本发明涉及棉花，特别是陆地棉（Gossypium    hirsutum    L.）品种的植株再生和转化。

近年来，属于不同分类群之植物的许多不同起源的组织都已经被作为离体组织培养物。也已确定了某些控制这类培养物生长和分化的因素。各类植物激素，和直接或间接，单独或协同起作用的植物生长调节剂之间微妙的相互作用的确立，已经使得对细胞、组织和器官之间可能存在的某些相互关系有了某种程度的认识。然而资料并不完全。

已知有时可将植物细胞培养物无限期地维持在未分化增殖状态。然而，只是在最近才发现可用实验方法诱使组织、器官或整个植物体重分化。Skoog等人在Symp.Soc，Exp，Biol，11：18-130"Chemical    re    gulation    of    growth    and    organ    formation    in    plant    tissues    cu    ltured    in    vitro"一文（列为本文的参考文献）中论证了细胞分裂素与生长素的相对比例可决定烟草木髓组织中器官发生的性质。愈伤组织培养物的再组织或再生包括枝条原基或胚的形成，二者最终均导致植物幼株在体外发育。

器官发生与胚发生的趋向仍取决于所涉及的品种和某些化学性和/或物理性触发因素的存在。

1902年，Haberlandt"Kulturversuche    mit    isolierten    pflan-zenzellen，"Mat.KI.Ksia.Akad，Wiss.Wien    111：62（列为本文的参考文献）假定植物细胞具有产生整个植物的能力并预言总有一天可在细胞培养物中证实这一点。1965年，Reinert"Untersuchungen    uber    die    morphogenese    an    Gewebekulturen，：Ber.dt.Bot.Ges.71：15，and    Steward    et    al，"Growth    and    organized    developmentof    cultured    cells/II.Organization    in    cultures    grown    from    freely    suspended    cells"，Am.J.Bot.45：705-708各自分别进一步证实了离体体细胞胚发生的存在。这两篇文献均列为本文的参考文献。在用实验操纵体细胞胚发生时，据信培养基的两种成分，即生长素和氮源，起着关键性作用。

还证明了体细胞胚发生的过程有两个阶段：第一阶段，在高浓度生长素存在下诱发形成具有胚发生能力的细胞;第二阶段，在无或低浓度生长素存在下胚细胞团块发育成胚。

诱导器官发生或胚发生可产生独特的愈伤组织结构。对若干植物品种的详细研究使得能够做出有关导致枝条，芽或胚发育的发育途径的某些概括。

应用组织培养技术使植物通过器官发生或胚发生而再生仍可能是形态发生方面的基础研究对商业化应用的最重要的贡献。

1971年Beasley报导了在棉花胚珠培养物中愈伤组织的形成（见“In    vitro    culture    of    fertilized    cotton    ovules，"Bioscience    21：906：907，1971，列为本文的参考文献）。此后，Hsu等人观察到因向培养基中加入CPA和赤霉酸刺激了得自胚珠的愈伤组织的生长｛见"Callus    induction    by    [2-chlorethyl]phosphonic（CPA）acid    in    cultured    cotton    ovules，"Physiol.Plant    36：150-153，1976列为本文的参考文献｝。对于Gossypium    hirsutum和G.arboreum，已经建立了来自其它外植体的愈伤组织培养物，例如（a）叶子｛见Davis    et    al.，"In    vitro    culture    of    callus    tissues    and    cell    suspensions    from    okra[Hibiscus    esculentus]and    cotton（Gossypium    hirsutum）"，In    vitro    9：395-398，1974，列为本文的参考文献｝;（b）胚轴（见Schenk    et    al."Medium    and    technique    for    induction    and    growth    of    monocotyledonous    and    dicotyledonous    plant    cellcultures，"Can.J.Bot.50：199-204，1972，列为本文的参考文献）;和（c）子叶（见Rani    et    al."Estabilishment    of    Tissue    Cultures    of    Cotton"，Plant    Sci.Lett.7：163-169，1976，列为本文的参考文献）。

Katterman等人观察到来自G.barbadense子叶的致密的愈伤组织形成根，并且还获得了一例完整的植物再生（见"The    influence    of    a    strong    reducing    agent    upon    initiation    of    callus    from    the    germinating    seedlings    of    Gossypium    barbadense"，Physiol.Plant    40：98-101，1977，列为本文的参考文献）。Smith等人确定了G.arboreum胚轴衍生愈伤组织的建立和继代培养的条件（见Definedco    nditions    for    the    initiation    and    growth    of    cotton    callus    in    vi    tro，Gossypium    arboreum，"In    vitro    13：329-334，1977，列为本文的参考文献）。后来，Price等人规定了来自棉属五个种的愈伤组织的建立和继代培养条件[见"Callus    cultures    of    six    species    of    cotton（Gossypium    L）on    defined    media，"Pl.Sci.Lett.8：115-119，1977，and"Tissue    culture    of    Gossypium    species    and    itspo    tential    incotton    genetics    and    crop    improvement，"Beltwide    co    tton    Produc-tion    Research    Conference    Proc.pp.51-55，1977，of    the    National    Cotton    Council，Memphis，均为本文的参考文献）。

在建立许多植物品种培养物方面的共同问题之一是培养基中外植体的“褐变”。在棉花中，通过用葡萄糖代替蔗糖，和每隔10天将培养物转移到新鲜培养基中克服了多酚的这种沥滤。在添加葡萄糖的培养基中培育3-4次后，褐变完全消失并可将培养物转回到加有蔗糖的培养基中。虽然对于棉属的某些品种来说已经克服了在继代培养期间愈伤组织的诱导，褐变和维持的困难，但对从愈伤组织培养物再生植物的所有尝试都未曾获得成功或包括若干费时的步骤。Davidonis和Hamilton报导了在培养开始两年后，最终形成胚（见"Plant    Regeneration    from    Callus    Tissue    of    Gossypium    hirsutum"，L.Plant    Sci.Lett.32：89-93，1983，列为本文的参考文献）。

尽管许多生长物质，如天然植物激素和合成的生长调节化合物都已被用于组织培养基以在体外使植物再生，但尚未概括出不同物质对植物再生的影响，更不必说细节了。实际上，当将同样的物质施用于不同的植物品种时，可以抑制生长，增进生长，或对植物生长无任何影响。因此，除了某些标准程序以外，要获得使任何新品种植物再生的操作方案必定仍是一个艰巨的任务并且完成植物转化是更加艰巨的任务。

本发明提供一种从自籽苗切下的片段使棉花植株迅速再生的方法。该方法具有高度的可重复性和可靠性并可实现棉花植株的基因转化。

本发明提供从体细胞使棉花植株再生，有时可伴随着植物转化的方法。

将种子灭菌并在暗处长成籽苗。籽苗是外植体（通常是胚轴和子叶）的一个来源。另一个来源是正在发育的果实的未成熟合子胚。将外植体分成几块并在第一愈伤组织生长培养基（含有葡萄糖）中培养一段时间使培养基中的外植体发育成愈伤组织，愈伤组织可抑制酚的分泌和刺激外植体细胞分裂和增殖。愈伤组织在经过酚的分泌阶段之后，被转移到新鲜的愈伤组织生长培养基（含有蔗糖）中，使之发育为胚发生愈伤组织。然后可将胚继代培养以产生更多的胚发生愈伤组织或将胚转移到另一种生长培养基（植物萌发培养基）中并培养一段时间以发育成植物幼株，经过另一段生长期，将植物幼株转移到温室中，然后移植到田间长成成熟的植物，从成熟的植物上可收获种子。

也可悬浮培养胚。在该程序中，在生长期以后，将含有胚发生块（其大小约为600微米以上，最好约为800微米以上）的胚分离出来并用来产生植物。将较小的愈伤组织再循环到愈伤组织生长培养基中使之长成形成植物的愈伤组织，或作为胚的来源。

转化可发生在外植体，愈伤组织或悬浮发育阶段。转化包括使外植体，愈伤组织和/或胚发生愈伤组织受到土壤杆菌载体的作用，土壤杆菌载体含有异源于棉花的可表达的基因序列，作用时间应足以使基因转移到细胞中，然后用一种对土壤杆菌有毒性的抗生素杀灭剩余的土壤杆菌。然后选择转化细胞和/或胚发生愈伤组织用于发育成转化植物幼株。在悬浮培养时，转化和/或选择可在从细胞和不能成胚的未成熟愈伤组织分离胚发生愈伤组织之前或之后发生。

可以获得具有独特的表型特征的植物，并提供新的对通常可抑制植物细胞生长的抗生素具有抗性的棉花植株;对除草剂，真菌病原体具有增强的抗性或耐受性的棉花植株和具有较高的产量和更好的纤维质量的棉花植株。

