一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用
阅读：559发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，将PNAG多糖合成酶编码基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，再将所述重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组枯草芽孢杆菌。还公开了该重组枯草芽孢杆菌的构建方法，通过向枯草芽孢杆菌导入新的代谢合成酶基因，成功构建重组枯草芽孢杆菌，并且经 发酵 可生产PNAG多糖，所生产的胞外分泌PNAG多糖可达到136mg/L，这为进一步通过代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产PNAG多糖奠定了 基础 ；还公布该重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工不同领域发酵制备含PNAG多糖产品中的应用，该重组菌产生的PNAG多糖可促进 益生菌 生长并抑制有害菌，在多领域具有很好地应用前景。，下面是一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将PNAG多糖合成酶编码基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组枯草芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述PNAG多糖合成酶编码基因来源于大肠杆菌；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
3.如权利要求1所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述PNAG合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1-3任意一项所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：通过克隆方法将PNAG合成酶编码基因连接到表达质粒上，构建重组表达质粒；
步骤2：将构建的重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌，得到产PNGA多糖的重组枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述表达质粒为pGrac-01。
6.如权利要求5所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述PNAG合成酶编码基因表达PNAG合成酶，所述PNAG合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种胞外分泌PNAG多糖的生产方法，其特征在于，应用如权利要求1-3任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到PNAG多糖。
8.如权利要求7所述的胞外分泌PNAG多糖的生产方法，其特征在于，接种量为：重组枯草芽孢杆菌按体积比3～5％接种于所述发酵培养基；发酵条件为：35～37℃条件下，发酵36～54h。
9.如权利要求7所述的胞外分泌PNAG多糖的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、硫酸铵6g/L、酵母粉20g/L、K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L以及MgSO4·7H2O 1.5g/L。
10.一种如权利要求1-3任意一项所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域发酵制备含PNAG多糖产品中的应用。
一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及遗传工程技术领域，特别涉及一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
[0002] PNAG是N-乙酰氨基葡萄糖单体按照β-1,6糖苷键连接起来的多糖分子，这种多糖通常由微生物胞外分泌产生的，是细菌的生物膜组成成分之一。PNAG多糖分子的结构与几丁质极其相似，除了化学键由1,6糖苷键取代了1,4糖苷键。几丁质具有杀菌，抗炎等生物活性，酶解几丁质后获得的低分子量几丁寡糖经过近几年研究也发现了更多的抗肿瘤、免疫促进、血糖调节、肠道菌群益生促进等生物活性，在医药、农业和食品领域具有非常好的应用前景。
[0003] 几丁质作为自然界储量第二丰富的多糖类物质，主要来自从虾蟹壳中提取，而提取工艺污染严重，需要大量浓盐酸去除钙去除蛋白，如果需要继续加工为壳多糖还要用到浓碱去脱乙酰。几丁质通过几丁质酶的水解获得几丁寡糖，由于几丁质大分子的复杂结构的难降解和商业化高活性的几丁质酶的缺乏，因此规模化酶解生产几丁寡糖生产的成本很高，限制了其广泛应用。
[0004] PNAG作为几丁质的结构类似物，也是一种阳离子多糖，由于其多存在于病原菌的生物膜中，与蛋白、DNA等致病因子紧密包裹组成生物膜的主要结构，具有黏附、免疫原性、保护细胞及耐药性等生物学意义。由于PANG在生物膜中的含量低、成分杂、PNAG的提取和性质研究较少有人涉及。
[0005] 为了克服现有技术中的问题，本发明采用重组微生物工程菌全合成PNAG多糖的技术方案，利用微生物的自身代谢途径，基于代谢工程和合成生物学的理念，以食品安全级别的工程菌—枯草芽孢杆菌为载体，通过微生物发酵，实现PNAG的微生物发酵合成，合成的PNAG产物无致病因子存在、无酸碱重污染环境的因素存在、无重金属元素残留，产品纯化时成本低廉，且生产效率稳定，可为生产PNAG提供生产路线，具有较强的经济意义。
