一的糖类修饰基因来实现，本发明还进一步用列举了能 够增加海藻糖磷酸酯合成酶底物可用性的其它的植物可表达的反义 基因的例子。这些基因具体例子为玉米和马铃薯中的植物可表达的 SPS反义基因及马铃薯中的AGP酶的反义基因。

用反义方法对糖类修饰酶的负调控不拘限于这些具体的举例。 例如，植物可表达的部分互补的反义基因可用来抑制靶基因的表达， 只要植物可表达反义基因产生的转录产物和靶基因的转录产物足够 互补，且足够长从而抑制所述靶基因的表达。

对于本发明，两种或多种基因在同一植物中如何存在是不重要 的。这尤其可以通过以下方法之一来实现： (a)以含有一个以上要导入基因的多基因构建物来转化植物系， (b)用不同的构建物同时共转化同一植物系， (c)以要导入的基因对同一植物进行几次转化， (d)把含不同基因的两种植物杂交使它们导入同一种植物中。

本发明应用的领域是农业和园艺业，例如，由于改造的植物具 有改良的性质，也可应用在那些使用或将使用海藻糖的一些工业上。 海藻糖磷酸酯和海藻糖可就此以其纯化的形式或混合物的形式、或 是作为植物某部分的贮存产物的形式使用。含有(增加水平的)海 藻糖磷酸酯或海藻糖的植物某部分可就此使用或加工而不需加入海 藻糖。

海藻糖也可从产生它的植物或植物部分中提纯，最终用在工业 加工中。在食品工业中，干燥前可在食物中加入海藻糖。食物的干 燥是工业中保存食物的一种重要的方法。海藻糖似乎对通过传统风 干的食品保存非常有用，并且能使高质量产品在加入水后快速还原 (Roser等，July 119，Trends in Food Science and Technology，pp.166 -169)。其益处包括天然香味/芳香，新鲜产品的味道和营养价值 (蛋白质和维生素)的保留。已证明，海藻糖具有稳定蛋白质和膜的 能力，并形成一化学惰性的、稳定的玻璃状物。这种完全干燥的食 品的低水活性能阻止引起腐败的化学反应。

田野作物如玉米、木薯、马铃薯，甜菜和甘蔗很久以来都被作 为大量糖类生产(淀粉和蔗糖)的天然来源。通过基因工程将海藻 糖生物合成途径引入到这些植物种类中，使这些作物能产生海藻糖， 这将允许利用这些基因工程作物生产海藻糖。

在说明书中所列举的全部文献都表明了本发明有关领域的技术 水平。不论是否专利，在本说明书的前后部分提及的所有出版物在 这里都被引入本文作为参考，就象它们是被单独引入的。

下面给出的例子仅为说明目的而决不是限制本发明的范围。 DNA操作

所有的DNA操作(从大肠杆菌分离DNA、限制性酶切、连接、 转化等等)都按照标准实验操作进行(Sambrook等、(1989)Moleculer Cloning：a laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratay Press，CSH，New York)。 菌种

在所有实施例中都用大肠杆菌K-12DH5α来克隆用于植物转 化实验的根癌农杆菌菌株是MOG 101，它是通过用壮观霉素抗性标 记取代T-DNA而从LBA 1010(Koekman等，(1982)Plasmid 7， 119)中衍生的非致癌性章鱼氨酸型辅助菌株。 农杆菌菌株MOG 101的构建

二分载体系统(Hookema A.，Hirsch，P.R.，Hooykaas，P.J. J.，和Schilperoort，R.A.(1983)Nature 303，179)用于把基因构 建物转进马铃薯和烟草植物体中。赋予根瘤农杆菌毒力功能的辅助 质粒是由章鱼氨酸Ti-质粒pTiB6衍生而来的。MOG 101是携带非 致癌性Ti-质粒(Koekman等、1982，同上)的根瘤农杆菌，Ti-质 粒的整个T-区从中缺失，并被转座子Tn 1831中(Hooylaas等， 1980，Plasmid 4，64-75)的细菌壮观霉素抗性标记所取代。