图1图解显示了通过组织培养技术使种子发育成棉花植株的优选步骤，同时显示了移植生长的转化区。

图2是不同发育阶段的具有体细胞胚（12）的棉花胚发生愈伤组织（10），包括叶（14）和根（16）的照片。

图3是分离的形成图2所示的胚发生愈伤组织培养物的晚球形期棉花体细胞胚的照片。

图4（参照图2）是在胚萌发培养基上发育的棉花胚和幼小植物（18）的照片。

图5是棉花悬浮培养物中胚细胞小团块的照片。

图6是悬浮培养物中球形期胚的照片。

图7显示了得自悬浮培养物的萌发胚，显示了形成的叶（14）和跟（16）。

图8显示了在胚萌发培养基上生长的小棉花植株的发育情况。

图9-15显示了棉花的基因转化，图9显示了含有卡那霉素抗性基因的转化棉花细胞集落（20）的发育情况。

图10显示了在添加抗生素的培养基上由所选的抗生素抗性细胞（图9）发育成的体细胞胚。

图11显示了含有对除草剂草甘膦具有抗性的基因的转化体细胞胚的萌发胚。

图12显示了由图11的胚发育成的小棉花植株。

图13显示了发育了叶（14）和根（16）的转化为对鳞翅目昆虫具有抗性的萌发体细胞胚。

图14显示了由图13的胚发育成的小植株。

图15显示了由具有卡那霉素抗性的转化胚发育成的Siokra种小植株。

图16表明含有Bt前毒素基因5′末端的质粒mp19/bt的构建。

图17表明含有与Bt前毒素编码序列5′末端融合的Ca    MV基因VI启动子的质粒mp19/bt    ca/del的构建。

图18表明具有与Ca    MV转录终止信号融合的前毒素3′编码区的质粒p702/bt的构建。

图19表明含有侧接有Ca    MV启动子和终止区序列的完整前毒素编码序列的质粒pBR322/bt    14的构建。

图20表明pRK252/Tn903/Bgl    II的构建。

图21表明pCIB5的构建。

图22和23表明pCIB4的构建。

图24表明pCIB2的构建。

图25表明pCIB10（含有T-DNA两臂和植物选择基因的广宿主范围质粒）的构建。

图26表明pCIB10/19    sbt的构建。

图27表明pCIB710的构建。

图28表明pCIB10/710的构建。

图29表明pCIB    10/35    sbt的构建。

图30表明pCIB    10/35    sbt（Kpn    I）的构建。

图31表明pCIB10/35    sbt（Bcl    I）的构建。

图32表明pCIB10/35    sbt（607）的构建。

图33表明载体DEI    PEP10的构建。

图34是由种植在轮枝孢侵染田中的棉花再生体组成的试验田的照片。

图35是图34所示的试验田中的再生S    J4植物子代的照片。箭头表明对轮枝孢真菌的耐受性增强的体细胞克隆变种。

本发明涉及用组织培养的方法由体细胞使棉花植株，特别是陆地棉（Gossypium    hirsutum）属的植株再生，然后在田间繁殖。还可以将细胞转化使之含有外源遗传信息。

各种适用于本发明的生长培养基如下：种子萌发生长培养基改良怀德氏储备溶液的组成（Phytomorphology    11：109-127，1961，列为本文的参考文献）成分    每1000ml的浓度    注释MgSO4·7H2O 3.6g 溶解并使终体积达1000ml（怀Na2SO42.0g 德氏A储备溶液）。1升培养NaH2PO4·H2O 1.65g 基用100ml。

Ca（NO3）2·4H2O 2.6g 溶解并使终体积达1000ml（怀KNO3800mg 德氏B储备溶液）。1升培养KCl    650mg    基用100ml。

Na2MoO4·4H2O 2.5mg 溶解并使终体积达100ml（怀

CoCl2·6H2O 2.5mg 德氏C储备溶液）。1升培养MnSO4·H2O 300mg 基用1.0ml。

ZnSO4·7H2O 50mgCuSO4·5H2O 2.5mgH3BO350mgFe    EDTA    1升MSFe    EDTA用10ml有机物    1升MS有机物用10ml。

愈伤组织生长/维持培养基MURASHIGE    &    SKOOG（MS）储备溶液的组成（Physiol.Plant    15：473-497，1962，列为本文的参考文献）成分    每1000ml储液    注释中的浓度NH4NO341.26g 溶解并使终体积达1000ml。

KNO347.50g 每升培养基用40ml。

CaCl2·2H2O 11.00gMgSO4·7H2O 9.25gKH2PO44.25gKI    83mg    溶解并使终体积达1000ml。

H3BO3620mg （MS-微量物）Mn SO4·H2O 1690mg 每升培养基用10ml。

Zn SO4·7H2O 860mgNa2MoO4·2H2O 25mgCu SO4·5H2O 2.5mgCo Cl2·6H2O 2.5mg烟酸    50mg    溶解并使终体积达1000ml。

维生素B盐酸盐    50mg    （MS-有机物）冷冻10ml等盐酸硫胺素    10mg    分试样。每升培养基用10ml。

Fe·EDTA 2.78g 将2.78g Fe SO4·7H2O溶Fe SO4·7H2O 3.73g 于大约200ml去离子水中。在Na2EDTA·2H2O 另一烧杯中，将3.73g Na2EDTA·2H2O（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）溶于200m去离子水中。在电炉上将Na2EDTA溶液加热大约10分钟。

在连续搅拌下，将Fe SO4溶液加入到Na2EDTA溶液中。

将溶液冷却至室温并使终体积达1000ml（MSEDTA）。

用箔盖上瓶口并贮存于冰箱中。

1升培养基用10ml。

盐酸硫胺素    50.00mg    溶解并使终体积达500ml。

（MS-硫胺素）。1升培养基用4.0ml。依需要而定。

肌醇    10.00g    溶解并使终体积达1000ml。

甘氨酸    0.20g    （MS-甘氨酸/肌醇）。

每升培养基用10ml。

植物萌发培养基BEASLEY    &    TING氏储备溶液（Am.J.Bot.60：130-139，1973，列为本文的参考文献）成分    每1000ml中的浓度    注释KH2PO42.72g 溶解并使终体积达100mlH3BO361.83mg （B & T-A储液）。

Na2MoO4·2H2O 2.42mg 每升培养基用10ml。

CaCl2·2H2O 4.41g 溶解并使终体积达100ml。

KI    8.3mg    （B    &    T-B储液）。

CoCl2·6H2O 0.24mg 每升培养基用10ml。

MgSO4·7H2O 4.93g 溶解并使终体积达100ml。

MnSO4·H2O 169.02mg （B & T-C储液）。

Zn SO4·7H2O 86.27mg 每升培养基用10ml。

Cu SO4·5H2O 0.25mgKNO325.275g 溶解并使终体积达200ml（B    &    T-D储液）。

每升培养基用40ml。

烟酸    4.92mg    溶解并使终体积达100ml。

维生素B盐酸盐    8.22mg    （B    &    T-有机物）。

盐酸硫胺素    13.49mg    每升培养基用10ml。

Fe    EDTA    每升MSFe    EDTA用10ml肌醇    每升培养基用100mg。

NH4NO3（15μM） 每升培养基用1200.6mg。

对于上述任一种溶液，都可采用下列程序制备1升培养基。以200ml去离子水为基础，加入各种储备溶液至规定体积（1升）。例如，如果在最终培养基中使用10ml储备溶液，则将10ml储备溶液加到200ml蒸馏水中。为了保证盐留在溶液中，一般按上述配方所示的顺序加入储备溶液。充分混匀后，补加去离子水到混合液中使之达到所需的500ml，并将混合液的pH值调至大约5.8到6.0。使终体积达1，000ml并通常加入组织培养基琼脂，或其等同物至大约0.8%（重量）。这是为了减缓溶液流动而使之略呈固态。然后在15-21磅/英寸的压力下将混合物高压灭菌5-20分钟，以杀死任何污染物，贴上适当的标签并作为无菌培养基贮存起来。

简言之，将棉花种子灭菌并在适宜的种子萌发培养基（如基础琼脂培养基）上暗处萌发一段时间以产生籽苗。正常生长期大约达4周，典型的是7-14天。

从籽苗上切下外植体片段，外植体最好来自胚轴或子叶。另外，人们同样可以用得自温室或田间生长的棉花植株的正在发育的果实的未成熟胚作为外植体。将外植体片段在适宜的第一愈伤组织生长培养基上培养，较好的培养基是含有葡萄糖的完全Murashige    &    Skoog（MS）营养培养基，通过在大约25-35℃，大约16小时光照和大约8小时无光的光/暗交替条件下使外植体生长。在培养步骤中，应随着营养物的消耗和持续培养大约3-4周后定期更换培养基，或到形成未分化的愈伤组织为止。将愈伤组织转移到第二愈伤组织生长培养基中，最好是添加有萘乙酸（NAA）和以蔗糖作为碳源的MS培养基并培养3-4个月，产生胚。

然后将胚维持在第二愈伤组织生长培养基中备用或将胚转移到种子萌发培养基（如Beasley    &    Ting氏培养基，最好含有酪蛋白水解物和铵源）中培养2-3周，长出植物幼株。

在高湿度条件下将植物幼株移栽到土壤中，然后移植到温室中的大盆里，最后转移到田间使之发育成熟。

本文简述的方法已被成功地用于通过组织培养和悬浮培养诱导陆地棉（Gossypium    hirsutum）棉花品种体细胞胚形成，最后从包括S    J2，S    J4，S    J5，B1644，B1810，B2724，GC510和Cl的陆地棉Acala变种和非Acala“采摘”Siokra及“剥离”变种FC2017胚轴和子叶衍生的愈伤组织培养物得到成熟植物。这些培养物已被转化为具有新特性的正常植物。

