技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一类用于伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的培养基。
背景技术
[0002] 伯克氏菌[Polyangium]brachysporum DSM 7029(＝K481-B101＝ATCC 53080)，于1988年于希腊从
土壤中分离获得。该菌生长速度快，两天可见单菌落，遗传操作简便。DSM
7029菌株可以产生抗
真菌和
肿瘤的药物
滑行菌素，它是杂合的NRPS/PKS(非核糖体肽合成酶/聚
酮合酶)类型的天然产物。
[0003] 利用DSM 7029菌株，还可以异源表达新型抗肿瘤药物埃博霉素。埃博霉素类化合物属于聚酮类的大环内酯化合物，可以稳定微管聚合，作用机制与紫杉醇类似。更为重要的是，埃博霉素对于紫杉醇和其他抗肿瘤药物无效的癌细胞也具有良好的活性。埃博霉素在DSM 7029菌株里异源表达，经过改造，产量可达307μg/L。但此发酵产量距离工业化生产的要求还有相当距离。目前，对于用于伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的培养基组成和优化的相关文献报道匮乏，因此如何获得能够有效提高伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物产量的培养基成为亟待解决的课题。
发明内容
[0004] 针对
现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一类用于伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的培养基，从而有效地提高天然产物的发酵产量并改善菌体发酵过程中的自溶现象。
[0005] 本发明的具体技术方案如下：
[0006] 本发明在第一方面提供了一种用于伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的培养基，该培养基除包含
酪蛋白胨、
酵母粉、六
水氯化镁、甘油、乙酸钠、丙酸钠、甲基
丙二酸、微量元素溶液和大孔
吸附树脂以外，还包含额外添加的
碳源组分，碳源组分选自
蔗糖、
淀粉、糊精、
葡萄糖和甘油中的一种或几种。
[0007] 优选地，上述微量元素溶液的组分至少包括四水氯化锰、七水
硫酸锌、五水硫酸
铜和七水硫酸亚
铁。
[0008] 优选地，上述大孔吸附树脂为安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂。
[0009] 优选地，额外添加的碳源组分中，蔗糖的添加量为5-50g/L。
[0010] 优选地，额外添加的碳源组分中，淀粉的添加量为5-50g/L。
[0011] 优选地，额外添加的碳源组分中，糊精的添加量为5-50g/L。
[0012] 优选地，额外添加的碳源组分中，甘油的添加量为5-50mL/L。
[0013] 优选地，额外添加的组合碳源组分中，蔗糖和葡萄糖的添加量为5-50g/L。
[0014] 更优选地，额外添加的碳源组分中，蔗糖的添加量为25g/L。
[0015] 更优选地，额外添加的碳源组分中，淀粉的添加量为25g/L。
[0016] 更优选地，额外添加的碳源组分中，糊精的添加量为25g/L。
[0017] 更优选地，额外添加的碳源组分中，甘油的添加量为25mL/L。
[0018] 更优选地，额外添加的碳源组分中，蔗糖的添加量为5g/L，葡萄糖的添加量为10g/L。
[0019] 在一个较优
实施例中，酪蛋白胨的含量为8g/L，酵母粉的含量为4g/L，六水氯化镁的含量为4.06g/L，非额外添加的甘油的含量为5mL/L，乙酸钠的含量为50mg/L，丙酸钠的含量为100mg/L，甲基丙二酸的含量为100mg/L，微量元素溶液的含量为1mL/L，大孔吸附树脂的含量为20mL/L。
[0020] 优选地，上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0021] 本发明在第二方面提供了一种改善伯克氏菌目DSM 7029菌株在菌体发酵过程中自溶现象的培养基，培养基除包含酪蛋白胨、酵母粉、六水氯化镁、甘油、乙酸钠、丙酸钠、甲基丙二酸、微量元素溶液和大孔吸附树脂以外，还包含额外添加的蔗糖。
[0022] 优选地，上述微量元素溶液的组分至少包括四水氯化锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜和七水硫酸亚铁。
[0023] 优选地，上述大孔吸附树脂为安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂。
[0024] 优选地，蔗糖的添加量为5-50g/L。
[0025] 更优选地，蔗糖的添加量为25g/L。
[0026] 在一个较优实施例中，酪蛋白胨的含量为8g/L，酵母粉的含量为4g/L，六水氯化镁的含量为4.06g/L，非额外添加的甘油的含量为5mL/L，乙酸钠的含量为50mg/L，丙酸钠的含量为100mg/L，甲基丙二酸的含量为100mg/L，微量元素溶液的含量为1mL/L，大孔吸附树脂的含量为20mL/L。
[0027] 优选地，上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0028] 本发明在第三方面提供了上述培养基在发酵制备天然产物中的应用，伯克氏菌目DSM 7029菌株为[Polyangium]brachysporum DSM 7029。
[0029] 在较优实施例中，上述天然产物是由聚酮合酶和/或非核糖体肽合成酶构成的基因簇的产物及其衍生物。
[0030] 更优选地，上述天然产物至少包括埃博霉素和滑行菌素。