Ti-质粒pTiB6含有两个相邻的T-区，TL(T-左)和TR(T- 右)。要获得缺乏TL和TR-区的衍生物，我们构建了中间载体 pMOG579。质粒pMOG 579是pBR322的衍生物，其中含有两个Ti- 质粒片段，该片段与位于pTiB6 T区左右外侧的片段同源(图5和6 中的阴影部分)。pMOG579中的这两个片段被转座子Tn1831中带有 壮观霉素标记的2.5kb BamHI-HindIII片段(Hooykaas等，1980 Plas- mid 4，64-75)分隔开(图6)。这个质粒通过三亲接合，用HB101 8pRK2013作为辅助子从大肠杆菌导入到根瘤农杆菌菌株LBA 1010 (C58-C9(PTiB6)＝一处理后的C58，其中导入了pTiB6)(Koekonam 等(1982)，同上)。接合子通过利福平(20mg/l)和壮观霉素(250mg/ l)的抗性来选择。pMOG579和pTiB6间的双重组导致了羧苄青霉素 抗性(pBR322标志)的丧失和整个T-区的缺失。500株壮观霉素抗 性的接合子影印接种到羧苄青霉素(100mg/l)上，其中两个发现是 敏感的。Southern分析(没表示出来)表明双交换的发生使得整个T- 区缺失。最终的菌种称为MOG101。这个菌株和它的构建与菌株 GV2260是相似的(Debaere等，1985，Nucl.Acid.Res，13，4777- 4788)。

对于MOG101一个可选择的辅助菌种是例如LBA 4404；这个菌 株也适于用在二分质粒的导入，如pMOG799和随后的植物转化。其 它合适的辅助菌株是很容易得到的。 表达载体pMOG 180的构建

表达载体pMOG 180是pMOG 18(EP 0 479 359 A1，Example 2b)的衍生物，其中编码GUS的基因被除去而其它基因作为BamHI 片段可插入到ALMV RNA4前导序列和3’nos终止子之间。

为这一目的，用PCR技术合成含有35S启动子和AIMV RNA 4 前导序列的pMOG 18的EcoRI/NcoI片段，所用引物对为5’GTTTC- TACAGGACGGA GGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA3’知5’CAGC- TATGACCATGATTACG3’，由此把NcoI位点突变成一个BamHI位 点。然后用EcoRI和BamHI消化pMOG18载体，之后，新合成的 EcoRI/BamHI片段可连接在这些限制性酶切位点之间。为了避免 PCR-诱导的启动子序列中的随机突变，在PCR合成的EcoRI/ BamHI片段中的EcoRI/EcoRV片段被pMOG18野生型的序列取代。 短的EcoRV/BamH1片段通过序列测定检测突变。最终的表达载体 是质粒pMOG 180(图7)。 三亲接合

二分载体在三亲接合中用含有质  粒pRK2013(Ditta G.，Stan- field，S.，Corbin，D.，和Helinski，D.R.等(1980)Proc.Natl. Acad.Sci，USA 77，7347)的大肠杆菌菌种HB101转移到根瘤农杆 菌菌株MOG 1010中并用来转化。 烟草的转化(Nicotiana tabacum SR1)

烟草的转化是通过植物组织和含有如上所述的目的二分载体的 根瘤农杆菌菌株MOG101(Hoekema等，1983，Nature 303，179- 180)共培养来进行的。如Horsch等(1985，Science 227，1229- 1231)所述采用烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)的叶 片共培养进行转化。转基因植物由生长在含有卡那霉素或潮霉素的 选择培养基上的幼苗再生得到，其抗性取决于二分质粒的抗性基因， 然后再使它生根，再转入土壤中。 马铃薯的转化：

马铃薯cv.Désiree是用含有如上所述的目的二分载体的根瘤农 杆菌菌株MOG 101来转化的(Hoekema A.，Huisman，M.J.Molendijk， L.，Van den Elzen，P.J.M.，和Cornelissen，B.J.C.(1989)Bio/ technology 7，273)。基本培养基是MS 30R30，组成为MS-培养基 (Murashige，T.，和Skoog，F.(1962)Physiol.Plan，14，473)，其 中有30g/L蔗糖，R3维生素(Ooms G.，Burrell，M.M.，Karp，A.， Bevan，M.，和Hille，J.(1987)Theor.Appl.Genet.73，744)，5μM 玉米素核苷(ZR)和0.3μM吲哚乙酸(IAA)。如需要，可用0.7g/ L Daichin琼脂使之固化。

