技术领域
[0001] 本
发明涉及
食品加工领域，尤其涉及一种褐藻寡糖单体的制备方法。
背景技术
[0002] 褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物，在农业、食品及医药领域有着十分重要的应用价值。研究表明，在
植物方面，褐藻寡糖混合物能够调节多种植物的生长功能，延长植物的生命周期，增强植物的免疫功能，在植物增产及抗病方面具有重大的意义。在动物方面，褐藻寡糖能促进多种动物生长，提高多种动物体内免疫细胞的数量，降低消化道和畜产品中的有害细菌的数量，对细胞的生长和增殖具有一定的促进和调节作用。在动物增产及提高肉类品质方面具有重大的意义。
[0003] 自然界中褐藻寡糖分布十分广泛，在植物和
微生物中都发现有褐藻寡糖的存在。褐藻寡糖在海藻胶中含量极高。海藻胶是从海带、
马尾藻等海藻中提取的直链多糖类化合物，糖链由L-古罗糖
醛酸(G)和D-甘露糖醛酸(M)组成。其链由M和G的组合方式不同，可分为α-(1→4)糖苷键连接聚古罗糖醛酸(PG)、β-(1→4)糖苷键连接的聚甘露糖醛酸(PM)和甘露糖醛酸与古罗糖醛酸镶嵌
片段(MG或GM)。由海藻胶制备寡糖的传统方法主要有化学
氧化法、物理降解法和酶解法。化学氧化法制备条件较剧烈，且制备中会产生大量的工业三废，同时产品中的残留物质能对
农作物、牲畜及人体都会造成损害。而物理降解法存在着降解效率低，产品成本高等问题。
[0004] 目前，生物酶解法因为条件温和，副产物少，环境友好等特点被广为接受，其中褐藻酶解产品在农业领域应用最为广泛。但是褐藻酶解产品中的活性物质褐藻寡糖检测难的问题，影响了对其产品的评价和推广应用。而解决这一问题的关键就是褐藻寡糖标准品的制备。褐藻酶解产物中不仅有古罗糖醛酸寡糖，还有甘露糖醛酸寡糖；即使同一类型的寡糖，也是由不同链长的物理化学性质极其相似的糖单体组成，成分的复杂性增加了糖单体分离纯化的难度。
发明内容
[0005] 鉴于此，有必要针对
现有技术存在的
缺陷，提供一种褐藻寡糖单体的制备方法。
[0006] 一种褐藻寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液；及
[0008] 将所述酶解液分离纯化得到所述褐藻寡糖单体；
[0009] 所述褐藻寡糖单体包括甘露糖醛酸
二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖中的一种。
[0010] 在一些
实施例中，采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，包括下述步骤：
[0011] 步骤110：将室温状态下的嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg3接种于
海水培养基中，于20-35℃
温度条件培养10-24h，得到活化液；
[0012] 步骤120：取适量的所述活化液接种于Alg培养基中，培养20-30h，得到
发酵液；
[0013] 步骤130：将所述发酵液离心处理，取上清液加入
硫酸铵至
饱和度为75％-85％，静置12-24h后再恒温离心处理，获取沉淀物；
[0014] 步骤140：将所述沉淀物用
磷酸盐缓冲液充分溶解后，于0-4℃温度条件下离心处理，得到的上清液即为粗酶液；
[0015] 步骤150：将所述粗酶液添加于褐藻
浆液或褐藻胶溶液中，并于30-45℃摇床内酶解20-30h后再离心处理，取上清液，得到所述酶解液。
[0016] 在一些实施例中，步骤110中，所述嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg3的保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2016年03月02日，保藏号为CGMCC NO 12155。
[0017] 在一些实施例中，步骤110中，所述
海水培养基的配方为：
酵母粉5g、蛋白胨10g、海水1000ml、pH7.2-7.4。
[0018] 在一些实施例中，步骤120中，所述Alg培养基的配方为：海藻酸钠5g、硫酸
氨5g、
硫酸镁1g、磷酸氢二
钾2g、去离子水1000ml，pH 7.2-7.4。
[0019] 在一些实施例中，步骤140中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.4。
