一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用
阅读：153发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用，所述蛋白表达调控系统包括Cas9蛋白、RsgRNA和无细胞蛋白表达系统；所述RsgRNA按5’-3’方向包括反义核酸和sgRNA。本发明的核酸检测系统将CRIPSR/Cas9核酸识别调控系统和基因回路相结合，利用RsgRNA调控蛋白酶的表达，将核酸 信号 转化为蛋白酶的生成，通过检测蛋白酶实现对核酸的快速检测。，下面是一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用专利的具体信息内容。
1.一种基于CRISPR-Cas9的蛋白表达调控系统，其特征在于，所述蛋白表达调控系统包括Cas9蛋白、RsgRNA和无细胞蛋白表达系统；
所述RsgRNA按5’-3’方向包括反义核酸和sgRNA。
2.根据权利要求1所述的蛋白表达调控系统，其特征在于，所述反义核酸的长度为10～
20bp；
优选地，所述反义核酸包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
优选地，所述RsgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白表达调控系统，其特征在于，所述无细胞蛋白表达系统包括报告质粒和蛋白合成体系。
4.根据权利要求3所述的蛋白表达调控系统，其特征在于，所述报告质粒按5’-3’方向包括串联的元件：启动子、核糖体结合位点、蛋白表达框和终止子；
优选地，所述启动子包括T7启动子或T5启动子，优选为T7启动子；
优选地，所述蛋白包括蛋白酶，优选为6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳糖脱氢酶、蔗糖转化酶或荧光素酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
优选地，所述终止子包括为T7终止子；
优选地，所述报告质粒的载体包括pFN6A/K、pFN18A/K、pIVEX、pIX、pET3a、pET32a、pET43a或pET15b中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的蛋白表达调控系统，其特征在于，所述蛋白合成体系包括大肠杆菌提取物、兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物、昆虫提取物或人细胞提取物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述蛋白合成体系包括RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰tRNA、氨基酸、氨酰tRNA合成酶或ATP中的任意一种或至少两种的组合。
6.一种核酸检测系统，其特征在于，所述核酸检测系统包括如权利要求1-5任一项所述的蛋白表达调控系统。
7.根据权利要求6所述的核酸检测系统，其特征在于，所述核酸检测系统还包括蛋白检测系统，优选为蛋白酶检测系统；
优选地，所述蛋白酶检测系统包括酶底物和/或显色液；
优选地，所述蛋白酶包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳糖脱氢酶、蔗糖转化酶或荧光素酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述酶底物包括葡萄糖-6-磷酸、乳糖、蔗糖或荧光素中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述显色液包括WST-8。
8.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包括如权利要求6或7所述的核酸检测系统；
优选地，所述核酸检测试剂盒还包括反应缓冲液。
9.一种核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求8所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法包括以下步骤：
(1)将待检测的核酸与蛋白表达调控系统共孵育；
(2)加入酶底物和显色剂，孵育；
(3)观察体系颜色变化，并根据标准曲线进行结果的定量分析；
优选地，所述蛋白表达调控系统中，Cas9蛋白、RsgRNA和报告质粒的摩尔比为(3～5):
(6～8):1。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的蛋白表达调控系统、如权利要求6或7所述的核酸检测系统或如权利要求8所述的核酸检测试剂盒在制备体外诊断试剂中的应用。