将马铃薯的块基削皮，其表面用含0.1％Tween-20的0.6％次 氯酸盐溶液消毒20分钟。马铃薯用大量的无菌水彻底清洗至少2小 时。从以Corkbore制备的块茎组织的圆柱体上切下大约2mm厚的圆 片。圆片在含无ZR和IAA的MS30R3培养基和106-107细菌/ml的 携带二分载体的农杆菌MOG 101的悬浮液中温育20分钟。随后，圆 片在无菌的滤纸上吸干水分，再转移到含有ZR和IAA的固体MS 30R3培养基上。两天后，圆片再转移到含有100mg/L头孢噻肟(cefo- taxim)和50mg/L万古霉素的新鲜培养基上。一周后，圆片再转移到 相同的培养基上，但这一次用100mg/l卡那霉素来选择转基因幼苗。 4-8周后，切下从圆片上长出的幼苗，放在生根培养基中 (MS30R3-培养基，不合ZR和IAA，但含有100mg/L头孢噻肟(ce- fotaxim)和100mg/L卡那霉素)。幼苗通过分生组织扦插进行无污染 的繁殖，根发育后再转入土壤。合适时，用10mg/L潮霉素代替 100mg/L卡那霉素进行筛选。

马铃薯cv.Kardal的转化基本如cv.Désiree操作，但有以下的 变动：基本培养基中的植物激素：玉米素核苷3.5mg/l；IAA(吲哚 乙酸)0.03mg/l。用于转化的农杆菌悬浮液为105至106细菌每毫升。 生根培养基中卡那霉素的浓度为50mg/l。 海藻糖测定

海藻糖的鉴定基本上如Hottiger等所描述(Hottiger等，(1987) J.Bact，169，5518)。马铃薯块茎组织在液氮中冷冻，用碾槌和研 缽粉碎然后在大约3倍体积的500mM三氯乙酸中室温下抽提60分 钟。离心后，沉淀再用同样方法抽提一次。测定两次抽提的混合上 清液中蒽酮阳性物质(Spiro R.G.(1966)Meth.Enzymol，8，3)。 海藻糖可通过薄层层析法定性测定。将抽提物去离子(Merck，Ion ex- chenger v)并加至硅胶60板(Merck)上。层析板用正丁醇-吡啶- 水(15∶3∶2，V/V)展开后，用5mg/ml香草醛的浓硫酸液喷洒，并 在130℃加热显现斑点。商品海藻糖(Sigma)用作标准品。

海藻糖还可通过阴离子交换层析用脉冲安培计检测进行定量测 定。抽提物由在1g冷冻材料中加入1ml沸水制备，随后100℃加热 15分钟。样品(25μl)用配备有4×250mm Dronex 35391 Carbopac PA -1柱和一4×50mm Dionex 43096 Carbopac PA-1预柱的Dronex DX-300液相色谱仪分析。以100mM NaOH在1ml/min流速下洗 脱。以一脉冲安培检测器检测糖。以商品海藻糖(Sigma)为标准品。 酶的测定：

在所有的测定中，非转基因块茎材料或非转基因的烟草材料用 作对照。所有样品中蛋白含量测定如Bradford所述(Bradford (1976)Anal.Biochem，72，2498)。在块茎抽提物实验中，冷冻的 大约100mg的马铃薯块茎切片在100μl 20mM HEPES PH7.4中匀 浆，离心(Empendnf，最大速度下5分钟)。上清用于酶活实验。 SPS活性-SPS活性基本按照Amin，J.和Preiss，J.(1982)(Plamf physiol.69，1027-1030)所描述的方法测定。通过改变反应混合物 的组成，可测定SPS活性的两种形式Vmas和Vsel。Vmax反应混合 物中含有3.2mM VDP-葡萄糖，81μM[14C]-UDP-葡萄糖，3.2mM 果糖-6-磷酸酯，16mM葡萄糖-6-磷酸酯，100mM Hepes PH7.4， 20mM MgCl2和5mM EDTA，总体积为50μl。在Vsel反应混合物中， 果糖-6-磷酸酯和葡萄糖-6-磷酸酯的浓度减半并加入5mM无 机磷酸盐。作为对照，在Vmax反应混合物中测定SPS酶活时不加入 果糖-6-磷酸酯和葡萄糖-6-磷酸酯。反应在室温下进行30分 钟，95℃加热5分钟终止反应。反应产物用碱性磷酸酯酶处理，产 生的[14C]-蔗糖通过离子交换层析从底物中分离。反应中形成的 放射标记蔗糖的量用闪烁记数器测定。 TPS活性-TPS活性用与所述SPS相似的方法来测定。离子交换层 析后，样品中含有脱磷酸的蔗糖还有海藻糖。为了测定形成的产物 中哪一部分是海藻糖，样品用上述的薄层层析分离。将抽提物去离 子(Merck，Ion exchanger v)并上样于硅胶60板(Merch)。层析后， 刮下含[14C]-蔗糖和[14C]-海藻糖的点，用闪烁记数器测定。 AGP酶(AGPase)活性-AGP酶活性用Muller-Roker等所描述的方 法测定(Müller-Rber B.，Sonnewald，U.，和Willmitzer，L. (1992)EMBO J.11，1229)。由ADP-葡萄糖产生的葡萄糖-1-磷 酸酯在NAD-连接的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶系统中测定。反应物 中含有80mM HEPES PH7.4，10mM MgCl2，1mM ADP-葡萄糖， 0.6mM NAD，10μM葡萄糖-1，6-二磷酸，3mM DTT，0.02％牛 血清白蛋白，1U鼠肌肉中的磷酸葡萄糖转位酶(Sigma)，2.5U肠系 膜状明串珠菌的NAD-连接的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和块茎抽提 物。加入焦磷酸钠至终浓度2mM来启动反应。NAD还原用分光光 度计在340nm 30℃测定。AGP酶活性的单位定义为每分钟在30℃ 产生的葡萄糖-1-磷酸纳摩尔数。