具体地讲，首先要将棉花种子灭菌。可通过将种子浸泡在95%乙醇中2-3分钟，在无菌水中漂洗一次或多次，然后将种子放在15%次氯酸钠溶液中泡15-20分钟，并用无菌水冲词卫词实泵鹁?然后将经灭菌的种子转移到第一培养基（称为种子萌发培养基）中。种子萌发培养基是一种盐含量正常的培养基。适宜的萌发培养基为基础琼脂培养基，包括怀德氏培养基或半强度MS培养基（成分的强度为1/2）。一般在暗处，经过大约12-14天时间萌发。

最好从萌发的种子上切下胚轴和/或子叶，分成几块或切成片段并在第一愈伤组织生长培养基（添加有生长物质的MS培养基）上培养。目前较好的培养基为添加有大约0.4mg/l盐酸硫胺素，大约30g/l葡萄糖，大约2mg/l萘乙酸，大约1mg/l激动素（普通生长调节剂），和大约100mg/l肌醇和琼脂的MS培养基。盐酸硫胺素的浓度范围一般为0.1～大约0.5mg/l，葡萄糖大约为20-30g/l，萘乙酸大约为1-10mg/l，激动素大约为1-2mg/l，肌醇大约为50～100mg/l。

在大约25-35℃，大约30℃较好，大约16小时光照和大约8小时无光的光/暗交替条件下维持培养物。光强度为大约2000-4000勒较好，大约3000-4000勒更好。

每隔3-4周将形成的愈伤组织定期继代培养并转移到新鲜的第一愈伤组织生长培养基中。在培养外植体的过程中，培养基变暗表明从外植体中分泌出酚类化合物，在这种情况下，应不断更换培养基。通过每10天更换一次培养基已避免了变暗现象的发生。一般在更换3-5次培养基之后，酚的分泌消失。此时，可用含有蔗糖的新鲜愈伤组织生长培养基代替第一愈伤组织生长培养基或向第一愈伤组织生长培养基中补加蔗糖作为碳源。

培养3-4周后，在外植体的切面上发育出活性愈伤组织。然后将该愈伤组织转移到新鲜的第二愈伤组织生长维持培养基中，该培养基最好是含有大约1-10mg/l（大约1-5mg/l较好）NAA的MS培养基。细胞分裂素的使用浓度为0到大约1g/l。愈伤组织生长培养基的特征在于它是一种含盐量比种子萌发培养基高10倍之多的高盐含量培养基。第一和第二愈伤组织生长培养基的主要差别在于碳源。在酚分泌期使用葡萄糖。当停止分泌时使用蔗糖。愈伤组织生长培养基的其它成分可保持不变，也可改变。

将愈伤组织以固定的时间间隔转移到新鲜的愈伤组织生长培养基中，一般大约在转移5-7次后或直到在部分愈伤组织中显见花色素苷色素沉着为止，发育出淡黄-白色胚发生愈伤组织。

然后有选择地继代培养胚发生愈伤组织并通过正常传代来维持。胚发生愈伤组织含有不同发育期的体细胞胚。有些可能已达到能成长为小植株的发育点。但大多数需进一步发育，有些可能提前萌发。另一些可作为胚的来源待以后使用。

图2表明含有不同大小的体细胞胚12的Acala棉花愈伤组织10的这一发育期，其中有些胚已长出叶14和根16。图3表明在晚球形期分离出的体细胞胚。

图4表明通过将体细胞胚转移到胚萌发培养基（在此称为第三生长培养基）中可实现进一步的发育，胚萌发培养基富含氮，通常为铵或其等同物的形式。适宜的培养基包括Beasley    &    Ting氏培养基，最好添加约为500mg/l的酪蛋白水解物。

从体细胞胚萌发，一般2-3周内就可形成长有6片叶子并具有良好根系的发育完全的植物幼株18。

在这一阶段，将小植物丛移栽到土壤中并在高湿度条件下于标准温箱中生长。温度一般维持在大约25-30℃（见图7）经过一段时间的生长之后，将小植物转移到温室中的大盆中，以后再移植到田间并发育成熟。所有再生植物无论是在温室中还是在野外条件下生长最好都是自花传粉，收集种子，然后使种子萌发并将4-5周龄的籽苗转移到田间进行子代行栽试验和其它标准植物育种试验。采用上述步骤，在大约6-8个月内，约35%的外植体产生的棉花植株成活。

用悬浮培养法使棉花胚细胞增殖：使生长的胚发生愈伤组织发育成植物的另一种方法是：可将愈伤组织切成小块并采用悬浮培养技术使之进一步发育。

在这个程序中，悬浮液的浓度通常为8ml愈伤组织生长培养基（如第二愈伤组织生长培养基，即添加NAA的MS培养基）中含有大约750～1000mg愈伤组织碎块，使愈伤组织碎块在悬浮液中生长。在一个优选实施方案中，将愈伤组织悬浮液置于T-管中并在约16小时光和约8小时暗的条件下将T-管放在辊式转鼓上以大约1.5转/分的速度旋转。生长大约3～4周。

大约每3～4周后，将悬浮液过滤除去胚发生愈伤组织的大细胞团块（见图5）并在图6所示的晚球形期进行分离。将滤液放回到营养培养基中生长3～4周。反复重复这一步骤，同时每隔大约3～4周收集一次大细胞团块，在此期间，用新鲜的愈伤组织生长培养基全部或部分取代原培养基。最好将大约4体积或更多的新鲜培养基加到约1体积的残余悬浮液中。目前较好的滤器筛目大小约为600微米以上，800微米以上更好，因已观察到粒度小于600微米的细胞团块不能发育成植物，而大于600微米（大于800微米更好）的细胞团块已充分分化为胚细胞并能发育成活植物。

也可通过将胚发生愈伤组织转移到含有液体胚生长培养基（约20ml    MS，NAA浓度为2.0mg/l）的培养瓶（如De    Long瓶或锥形瓶）中开始悬浮培养。将培养瓶置于转动摇床上以大约100～110冲程/分钟的速度振摇。3～4周后，该悬浮液适用于如上所述的过滤以除去大细胞团块进行植物发育。

一般说来，传代3或4次之后，将“T”管或De    Long或锥形瓶中的细胞悬液放入含有NAA（2.0mg/l）的琼脂固化的MS培养基或含有酪蛋白水解物（500mg/l）和氮源的Beasley    &    Ting氏培养基中。3～4周内，明显可见具有发育胚的胚发生愈伤组织。同样，较大的细胞团块置于上述培养基时也发生具有发育胚的胚发生块。

在两种悬浮生长法中，都用MS培养基促进和/或供养胚，而用萌发培养基使植物迅速发育。

需要的话，可将籽苗外植体转化。在这个步骤中，可使用灭菌种子的子叶和/或胚轴片段。最好用子叶。

将这些片段放在含有土壤杆菌载体的培养基中一段足够时间以使载体将基因转移到外植体细胞中，该载体含有一个例如对抗生素（如卡那霉素）具抗性的密码（遗传标志物）。一般接触时间为1分钟到24小时并可伴随着间歇搅拌或轻度搅拌。然后取出外植体并放在琼脂固化的愈伤组织生长培养基（如添加有NAA（2mg/l）的MS培养基）上，在25～35℃，最好30℃，16小时光/8小时暗条件下温育大约15～200小时。

温育后，将外植体转移到添加抗生素头孢噻肟（浓度最好为200mg/l）的同样培养基中。加入头孢噻肟的目的是防止任何残余土壤杆菌繁殖和植物组织过度生长。另外，可用添加有NAA（2mg/l）的MS培养基冲洗外植体并于冲洗前再温育4～28天，然后温育含有头孢噻肟的同样培养基。在新鲜培养基上培养4～5周末，将发育的愈伤组织，即初级愈伤组织与初级外植体组织的残余物分离并转移到含有NAA（2mg/l），头孢噻肟（200mg/l）和抗生素（如硫酸卡那霉素（50mg/l）的MS培养基中。根据初级愈伤组织在抗生素（卡那霉素）存在时的生长能力鉴定转化的初级愈伤组织，挑选出转化的愈伤组织，使胚发育，萌发，经过上述步骤获得植物。

实现细胞悬液的转化也是可行的。在7～14天（通常为7～10天）正常继代培养生长周期之后，使细胞沉降，移出上清液。可将残余的浓缩悬浮细胞在4000xg下离心5分钟，弃去过量的培养基。将浓缩悬浮培养物重新悬浮于8ml含有土壤杆菌的同样培养基中。将悬液转移至“T”管中并适当搅拌进行温育。

在温育大约2～24小时，最好3～5小时以使细菌附着和DNA转移之后，取出悬浮液使细胞沉降。弃去含有细菌的上清液并用新鲜培养基洗涤细胞。需要的话，可将悬浮液离心约5分钟并除去上清液。在任一种情况下，都将细胞重新悬浮于同样培养基中并转移到“T”管或培养瓶中，重新开始悬浮继代培养。其目的是减少留在细胞悬液中的未附着土壤杆菌载体的量。

大约15～200小时，一般15～72小时，最好18～20小时后，将悬浮液过滤除去大细胞团块并用新鲜液体培养基洗涤，使细胞沉降。将悬浮物重新悬浮于含有头孢噻肟（200mg/l）的新鲜液体培养基中，然后置于培养皿中的固化培养基上。

另外，可将悬浮物重新悬浮于含有头孢噻肟的新鲜培养基中并在置于培养皿中的固化培养基之前再生长4～28天。细胞浓度为1体积悬浮细胞加3体积含有头孢噻肟的培养基。培养基中卡那霉素含量为10～300mg/l，大约20～200mg/l较好，大约40～80mg/l更好，用来选择可表达新霉素磷酸转移酶（NPT）基因的转化细胞。在选择性浓度卡那霉素中增殖的细胞和胚如上所述进一步生长为成熟的体细胞胚，后者按本文所述方法能萌发和再生为完整的植物。