[0020] 在一些实施例中，步骤150中，向褐藻浆液或褐藻胶溶液中添加的粗酶液体积分数为2.5-7.5％。
[0021] 在一些实施例中，将所述酶解液分离纯化得到所述褐藻寡糖单体，包括下述步骤：
[0022] 步骤210：在所述酶解液加入稀
盐酸，使所述酶解液沉淀出古罗糖醛酸及其
聚合物；
[0023] 步骤220：对上述混合物离心处理，去除古罗糖醛酸及其聚合物，并收集上清液；
[0024] 步骤230：在所述上清液中，加入
乙醇，使得到的混合物中醇体积分数浓度为70％-80％，沉淀、离心后取上清，再
冷冻干燥，得到甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物；
[0025] 步骤240：将所述甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物用纯水溶解后，上样Bio-gel P6柱，并用
碳酸氢铵溶液洗脱，收集第一洗脱液；
[0026] 步骤250：将所述第一洗脱液上样Bio-gel P6柱，以碳酸氢铵溶液洗脱，收集第二洗脱液得到所述褐藻寡糖单体。
[0027] 在一些实施例中，在完成步骤240之后，进行步骤250之前，还包括下述步骤：
[0028] 选取所述第一洗脱液中TLC检测后寡糖组分相同的样本，汇集，浓缩。
[0029] 在一些实施例中，步骤250中，所述碳酸氢铵溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。
[0030] 另外，本发明还提供了包括上述褐藻寡糖单体的褐藻寡糖。
[0031] 上述褐藻寡糖单体的制备方法，采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，再将所述酶解液分离纯化得到包括甘露糖醛酸二糖，甘露糖醛酸三糖等褐藻寡糖单体，由于本发明采用酶解法降解褐藻，与传统的化学法相比条件温和，制备过程洁净环保，无有害化学物质的添加和残留，且工艺简单。
附图说明
[0032] 图1为一实施方式的褐藻寡糖单体的制备方法的
流程图；
[0033] 图2为采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液的流程图；
[0034] 图3为将所述酶解液分离纯化得到所述褐藻寡糖单体的流程图；
[0035] 图4为本发明实施例1提供的TLC检测结果图；
[0036] 图5为本发明实施例2提供的TLC检测结果图。
具体实施方式
[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0038] 如图1所示，一实施方式的褐藻寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：
[0039] S10、采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，及
[0040] S20、将所述酶解液分离纯化得到所述褐藻寡糖单体；所述褐藻寡糖单体包括甘露糖醛酸二糖及甘露糖醛酸三糖。
[0041] 上述褐藻寡糖单体的制备方法，采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，再将所述酶解液分离纯化得到包括甘露糖醛酸二糖及甘露糖醛酸三糖的褐藻寡糖单体。
[0042] 请参阅图2，步骤S10，采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，包括下述步骤：
[0043] 步骤S110：将室温状态下的嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg3接种于海
水培养基中，于30℃温度条件培养12h，得到活化液；
[0044] 其中，所述嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg3(菌种名：Bacillus halosaccharovorans)的保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2016年03月02日，保藏号为CGMCC NO 12155。