[0031] 本发明在第四方面提供了一种提高伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的产量的方法，该方法采用本发明第一方面所提供的培养基作为伯克氏菌目DSM 7029菌株的发酵培养基。
[0032] 本发明在第五方面提供了一种改善伯克氏菌目DSM 7029菌株在菌体发酵过程中自溶现象的方法，该方法采用本发明第二方面所提供的培养基作为伯克氏菌目DSM 7029菌株的发酵培养基。
[0033] 本发明提供了一类用于伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的培养基，通过向培养基中添加蔗糖、淀粉、糊精、葡萄糖和甘油等组分，实现了显著提高天然产物的发酵水平。本发明的有益效果体现在：添加的碳源成分价格廉价易得，配置简单；与对照培养基的结果相比，产量提高显著，最多达到28mg/L的产量，基本满足了利用伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物的工业需求，具有良好的应用前景。
[0034] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或
修改，都落入本发明保护的范围。
[0035] 以下将结合
附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
[0036] 图1示出了本发明较优实施例中在培养基中添加不同碳源时天然产物的产量比较结果；
[0037] 图2示出了本发明较优实施例中不同浓度蔗糖对菌株MMR11发酵埃博霉素产量的影响；
[0038] 图3示出了本发明较优实施例中不同浓度糊精对菌株MMR11发酵埃博霉素产量的影响；
[0039] 图4示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天的菌体形态观察结果；
[0040] 图5示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天活菌数的变化；
[0041] 图6示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天OD600的变化；
[0042] 图7示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天pH的变化；
[0043] 图8示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天蔗糖浓度的变化；
[0044] 图9示出了本发明较优实施例中在培养基中添加蔗糖对滑行菌素的产量(峰面积)影响；
[0045] 图10示出了本发明较优实施例中菌株MMR11培养基中添加蔗糖和葡萄糖对埃博霉素的产量影响。
具体实施方式
[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所用的实验材料和
试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0047] 实施例1
[0048] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0049] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三
角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0050] 其中，
[0051] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL/L，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0052] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0053] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0054] 其中，
[0055] 所述发酵培养基的组分及含量为：
[0056] 对照培养基：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0057] 额外添加蔗糖的培养基：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，蔗糖15g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0058] 额外添加淀粉的培养基：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，淀粉15g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0059] 额外添加糊精的培养基：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，糊精15g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0060] 额外添加甘油的培养基：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL/L，甘油(额外添加)15mL/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0061] 上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0062] 4、埃博霉素的分离提取纯化检测：发酵6天后用100目的筛网过滤收集树脂，于三角瓶中，加入25mL甲醇过夜浸提两次。合并后取2mL浸提液，用0.22μm滤器过滤，质谱检测。