一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 核酸检测技术对保障人们的生命健康具有十分重要的意义，同时具有重大的经济价值。核酸检测为疾病诊断和食品监督提供了一种安全、快速、灵敏、特异的手段。目前用于核酸检测的方法主要包括电泳法、光谱法和荧光法，但是这些方法存在着费时费力、成本高昂的问题。
[0003] 合成生物学旨在通过设计天然系统的组件从而解决全球性的挑战。目前，合成生物学家正在建立全细胞生物传感器，该技术的核心是制备能够人为控制的合成基因网络。但是在活细胞中容纳这些工程化途径意味着合成生物学被限制在实验室或大型工厂中。
[0004] 目前的研究试图将合成基因网络移至活细胞之外。作为体外合成生物学最重要的研究平台，无细胞蛋白合成系统不依赖于细胞结构，利用外源DNA或mRNA在体外合成目标蛋白质，突破了传统生物学方法的局限性，具有简便、快速、可控性强和绿色经济等优点。已有研究将无细胞合成系统应用于响应不同的目标物，包括利用转录因子的配体调节转录因子的活性，利用DNA或RNA适配体的结构改变激活启动子表达报告蛋白等。无细胞合成生物学系统的这种响应能力说明了其特定的生物学检测潜力，但是如何利用合成生物学完成核酸类目标物的检测，仍需要进行进一步探索。
[0005] 酶的生物合成是分子酶学工程与合成生物学的交叉领域，酶的检测相对于核酸检测具有简便易行、结果读取方便的优点。因此，利用合成生物学将核酸检测转变为酶的检测，将极大增强核酸检测的易操作性和即时检测性。
[0006] 合成生物学基因回路不仅包括转录翻译系统，而且需要精确的控制系统。CRISPR系统是一种高效的基因编辑工具，目前已被开发成为一种新型的基因调控工具。将CRISPR系统用于合成生物学基因回路的调控，可以缩短响应时间，并减少其他调控蛋白带来的负担。例如，将灭活的Cas9(dCas9)与各种基因激活或阻遏结构域如VP48、VP64、KRAB进行融合，可以用于激活或抑制启动子的活性，起到调控基因回路的作用。
[0007] CN107142247A公开了可诱导的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干细胞及其应用，其中小鼠胚胎干细胞是A2Lox.Cre细胞，其可逆地表达dCas9-VPR融合蛋白或dCas9-KRAB融合蛋白，所述小鼠胚胎干细胞的构建方法不编辑基因组序列，直接激活或者抑制基因表达，融合蛋白的表达具有可诱导性和可逆性，对基因的靶向调控具有可控性和多样性。
[0008] CN107722125A公开了一种高效的人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用，通过在核酸酶失活的Cas9蛋白(dCas9)的羧基端连上多个拷贝的VP64和TAL转录激活结构域，产生一系列新型的人工转录激活因子，并筛选出转录激活活性最好的dCas9-TV；当仅使用一个向导RNA(gRNA)靶向特定基因启动子时，dCas9-TV能高效地激活拟南芥和水稻内源基因的转录，使用多个gRNA分别靶向多个靶基因时，dCas9-TV能同时实现多基因的转录激活；另外，dCas9-TV被证实在人类细胞中同样具有高效的靶向转录激活活性。
[0009] 但是目前基于dCas9的转录调控和重编程效率较低，采用单链向导RNA(sgRNA)用于调节基因表达，设计更加简单、灵活且高效，还可以避免融合蛋白对Cas9功能的影响。
[0010] CN106318973A公开了一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法，该基因调控装置包括一核苷酸序列，其本身是一sgRNA或者经转录成为一sgRNA，该sgRNA在结构上包括两个部分：与失活Cas9蛋白结合的第一部分和连接在第一部分的3’端的第二部分，其中第一部分的5’端有一段反义序列，第二部分是适体序列部分，其包括配体结合部分和适体茎部；当不存在配体时，反义序列与适体茎部配对结合；当存在配体时，反义序列与适体茎部解离以与目标DNA配对结合。通过将结合特异生物信号的RNA核糖开关整合到sgRNA，建立细胞信号强度与基因表达强度的桥梁，能够在识别生物信号的基础上，激活或者沉默任何一个目标基因，在信号配体与细胞基因之间建立人工联系。
[0011] CN108753836A公开了一种利用RNA干扰机制的基因调控或编辑系统，所述基因调控或编辑系统包括以下几个部分：1.CRISPR-Cas9基因调控或编辑组件；2.前体单链引导RNA(pre-sgRNA)，所述前体合成引导RNA含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列。所述基因调控或编辑系统可用于对含有目标miRNA或siRNA的细胞内的目标基因进行调控和编辑。
[0012] 上述装置或系统在目标基因的表达调控方面具有优异表现，但是能否用于核酸检测、如何进行改进，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