[0045] 优选地，所述海水培养基的配方为：酵母粉5g、蛋白胨10g、海水1000ml、pH7.2-7.4。
[0046] 步骤S120：取适量的所述活化液接种于Alg培养基中，培养20-30h，得到发酵液；
[0047] 优选地，所述Alg培养基的配方为：海藻酸钠5g、硫酸氨5g、硫酸镁1g、
磷酸氢二钾2g、去离子水1000ml，pH 7.2-7.4。
[0048] 步骤S130：将所述发酵液离心处理，取上清液加入硫酸铵至所述硫酸铵的饱和度为75％-85％，静置12h-24h后再恒温离心处理，获取沉淀物；
[0049] 步骤S140：将所述沉淀物用磷酸盐缓冲液充分溶解后，于4℃温度条件下离心处理，得到的上清液即为粗酶液；
[0050] 优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.4。
[0051] 步骤S150：将所述粗酶液添加于褐藻浆液或褐藻胶溶液中，并于35℃摇床内酶解20-30h后再离心处理，取上清液，得到所述酶解液。
[0052] 优选地，褐藻浆液或褐藻胶溶液中添加的粗酶液体积分数为2.5-7.5％。
[0053] 请参阅图3，步骤S20，将所述酶解液分离纯化得到所述褐藻寡糖单体，包括下述步骤：
[0054] 步骤210：在所述酶解液加入稀盐酸，使所述酶解液沉淀出古罗糖醛酸及其聚合物；
[0055] 优选地，在所述酶解液加入稀盐酸调节pH值为2.6-3.0。
[0056] 步骤220：对上述混合物离心处理，去除古罗糖醛酸及其聚合物，并收集上清液；
[0057] 步骤230：在所述上清液中，加入乙醇，使得到的混合物中醇浓度为70％-80％，沉淀、离心后取上清，再冷冻干燥，得到甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物；
[0058] 步骤240：将所述甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物用纯水溶解后，上样Bio-gel P6柱，并用碳酸氢铵溶液洗脱，收集第一洗脱液；
[0059] 步骤250：将所述第一洗脱液上样Bio-gel P6柱，以碳酸氢铵溶液洗脱，收集第二洗脱液得到所述褐藻寡糖单体。
[0060] 优选地，所述碳酸氢铵溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。
[0061] 优选地，在完成步骤240之后，进行步骤250之前，还包括下述步骤：
[0062] 所述第一洗脱液中每2mL收集一管，选取所述第一洗脱液中TLC检测后寡糖组分相同的样本，汇集，浓缩。
[0063] 本发明提供的褐藻寡糖单体的制备方法，采用酶解法降解褐藻或褐藻胶得到酶解液，再将所述酶解液分离纯化得到包括甘露糖醛酸二糖及甘露糖醛酸三糖的褐藻寡糖单体。
[0064] 下面为具体实施例部分。
[0065] 实施例1
[0066] 1.粗酶液的制备
[0067] 于-80℃取嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg 3冻存管，室温自然融化后于超净台内接种于100ml海水培养基中，30℃摇床内200rpm培养12h。
[0068] 取上述菌液4ml，接种于200ml改良的Alg培养基中，30℃，培养30h，得到发酵液。其中改良的Alg培养基的配方为海藻酸钠20g、硫酸氨5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、加去离子水至1000ml，pH 7.2-7.4。
[0069] 12000r/min离心15min去除菌体，取上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，放入4℃
冰箱中静置12h，使其中的褐藻酸钠裂解酶充分沉淀，然后于4℃条件下离心15min，保留沉淀。沉淀用1.5ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)充分溶解后，即为粗酶液。
[0070] 2.酶解液的制备
[0071] 取粗酶液1ml加入40ml浓度为30g/L的褐藻胶溶液中，35℃摇床内200rpm震荡酶解30h。30h后，12000r/min离心15min，取上清，即为酶解液。
[0072] 3.pH分级
[0073] 利用古罗糖醛酸与甘露糖醛酸在不同pH值处