                     实施例1

全长大肠杆菌 otsA基因的克隆

在大肠杆菌中，海藻糖磷酸酯合成酶(TPS)由位于 otsBA操纵 子的 otsA基因编码。操纵子在大肠杆菌染色体上转录的位置和方向 是已知的(Koaseh，I.，Falkenberg，P.Styrvold，O.B，和Strom，A. R.(1992)J.Bact.174，889)。 otsA基因位于42’，并根据Kaasen 等将其定位在存在于Kakara等命名的EMBL4基因组克隆7F11的 18-8kb片段上(Kohara，Y.，Akiyama，K.，and Isono，K. (1987)Cell 50，4955)。DNA由λ克隆7F11的裂解物中制备，用 HindIII消化。分离的2.9kb HindIII片段(插入片段14.3kb处的右手 HindIII位点在图谱上被kohlara等省略，如Kassen早已指出的那样) 克隆到HindIII切成线性的PUC 18中。所形成质粒(称为pMOG 674)的2.9kb HindIII插入片段被测序。该序列中含有阿拉伯糖转运 操纵子的部分araH基因(Scripture，J.B.，Voelker，C.，Miller，S.， O Donnell，R.T.，Polgar，L.，Rade，J.，Horazdovsky，B.F.，和 Hogg，R.W.(1987)J.Mol.Bul.197，37)，Kaassen等定位的编 码TPS的 otsB基因，和编码TPS的部分 otsA基因。 otsA被发现不局 限在Kaasen等。所描述的2.9kb HindIII片段中。为完成这一序列，一 重叠的BamHI/EcoRI片段被分离并部分测序。完整的编码TPS的 otsA基因的序列如SEQIDNO：2所示。 otsA基因在克隆7F11上的位 置及所使用的限制性酶切位点如图8中所示。在Kohara等，所绘图 谱上不存在的另一HindIII位点被发现存在于2.9kb HindIII片段的 左手位点。

通过将寡聚核苷酸双链

           SstI

  5′AGCTCACGAGCTCTCAGG 3′           (SEQ ID NO：8)

  3′GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5′           (SEQ ID NO：9) 克隆到由HindIII切开的pMOG 180中，pMOG 180中HindIII位点由 SstI位点取代。形成的载体被称为pMOG746。寡聚核苷酸双链

          BamHI      SphI  HindIII

          |    SmaI  |     |           BamHI

          |    |     |     |           |   5′         GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG     3′    (SEQ ID NO：10)   3′             GGGGCCCCGTACGTTCGAACCTAG 5′    (SEQ ID NO：11) 被克隆到用BamHI切成线状的载体pMOG 746中。这种含有所要求 取向(用限制性内切酶消化来检验)的寡聚核苷酸双链的载体被称 作pMOG 747。质粒pMOG 674的2.9kb HindIII片段克隆到用HindIII 切成线状的pMOG 747中，产生载体pMOG 748。大约2.4kb EcoRV/ SstI和大约3.5kb SstI/SmaI的pMOG 748片段被分离，连接，再转化 到大肠杆菌中，由此缺失2.9kb HindIII片段的3’末端。形成的质粒 称作pMOG 749。 otsA基因的5’末端由PCR合成，PCR是用合成的 寡聚核苷酸TPS1和TPS2，且用pMOG 749作为模板来进行的。

TPS1      5′ GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3′    (SEQIDNO：12)

TPS2      5′ GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3′  (SEQIDNO：13)