发明内容
[0006] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，通过PNAG多糖合成酶编码基因和表达载体连接重组后，转入枯草芽孢杆菌，利用基因工程成功构建重组工程菌。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，通过基因改造枯草芽孢杆菌代谢途径的方式，构建了一种能够合成PNAG的重组枯草芽孢杆菌。
[0009] 本发明还提供一种胞外分泌PNAG多糖的生产方法，主要是通过微生物发酵重组枯草芽孢杆菌的方式，实现PNAG多糖的积累。
[0010] 本发明还提供一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域发酵制备含PNAG多糖产品中的应用，为不同领域研究PNAG的生物学意义奠定基础。
[0011] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，将PNAG多糖合成酶编码基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组枯草芽孢杆菌。
[0012] 优选的是，所述PNAG多糖合成酶编码基因来源于大肠杆菌；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
[0013] 优选的是，所述PNAG合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014] 本发明还提供所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤1：通过克隆方法将PNAG合成酶编码基因连接到表达质粒上，构建重组表达质粒；
[0016] 步骤2：将构建的重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌，得到产PNGA多糖的重组枯草芽孢杆菌。
[0017] 优选的是，所述表达质粒为pGrac-01。
[0018] 优选的是，所述PNAG合成酶编码基因表达PNAG合成酶，所述PNAG合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0019] 本发明还提供一种胞外分泌PNAG多糖的生产方法，应用所述的重组枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到PNAG多糖。
[0020] 优选的是，接种量为：重组枯草芽孢杆菌按体积比3～5％接种于所述发酵培养基；发酵条件为：35～37℃条件下，发酵36～54h。
[0021] 优选的是，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、硫酸铵6g/L、酵母粉20g/L、K2HPO4·3H2O12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L以及MgSO4·7H2O1.5g/L。
[0022] 本发明还提供一种所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域发酵制备含PNAG多糖产品中的应用。
[0023] 本发明至少包括以下有益效果：
[0024] 本发明公开的重组枯草芽孢杆菌，是通过将外源的PNAG合成酶编码基因和表达载体连接，构建了重组表达质粒后，再导入枯草芽孢杆菌宿主细胞中即得重组枯草芽孢杆菌，由于枯草芽孢杆菌作为一种生长迅速、培养条件粗放的重要工程菌微生物，具有遗传背景清晰，发酵工艺较为成熟的优势，又因其具有强大的胞外蛋白分泌能力，因此，通过向枯草芽孢杆菌中导入新的代谢合成酶，利用细胞已有的前体分子，合成PNAG多糖，以达到通过改变枯草芽孢杆菌的代谢途径获取PNAG多糖，从而实现用生物合成的方式取代原有的天然提取技术，克服现有技术天然提取技术的缺陷，即可得到PNAG多糖；本发明还提供了重组枯草芽孢杆菌构建方法，该方法简单、便于使用，具有很好地应用前景。
[0025] 本发明还公开了胞外分泌PNAG多糖的生产方式，是通过重组枯草芽孢杆菌发酵的方式实现PNAG多糖的胞外分泌及积累，并且PNAG多糖的浓度了达到136mg/L，这为进一步通过代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产PNAG多糖奠定了基础。
[0026] 本发明所制备的PNAG多糖，由于其可明显促进细胞凋亡、提高双歧杆菌和乳酸杆菌益生菌的生长速度并且还可显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，因此，通过发酵重组枯草芽孢杆菌制备含PNAG的产品以应用于食品、医药、化工不同领域，具有重要的指导意义和应用价值。
[0028] 图1为本发明所述的表达质粒pGrac-01的图谱；
[0029] 图2为本发明所述的重组质粒pGrac-01-PNS的图谱；
[0030] 图3为本发明所述的PNAG多糖的GPC色谱图；
[0031] 图4为所述的PNAG多糖的添加对双歧杆菌生长的促进作用；
[0032] 图5为所述的PNAG多糖的添加对嗜酸乳酸杆菌生长的促进作用；
[0033] 图6为所述的PNAG多糖的添加对大肠杆菌生长的抑制作用；
[0034] 图7为为所述的PNAG多糖的添加对金黄色葡萄球菌生长的促进作用。
具体实施方式
[0036] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商所建议的条件；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0037] 本发明提供一种胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌，将PNAG多糖合成酶编码基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌中得到重组枯草芽孢杆菌。