采用上述步骤并参照图9，可以看出变异的细胞集落是转化的结果。存在对卡那霉素具有抗性的棉花细胞20。参照图10，可以看出转化的愈伤组织在抗生素MS培养基中发育成体细胞胚。图11表明经转化的体细胞胚建立了对卡那霉素的抗性和对除草剂草甘膦的抗性。图12表明从图11的胚长成的植物。图13表明生长在MS培养基上的细胞转化后对鳞翅目昆虫具有抗性。图14表明将图13的细胞转移到Beasley    &    Ting氏培养基中。图15表明图14的植物幼株进一步发育成更加成熟的小植物。

棉花再生实例1由子叶外植体开始的植物再生陆地棉Acala棉品种S    J2的种子用95%乙醇接触，灭菌3分钟，然后用无菌水冲洗两次，并用15%次氯酸钠浸泡15分钟，再用无菌水冲洗。灭菌后的种子在暗室中于基础琼脂培养基上萌发约14天，产生籽芽。将芽的子叶切成2～4mm的片段，将其在无菌条件下移到愈伤组织诱导培养基中，该培养基由Murashige和Skoog（MS）主盐和副盐组成，附加有0.4mg/l盐酸硫胺素、30g/l葡萄糖、2.0mg/l萘乙酸（NAA）、1mg/l激动素、100mg/l间-肌醇和琼脂（0.8%）。在Percival恒温箱中采用光强度为约2000～4000勒克司的莹光灯（冷日光）于约30℃下进行温育，光照下温育16小时，无光照（黑暗）下温育8小时。

在3至4周之内，培养的组织片段上形成愈伤组织，且由白色变为灰绿色。愈伤组织每3至4周在含有100mg/l间-肌醇、20g/l蔗糖、2mg/l萘乙酸和琼脂的MS培养基上进行继代培养。在将组织外植体置于愈伤组织诱导培养基上4至6个月之后，形成体细胞胚。每3至4周在新鲜愈伤组织培养基上继代培养，维持愈伤组织和体细胞胚的成长。

组织片段上形成的体细胞胚或是移到新鲜愈伤组织生长培养基上，或是移到Beasley和Ting培养基（胚萌发培养基）上。

由体细胞胚形成的体细胞小植物移到Beasley和Ting培养基，该培养基含有1200mg/l硝酸铵和500mg/l酪蛋白水解物作为有机氮源。培养基用固化剂（Gelrite）固化，将体细胞小植物置于Magenta箱中。

体细胞胚在大约三个月内发展成为体细胞小植物。体细胞小植物生根，具有6～8片叶，约3～4英寸高，将其移到土壤中，于高湿度的保温箱中保持3～4周，然后移至温室。硬化之后，也可将植物移至田间。

实例2重复实例1的步骤，但采用一半强度的MS培养基，即所有培养基组分的浓度减至实例1所述的一半。取得了基本上相同的结果。

实例3重复实例1和2的步骤，不同的是外植体是胚轴片断。取得了相同的结果。

实例4重复实例1和2的步骤，不同的是外植体是未成熟的合子胚。取得了基本上相同的结果。

实例5使用Acala棉花变种SJ4、SJ5、SJ2C-1、GC510、B1644、B2724、B1810、采摘变种Siokra和剥离变种FC2017重复实例1和2的程序，都成功地进行了再生。

实例6将实例1的步骤重复至得到能形成体细胞胚的愈伤组织。将约750～1000mg成长中的胚发生愈伤组织悬浮于T-管中以8ml为单位的液体悬浮培养基中，培养基包括MS主盐和副盐，补加有0.4mg/l盐酸硫胺素、20g/l蔗糖、100mg/l肌醇和萘乙酸（2mg/l），然后将其置于以1.5转/分辊式转鼓中，以16小时光照、8小时无光照进行培养。用莹光灯（冷日光）提供光强度为约2000?500勒克司的光照。

4周以后，用840μm的尼龙网过滤悬浮液，除去较大的细胞团块。使小于840μm的部分沉淀，用20～25ml新鲜悬浮培养基洗涤一次。将该悬浮液移至T-管（每管2ml），用6ml新鲜悬浮培养基稀释。以10～12天的间隔重复上述步骤保持培养物。即，将悬浮液过滤，仅将含有小于840μm细胞团块的部分移入新鲜悬浮培养基中。在所有情况下，含有大于840μm细胞团块的部分都被置于愈伤组织生长培养基以得到成熟的体细胞胚。

将愈伤组织生长培养基上形成的体细胞胚移至胚萌发培养基并按实例1的步骤萌发、长成小苗，然后成为田间生长植物。

实例7重复实例6的步骤，不同的是将750～1000mg胚发生愈伤组织移到含有15～20mlMS液体培养基（含有2mg/l    NAA）的De    Long烧瓶中，形成悬浮培养物。将含有培养物的烧瓶置于旋转摇床以100～110冲程/分振摇。3周以后，用840μm尼龙网过滤悬浮液，除掉较大的细胞团块用于植物生长，如实例4所述。使小于840μm的悬浮物沉淀，用MS液体培养基洗涤并重新悬浮于2～5ml    MS液体培养基中。将悬浮液移至含有1～2ml悬浮液和15ml新鲜MS液体基的De    Long烧瓶中进行继代培养。以7至10天的间隔重复这一步骤保持培养。每次继代培养后，仅将小于840μm悬浮液进行继代培养，将大的团块（840μm或更大）用作植物生长。

实例8采用实例6和7的悬浮培养步骤进行3或4次继代培养后，将T-管和De    Long烧瓶中的1.5～2.0ml细胞悬浮液置于用琼脂固化的含有2mg/l    NAA的MS培养基和含有500mg/l酪蛋白水解物的Beasley和Ting培养基上。3至4周内，可见到带有发育中胚的胚发生愈伤组织。同样，840μm或较大的团块置于愈伤组织生长培养基上，生成带有发育中胚的胚发生团块，最终长成植物。

棉化转化实例9用土壤杆菌LBA4434进行转化以形成肿瘤表型在T-管中继代培养Acala棉悬浮培养物3～4个月，7～10天更换一次培养基（MS培养基，含有2mg/l    NAA）。每次更换培养基后，可使细胞沉淀并收集用于转化。将上清液用吸管移出，细胞用土壤杆菌株LBA4434菌株转化。土壤杆菌LBA4434在菌株Hoekema，A等人的“Nature”303：179-180（1983）中有述（这里引用该文献作参考），它含有一个Ti质粒衍生的二位制植物转化体系。在该二位制体系中，一个质粒含有Ti-质粒的T-DNA，第二个质粒含有Ti-质粒的vir-区。两个质粒配合以完成植物转化。在LBA4434菌株中，T-DNA质粒（pAL1050）含有pTi Ach5的TL，这是一种章鱼碱Ti-质粒;vir-质粒（pAL4404）含有完整的pTi Ach5致毒区（Ooms，G.et al.Plasmid 7：15-29，1982，引入本文作参考）。LBA4434菌株可由荷兰Leiden大学生化系Robert Schilperoort博士提供。

用于转化的土壤杆菌菌株自甘油储备培养中取出，接种到少量过夜培养物中，由此第二天再接种50ml培养物。土壤杆菌在YEB培养基（于水中并用Na OH调节pH至7.2，含有5g牛肉膏/1、1g酵母膏/1、5g胨/1、5g蔗糖）上生长。高压灭菌后，加入1ml 2M Mg Cl2，此后，如有必要杀死其它菌株，再加入抗菌素。记录50ml过夜培养物在600nm的吸光值，将培养物离心，形成的小团粒重新悬浮于植物细胞生长培养基（MS培养基+2mg/lNAA），使其最终600nm的吸光值为0.5。

在除去上清液之后，将8ml该土壤杆菌LBA4434的细菌悬浮液加到每一含有悬浮植物细胞的T-管。搅拌含有植物和细菌细胞的T-管使细胞重新悬浮，回置于转鼓上3小时，使土壤杆菌攻击植物细胞。然后使细胞沉淀，除去存留的上清液。向T-管中加入等分的新鲜生长培养基，使悬浮液在转鼓上在残留的土壤杆菌存在下培养18～20小时。此后，再使细胞沉淀，除去上清液，用含有头孢噻肟（200μg/ml）的生长培养基溶液洗涤两次。然后，每一T-管中的细胞再悬浮于含有头孢噻肟（200μg/ml）的生长培养基，将悬浮液以1ml等分涂敷于陪氏培养皿上。

