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一种制备含有抗菌肽基因的 酵母的方法

阅读：332发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，通过本发明的制备步骤，将抗菌肽基因转录至酵母细胞体内，通过酵母细胞的发酵过程即可快速生产出抗菌肽，从而使养殖户可以购买回去后，自行对其进行发酵然后喂食畜禽，简单方便，酵母发酵出来的发酵液中抗菌肽表达量可达到3g/L，而酵母也可以作为畜禽的蛋白质来源。与现有技术相比，抗菌肽的生产更为方便，而且使用酵母发酵生产相比于传统对抗菌肽的生产成本更低。，下面是一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.使用限制性内切酶从包含抗菌肽基因的原核表达载体上将抗菌肽基因切下；
S2.对切下的抗菌肽基因进行琼脂糖电泳，并将电泳产物中为抗菌肽片段的部分进行分离纯化；
S3.将分离纯化的抗菌肽基因和使用同种限制性内切酶处理的酵母转染载体使用连接酶进行连接，将连接产物转化感受态细胞，并涂板；
S4.挑选克隆，并通过PCR方法确定阳性克隆，并通过测序确定基因序列的正确性；
S5.对携带经验证无序列差错的抗菌肽基因的阳性克隆进行扩大培养并收集菌体，制备无内毒素的、含抗菌肽基因的酵母转染载体；
S6.通过磷酸钙等转染色方法将含抗菌肽基因的酵母转染载体转入酵母细胞内；
S7.对S6内的酵母细胞施加抗生素压力并进行涂板培养；
S8.挑选克隆，分离、验证整合有抗菌肽基因的阳性酵母菌。
2.如权利要求1所述的一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，其特征在于：
还包括步骤S9：对S8验证合格的阳性酵母菌进行小试和中试从而确定工业化大规模生产的培养条件。

说明书全文

一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因领域，特别是一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法。

背景技术

[0002] 由于抗生素在畜牧业的使用可能引起严重的食品安全、生态安全以及人类的健康问题，很多国家已经立法禁止使用部分抗生素，并且禁止抗生素残留或超标的猪肉进口，为此开发在猪体内无有害残留，细菌不能产生耐药性的抗生素有效替代品迫在眉睫。而抗菌肽是动物先天性免疫系统中的一类具有天然抗菌活性的多肽，与抗生素相比，抗菌活性肽拥有以下优势：进入机体后无有害残留，不污染环境，对人类健康不够成威胁，具有较好的热稳定性，分子量小，具备抵抗多种肠胃道蛋白酶水解的能力，能在消化道被完整吸收，且具有独特的抗菌抑菌机理，使病原微生物不易对抗菌肽产生耐药性等等，但是现有的抗菌肽生产殊为不易，产量很小，生产成本太大，导致非常不使用。

发明内容

[0003] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，从而制备抗菌肽更为简单。

[0004] 本发明为解决问题所采用的技术方案是：一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，包括以下步骤：

[0005] S1.使用限制性内切酶从包含抗菌肽基因的原核表达载体上将抗菌肽基因切下；

[0006] S2.对切下的抗菌肽基因进行琼脂糖电泳，并将电泳产物中为抗菌肽片段的部分进行分离纯化；

[0007] S3.将分离纯化的抗菌肽基因和使用同种限制性内切酶处理的酵母转染载体使用连接酶进行连接，将连接产物转化感受态细胞，并涂板；

[0008] S4.挑选克隆，并通过PCR方法确定阳性克隆，并通过测序确定基因序列的正确性；

[0009] S5.对携带经验证无序列差错的抗菌肽基因的阳性克隆进行扩大培养并收集菌体，制备无内毒素的、含抗菌肽基因的酵母转染载体；

[0010] S6.通过磷酸钙等转染色方法将含抗菌肽基因的酵母转染载体转入酵母细胞内；

[0011] S7.对S6内的酵母细胞施加抗生素压力并进行涂板培养；

[0012] S8.挑选克隆，分离、验证整合有抗菌肽基因的阳性酵母菌。

[0013] 作为上述技术方案的进一步改进，还包括步骤S9：对S8 验证合格的阳性酵母菌进行小试和中试从而确定工业化大规模生产的培养条件。

[0014] 本发明的有益效果：通过本发明的制备步骤，将抗菌肽基因转录至酵母细胞体内，通过酵母细胞的发酵过程即可快速生产出抗菌肽，从而使养殖户可以购买回去后，自行对其进行发酵然后喂食畜禽，简单方便，酵母发酵出来的发酵液中抗菌肽表达量可达到3g/L，而酵母也可以作为畜禽的蛋白质来源。与现有技术相比，抗菌肽的生产更为方便，而且使用酵母发酵生产相比于传统对抗菌肽的生产成本更低。

具体实施方式

[0015] 一种制备含有抗菌肽基因的酵母的方法，包括以下步骤：

[0016] S1.使用限制性内切酶从包含抗菌肽基因的原核表达载体上将抗菌肽基因切下；

[0017] S2.对切下的抗菌肽基因进行琼脂糖电泳，并将电泳产物中为抗菌肽片段的部分进行分离纯化；

[0018] S3.将分离纯化的抗菌肽基因和使用同种限制性内切酶处理的酵母转染载体使用连接酶进行连接，将连接产物转化感受态细胞，并涂板；

[0019] S4.挑选克隆，并通过PCR方法确定阳性克隆，并通过测序确定基因序列的正确性；

[0020] S5.对携带经验证无序列差错的抗菌肽基因的阳性克隆进行扩大培养并收集菌体，制备无内毒素的、含抗菌肽基因的酵母转染载体；

[0021] S6.通过磷酸钙等转染色方法将含抗菌肽基因的酵母转染载体转入酵母细胞内；

[0022] S7.对S6内的酵母细胞施加抗生素压力并进行涂板培养；

[0023] S8.挑选克隆，分离、验证整合有抗菌肽基因的阳性酵母菌。

[0024] 通过本发明的制备步骤，将抗菌肽基因转录至酵母细胞体内，通过酵母细胞的发酵过程即可快速生产出抗菌肽，从而使养殖户可以购买回去后，自行对其进行发酵然后喂食畜禽，简单方便，酵母发酵出来的发酵液中抗菌肽表达量可达到3g/L，而酵母也可以作为畜禽的蛋白质来源，从而充分利用酵母的特效。与现有技术相比，抗菌肽的生产更为方便，而且使用酵母发酵生产相比于传统对抗菌肽的生产成本更低。

[0025] 进一步进行改进，为了使本方案生产出来的酵母更加适合工业生产，优选还包括步骤S9：对S8验证合格的阳性酵母菌进行小试和中试从而确定工业化大规模生产的培养条件。

[0026] 以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

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