通过测序确定0.4kb PCR片段有正确的序列。pMOG 749的1kb BamHI/HindIII片段和0.4kb XmaI/BamH PCR片段一起克隆到用 XmaI及HindIII切成线状的pMOG 747中。形成的质粒用HindIII和 SstI消化，并克隆编码TPS的三个C-末端氨基酸的合成寡聚核苷 酸TPS6/7，

                  LysLeuAlaStop

TPS 6/7：    5′  AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT    3′

             3′      CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC        5′ 形成的质粒用HindIII和SstI消化，克隆含有根瘤农杆菌胭脂氨酸合 成酶(NOS)基因终止子的质粒pMOG749 HindIII/SstI片段，产生质 粒pMOG 798。该质粒在带有双增强子的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子(Guilley等，(1982)Cell 30，763)、苜蓿花叶病毒(AMV) RNA4前导序列(Brederode等，(1980)Nucl.Acid Res.8，2213)和 根瘤农杆菌胭脂氨酸合成酶转录终止子序列的控制下含有正确取向 的 otsA基因。整个的表达盒作为一2.5kb EcoRI/SstI片段被克隆到 EcoRI和SstI切成线状的二分载体pMOG 23中。形成的二分载体 pMOG 799(图9)被用来转化马铃薯和烟草(含有pMOG 799的大 肠杆菌菌株已于1993年8月23日被保存在Centreaal Bureau voor Schimmelcultures，Phabagen collections，Padulaan 8，Utrecht，The Nether- lands，保藏号为CBS 430.93；pMOG 23已于1990年6月29日被保 存在CBS，保藏号为CBS 102.90)。

                         实施例II

在pMOG 799转化的烟草中海藻糖的产生

用根瘤农杆菌将二分载体转化到烟草叶片中。20株独立的转基 因幼菌用来做海藻糖磷酸酯合成酶(TPS)活性的分析。发现一些离 体生长的烟草植物与非转化的植物相比具有非常粗的根。对这些转 基因烟草植物的根进行分析，表明与非转基因对照植物相比，它的 海藻糖水平有增加。

                         实施例III

在pMOG 799转化的马铃薯中海藻糖的产生

用根瘤农杆菌将二分载体转化到马铃薯的块茎切片中。转基因 的幼苗用卡那霉素筛选。20株独立的转基因幼苗用来做海藻糖磷酸 酯合成酶(TPS)活性的分析。含有这种酶的幼苗被培养成成熟的植 物体。对这些转基因马铃薯植物成熟块茎的分析表明，与非转基因 对照植物相比，它的海藻糖水平有所增加。转基因植物系MOG 799.1被繁殖用于下一步工作。

                       实施例IV

pMOG 664的构建

合成了相应于马铃薯块茎cv.Descree(Muller-Rober，B.，Koss- mann，J.，Hannah，L.C.，Willmitzer，L.，和Sonnewald，U. (1990)Mol.Gen Genet，224，136-146)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 小亚基(AGPase B)cDNA序列的两条寡聚核苷酸

    5′  TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3′     (SEQIDNO：4)

    5′  GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3′     (SEQIDNO：5) 设计寡聚核苷酸使其末端含有合适的限制性酶切位点(BamHI和 NcoI划线部分)，以便用这些酶作用后可以反义取向组装在表达盒 中。从二个月大的叶片组织(Clontech)制备马铃薯cv.Desiree的cD- NA文库，用从中分离的DNA作为模板，用这些寡聚核苷酸PCR扩 增大约1kb的片段。通过测序表明，这个片段和马铃薯cv.Desiree (Muller-Roker，B.，Kossmann，J.，Hannah，L.C.，Willmitzer，L.， 和Sonnewedd，U.(1990)Mol.Gen.Genet.224，136-146)的AGPase B序列是一致的。用BamHI和NcoI消化以后，该片段被克隆到用 BamHI和NcoI切成线状的pMOG 18中。将所成质粒的1.85kb EcoRI/BamHI片段(含CaMV 35S启动子，AMV RNA4前导序列和反 义取向的AGP酶片段)，及含有根瘤农杆菌的胭脂氨酸合成酶 (NOS)基因终止子的BamHI/HindIII片段用三向连接克隆到用EcoRI 和HindIII切成线状的二分载体pMOG22中。二分载体pMOG 22中 含有植物可表达的HPTII基因以用潮霉素选择转基因植物(pMOG 22已于1990年1月29日被保存在the Centraal Buresu voor Schim- melcultures，保藏号为101.90)。形成的二分载体pMOG 664(图 4)用来转化马铃薯。