[0013] 针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统及其应用，所述核酸检测系统基于CRISPR-Cas9的高灵敏序列识别能力和切割能力，对目标核酸的输入信号进行识别，利用CRISPR-Cas9系统作为基因回路的开关，调控蛋白的表达，将核酸检测转换为快速、易读的蛋白酶或荧光酶信号，实现不依赖大型仪器的高灵敏度、高特异度的核酸检测。
[0014] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0015] 第一方面，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9的蛋白表达调控系统，所述蛋白表达调控系统包括Cas9蛋白、RsgRNA和无细胞蛋白表达系统；
[0016] 所述RsgRNA按5’-3’方向包括反义核酸和sgRNA。
[0017] 本发明中，RsgRNA的设计基于Cas9激活策略，利用5’端反义核酸与触发序列结合，从而稳定抑制CRISPR/Cas9编辑系统的活性，所述触发序列为靶核酸中的部分序列，可以与RsgRNA中的5’端反义核酸进行碱基互补配对。
[0018] 本发明中，Cas9-RsgRNA在没有靶核酸的情况下，处于激活状态，RsgRNA中的sgRNA通过识别待表达的蛋白的基因序列，引导Cas9对蛋白的基因序列进行特异性切割，使得蛋白不能成功翻译表达，从而不产生信号；在有靶核酸的情况下，RsgRNA中的5’端反义核酸与靶核酸结合，Cas9-RsgRNA的切割能力被抑制，蛋白成功表达翻译，从而产生信号；本发明的Cas9-RsgRNA将核酸的输入信号转换为蛋白信号，实现了对靶核酸的简易快速检测。
[0019] 本发明中，RsgRNA中的5’端反义核酸与sgRNA(向导序列和sgRNA支架序列)相互独立，靶核酸中的触发序列只与RsgRNA上的反义核酸杂交，不影响RsgRNA与Cas9的结合，也不影响Cas9蛋白对报告质粒的切割作用，理论上可以通过设计RsgRNA，检测任意目标物，在反义核酸设计时只需要注意避免与标准sgRNA产生二级空间结构即可。
[0020] 示例性地，所述反义核酸的长度为10～20bp，例如可以是10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp或20bp，优选为15～18bp。
[0021] 优选地，所述反义核酸包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
[0022] SEQ ID NO:1：GCGACAAUUACAACUC。
[0023] 优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
[0024] SEQ ID NO:2：
[0025] GAAUUCCAAUUGGAGCUCUCCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。
[0026] 优选地，所述RsgRNA包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
[0027] SEQ ID NO:3：
[0028] GCGACAAUUACAACUCGAAUUCCAAUUGGAGCUCUCCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。
[0029] 优选地，所述无细胞蛋白表达系统包括报告质粒和蛋白合成体系。
[0030] 优选地，所述报告质粒按5’-3’方向包括串联的元件：启动子、核糖体结合位点、蛋白表达框和终止子。
[0031] 本发明中，在不存在靶核酸的情况下，CRISPR/Cas9系统被激活，通过RsgRNA上的引导序列与报告质粒结合，Cas9对报告质粒进行切割，从而不产生蛋白信号；所述RsgRNA引导序列结合报告质粒的位置，包括但不限于质粒的启动子区、核糖体结合位点和蛋白质翻译区。
[0032] 优选地，所述启动子包括T7启动子或T5启动子，优选为T7启动子。
[0034] 优选地，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
[0035] SEQ ID NO:4：
[0036] ATGGTGAGCGAAATTAAAACCCTGGTGACCTTTTTTGGCGGCACCGGCGATCTGGCGAAACGCAAACTGTATCCGAGCGTGTTTAACCTGTATAAAAAAGGCTATCTGCAGAAACATTTTGCGATTGTGGGCACCGCGCGCCAGGCGCTGAACGATGATGAATTTAAACAGCTGGTGCGCGATAGCATTAAAGATTTTACCGATGATCAGGCGCAGGCGGAAGCGTTTATTGAACATTTTAGCTATCGCGCGCATGATGTGACCGATGCGGCGAGCTATGCGGTGCTGAAAGAAGCGATTGAAGAAGCGGCGGATAAATTTGATATTGATGGCAACCGCATTTTTTATATGAGCGTGGCGCCGCGCTTTTTTGGCACCATTGCGAAATATCTGAAAAGCGAAGGCCTGCTGGCGGATACCGGCTATAACCGCCTGATGATTGAAAAACCGTTTGGCACCAGCTATGATACCGCGGCGGAACTGCAGAACGATCTGGAAAACGCGTTTGATGATAACCAGCTGTTTCGCATTGATCATTATCTGGGCAAAGAAATGGTGCAGAACATTGCGGCGCTGCGCTTTGGCAACCCGATTTTTGATGCGGCGTGGAACAAAGATTATATTAAAAACGTGCAGGTGACCCTGAGCGAAGTGCTGGGCGTGGAAGAACGCGCGGGCTATTATGATACCGCGGGCGCGCTGCTGGATATGATTCAGAACCATACCATGCAGATTGTGGGCTGGCTGGCGATGGAAAAACCGGAAAGCTTTACCGATAAAGATATTCGCGCGGCGAAAAACGCGGCGTTTAACGCGCTGAAAATTTATGATGAAGCGGAAGTGAACAAATATTTTGTGCGCGCGCAGTATGGCGCGGGCGATAGCGCGGATTTTAAACCGTATCTGGAAGAACTGGATGTGCCGGCGGATAGCAAAAACAACACCTTTATTGCGGGCGAACTGCAGTTTGATCTGCCGCGCTGGGAAGGCGTGCCGTTTTATGTGCGCAGCGGCAAACGCCTGGCGGCGAAACAGACCCGCGTGGATATTGTGTTTAAAGCGGGCACCTTTAACTTTGGCAGCGAACAGGAAGCGCAGGAAGCGGTGCTGAGCATTATTATTGATCCGAAAGGCGCGATTGAACTGAAACTGAACGCGAAAAGCGTGGAAGATGCGTTTAACACCCGCACCATTGATCTGGGCTGGACCGTGAGCGATGAAGATAAAAAAAACACCCCGGAACCGTATGAACGCATGATTCATGATACCATGAACGGCGATGGCAGCAACTTTGCGGATTGGAACGGCGTGAGCATTGCGTGGAAATTTGTGGATGCGATTAGCGCGGTGTATACCGCGGATAAAGCGCCGCTGGAAACCTATAAAAGCGGCAGCATGGGCCCGGAAGCGAGCGATAAACTGCTGGCGGCGAACGGCGATGCGTGGGTGTTTAAAGGC。
[0037] 优选地，所述终止子为T7终止子。
[0038] 优选地，所述报告质粒的载体包括pFN6A/K、pFN18A/K、pIVEX、pIX、pET3a、pET32a、pET43a或pET15b中的任意一种。
[0039] 优选地，所述蛋白合成体系包括大肠杆菌提取物、兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物、昆虫提取物或人细胞提取物中的任意一种或至少两种的组合。
[0040] 优选地，所述蛋白合成体系包括RNA聚合酶、核糖核苷酸、核糖体、氨酰tRNA、氨基酸、氨酰tRNA合成酶或ATP中的任意一种或至少两种的组合。
[0041] 本发明中，蛋白合成系统包括用于转录翻译蛋白的所有成分，大多提取自原核或真核生物，全细胞提取物通过商业化试剂盒如Thermo Scientific、Life Technologies、New England Biolabs Inc.、Sigma Aldrich和Promega进行提供。
[0042] 本发明中，在无细胞蛋白表达系统中，以报告质粒为模板，在蛋白合成体系中完成蛋白的表达。
[0043] 第二方面，本发明提供了一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括如第一方面所述的蛋白表达调控系统。
[0044] 优选地，所述试剂盒还包括蛋白检测系统，优选为蛋白酶检测系统。
[0045] 优选地，所述蛋白酶检测系统包括但不限于6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)检测试剂盒、乳糖脱氢酶检测试剂盒或血糖仪等可快速获得蛋白表达含量、活性的检测系统。
[0046] 示例性地，在比色报告系统中，通过在短时间内检测底物的编号，根据比色强度反应酶的生成量，进而通过计算获得目标物核酸的量，所述系统具有快速、方便、不依赖大型仪器、可肉眼观察等特点。
[0047] 优选地，所述比色报告系统包括酶底物和/或显色液。
[0048] 优选地，所述蛋白酶包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳糖脱氢酶、蔗糖转化酶或荧光素酶中的任意一种或至少两种的组合。
[0049] 优选地，所述酶底物包括葡萄糖-6-磷酸、乳糖、蔗糖或荧光素中的任意一种或至少两种的组合。
[0050] 优选地，所述显色液包括WST-8。