在未加入任何植物激素的生长培养基上，感染的细胞生长⒔⒆橹邮盏絋-DNA中野生型植物激素基因。细胞发育成肿瘤，进一步表明了培养物的转化。

实例10棉花转化形成抗卡那霉素非肿瘤表型使用含有含T-DNA二位制载体pCIB10（Rothstein，S.J.et    al.Gene    53：153-161，1987，引入本文作参考）以及pAL4404vir-质粒的土壤杆菌转化实例9所得的悬浮培养物。pCIB10的T-DNA含有一嵌合基因，该基因由来源于nopaline合成酶的启动子、来源于Tn5的编码新酶素磷酸转移酶的编码区以及来源于nopaline合成酶的终止区组成。含有pCIB10的土壤杆菌在含有卡那霉素（50μg/ml）的YEB培养基上生长。转化以与实例9相同的方式完成，不同的是将1ml等分细胞和土壤杆菌悬浮液立即涂敷于含有卡那霉素（50μg/ml）或G418（25μ/ml）的选择性培养基上。转化的植物组织中nos/neo/nos嵌合基因的表达使得这种组织在两种抗生素存在下具有选择性。转化的组织存在2～4周，在选择皿上变为明显。未感染的组织以及增加的对比组织未显示出生长，变棕色且死去。转化的组织在卡那霉素和G418两者的存在下生长良好。

此时，将生长良好的组织碎片用新鲜选择性培养基继代培养。在这些组织碎片上形成了体细胞胚，将其移植于新鲜非选择性养基。当胚开始分化和萌芽时，即在其开始形成根和生出2～3片叶时，将其移到含有实例1所述的生长培养基的Magenta箱中。使其继续生长至成为具有6～8片叶的小植物，此时将其从琼脂培养基中移出。

将小植物移栽于盆土，用大烧杯罩着以保持湿度，放入Percival保温箱中4～8周。然后将罩杯移开，将植物移植于温室。植物在温室中生长、开花并结籽。

实例11重复实例10的步骤，不同的是采用的转化土壤杆菌含有T-DNA载体DEI    PEP10以及pAL4404    vir-质粒。如图33所示，DEIPEP10采用两个来自根瘤土壤杆菌（C-58菌株）、用BamHI再分以在植物基因组中整合的T-DNA    Pst    Ⅰ酶解右臂序列，一个过客玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Pepcase基因）和一个能在植物中表达且提供对抗生素卡那霉素和G418有抗性的嵌合基因（NOS｜NPT｜TK）。这一嵌合基因采用nopaline合成酶启动子，编码区来自Tn5的新霉素磷酸转移酶Ⅱ编码区，来自单纯性疱疹病毒胸苷激酶基因的终止区。转化以后，胚发生愈伤组织和胚在卡那霉素（50mg/l）上选择获得。由在此程度（50mg/l）的卡那霉素上的对比组得到无抗性的愈伤组织。

实例12转化棉花悬浮培养细胞为耐草甘膦表型重复实例10的步骤，不同的是使用的转化土壤杆菌含有T-DNA载体pPMG85/587（Fillatti，J.et    al.，Mol    Gen.Genet.206：192-199，1987，引入本文作参考）以及pAL4404    vir质粒。质粒pPMG85/587携带三个能在植物中表达的嵌合基因。两个基因密码为对抗生素卡那霉鼠伤寒沙门氏菌和G418有抗性的新霉素磷酸转移酶（NPT）。第三个嵌合基因含有S.typhimurium突变aro    A基因，提供了对除草剂草甘膦的耐受性（Comai，et    al.，Science    221：370-371，1983，引入本文作参考）。含有pPMG85/587的土壤杆菌在含有卡那霉素（100μg/l）的培养基上生长。转化以与实例10所述的方式完成，不同的是使悬浮物生长28天，此时将1ml等分涂敷于含有选择性抗生素的培养基。NPT嵌合基因在转化植物组织中的表达使得这种组织对两种抗生素有选择性。在此种情形下，选择性抗生素是卡那霉素（50μg/l）。

在2～4周中，转化组织在选择皿上变为明显。然后将植物组织、单胚和愈伤组织置于含有除草剂草甘膦1mM的生长培养基上，转化组织继续良好生长。对愈伤组织和胚的蛋白提取和分析证实存在草甘膦耐性基因产物。

实例13转化棉花悬浮培养细胞为潮霉素抗性非肿瘤表型重复实例10的步骤，不同的是使用含有T-DNA二位制载体pCIB715（Rothstein，S.J.et    al.Gene    53：153-161，1987）以及vir-质粒的转化土壤杆菌。pCIB715的T-DNA含有由花菜嵌合性病毒（Ca    MV）35S转录的启动子和终止区组成的嵌合基因（Odell    et    al，Nature    313：810-812，1985，引入本文作参考）和潮霉素B磷酸转移酶编码序列（Gritz，L.and    J.Davies，Gene    25：179～188，引入本文作参考）。含有pCIB715的土壤杆菌在含有卡那霉素（50μg/l的培养基上生长。

转化仍按实例10所述方式进行，不同之处在于立即将1ml等分涂敷于含有50μg/ml潮霉素作为选择抗生素的培养基上。转化植物组织中嵌合潮霉素基因的表达使含有潮霉素培养基上的这种组织具有选择性。转化的组织以实例8所述的方式在选择性生长培养基上生长，证实转化已经发生。

实例14转化棉花悬浮培养细胞使之具有鳞翘目害虫抗性重复实例10的步骤，其不同之处如下所述。使用了不同的土壤杆菌。此外，植物组织在抗生素上选择出转化材料后，如本文所述，要继续选择BT基因表达。

使用的土壤杆菌含有T-DNA载体pCIB10（Rothstein    et    al，，Gene    53：153-161（1987），引入本文作参考），其中插入了下述的嵌合苏云金芽孢杆菌内毒素基因（“BT基因”）：

为制备土壤杆菌载体，将Ca MV基因Ⅵ启动子和前毒素编码序列融合。先构建了噬菌体载体mp19（Yanish-Perron et al.，1985）衍生物。步骤如图16、17所示。首先，将含有前毒素编码区5′端大约155个核苷酸和编码序列中相邻的大约1346个核苷酸的DNA片段插到mp19。噬菌体mp19 ds rf（双链复制型）DNA用限制性核酸内切酶Sac Ⅰ和Sma Ⅰ酶解，在经低凝胶温度琼脂糖电泳后，大约7.2-kbp载体片段用标准步骤纯化。由瑞士Basle，CIBA-Geigy公司J.Nueesch博士得到了含有大约10kbp（千个碱基对）苏云金芽孢杆菌DNA的质粒pKU25/4，包括前毒素基因。质粒pKU25/4中的前毒素基因的核苷酸序列示于下面式1。质粒pKU25/4DNA用核酸内切酶Hpa Ⅰ和Sac Ⅰ酶解，纯化含有式1核苷酸2～1505的1503bp片段。这一片段含有大约155bp细菌启动子序列和大约1346bp前毒素编码序列开始部分。然后将大约100ng每一片段混合，加入T4DNA连接酶，于15℃过夜培养。所得混合物转入大肠杆菌HB101菌株与指示菌大肠杆菌JM101混合，涂于平皿上。使用一种噬菌体（mp/19bt）继续下面的构建。

然后，将含有Ca    MV基因Ⅵ启动子和基因Ⅵ的某些编码序列的DNA片段插入mp19/bt。噬菌体mp19/bt    rf    DNA用BamH    Ⅰ酶解，用DNA多聚酶大片段处理，产生平末端，并用核酸内切酶Pst    Ⅰ再切割。较大的载体片段用前述方式电泳进行纯化。Paszkowski等人在EMBO    J.3，2717-2722（1984）中描述了质粒pABD1，这里引用该文作参考。质粒pABD1    DNA用Pst    Ⅰ和Hind    Ⅲ酶解。纯化大约465bp长、含有Ca    MV基因Ⅵ启动子和大约75bp基因Ⅵ编码序列的片段。两个片段用前述的方法处理。所得的一个重组的噬菌体mp19/btca含有Ca    MV基因Ⅵ启动子序列，部分基因Ⅵ编码序列，大约155bp前毒素编码序列上游苏云金芽孢杆菌DNA和大约1346bp前毒素编码序列。为使Ca    MV启动子序列准确地融合到前毒素编码序列，通过对mp19/btca    DNA的寡核苷酸的诱变除去间隔DNA。采用Applied Biosystems DNA合成仪通过常规步骤合成具有（5′）TTCGGATTGTTATCCATGGTTGGAGGTCTGA（3′）序列的DNA寡核苷酸。这一寡核苷酸与在Ca MV启动子（uncleotides 5762 to 5778 in Hohn，Current Topics，in Microbiology and Immunology，96，193-235（1982），引入本文作参考）3′端和前毒素编码序列开始部分（上式中核苷酸156-172）的噬菌体mp191/btca的序列互补。诱变的一般程序如Zoller和Smith在Meth，Enzym，100，468-500（1983）中所述，这里引用该文作参考。大约5μg单链噬菌体mp19/btca DNA与0.3mg磷酸化寡核苷酸混合，体积为40μl。混衔锛尤戎?5℃，5分钟后冷却至50℃，然后缓慢冷却至4℃。此后，加入缓冲剂、核苷酸三磷酸化物、ATP、T4DNA连接酶和大片段DNA多聚酶，于15℃过夜培养，如（Zoller and SmithM eth.Enzym.，100，468～500（1983），引入本文作参考）所述。琼脂糖凝胶电泳后，纯化环状双链DNA，并将其转染大肠杆菌JM101菌株。筛选所得噬菌斑与32-P标记寡核苷酸杂交的序列，噬菌体用DNA限制性核酸内切酶分析法分析。在得到的噬菌体克隆中有准确地除掉了Ca MV基因Ⅵ启动子和前毒素编码序列间的不需要序列的噬菌体克隆。这种噬菌体称为mp19/btca/del（见图17）。

