一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法
阅读：169发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种提高酿酒 酵母 丁醇耐受能 力 的方法，本发明提供的工程菌pY26-CERT不影响菌株的正常生产，并且可以耐受1％丁醇，能够使得在该浓度下的 生物 量较野生型菌株显著增加19.7％，并且使IPC、MIPC、M(IP)2C这三种主要的鞘脂组分分别较野生型提高了20％、65％、和56％，另外细胞膜的完整性较野生型菌株提高了27.8％。能够提高在生产过程中对高浓度丁醇的抗压能力，有利于提高 发酵 产品的产量，也能够节约丁醇在工业化生产中的生产成本，有利于丁醇工业化生产发展。，下面是一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法专利的具体信息内容。
1.一种编码神经酰胺转运蛋白CERT的基因，其特征在于，编码所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有人源神经酰胺转运蛋白CERT基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将如SEQ ID NO.1所示的基因连接至pY26载体上。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，pY26载体上还含有强启动子TEF1。
4.一种表达权利要求1所述基因的重组菌，所述重组菌是以酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A为出发菌株。
5.权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述重组菌的构建步骤为：先构建含有权利要求1所述基因的重组质粒，再将含有权利要求1所述基因的重组质粒转入酿酒酵母中，得到重组菌。
6.一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法，其特征在于，在酿酒酵母中表达CERT蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CERT蛋白是以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行表达。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将CERT蛋白通过TEF1强启动子进行表达。
9.一种提高酿酒酵母细胞膜完整性的方法，其特征在于，所述方法是将编码CERT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示在酿酒酵母中进行过表达。
10.氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的神经酰胺转运蛋白CERT或权利要求1所述基因或权利要求2所述重组质粒或权利要求4所述重组菌或权利要求6所述方法在提高酿酒酵母丁醇耐受能力方面的应用。
一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法
技术领域
背景技术
[0002] 丁醇作为一种极强的疏水性物质，具有较强的渗透性，能够与酿酒酵母细胞膜反应，破坏酵母细胞膜的组分与功能。在丁醇工业生产过程中，随着丁醇浓度的不断积累，其对酵母细胞的破坏也不断增加，最终直接导致酵母细胞的生长能力下降，丁醇生产性能减弱。
[0003] 细胞膜工程作为现阶段改善酵母细胞丁醇耐受能力的主要手段，其主要围绕着膜脂的化学结构多样性与膜脂组分多样性进行改造的。
[0004] 膜脂化学结构多样性主要由脂质的磷脂头部与脂肪酸尾部决定。不同的磷脂头部具有不同的物理化学特征，磷脂酰乙醇胺具有较小的头部结构并最终形成了圆锥状的磷脂形状，而磷脂酰胆碱具有比乙醇胺稍大的头部结构则形成了圆筒状的磷脂形状，圆筒状结构有利于膜脂的排列而圆锥状结构则增加了膜脂的排列压力改变了膜脂的弯曲程度。不同于磷脂头部化学种类的差异，脂肪酸尾部的差异主要集中在化学结构(脂肪酸饱和度与链长)的变化，高饱和度的脂肪酸类具有较大的空间位阻而使得脂质间的排列较为疏松从而提高了细胞膜的流动性，而较长的脂肪酸链增加了细胞膜的厚度而降低了对物质的通透性。
[0005] 膜脂组分的多样性是指细胞膜上不同脂质组成的比例的多样性，脂质组分的多样性也决定着细胞膜的不同生理功能，如甾醇含量的增加能有效增强细胞膜的完整性，而改变细胞膜上高不饱和磷脂含量能够增加细胞膜的流动性。
发明内容
[0006] 为了有效解决酿酒酵母丁醇耐受能力低的问题，使得酿酒酵母菌株在丁醇胁迫条件下生存能力有所提高，本发明通过过量表达人源的神经酰胺转运蛋白CERT(NCBI登录号为：NP_005704)来增强酿酒酵母的丁醇胁迫抗性。
[0007] 本发明提供一种编码人源的神经酰胺转运蛋白CERT的基因，编码所述蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 本发明提供一种人源的神经酰胺转运蛋白CERT，所述蛋白CERT氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0009] 本发明提供一种含有所述人源神经酰胺转运蛋白CERT基因的重组质粒，所述重组质粒是将如SEQ ID NO.1所示的基因连接至pY26载体上。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，pY26载体上还含有强启动子TEF1，该强启动子位于CERT基因的上游。
[0011] 本发明提供一种含有所述人源神经酰胺转运蛋白的重组菌，所述重组菌是以酿酒酵母菌株是Saccharomyces cerevisiae W303-1A为出发菌株。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建步骤为：构建重组质粒pY26-CERT，再将重组质粒pY26-CERT通过醋酸锂方法转入酿酒酵母W303-1A感受态中，通过尿嘧啶缺陷性平板进行筛选，得到菌株W303-1ApY26-CERT。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，具体步骤为：(1)将酿酒酵母W303-1A接种至20～60mL YPD培养基中25～35℃过夜培养，使得菌液OD600＞1.2，然后将菌液接种至新的培养基中在相同条件下培养至OD600达到0.3～1.0；(2)将该菌液离心富集后去上清，加去离子水重悬，再离心富集；(3)将步骤(2)重复3次；(4)在步骤(3)最终得到的悬液中加入LiAc，混匀后离心，去上清；(5)将混合液加入步骤(4)中离心后去上清的离心管中；(6)28～35℃培养25～35min后，再在40～45℃培养35～45min后，2500～4500rpm离心0.5～1.5min，去上清后用