[0038] 上述方案中，由于枯草芽孢杆菌具备强大的胞外分泌能力，通过克隆技术，向枯草芽孢杆菌中导入PNAG合成酶系统，改造枯草芽孢杆菌的代谢通路，成功构建一种重组工程菌；通过重组枯草芽孢杆菌的代谢获取胞外分泌PNAG多糖，该途径有助于通过采用生物合成技术取代原有的天然提取技术，可提供一种经济有效的生产途径。
[0039] 一个优选方案中，所述PNAG多糖合成酶编码基因来源于大肠杆菌ATCC25922；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
[0040] 上述方案中，Bacillus subtilis 168的保藏号为：ATCC23857。
[0041] 一个优选方案中，所述PNAG合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0042] 本发明还提供所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0043] 步骤1：通过克隆方法将PNAG合成酶编码基因连接到表达质粒上，构建重组表达质粒；
[0044] 步骤2：将构建的重组表达质粒转入枯草芽孢杆菌，得到产PNGA多糖的重组枯草芽孢杆菌。
[0045] 一个优选方案中，所述表达质粒为pGrac-01。
[0046] 一个优选方案中，所述PNAG合成酶编码基因表达PNAG合成酶，所述PNAG合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0047] 本发明还提供一种胞外分泌PNAG多糖的生产方法，应用所述的重组枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到PNAG多糖。
[0048] 一个优选方案中，接种量为：重组枯草芽孢杆菌按体积比3～5％接种于所述发酵培养基；发酵条件为：35～37℃条件下，发酵36～54h。
[0049] 在上述方案中，重组枯草芽孢杆菌接种发酵培养基前，先接种于种子培养基，并在37℃、220rpm下培养10～16h(优选培养10h)，得到种子液；将种子液按体积比3～5％(优选
5％)接种于发酵培养基中，于37℃、220rpm条件下，培养48h。
5％)接种于发酵培养基中，于37℃、220rpm条件下，培养48h。
[0050] 种子培养基包含以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L及NaCl10g/L。
[0051] 一个优选方案中，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、硫酸铵6g/L、酵母粉20g/L、K2HPO4·3H2O12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L以及MgSO4·7H2O1.5g/L。
[0052] 在上述方案中，通过上述公开发酵方式，可使得重组枯草芽孢杆菌代谢产生的PNAG多糖的含量达到136mg/L，聚合度在5-20左右，平均分子量3000 Da。
[0053] 本发明还提供一种所述的胞外分泌PNAG多糖的重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域发酵制备产品中的应用。
[0054] 为更清楚的说明本发明的技术方案，将以具体的实施例进一步说明。
[0055] 实施例1
[0056] 构建重组质粒
[0057] 根据NCBI上公布的大肠杆菌(E.coli，GenBank：WP_126317446.1)中的PNAG合成编码基因PNS，通过密码子优化，基因合成如SEQ ID NO.1所示的序列，具体设计方法为：
[0058] 设计引物：PNS-F：5’-atgaccgatcgcattattgctttcctgata-3’
[0059] PNS-R：5’-tcacgattcgatcctcccaatgcca-3’
[0060] 将上述设计的引物，以合成PNAG合成酶编码基因PNS为模板扩增PNS基因片段，表达质粒pGrac-01(如图1所示)经KpnI和HindIII双酶切线性化后与以上扩增基因片段，通过T4连接酶连接，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功，命名为pGrac-01-PNS(如图2所示)。
[0061] 具体使用Superpfu Mix试剂，利用PCR扩增PNS基因目的片段，PCR反应体系如下：
[0062]
[0063] PCR的反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，循环数30；72℃延伸10min。
[0064] 实施例2
[0065] 构建重组枯草芽孢杆菌
[0066] 将构建好的重组表达质粒pGrac-01-PNS转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中，采用PNS-F和PNS-R引物挑选出转化子进行菌落PCR，出现1200bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
[0067] 实施例3
[0068] 发酵生产PNAG多糖，包括以下步骤：
[0069] 1)将实施例2成功构建的重组枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，于37℃、220rpm下培养10h，备用。种子培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L以及NaCl10g/L。