                        实施例V

pMOG 801的构建

合成一组与玉米蔗糖磷酸酯合成酶(SPS)cDNA序列(Worrell， A.C.，Bruneau，J-M.，Summerfait，K.，Boersig，M.，和Voelker， T.A.(1991)Plant Cell 3，1121)互补的寡聚核苷酸。它们的序列 如下：

   5′CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG   3′  (SEQIDNO：6)

   5′CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3′  (SEQIDNO：7)

以由两个月大的叶片组织(clontech)中制备的马铃薯cv.Desiree DNA文库中分离的DNA作为模板，用这些寡聚核苷酸进行370bp DNA片段的PCR扩增。通过这个片段的测序表明它与玉米的SPS序 列同源(见图3，和Worrell等(1991))。此PCR片段被用来筛选从 2个月叶片组织制备的马铃薯cv.Déiree cDNA文库的一个λgt10文 库。一个阳性杂交克隆的插入序列被测序，发现654bp的DNA片段 的序列与玉米SPS序列的对应部分(始于wbrrell等(1991)中图11中 第349个核苷酸)有65％的一致率。这个克隆的EcoRI插入序列和 以下的合成寡聚核苷酸双链以三向连接克隆到BamHI消化的pMOG 180中。

   5′GATCGTCAGATCTAGC  3′     (SEQIDNO：14)

   3′CAGTCTAGATCGTTAA  5′     (SEQIDNO：15) 含有相对于Camv 35S启动子反义取向的SPS片段的质粒被称作 pMOG787。质粒pMOG787的EcoRI/HindIII片段以三向连接与下列 合成接头克隆到用EcoRI切成线状的二分载体pMOG22中。

   5′AGCTTCCCCCCCG    3′      (SEQIDNO：16)

   3′AGGGGGGGGTTAA    5′      (SEQIDNO：17) 二分载体pMOG22中含有转基团植物用潮霉素选择的植物可表达 HPTII基因(pMOG22已于1990年1月29日保藏于Centraal Bureau Voor Schimmelcultures，保藏号为101.90)。形成的二分载体pMOG 801(图10)用于马铃著的转化。

                   实施例VI

                  pMOG802的构建

将含有反义SPS表达盒的质粒pMOG801的EcoRI片段克隆到 用EcoRI切成线状的二分载体pMOG664中(含有反义AGPase盒)。 形成的二分载体被称作pMOG802(图11)。

                   实施例VII

在pMOG 799和pMOG664转化的马铃薯中海藻糖的产生

表达TPS(实施例IX)的卡那霉素抗性植物系MOG799.1的马 铃薯块茎切片用含有反义AGP酶表达盒的二分载体pMOG664转 化。用10mg/L卡那霉素筛选的转基因幼苗，通过PCR来分析TPS和 反义AGP酶序列的存在。含有二者的转基因植物用于TPS和AGP

转基因块茎AGP酶活性的分析表明与非转基因对照相比，在个 体转基因系中酶活水平降低。Northern印迹法表明，与非转基因对照 植物相比，AGP酶的mRNA水平降低。与转基因植物系MOG799.1 相比，具有TPS活性和降低了AGP酶水平的转基因马铃薯物块茎 中，海澡糖的水平提高。

                 实施例VIII

pMOG 799和pMOG801转化的马铃薯中海澡糖的产生

表达TPS(实施例IX)的卡那霉素抗性植物系MOG799.1的马 铃薯块茎切片用含有反义SPS表达盒的二分载体pMOG801转化。 以10mg/L潮霉素筛选的转基因幼苗通过PCR来分析TPS和反义 SPS序列的存在。含有二者的转基因植物用于TPS和SPS活性的分 析。

转基因块茎SPS活性的分析表明，与非转基因对照相比，在个 体转基因系中酶活水平有降低。Northern印迹法表明，与非转基因对 照植物相比，SPS的mRNA水平降低。与转基因植物系MOG799.1 相比，具有TPS活性且降低了SPS水平的转基因马铃薯植物块茎 中，海澡糖的水平提高。

                 实施例IX

pMOG 799和pMOG802转化的马铃薯中海藻糖的产生

表达TPS(实施例IX)的卡那霉素抗性植物系MOG799.1的马 铃薯块茎切片用含有反义SPS和AGP酶表达盒的二分载体 pMOG802转化。以10mg/L潮霉素筛选的转基因幼苗通过PCR来分 析TPS和反义AGP酶及反义SPS序列的存在。含有这三种构建物的 转基因植物用于TPS、AGP酶和SPS活性的分析。 转基因植物用于TPS、AGP酶和SPS活性的分析。