此后，构建了一种质粒，其中前毒素基因3′编码区与Ca MV转录终止信号融合。步骤如图18所示。首先，质粒pABDI DNA用核酸内切酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ酶解，分离含有Ca MV转录终止区序列的0.5kbp片段。然后，质粒pUC19（Yanisch-Perron et al.，Gene，33，103-119（1985），引入本文作参考）用BamH Ⅰ酶解，与0.5kbp片段混合，与T4DNA连接酶一起培育。在DNA转入大肠杆菌HB101菌株后，得到了具有图18所示结构的一种克隆，称为质粒p702。此后，质粒p702用核酸内切酶Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切割，用凝胶电泳分离较大的、大约3.2kbp的片段。质粒p KU25/4DNA用核酸内切酶AhaⅢ和Sac Ⅰ酶解，凝胶电泳后分离出含有前毒素编码序列3′部分（nt1504-3773）的2.3kbp片段（式1中核苷酸1502-3773）。将这两种DNA片段混合，用T4DNA连接酶培育，转入大肠杆菌HB101菌株。结果得到的质粒是p702/bt（图18）。

最后，部分噬菌体mp19/btca/del ds rf DNA和质粒p702/bt相接，产生含有完整的前毒素编码序列、由Ca MV启动子和终止区序列侧接的质粒（见图18）。噬菌体mp19/btca/del DNA用核酸内切酶Sac Ⅰ和Sph Ⅰ酶解，琼脂糖凝胶电泳后纯化约1.75kbp片段。同样，质粒p702/bt DNA用核酸内切酶Sac Ⅰ和Sal Ⅰ酶解，分离约2.5kbp片段。最后，质粒pBR322 DNA（Bolivar et al.，Gene，2，95-113（1977），引入本文作参考）用Sal Ⅰ和Sph Ⅰ酶解，分离4.2kbp较大的片段。将这三个DNA片段混合，用T4DNA连接酶温育并转入大肠杆菌HB101菌株。结果得到的质粒pBR322/bt14是pBR322衍生的，含有Ca MV基因Ⅵ启动子和融合于苏云金芽孢杆菌结晶蛋白编码序列的翻译起始信号，接着是Ca MV转录终止信号（见图19）。

载体pCIB10是适用于经根瘤土壤杆菌将嵌合基因转移到植物的Ti-质粒衍生载体。该载体由宽范围宿主质粒pRK252（可由圣路易斯（Mo.）华盛顿大学W.Barnes博士提供。衍生该载体还含有由Tn903提供的植物中卡那霉素抗性基因，和来自Ti质粒pTi    T37的左右T-DNA端序列。在两臂序列之间有来自质粒pUC18的多连接子和提供植物中卡那霉素抗性的嵌合基因。

首先，修饰质粒pRK252，用来自转位子T903的卡那霉素抗性基因取代四环素抗性基因（Oka，et    al.，J.Mol.Biol.，147，217-226（1981），引入本文作参考），且还对其进行修饰，用BglⅡ位点取代pRK252中单一EcoRⅠ位点（见图20对这些修饰的总结）。质粒pRK252首先用核酸内切酶Sal    Ⅰ和Sma    Ⅰ酶解，然后用DNA多聚酶大片段处理，产生平末端，大的载体片段用琼脂糖凝胶电泳纯化。继之，质粒p368用核酸内切酶BamH Ⅰ酶解，用DNA多聚酶大片段处理，琼脂糖凝胶电泳后分离出大约1050-bp片段，这一片段含有来自转位子Tn903的基因，使之具有对抗生素卡那霉素抗性（OKa et al.，J.Mol.Biol.，147，217-226（1981），引入本文作参考）。然后将两个片段用DNA多聚酶大片段处理，产生平末端。将两个片段混合，用T4DNA连接酶于15℃过夜温育。在转入大肠杆菌HB101菌株和选择卡那霉素抗性菌落之后，得到质粒pRK2521/Tn903（见图19）。

质粒pRK252/Tn903在其EcoR Ⅰ位点被酶解，接着用大肠杆菌DNA多聚酶大片段处理，产生平末端。将这一片段加到合成Bgl Ⅱ限制性位点连接体，用T4DNA连接酶过夜温育。所得DNA用过量Bgl Ⅱ限制性核酸内切酶酶解，较大的载体片段用琼脂糖凝胶电泳纯化。所得片段再用T4DNA连接酶温育，经其新加的Bgl Ⅱ粘性末端重新成环。转入大肠杆菌HB101菌株之后，得到质粒pRK252/Tn903/BglⅡ（见图20）。

构建了含有Ti质粒T-DNA两臂、质粒pUC19的多连接子和植物中卡那霉素抗性可选择基因的质粒pBR322的衍生物（见图21）。质粒pBR325/Eco29含有来自nopaline Ti质粒pTi T37的1.5-kbp Eco R Ⅰ片段。这一片段含有T-DNA左端序列（Yadav et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6322-6326（1982），引入本文作参考）。为用Hind Ⅲ端取代这一片段的Eco R Ⅰ端，质粒pBR325/Eco29 DNA用EcoR Ⅰ酶解，然后用核酸酶Sl酶解，接着用DNA多聚酶大片段温育产生平末端，最后与合成Hind Ⅲ连接物混合，以及用T4DNA连接酶温育。所得DNA用核酸内切酶Cla Ⅰ和过量Hind Ⅲ酶解，得到的含有T-DNA左端的1.1-kbp片段用凝胶电泳纯化。此后，质粒pUC19的多连接子通过用核酸内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶解质粒DNA分离，用琼脂糖凝胶电泳分离较小的片段（大约53bp）。此后，质粒pBR322用核酸内切酶EcoR Ⅰ和Cla Ⅰ酶解，与另外的两个分离的片段混合，用T4DNA连接酶温育并转入大肠杆菌HB101菌株。得到的质粒pCIB5含有多聚连接子和质粒pBR322衍生物中的T-DNA左臂。

构建了含有植物中卡那霉素抗性表达基因的质粒（见图22和23）。由英国剑桥大学植物育种学院M.Bevan博士得到了质粒Bin6。Bevan在Nucl.Acids Res.，12，8711-8721（1984）中描述了这一质粒，该文引入本申请作参考。质粒Bin6 DNA用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶解，琼脂糖凝胶电泳后分离并纯化了含有嵌合新霉素磷酸转移酶基因的大约为15kbp的片段。这一片段与已用核酸内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割的质粒pUC18 DNA混合。用T4DNA连接酶温育后，得到的DNA转入大肠杆菌HB101菌株。所得质粒称为pUC18/neo。这一质粒DNA在新霉素磷酸转移酶基因和nopaline合成酶终止区序列之间含有不想要的BamH Ⅰ识别序列（见Bevan，Nucl.Acids Res.，12，8711-8721（1984），引入本文作参考）。为除掉这一识别序列，质粒pUC18/neo用核酸内切酶BamH Ⅰ酶解，接着用DNA多聚酶大片段处理，产生平末端。然后将片段用T4DNA连接酶温育使片段重新成环，并转入大肠杆菌HB101菌株。得到的质粒pUC18/neo（Bam）失去了BamH Ⅰ识别序列。

然后将T-DNA右端序列相邻加到嵌合NPT基因上（见图24）。质粒pBR325/Hind    23含有质粒pTi    T37的3.4-kbp    Hind    Ⅲ片段。这一片段含有T-DNA右端序列（Bevan    et    al.，Nuel，Acids    Res.，Ⅱ，369-385，引入本文作参考）。质粒pBR325/Hind    23DNA用核酸内切酶Sac    Ⅱ和Hind    Ⅲ切割，琼脂糖凝胶电泳后分离并纯化了含有右端的1.0kbp片段。质粒pUC18/neo（Bam）DNA用核酸内切酶Sac    Ⅱ和Hind    Ⅲ酶解，用琼脂糖凝胶电泳分离4.0kbp载体片段。将两个片段混合，用T4DNA连接酶温育并转入大肠杆菌HB101菌株。得到的质粒pCIB4（图23所示）含有T-DNA右端和质粒pUC18衍生物中卡那霉素抗性植物选择标记。

继之，构建了同时含有T-DNA左臂和右臂，植物选择性卡那霉素抗性基因和pUC18多连接子在两臂之间的质粒（见图28）。质粒pCIB4DNA用核酸内切酶Hind Ⅲ酶解，然后用DNA多聚酶大片段处理，产生平末端，最后用核酸内切酶EcoR Ⅰ酶解。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有嵌合卡那霉素抗性基因和T-DNA右端的2.6-kbp片段。质粒pCIB5 DNA用核酸内切酶Aat Ⅱ酶解，用T4聚合酶处理产生平末端，然后用核酸内切酶EcoR Ⅰ切割。通过琼脂糖凝胶电泳纯化较大的载体片段，与pCIB4片段混合，与T4DNA连接酶一起温育，转入大肠杆菌HB101菌株。得到的质粒pCIB2（图24所示）是在T-DNA两臂之间含有所需序列的质粒pBR322的衍生物。

下述步骤完成了载体pCIB10的构建，如图25所示。质粒pCIB2 DNA用核酸内切酶Eco RV酶解，并如上所述将含有BglⅡ识别位点的合成连接子加入。经过量BglⅡ核酸内切酶酶解后，经琼脂糖凝胶电泳分离大约2.6-kbp片段。上述的质粒pRK252/Tn903/BglⅡ（见图20）用核酸内切酶BglⅡ酶解，然后用磷酸处理防止再环化。将这两个DNA片段混合，用T4DNA连接酶保温，转入大肠杆菌HB101菌株。得到的质粒是完整的载体pCIB10。