[0063] 5、根据吸收峰面积与标准样品浓度关系的曲线计算天然产物的产量，三组结果取平均值并计算误差。
[0064] 与培养基中不添加碳源的培养基相比，使用含有本实施例所述添加蔗糖、淀粉、糊精或甘油的培养基，显著提高了天然产物的产量。具体的，天然产物产生差别如图1所示。结果显示伯克氏菌目DSM 7029菌株发酵制备天然产物时利用蔗糖、淀粉、糊精或甘油添加的培养基，天然产物的发酵产量得到了显著提高(epoC:埃博霉素C；epoD:埃博霉素D)。与对照培养基相比，添加蔗糖时天然产物总量提高了约9.6倍；与对照培养基相比，添加淀粉时天然产物总量提高了约5.2倍；与对照培养基相比，添加糊精时天然产物总量提高了约11倍；与对照培养基相比，添加甘油时天然产物总量提高了约3.2倍。
[0065] 实施例2
[0066] 蔗糖的添加量优化实验
[0067] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0068] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0069] 其中，
[0070] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0071] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0072] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0073] 其中，
[0074] 所述发酵培养基的组分及含量为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，蔗糖0-35g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0075] 上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0076] 4、埃博霉素的分离提取纯化检测：发酵6天后用100目的筛网过滤收集树脂，于三角瓶中，加入25mL甲醇过夜浸提两次。合并后取2mL浸提液，用0.22μm滤器过滤，质谱检测。
[0077] 5、根据吸收峰面积与标准样品浓度关系的曲线计算天然产物的产量，三组结果取平均值并计算误差。
[0078] 经检测，埃博霉素的产生情况如图2所示。结果显示，在发酵培养基中添加不同浓度的蔗糖，均能增加埃博霉素的产量。结合天然产物产量和成本考虑，蔗糖25g/L为最优选的添加量。
[0079] 实施例3
[0080] 糊精的添加量优化实验
[0081] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0082] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0083] 其中，
[0084] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0085] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0086] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0087] 其中，
[0088] 所述发酵培养基的组分及含量为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，糊精0-50g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0089] 4、埃博霉素的分离提取纯化检测：发酵6天后用100目的筛网过滤收集树脂，于三角瓶中，加入25mL甲醇过夜浸提两次。合并后取2mL浸提液，用0.22μm滤器过滤，质谱检测。
[0090] 5、根据吸收峰面积与标准样品浓度关系的曲线计算天然产物的产量，三组结果取平均值并计算误差。
[0091] 经检测，埃博霉素的产生情况如图3所示。结果显示，在发酵培养基中添加不同浓度的糊精，均能增加埃博霉素的产量。结合天然产物产量和成本考虑，糊精25g/L为最优选的添加量。
[0092] 实施例4
[0093] 蔗糖添加后可以改善菌体发酵过程中的自溶现象
[0094] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0095] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0096] 其中，
[0097] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0098] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0099] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0100] 其中，