转基因块茎的AGP酶和SPS活性的分析表明，与非转基因对照 相比，在个体转基因系中，两酶的活性都降低。Northern印迹法表明， 与非转基因对照植物相比，AGP酶和SPS的mRNA水平降低。与转 基因植物系MOG799.1相比，具有TPS活性并降低了SPS水平的转 基因马铃薯植物块茎中，海藻糖的水平提高。 保藏的菌种： pMOG22；保藏号CBS 101.90(23页，18-21行；24页，21-23行) pMOG23；保藏号CBS 102.90(22页，10行) pMOG799；保藏号CBS 430.93(22页，6行)

                        序列表

(1)一般信息：   (i)申请人：

(A)名称：MOGEN International N.V

(B)街道：Einsteinweg 97

(C)城市：LEIDEN

(D)州：Zuid-Holland

(E)国家：荷兰

(F)邮政编码(ZIP)：NL-2333 CB

(G)电话：(31)、(71)、258282

(H)传真：(31)、(71)、221471   (ii)发明题目：植物中海藻糖的产生   (iii)序列数目：17   (iv)计算机可读形式：

(A)媒介种类：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.25版本(EPO)

(v)本申请资料

申请号：WO PCT/EP93/02290 (2)SEQ ID NO：1的信息   (i)序列特征：

(A)长度：370碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑型：线性

(ii)分子类型：cDNA到mRNA

(iii)假拟：无

(vi)原始来源：

(A)生物体：马铃薯

(B)菌种：Desiree

(F)组织类型：叶

(xi)序列描述：SEQ ID No：1： CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TAGTAGAGCT TGCTCGAGCA      60 CTTGCAAACA TGAAAGGAGT TCACCGAGTT GATCTCTTGA CTCGGCAGAT CACATCCCCA     120 GAGGTTGATT CTAGCTATGG TGAGCCAATT GAGATGCTCT CATGCCCATC TGATGCTTTG     180 GCTGCTGTGG TGCCTACTAT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGACAAGATA TTCCAAAAGA     240 ATTTACATAC CAGAATTTGT TGATGGAGCA TTAAGCCACA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT     300 ATAGGGGAGC AAGTCAATGC TGGAAAAGCA GTGTGGCCTT ACGTGATACA TGGGCACTAT     360 GCCGATGCTG                                                            370 (2)SEQ ID No：2的信息：    (i)序列特性：    (A)长度：1446碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：双链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (iii)假拟：无    (vi)原始来源：    (A)生物体：大肠杆菌    (Vii)直接来源：    (B)克隆：7F11    (viii)基因组中的位置：    (B)图谱位置：41-42’    (ix)特性：    (A)名称/关键词：CDS    (B)位置：19..1446    (C)其它信息：/产物＝“海藻糖磷酸酯合成酶”/基因＝ “otsA”    (xi)序列描述：SEQ ID No：2： GAGAAAATAA CAGGAGTG ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT AAC        51

                Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn

                  1               5                  10 CGG ATT GCA CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT GCC        99 Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala

             15              20                  25 GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT GGC       147 Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly

     30                  35                  40 TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG AAA       195 Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys

 45                  50                  55 AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC CTT       243 Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu  60                  65                  70                  75 GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT TTT       291 Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe

             80                  85                  90 CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC GGC       339 His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly

         95                 100                 105 TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG TTG       387 Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu

    110                 115                 120 CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA TTT       435 Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe

125                 130                 135 GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC TTT       483 Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe 140                 145                 150                 155 CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG ACA       531 Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr

            160                 165                 170 TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT TTC       579 Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe

        175                 180                 185 CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG TTC CTG GAT TGT CTT TCT AAC CTG       627 Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu

    190                 195                 200 ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC AAA       675 Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys

205                 210                 215 GCA TTT CGA ACA GAA GTC TAC CCG ATC GGC ATT GAA CCG AAA GAA ATA       723 Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile 220                 225                 230                 235 GCC AAA CAG GCT GCC GGG CCA CTG CCG CCA AAA CTG GCG CAA CTT AAA       771 Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys

            240                 245                 250 GCG GAA CTG AAA AAC GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG GAT       819 Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp

        255                 260                 265 TAT TCC AAA GGT TTG CCA GAG CGT TTT CTC GCC TAT GAA GCG TTG CTG       867 Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu

    270                 275                 280 GAA AAA TAT CCG CAG CAT CAT GGT AAA ATT CGT TAT ACC CAG ATT GCA       915 Glu Lys Tyr Pro Gln His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala

285                 290                 295 CCA ACG TCG CGT GGT GAT GTG CAA GCC TAT CAG GAT ATT CGT CAT CAG       963 Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln 300                 305                 310                 315 CTC GAA AAT GAA GCT GGA CGA ATT AAT GGT AAA TAC GGG CAA TTA GGC      1011 Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly

            320                 325                 330 TGG ACG CCG CTT TAT TAT TTG AAT CAG CAT TTT GAC CGT AAA TTA CTG      1059 Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu

        335                 340                 345 ATG AAA ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG ACG CCA CTG CGT      1107 Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg

    350                 355                 360 GAC GGG ATG AAC CTG GTA GCA AAA GAG TAT GTT GCT GCT CAG GAC CCA      1155 Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro

365                 370                 375 GCC AAT CCG GGC GTT CTT GTT CTT TCG CAA TTT GCG GGA GCG GCA AAC      1203 Ala Asn Pro Gly Val Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn 380                 385                 390                 395 GAG TTA ACG TCG GCG TTA ATT GTT AAC CCC TAC GAT CGT GAC GAA GTT      1251 Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile Val Ash Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val

            400                 405                 410 GCA GCT GCG CTG GAT CGT GCA TTG ACT ATG TCG CTG GCG GAA CGT ATT      1299 Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile

        415                 420                 425 TCC CGT CAT GCA GAA ATG CTG GAC GTT ATC GTG AAA AAC GAT ATT AAC      1347 Ser Arg His Ala Glu Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn

    430                 435                 440 CAC TGG CAG GAG TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG CAG ATA GTT CCG CGA      1395 His Trp Gln Glu Cys Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg

445                 450                 455 AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA GTT GCT ACC TTT CCA AAG CTT      1443 Ser Ala Glu Ser Gin Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu 460                 465                 470                 475 GCG                                                                  1446 Ala (2)SEQ ID No：3的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：476个氨基酸    (B)类型：氨基酸    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：蛋白质    (xi)序列描述：SEQ ID No：3 Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro   1               5                  10                  15 Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly

         20                  25                  30 Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr

     35                  40                  45 Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr

 50                  55                  60 Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn  65                  70                  75                  80 Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp

             85                  90                  95 Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn

        100                 105                 110 Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile

    115                 120                 125 Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg

130                 135                 140 Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe 145                 150                 155                 160 Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu

            165                 170                 175 Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp

        180                 185                 190 Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr

    195                 200                 205 Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu

210                 215                 220 Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala 225                 230                 235                 240 Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn

            245                 250                 255 Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu

        260                 265                 270 Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln

    275                 280                 285 His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly

290                 295                 300 Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala 305                 310                 315                 320 Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr

            325                 330                 335 Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg

        340                 345                 350 Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu

    355                 360                 365 Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val

370                 375                 380 Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala 385                 390                 395                 400 Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp

            405                 410                 415 Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu

        420                 425                 430 Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys

    435                 440                 445 Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln

450                 455                 460 Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala 465                 470                 475 (2)SEQ ID No：4的信息    (i)序列特征：    (A)长度：22碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：4    TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC (2)SEQ ID No：5的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：22碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：5：    GATTGGATCC AGGGCACGGCTG (2)SEQ ID No：6的信息：    (i)序列特征    (A)长度：33碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：6    CTAGGTCGTGATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG (2)SEQ ID No：7的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：35碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：7：    CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC (2)SEQ ID No：8的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：18碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：    AGCTCACGAG CTCTCAGG (2)SEQ ID No：9的信息    (i)序列特征：    (A)长度：18碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：9    GTGCTCGAGA GTCCTCGA (2)SEQ ID No：10的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：24碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：10：    GATCCCCCGGGGCATGCAAG CTTG (2)SEQ ID No：11的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：24碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：11：    GGGGCCCCGTACGTTCGAAC CTAG (2)SEQ ID No：12的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：23碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：12：    GAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC (2)SEQ ID No：13的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：25碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：13：    GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC (2)SEQ ID No：14的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：16碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：14    GATCGTCAGA TCTAGC (2)SEQ ID No：15的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：16碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：15：    CAGTCTAGAT CGTTAA (2)SEQ ID No：16的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：13碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：16：    AGCTTCCCCC CCG (2)SEQ ID No：17的信息：    (i)序列特征：    (A)长度：13碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑型：线性    (ii)分子类型：cDNA    (iii)假拟：是    (xi)序列描述：SEQ ID No：17：    AGGGGGGGCT TAA