将嵌合前毒素基因插入载体pCIB10的步骤如图26所示。质粒pBR322/bt14 DNA用核酸内切酶Pvu Ⅰ和Sal Ⅰ酶解，然后用核酸内切酶BamH Ⅰ部分酶解。通过琼脂糖凝胶电泳分离含有嵌合基因尺寸为大约4.2kbp的BamH Ⅰ-Sal Ⅰ片段，与已经用核酸内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶解的质粒pCIB10 DNA混合。用T4DNA连接酶温育并转入大肠杆菌HB101菌株后，图26所示的质粒在质粒载体pCIB10中含有嵌合前毒素基因。

为了将质粒pCIB10/19sbt由大肠杆菌HB101菌株转移入土壤杆菌，使用了中间体大肠杆菌宿主菌株S17-1。这一菌株由Agrigenetics    Research    Corp.，Boulder，Co.可得，具有迁移功能，能将质粒pCIB10经过连接直接移到土壤杆菌，由此避免了必须将裸露的质粒DNA直接转入土壤杆菌（关于菌株S17-1，请参见Simon    et    al.，“Molec    ular    Genetics    of    the    Bacterial-Plant    Interaction”，AP    uhler，ed，Springer    Verlag，Berlin，pp.98-106，1983）。首先，将质粒pCIB10/19    Sbt    DNA引入到氯化钙处理过的S17-1细胞。此后，将转化的S17-1细胞培养物和根瘤土壤杆菌菌株LBA4404（Ooms    et    al.，Gene，14，33-50（1981），引入本文作参考）混合，室温下涂于N琼脂（Difco）平皿上过夜。将1铂环所得细菌划线接种于AB基本培养基上（Chilton    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，7347-7351（1974），引入本文作参考），以50μg/l卡那霉素涂敷，于28℃温育。菌落重新划线接种于相同的培养基，然后划线接种于NB琼脂平皿上。采集缓慢生长的菌落，重新划线接种于含有卡那霉素的基本培养基，分离单一菌落。这一程序选择含有pCIB10/19sbt质粒的土壤杆菌。

如图27所示，通过对Ca    MV35    S启动子暗盒质粒pCIB710的构建，实现了构建带有Ca    MV35    S启动子的苏云金芽孢杆菌前毒素嵌合基因。这一质粒含有Ca    MV启动子和35S    RNA转录的转录终止序列（covey，S.N.，Lomonossoff，G.P.and    Hull，R.，Nucleic    Acids    Research    vol.9，6735-6747（1981），引入本文作参考）。用如前所述的制备性琼脂糖凝胶电泳由质粒pLVⅢ分离Ca    MV    DNA1149-bp    BglⅡ限制性片段（Hohn    et    al.，Current    Topics    in    Mic    robiolog    and    Immunology，96，194-220    and    Appendices    A    to    G（1982），引入本文作参考。（由California-San Diego大学S.Howell博士可得，此外，这一片段也可直接从Ca MV DNA分离）），并与用BamH Ⅰ切割的质粒pUC19 DNA混合，用T4DNA连接酶处理，转入大肠杆菌。所得质粒中BamH Ⅰ限制位点被Bgl Ⅲ粘性末端与BamH Ⅰ粘性末端的连接破坏。得到的质粒称为pUC19/35 S，之后用于寡核苷酸定向的离体诱变，将BamH Ⅰ识别序列GGATCC插在紧接Hohn文献中Ca MV核苷酸7483之后。得到的质粒pCIB710含有由BamH Ⅰ限制位点隔开的Ca MV35 S启动子区和转录终止区。插入该BamH Ⅰ位点的DNA序列将通过Ca MV转录调节序列在植物中表达。pCIB710在转录的开始部分和BamH Ⅰ位点之间不含有任何ATG翻译起始密码子。

通过图29所示步骤将Ca    MV35S启动子/终止盒插入p    CIB10。用EcoR    Ⅰ和SalⅠ酶解质粒p    CIB10和p    CIB710    DNA，混合，连接。产生的质粒p    CIB10/710含有已被插到植物转化载体p    CIB10的Ca    MV35S启动子/终止盒。Ca    MV35    S序列位于p    CIB10的T-DNA两端之间，且在植物转化过程中将被插入植物基因组。

通过图29所示的步骤，将紫云金芽孢杆菌前毒素基因插入p    CIB10/710。用BamH    Ⅰ和Nco    Ⅰ酶解作为前毒素基因来源的质粒p    CIB10/19    sbt，通过制备性凝胶电泳分离出含有前毒素基因的3.6kb片段。然后将该片段与带有序列5′-CATGGCCGGATCCGGC-3′的合成Nco    Ⅰ-BamH    Ⅰ连接物混合，再用BamH    Ⅰ酶切。该步骤使得前毒素片段的两端均变为粘性末端。再将这一片段插入被BamH    Ⅰ切割的p    BIC10/710。产生的质粒p    CIB10/35sbt如图29所示，在Ca    MV35    S启动子和转录终止序列之间含有前毒素基因。

如上所述将质粒p    CIB10/35sbt转移至根瘤土壤杆菌LBA4404菌株。

通过在Kpn    Ⅰ限制性核酸内切酶位点（它位于式Ⅰ所示序列的2325位）进行切割而除去基因的C-末端部分，构建出含有大约725个氨基酸的缺失紫云金芽孢杆菌前毒素基因，也构建出含有这一缺失基因（它携带Ca    MV35    S启动子）的嵌合基因。用BamH    Ⅰ和Kpn    Ⅰ酶切质粒p    CIB10/35sbt（图29），通过制备性琼脂糖凝胶电泳分离含有缺失前毒素基因的大约2.2kbp的BamH    Ⅰ/Kpn    Ⅰ片段。为了将3′-端的Kpn    Ⅰ位点转化为BamH    Ⅰ位点，将该片段与Kpn    Ⅰ/BamH    Ⅰ连接物寡核苷酸混合并连接。然后将这一片段与被BamH    Ⅰ切割的p    CIB10/710（图28）混合。

通过在Bcl    Ⅰ限制性核酸内切酶位点（它位于式Ⅰ所示序列的2090位）切割以除去基因的C-末端部分，而产生含有大约645个氨基酸的缺失前毒素基因。用BamH    Ⅰ和Bcl    Ⅰ酶解质粒p    CIB10/35sbt（图29），且通过制备性琼脂糖凝胶电泳分离出含有缺失前毒素基因的约1.9kbp    BamH    Ⅰ/Bc    ⅠⅠ片段。由于Bcl    Ⅰ象BamH    Ⅰ一样能够产生粘性末端，因此在将该片段连接到BamH    Ⅰ切割的p    BIC10/710（图28）之前无需进一步处理。在卡那霉素上筛选所产生的质粒，该质粒含有图31所示的结构p    CIB10/35sbt（Bcl    Ⅰ）。

所产生的转化体[称作p    CIB10/35sbt（Kpn    Ⅰ）且表示于图30]含有约725个氨基酸的缺失前毒素基因。在卡那霉素上筛选这些转化体。

通过引入BamH    Ⅰ切割位点（GGATCC）而产生缺失前毒素基因。它是通过克隆含有得自p    CIB10/35sbt的前毒素序列的BamH    Ⅰ片段至mp18且使用上面所述的标准寡核苷酸诱变方法而完成的。诱变之后，从M13克隆制备双链复制型DNA，然后用BamH    Ⅰ将其酶解。将含有缺失前毒素基因的约1.9kbp片段插入BamH    Ⅰ切割的p    CIB10/710，在卡那霉素上筛选所产生的质粒，其结构p    CIB10/35sbt（607）如图32所示。

使用p    CIB10/sbt607。按实施例7所述的方法进行转化。不同之处在于，将1ml等份试样立即置于含有选择性抗生素的培养基中。这一选择培养基含有卡那霉素（50μg/ml）或G418（25μg/ml）。由于NPT嵌合基因在两种转化的植物组织中的表达，使得在任一种抗生素上都能够筛选该组织。

在2-4周，转化的组织在选择平板上变得明显。在卡那霉素或G418上筛选植物材料。然后用缓冲液提取植物组织（不管是各个胚还是愈伤组织），用ELISA测定法检测BT基因产物的表达。提取条件如下：每100mg组织，在0.1ml含有50m MNa CO3（p H9.5）、0.05% Triton、0.05% Tween、100nM Nacl、10m MEDTA、1mM leupeptine及1mM PM SF的提取缓冲液中均化。leupeptine和PW SF在使用前立即从100 X原液中加入。用一电动研杵研磨该组织。提取之后，加进2M Tris（p H7），以调整pH至8.0-8.5，然后在Beckman微型离心机12中以12，000转/分的转速离心（于4℃离心10分钟），将其上清液用于酶联免疫吸附测定（“ELISA”）。

作为常规工具的ELISA技术已由M、F、Clark等在“Methods    in    Enzymology”118：742-766（1986）上加以叙述，在此引用以作参考。