[0101] 所述发酵培养基的组分及含量为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，蔗糖0或者25g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0102] 上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0103] 4、发酵参数监控：在发酵24、48、72、96、120和144小时取没有添加蔗糖和添加25g/L蔗糖的发酵液，利用冷冻扫描电镜观察菌体形态变化，并检测活菌数、OD600、pH和蔗糖浓度。图4示出了菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天菌体形态观察结果，结果显示，当不添加蔗糖进行发酵时，从发酵第三天，菌体几乎完全自溶；当添加蔗糖后，从发酵第五天才开始出现自溶现象，并直到第六天还有未自溶的菌体。说明在发酵过程中添加蔗糖，可以有效的改善DSM 7029的自溶现象。图5示出了菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天活菌数的变化，结果显示，当不添加蔗糖进行发酵时，从发酵第三天，活菌数下降明显；当添加蔗糖后，直到第六天还有较多活菌。说明在发酵过程中添加蔗糖，可以有效的保持活菌数目。图6示出了菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天OD600的变化，结果显示，当不添加蔗糖进行发酵时，从发酵第二天，菌体
密度开始下降，没有稳定的平台期；当添加蔗糖后，菌体密度在四天内保持稳定，有稳定的平台期。说明在发酵过程中添加蔗糖，可以有效的保持菌体密度。图7菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天pH的变化，结果显示，当不添加蔗糖进行发酵时，从发酵第二天，pH开始上升；当添加蔗糖后，直到第六天还保持在中性。说明在发酵过程中添加蔗糖，可以有效的稳定发酵过程的pH。图8示出了菌株MMR11培养基添加蔗糖发酵埃博霉素6天蔗糖浓度的变化，结果显示，蔗糖在菌体发酵过程中被利用。
[0104] 实施例6
[0105] 利用DSM 7029添加蔗糖培养基发酵滑行菌素
[0106] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0107] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0108] 其中，
[0109] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0110] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0111] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0112] 其中，
[0113] 所述发酵培养基的组分及含量为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，蔗糖0或者25g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0114] 上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0115] 4、滑行菌素的分离提取纯化检测：发酵6天后用100目的筛网过滤收集树脂，于三角瓶中，加入25mL甲醇过夜浸提两次。合并后取2mL浸提液，用0.22μm滤器过滤，在249nm下进行高效液相色谱检测。
[0116] 经检测，滑行菌素的产生情况如图9所示，示出了培养基中添加蔗糖对滑行菌素的产量(峰面积)的影响。与对照培养基相比，培养基中添加蔗糖大幅提高了滑行菌素的产量。
[0117] 实施例7
[0118] 混合碳源的添加量优化实验
[0119] 1、发酵菌株的选择：伯克氏菌目[Polyangium]brachysporum DSM 7029含埃博霉素基因簇菌株MMR11。
[0120] 2、菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30℃培养2天，再接种至液体培养基中，30℃，200rpm培养2天。再将菌液转移至小三角瓶中，30℃，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0121] 其中，
[0122] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。固体培养基加入1.5％的琼脂，121℃湿热灭菌20分钟。
[0123] 所述液体培养基的成分为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，pH 7。121℃湿热灭菌20分钟。
[0124] 3、发酵培养方式：取步骤2制得的菌液25mL接种至发酵培养基中，于30℃，200rpm培养6天。
[0125] 其中，
[0126] 所述发酵培养基的组分及含量为：酪蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，六水氯化镁4.06g/L，甘油5mL，蔗糖5g/L，葡萄糖0-10g/L，乙酸钠50mg/L，丙酸钠100mg/L，甲基丙二酸100mg/L，微量元素溶液1mL/L，安伯莱特XAD-16大孔吸附树脂20mL/L。
[0127] 上述微量元素溶液中，四水氯化锰的含量为7.9g/L、七水硫酸锌的含量为1.5g/L、五水硫酸铜的含量为6.4g/L，七水硫酸亚铁的含量为1.1g/L。
[0128] 4、埃博霉素的分离提取纯化检测：发酵6天后用100目的筛网过滤收集树脂，于三角瓶中，加入25mL甲醇过夜浸提两次。合并后取2mL浸提液，用0.22μm滤器过滤，质谱检测。
[0129] 5、根据吸收峰面积与标准样品浓度关系的曲线计算天然产物的产量，三组结果取平均值并计算误差。
[0130] 经检测，埃博霉素的产生情况如图10所示。结果显示，在含有5g/L蔗糖的发酵培养基
基础上添加5g/L的葡萄糖，产量是不添加葡萄糖的2.87倍。在含有5g/L蔗糖的发酵培养基基础上添加10g/L的葡萄糖，产量是不添加葡萄糖的3.45倍。与单一碳源相比，混合碳源可以明显提升埃博霉素的产量。
[0131] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由
权利要求书所确定的保护范围内。