[0051] 根据本发明，在比色报告系统中，葡萄糖-6-磷酸在G6PD作用下转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂，在此反应过程中NADP+被还原为NADPH，NADPH在电子耦合试剂1-Mpms(1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)还原生成橙黄色甲臜(formazan)。
[0052] 根据本发明，在靶核酸存在的情况下，特异性蛋白酶被表达，加入酶底物后，检测工作在10分钟内完成，蛋白酶将底物催化产生比色变化，肉眼观察颜色变化，在有标准曲线的情况下，可以进行定量分析；转化酶可以将蔗糖转化成葡萄糖，结果采用血糖仪读数，获得底物葡萄糖的量。
[0053] 第三方面，本发明提供了一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包括如第二方面所述的核酸检测系统。
[0054] 优选地，所述核酸检测试剂盒还包括反应缓冲液。
[0055] 本发明中，所述缓冲液配方为：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，pH＝8.8。
[0056] 第四方面，本发明提供了一种核酸检测方法，所述方法包括采用如第三方面所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法包括以下步骤：
[0057] (1)将待检测的核酸与蛋白表达调控系统共孵育；
[0058] (2)加入酶底物和显色剂，孵育；
[0059] (3)观察体系颜色变化，并根据标准曲线进行结果的定量分析。
[0060] 优选地，所述蛋白表达调控系统中，Cas9蛋白、RsgRNA和报告质粒的摩尔比为(3～5):(6～8):1，优选为5:6:1。
[0061] 第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的蛋白表达调控系统、如第二方面所述的核酸检测系统或如第三方面所述的核酸检测试剂盒在制备体外诊断试剂中的应用。
[0062] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0063] (1)本发明的核酸检测系统将CRIPSR/Cas9核酸识别调控系统和基因回路相结合，利用RsgRNA调控蛋白酶的表达，将核酸信号转化为蛋白酶的生成，通过检测蛋白酶实现对核酸的快速检测；
[0064] (2)本发明的无细胞蛋白表达系统发挥传感器的作用，表达有色底物的蛋白酶用于核酸目标物的可视化定量检测；
[0065] (3)本发明的核酸检测系统具有本底低、响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便的优点，基因回路的抗干扰能力强，输出稳定，同时具有较高的灵敏度和特异性，克服了传统核酸检测对仪器的依赖，结果读取简单。附图说明
[0066] 图1为标准sgRNA的二级结构；
[0067] 图2为RsgRNA的二级结构；
[0068] 图3为触发序列与RsgRNA的结合作用；
[0069] 图4为具有G6PD基因序列的报告质粒；
[0070] 图5为触发序列对Cas9/RsgRNA切割能力的调控作用；
[0071] 图6为核酸检测原理图；
[0072] 图7为比色信号的产生机制；
[0073] 图8(A)为反应体系颜色变化图，图8(B)为对应的吸光度；
[0074] 图9(A)为特异性实验比色图，图9(B)为对应的吸光度；
[0075] 图10(A)为灵敏度实验比色图，图10(B)为对应的吸光度。
具体实施方式
[0076] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0078] 实施例1设计标准sgRNA和RsgRNA
[0079] 标准sgRNA靶位通过CHOPCHOP(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)进行设计，通过Moreno-Mateos分数进行筛选评估(Vejnar C E,et al..Cold Spring Harbor Protocols,2016)，得到如SEQ ID NO:2所示的sgRNA，二级结构如图1所示；如SEQ ID NO:3所示的RsgRNA是在sgRNA的5’端增加如SEQ ID NO:1所示的反义核酸，二级结构如图2所示。
[0080] 如图3所示，在有靶核酸存在的情况下，触发序列与RsgRNA上的反义核酸杂交，二级结构的自由能ΔG＝-57.68kcal/mol。
[0081] 实施例2报告质粒的构建
[0082] 本实施例构建的报告质粒包含T7启动子、核糖体结合位点、G6PD编码序列和T7终止子，根据G6PD的蛋白序列，结合大肠杆菌密码子的特点优化，设计如SEQ ID NO:4所示的G6PD编码序列，步骤如下：
[0083] 采用汉恒生物HB-infusionTM无缝克隆试剂盒，利用体系中的DNA外切酶、DNA聚合酶和连接酶将如SEQ ID NO:4所示的编码序列插入载体pET3a骨架中，避免限制性内切酶克隆方法对启动子区和核糖体结合位点序列Shine-Dalgarno(SD)的影响，构建如图4所示的质粒。