利用标准方法已完成对Bt毒素的酶联免疫吸附测定，且将其用于分析转移基因植物材料的Bt序列的表达。对于该方法，用乙醇对ELISA平板进行预处理，向平板中加入浓度为3μg/ml的亲和纯化的抗Bt抗血清（50μl）（存在于硼酸盐缓冲盐水中）（见下述）。将其于4℃保温过夜。抗血清是在对用经梯度纯化的Bt结晶免疫兔子应答中产生的（Ang，B，J.&    Nickerson，K.W.;Appl.Environ.Microbiol.36：625-626（1978），在此作为参考文献引入]，用十二烷基磺酸钠将其溶解，且用ELISA洗涤缓冲液（见下述）洗涤。再用阻断缓冲液（见下述）将其于室温下处理1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤。加入植物提取物以提供50μg蛋白质（这通常大约为5μl提取物）。使用商业上可得到的试剂盒（由Bio-Rad，Richmond，California生产），通过Brad-ford的方法（Bradford，M.Anal.Bio-chem.72：248（1976），在此引用以作参考]测定作为蛋白质的叶片提取物缓冲液。若叶片提取物需要稀释，则使用ELISA稀释剂（见下述）。让其在4℃过夜保温，用ELISA洗涤缓冲液洗涤之后，以3μg/ml蛋白质（存在于ELISA稀释剂中）的浓度加进50μl亲和纯化的山羊抗Bt抗血清。于37℃保温2小时，再用ELISA洗涤缓冲液洗涤。在ELISA稀释剂中将结合至碱性磷酸酶（商业上可得自Sigma    Chemicals    St.Louis，Mo.）的50μl兔抗山羊抗体以1∶500稀释，且于37℃保温1小时，再用ELISA洗涤缓冲液洗涤。加入50μl底物[0.6mg/ml对-硝基苯磷酸盐存在于ELISA底物缓冲液（如下）]，于室温下保温30分钟。通过加入50μl3M    NaOH终止反应。于改进的ELISA读数器[Hewlett    Packard，Stanford，Ca.]上405nm处读取吸收值。

当用这一ELISA方法进行检测时，发现被p    CIB10/35s    Bt（BCl    I）转化的植物组织显示出阳性反应，表明Bt基因被表达。

EPBS（ELISA磷酸盐缓冲盐水）10m M磷酸钠：Na2HPO44.68克/4升NaH2PO4·H2O 0.976克/4升140mM    NaCl    NaCl    32.7克/4升pH应大约为7.4硼酸盐缓冲盐水100mM硼酸25mM硼酸钠75mM    Na    Cl

需要时用HCl或NaOH将pH调至8.4-8.5。

ELISA阻断缓冲液存在于EPBS中，1%BSA0.02%叠氮化钠ELISA洗涤缓冲液10m    MTris-HCl，pH8.00.05%    Tween    200.02%叠氮化钠2.5M    TrisELISA稀释剂存在于EPBS中：0.05%    Tween    201%    BSA0.02%叠氮化钠ELISA底物缓冲液500ml中，48ml二乙醇胺24.5mg Mg Cl2用HCl调pH至9.8

ELISA底物15mg对硝基苯磷酸盐存在于25ml底物缓冲液中。

为了进行生物测定，首先从抗生素抗性细胞培养物（通过用这些土壤杆菌进行转化而获得）制备细胞悬浮液。将其在补加G418（25mg/l）的培养基中培养，每隔7-10天移种至含有抗生素的新鲜培养基中。将该培养物的样品用于生物测定，以测试对于鳞翅目昆虫的毒性。将20ml该培养物的等份试样沉淀（细胞体积＝3-4ml），再悬浮于无抗生素的培养基中。将悬浮液在该培养中再培养两天，以排除任何剩余抗生素的细胞。将两圈湿Whatman    2.3cm滤纸置于3/4盎司分部杯的底部。将0.2cm厚的转化悬浮培养细胞层置于滤纸圆片上。向每一分部杯中放进新孵化的烟草天蛾或美洲菸夜蛾的幼虫。对照为在非转化悬浮培养细胞上饲养的幼虫。每隔2天（或根据需要）填满圆片。天蛾幼虫通常需要多种植物材料。与从非转化细胞为食物的幼虫的生长率相比，以转化细胞为食物的幼虫的生长率及死亡率在5天后开始计数，且清楚地证实了转化棉花细胞中的BT基因产物的毒性。

实施例15置于干酪包布单上的美洲菸夜蛾卵得自北卡罗来纳洲立大学，烟草昆虫防治实验室（Raleigh，North    Carolina）。将干酪包布单转入一个大的带盖的玻璃烧杯中，用一湿纸巾于29℃将其保温，以保持湿度。该卵在3天内孵化。孵化之后尽快地将幼虫（每杯一个幼虫）转入带盖的3/4盎司塑料杯。每杯含有棉花圆叶片。用细毛涂料刷转移幼虫。

从棉花植物的叶子打出直径1厘米的圆叶片，将其放入含有幼虫的杯中湿滤纸圈上。至少要测试来自每一植物的6-10个圆叶片，它们分别代表嫩叶及老叶。每隔2天（或根据需要）置换圆叶片，以喂养幼虫。将以转化植物叶子为食物的幼虫的生长率（大小或所有复制虫的组合重量）和死亡率与以非转化棉叶为食物的幼虫的生长率和死亡率进行比较。

与对照相比，以用p    CIB10/35    SB5（Bcl    Ⅰ）转化的棉花圆叶片为食物的幼虫的生长率下降，而死亡率增加。

已发现，作为本发明再生方法的结果，一定数量的本发明的再生植物（5-10%）已用遗传方法获得了可遗传的表型变异。这种变异已知为体细胞克隆变异。下面的实施例说明了如何将作为本发明再生方法结果的体细胞克隆变异用于给棉花变种带来商业上有用的新特性。

实施例16    对真菌病原体具有耐受力的棉花再生体接着实施例1的步骤，将得自变种S    J5和S    J4的再生棉花植物硬化，放入土壤。这些植物自花传粉。收集代表F1代的种子。

为了获得对轮枝孢属具有更大耐受性的再生体（体细胞克隆变种），将F1代种入被轮枝孢菌感染的土壤，以进行子代行栽分析。将变种S    J4和S    J5的种子种入地中以作对照。通过对整个植物活力、产量以及缺乏与疾病相关的叶片症状进行评价而在几个子代行（5%）中鉴定出比其亲代变种更加耐受轮枝孢属真菌的体细胞克隆变种。图33显示了种于被轮枝孢属感染的地上的再生体的子代行。图34显示了能够耐受轮枝孢属的变种S    J4的体细胞克隆变种。已表现这种对真菌病原体耐受性的改进可稳定遗传，且传给以后的各代。

实施例17    改变了生长习性的棉花再生体采用实施例13的椒ǎ煌υ谟冢篎1代不是种于感染病害的土壤中，而是种于棉花育种苗圃。将F1再生子代的全部生长习性与对照变种的生长习性进行比较。鉴定出比亲代变种生长习性更均匀且更矮的体细胞克隆变种。在本发明人的试验中称作Phy6的一个S J5再生体，其高度比亲代变种矮20%。这种生长习性对于在窄行（30″行矩）培养条件下生长的棉花来说是适宜的。已发现这些特性可稳定遗传，且代给以后的各代。

实施例18    改进了纤维特性的棉花再生体采用实施例13的方法，不同之处在于：再生体的F1子代是种于棉花育种苗圃，且让其结果。棉桃成熟之后，收集棉花，对几种纤维质量特性进行分析，其中包括长度、均匀性、抗张强度、弹性以及纤维细度。鉴定出在一个或多个这些特性方面比亲代变种有明显改进的体细胞克隆变种。从F2子代（F1的细胞传粉）获得的代表性数据已收入下面的表1。用星号标明的数据代表S J5再生体的改进，它在统计学上是显著的，且已发现它能够在以后的各代中真实繁育。

表1变种或品系    长度    均匀指数    抗张强度    弹性    纤维细度SJ5    1.13    48.7    24.7    6.8    4.273SP16    1.27＊    51.2    24.6    8.0＊    4.10＊3SP20    1.28＊    53.1＊    23.1    7.6＊    4.13＊5SP10    1.11    53.2＊    25.7＊    6.2    4.555SP17    1.18    51.7    26.7＊    7.1    4.43实施例19    改进了产量的棉花再生体采用实施例13的方法，不同之处在于：变种SJ4再生体的F1子代在同样的产量试验中是与非再生的对照种在一起。一个显示了更均匀的生长习性和更加有活力的生长习性的变种的产量比同一试验中的亲代变种增加4%。数据见下面的表2。

表2变种或品系    每块试验田的    平均产量    增加百分数平均产量（磅）    磅/英亩SJ4    28.0    3049Phy4    29.1    3169    4%＊＊这一差别在95%的置信度上是明显的。

对于加州的普遍棉花种植者来说，产量增加4%将意味着每英亩几乎获得20美元，在那里每年种植一百万英亩以上的棉花。

实施例20    对除草剂（卡那霉素）具有耐性的棉花再生体按实施例5的方法获得棉花变种B1644的悬浮培养物。然后将该悬浮培养物置于如实施例6所述的琼脂培养基上培养，但补加了除草剂（抗生素）卡那霉素（25mg/l）。群体中的大部分细胞死亡，但有几个（1-5%）具有耐受性，从而存活。将这几个存活细胞在琼脂固化的培养基中选择性地继代培养，不断提高补加的卡那霉素的浓度，直至最终浓度达到50mg/l。从这一愈伤组织形成胚，且那些抗性胚萌发成卡那霉素抗性植物。

式Ⅰ