溶解度不同的特性，将酶解液用稀盐酸调pH值为2.6，将大部分古罗糖醛酸及其聚合物沉淀下来，12000r/min离心15min收集上清，即为去除了古罗糖醛酸及其聚合物，含有甘露糖醛酸及其聚合物的水溶液。
[0074] 4.乙醇沉淀
[0075] 取上清，加入3倍体积的乙醇，使其醇浓度为75％，沉淀5h后，12000r/min，15min离心取上清，冷冻干燥，即得甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物。
[0076] 5.柱分离
[0077] 将冷冻干燥得到的露糖醛酸及其聚合物的粗提物用4mL超纯水溶解后，全部上样于Bio-gel P6柱，以0.5mol/L的碳酸氢铵溶液自然洗脱，前30mL每10mL收集一管，之后每2mL收集一管，为第一洗脱液。选取所述第一洗脱液中TLC检测后寡糖组分相同的样本用
旋转蒸发仪在50℃蒸发浓缩至4mL，上样于Bio-gel P6柱，以0.5mol/L的碳酸氢铵溶液自然洗脱，即可制备得到褐藻寡糖单体，TLC检测结果见图4。
[0078] 6.HPLC检测分析使用waters高效液相色谱仪-2414示差折光检测器进行检测，色谱柱为SB-802.5HQ，流动相为0.1M的硫酸钠溶液，柱温35℃，流速0.5mL/min，上样量为20μL。
[0079] 注：图4中，TLC板1-5道依次为非还原性末端双键饱和的褐藻寡糖标准品(从上到下依次为二糖、三糖、四糖、五糖)，实施例1褐藻寡糖三糖，实施例1褐藻寡糖二糖，实施例1褐藻源单糖。
[0080] 实施例2
[0081] 1.粗酶液的制备
[0082] 于-80℃取嗜糖芽孢杆菌YIC-Alg 3冻存管，室温自然融化后于超净台内接种于100ml海水培养基中，30℃摇床内200rpm培养12h。
[0083] 取上述菌液4ml，接种于200ml Alg培养基中，30℃培养24h，得到发酵液，12000r/min离心15min去除菌体，取上清液加入硫酸铵至饱和度为80％，放入4℃冰箱中静置12h，使其中的褐藻酸钠裂解酶充分沉淀，然后于4℃条件下离心15min，保留沉淀。沉淀用1.5ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)充分溶解后，即为粗酶液。
[0084] 2.酶解液的制备
[0085] 取粗酶液1ml加入40ml浓度为20g/L的褐藻浆液中，37℃摇床内200rpm反应30h后12000r/min离心15min，取上清，即为酶解液。
[0086] 3.pH分级
[0087] 利用古罗糖醛酸与甘露糖醛酸在不同pH值处溶解度不同的特性，将酶解液用稀盐酸调pH值为3.0，将大部分古罗糖醛酸及其聚合物沉淀下来，12000r/min离心15min收集上清，即为去除了古罗糖醛酸及其聚合物，含有甘露糖醛酸及其聚合物的的水溶液。
[0088] 4.乙醇沉淀
[0089] 取上清，加入3倍体积的乙醇，使其醇浓度为75％，沉淀5h后，12000r/min，15min离心取上清，冷冻干燥，即得甘露糖醛酸及其聚合物的粗提物。
[0090] 5.柱分离
[0091] 将冷冻干燥得到的露糖醛酸及其聚合物的粗提物用4mL超纯水溶解后，全部上样于Bio-gel P6柱，以0.6mol/L的碳酸氢铵溶液自然洗脱，前30mL每10mL收集一管，之后每2mL收集一管，为第一洗脱液。选取所述第一洗脱液中TLC检测后寡糖组分相同的样本用
旋转蒸发仪在50℃蒸发浓缩至4mL，上样于Bio-gel P6柱，以0.6mol/L的碳酸氢铵溶液自然洗脱，即可制备得到褐藻寡糖单体，TLC检测结果见图5。
[0092] 6.HPLC检测分析
[0093] 使用waters高效液相色谱仪-2414示差折光检测器进行检测，色谱柱为SB-802.5HQ，流动相为0.1M的硫酸钠溶液，柱温35℃，流速0.5mL/min，上样量为20μL。
[0094] 注：图5中，TLC板1-5道依次为非还原性末端双键饱和的褐藻寡糖标准品(从上到下依次为单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖)，实施例2褐藻寡糖三糖样本1，实施例2褐藻寡糖三糖样本2，实施例2褐藻寡糖二糖样本1，实施例2褐藻寡糖二糖样本2。
[0095] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