[0084] 实施例3 Cas9-sgRNA或Cas9-RsgRNA对G6PD的调控作用
[0085] 将实施例1构建的Cas9-sgRNA或Cas9-RsgRNA加入到包含报告质粒的无细胞蛋白表达系统中，实现对G6PD蛋白合成的调控作用。
[0086] 如图5表示Cas9-RsgRNA对DNA的切割作用以及不同浓度目标物对切割底物的抑制作用，其中，最左侧为DNA ladder泳道，1号泳道表示作为切割底物的DNA，2号泳道表示Cas9-RsgRNA切割底物DNA后的切割产物，3号-8号泳道表示不同浓度触发序列(0.1，0.4，2，10，50，250nM)对Cas9-RsgRNA切割系统的抑制作用。结果表明，随着触发序列浓度的增大，其对Cas9-RsgRNA的切割效果抑制越强。
[0087] 实施例4靶核酸检测
[0088] 如图6所示为核酸检测原理图，向包含50nM Cas9蛋白、60nM RsgRNA和10nM报告质粒的切割体系中加入靶核酸GAGTTGTAATTGTCGC(SEQ ID NO:5)，在37℃下孵育2h，与RsgRNA互补结合，抑制Cas9蛋白对报告质粒的切割作用，G6PD蛋白酶在无细胞蛋白表达体系中翻译合成，根据图7，G6PD蛋白酶与葡萄糖-6-磷酸发生催化反应生成6-磷酸葡萄糖酸内脂，同时NADP+被还原为NADPH，NADPH在1-Mpms的作用下将WST-8还原成橙黄色甲臜(formazan)；通过肉眼观察溶液的颜色变化、并采用碧云天G6PD活性检测试剂盒(商品编号S0189)在
450nm处测定吸光度，进行定量检测，重复3次区取平均值并计算标准差。
450nm处测定吸光度，进行定量检测，重复3次区取平均值并计算标准差。
[0089] 如图8(A)和图8(B)所示，与空白对照1号体系和阳性对照2号体系(G6PD)相比，在加入靶核酸的5号体系(靶核酸+Cas9/RsgRNA+G6PD)中，CRISPR/Cas9的编辑功能被抑制，体系中生成橙黄色甲臜，450nm处吸光度(A450 nm absorbance value)显著增大，而未加入靶核酸的3号体系(Cas9/sgRNA+G6PD)和4号体系(Cas9/RsgRNA+G6PD)中，Cas9实现对报告质粒的切割，体系不变色，450nm处吸光度处于较低的水平。
[0090] 实施例5特异性实验
[0091] 通过加入与触发序列不同的非特异性核酸序列，验证核酸检测系统的特异性，所述非特异性核酸序列包括如SEQ ID NO:6～9所示的核酸序列：
[0092] SEQ ID NO:6：GAATACTAACATGGAG；
[0093] SEQ ID NO:7：AGAATCGACGATTTAA；
[0094] SEQ ID NO:8：CGGATCACTGAAAGA；
[0095] SEQ ID NO:9：CGGTCTACTTTTGGGG。
[0096] 如图9(A)和图9(B)所示，1号体系为不包含报告质粒的检测系统，作为空白对照，2号体系为包含报告质粒(G6PD)、不包含Cas9-sgRNA切割系统的阳性对照，3号体系Cas9/sgRNA+G6PD中，Cas9实现对报告质粒的切割，450nm处吸光度处于较低的水平。与空白对照1号体系和阳性对照2号体系(G6PD)相比，在加入靶核酸的4号体系(靶核酸+Cas9/RsgRNA+G6PD)中，CRISPR/Cas9的编辑功能被抑制，体系中生成橙黄色甲臜，450nm处吸光度(A450 nm absorbance value)显著增大。5号，6号，7号，8号体系为分别添加与靶序列不同的非特异性序列(SEQ ID NO:6-9)，结果显示，仅含有靶序列的4号体系为阳性，其他均为阴性，特异性良好。
[0097] 实施例6灵敏度实验
[0098] 利用已测定浓度的靶序列作为触发序列进行灵敏度评价。利用TE缓冲液进行5倍系列稀释，共稀释5个稀释度，终浓度分别为0.4，2，10，50，250nM。利用己建立的核酸检测方法对每个稀释度的靶序列进行检测，评价其灵敏度。检测结果如图10(A)和图10(B)显示，在不依赖核酸扩增，已建立的核酸检测方法在2nM靶序列做为触发序列即有明显的信号产生。根据D＝3N×Q/I计算检测限，式中D为检测限；Q为进样量；N为噪音；I为信号响应值。得到检测限为0.032nM。
[0099] 综上所述，本发明的核酸检测系统将CRIPSR/Cas9核酸识别调控系统和基因回路相结合，利用RsgRNA调控蛋白酶的表达，将核酸信号转化为蛋白酶的生成，通过检测蛋白酶实现对核酸的快速检测；其中，无细胞蛋白表达系统发挥传感器的作用，表达有色底物的蛋白酶用于核酸目标物的可视化定量检测；所述核酸检测系统特异性好，灵敏度可达0.032nM，克服了传统核酸检测对仪器的依赖，结果读取简单。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
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