[0070] 2)将上述培养好的重组枯草芽孢杆菌的种子液按体积5％接种于液体培养基中，于37℃、220rpm条件下发酵48h，固液分离，获取发酵液上清液。发酵培养基包含以下质量浓度的组分：蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L、乳糖5g/L、硫酸铵6g/L、酵母粉20g/L、K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO4 2.5g/L以及MgSO4·7H2O 1.5g/L。
[0071] 实施例4
[0072] PNAG多糖产量的测定
[0074] 经测定PNAG多糖产量可达到136mg/L，过表达PNAG合成酶编码基因PNS，实现了PNAG多糖在重组枯草芽孢杆菌胞外分泌。
[0075] 实施例5
[0076] PNAG多糖的纯化
[0077] 上述实施例3得到发酵液上清液中加入3倍体积的冰乙醇，-20度过夜沉淀，12000rpm离心收集沉淀，再用发酵液上清液初始体积1/2的去离子水溶解离心后收集的沉淀，加入Savage试剂去除蛋白，离心去除沉淀，收集上清液冻干保存。
[0078] 实施例6
[0079] PNAG多糖的平均分子量和分布测定
[0080] 将实施例5中纯化后保存的样品，配成10mg/ml的样品溶液，过0.22μm滤膜于液相小瓶中，供分子量测定用；
[0081] 采用GPC色谱测定分子；GPC色谱条件，Agilent 1200，蒸发光检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速1mL/min，柱温40℃，进样体积为10μl；PNAG多糖的GPC色谱图(如图3)；经GPC软件计算，PNAG多糖的平均分子量为3000Dalton。
[0082] 实施例7
[0083] PNAG多糖的含量测定
[0084] (1)氨基葡萄糖标准曲线的制备：按表2-1，在96孔板中，依次加入标准氨基葡萄糖溶液10ul、蒸馏水、0.2％硫酸蒽酮溶液，用100uL移液枪充分吹打均匀，于冰水中冷却5min，冷却后于沸水中水浴10min，冷却至室温，620nm处采用多功能酶标仪测定吸光度，横坐标选择的是氨基葡萄糖浓度(C)，纵坐标选择的是吸光度(A)，进行标准曲线的绘制，并计算出回归方程(如下)：
[0085] y＝0.0092x-0.0351，R2＝0.9897
[0086] (2)含量测定。精确称量纯化后多糖样品，配成1mg/ml样品溶液。取96孔板，在孔中相继加入浓度为1mg/ml样品溶液10μl，0.2％硫酸蒽酮溶液40μl。用移液枪反复吹打混匀，冷却后于沸水中水浴10分钟，冷却至室温，400nm处采用多功能酶标仪测定吸光度。设置三个平行孔以减少误差。根据回归方程求得样品中多糖的浓度，再计算出多糖的含量。
[0087] 根据上述实验结果，以氨基葡萄糖计，样品溶液中多糖含量在0.944mg/ml,，百分含量为94.4％。
[0088] 实施例8
[0089] PNAG多糖的应用
[0090] 1)胞外分泌PNAG多糖用于肺癌细胞A549的抑制增殖实验
[0091] HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM于37℃，5％CO2及饱和湿度培养箱内培养，2d更换培养液，待细胞单层生长铺满80％左右时传代。取对数期细胞，接种96孔板，5000个/孔，贴壁过夜；实验分组为CK、0.0008mg/mL、0.004mg/mL、0.02mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL和5mg/mL的药物，同时以加DMEM完全培养液的细胞作为对照组，分别作用24h、48h、72h，用CCK8测增殖率。
[0092] 结果显示：浓度0.0008mg/mL-0.1mg/mL的PNAG多糖作用于肺癌细胞A549，存活率>100％，说明PNAG多糖有促进细胞增殖的作用；
[0093] 浓度0.5mg/mLPNAG多糖作用于肺癌细胞A549，存活率<100％，且三个时间点抑制率分别为95.8％、81.3％和71.1％(如表1所示)；
[0094] 浓度超过1mg/ml时药物不稳定，容易形成沉淀，后续实验最高浓度设定为0.5mg/ml。
[0095] 表1 PNAG多糖成分对肺癌细胞A549增殖抑制情况
[0096]
[0097]
[0098] 2)胞外分泌PNAG多糖提高益生菌生长速度的实验
[0099] 本申请利用胞外分泌PNAG多糖按浓度0.0008mg/mL加入培养双歧杆菌(保藏号：ATCC 15707)及嗜酸乳酸杆菌(保藏号：ATCC 53103)的培养基中，培养28h，并分别每4h记录一次细胞干重；同时，用浓度0.0008mg/mL、葡萄糖替代PNAG多糖，其他条件均相同，作为对比。如图4和图5所示，额外补充的葡萄糖和PNAG多糖都能随着时间的增长，可促进双歧杆菌及嗜酸乳酸杆菌的细胞干重的增加，由此说明PNAG多糖对提高益生菌生长速度有重要的应用价值。
[0100] 3)胞外分泌PNAG多糖抑制有害菌生长的实验
[0101] 本申请利用胞外分泌PNAG多糖按浓度0.0008mg/mL加入培养大肠杆菌(保藏号：ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(保藏号：ATCC6538)培养基中，培养28h，并分别每4h记录一次细胞干重；同时，用浓度0.0008mg/mL、葡萄糖替代PNAG多糖，其他条件均相同，作为对比。
如图6和图7所示，额外补充的葡萄糖和PNAG多糖都能随着时间的增长，可抑制双歧杆菌及嗜酸乳酸杆菌的细胞干重的增加，由此说明PNAG多糖对抑制有害菌生长具有重要的应用价值。
如图6和图7所示，额外补充的葡萄糖和PNAG多糖都能随着时间的增长，可抑制双歧杆菌及嗜酸乳酸杆菌的细胞干重的增加，由此说明PNAG多糖对抑制有害菌生长具有重要的应用价值。
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