150～250uL无菌水重悬，将重悬液涂布于营养缺陷型培养基平板。
150～250uL无菌水重悬，将重悬液涂布于营养缺陷型培养基平板。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)和(3)所述的离心条件为3500rpm～4500rpm，4～8min；步骤(2)中去离子水添加量为25～35mL；(3)步骤(4)中的LiAc浓度为0.3～0.6mol/L，添加量为0.5～1.5mL，离心条件为10000～15000rpm离心5～15s。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，步骤(5)所述转化液制备方法为：200～250μL 50％的PEG，30～40μL 1mol/L LiAc，45～55μLssDNA，20～25μL DNA水溶液按混合液按顺序加入。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，步骤(6)所述平板为尿嘧啶缺陷性培养基平板。
[0017] 本发明还提供一种提高酿酒酵母细胞膜完整性的方法，所述方法是过表达基因CERT。
[0018] 本发明提供一种能够耐受高浓度丁醇的酿酒酵母在能源、化工方面的应用。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在制备丁醇中的应用。
[0020] 有益效果：本发明提供了一种能够增强酵母的丁醇耐受能力的工程菌及其构建方法，本发明提供的工程菌(pY26-CERT)不影响菌株的正常生产，并且可以耐受1％丁醇，能够使得在该浓度下的生物量较野生型和pY26-NVJ2菌株分别显著增加19.7％、18.4％，并且使IPC、MIPC、M(IP)2C这三种主要的鞘脂组分分别较野生型提高了20％、65％、和56％，另外细胞膜的完整性较野生型和pY26-NVJ2菌株提高了27.8％和25％。能够提高在生产过程中对高浓度丁醇的抗压能力，有利于提高发酵产品的产量。附图说明
[0021] 图1为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的平板生长实验。
[0022] 图2为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的生长曲线；A为正常条件下(YNB+0％丁醇)各菌株的生长曲线；B为1％丁醇条件下各菌株的生长曲线；C为2％丁醇条件下各菌株的生长曲线。
[0023] 图3为各菌株在正常条件与0％，1％，2％丁醇条件下鞘脂(主要包含三类：IPC，MIPC，M(IP)2C)含量的变化
[0024] 图4为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的细胞膜完整性测定。
具体实施方式
[0026] 配制含YNB+丁醇培养基：在YNB培养基的基础上添加0％，1％，2％(体积比)的丁醇。
[0027] 配制尿嘧啶缺陷性培养基：组氨酸、亮氨酸、腺嘌呤、色氨酸终浓度分别为200mg/L、1000mg/L、200mg/L、200mg/L。
[0028] 实施例1：过表达菌株的构建
[0029] 以如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，以P1/P2为引物扩增目的基因CERT，构建反应PCR扩增体系：PrimerSTAR酶0.5μL、5×PrimerSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL、两条引物各1μL、模板1μL，加水补足至50μL；PCR反应条件为：①95℃、2min，②98℃、10s，③55℃、15s，④68℃、2min⑤72℃、5min，②～④反应扩增30个循环。
[0030] 将扩增产物(通过生工生物工程(上海)股份有限公司的胶回收试剂盒回收后)与质粒PY26用相同的限制性内切酶SacIⅠ和NotⅠ消化(消化体系为：内切酶各10μL，扩增产物30μL、质粒20μL、10×T Buffer20μL；反应条件为：37℃、120min)，通过T4连接酶将基因CERT连接到PY26，该载体参见Chen X et al,Metabolic engineering of Torulopsis glabrata for malate production.Metabolic engineering,2013,19:10-16，由强启动子TEF1启动转录翻译。
[0031] P1：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCGGATAATCAGAGCTG(SEQ ID NO.2)
[0032] P2：TCCCCGCGGCTAGAACAAAATAGGCTTTCCT(SEQ ID NO.3)，(下划线处为酶切位点)[0033] 将上述重组质粒pY26-CERT通过醋酸锂方法转入酿酒酵母W303-1A感受态中，(操作步骤参照文献Gietz RD,Schiestl RHJNp.High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.2007,2(1):31.)，具体操作如下，[0034] (1)将酿酒酵母W303-1A接种至20mL YPD培养基中，30℃过夜培养(OD600>1.5)，转接到50ml的YPD中，接种1-2mL，待OD600达到0.5左右时，停止培养，约培养6-8小时；
[0035] (2)取30mL4000rpm，4℃离心5min；
[0036] (3)去上清，加入30mL预冷的去离子水重悬，4000rpm离心5min；
[0037] (4)重复步骤(3)一次；
[0038] (5)将菌体重悬于1mL的0.5mol/L的LiAc(将10.202g LiAc溶于100mL去离子水中，用醋酸调节至pH7.5，121℃灭菌20min)中；
[0039] (6)转移上述悬液至1.5ml EP管中，12000rpm离心10s，去上清。
[0040] (7)将菌体重悬于0.5ml 0.1mol/L的LiAc中；
[0041] (8)将上述悬液分装与1.5EP管中，每管50μL，12000rpm离心10s，去上清。
[0042] (9)将制备好的ssDNA(购自Sigma Aldrich公司，浓度为2mg/mL)在沸水中放置5min后置于冰上冷却待用，(ssDNA沸水5min后，冰上迅速冷却)；
[0043] (10)配制转化混合液：240μL 50％的PEG，36μL 1mol/L LiAc，50μLssDNA，34μL DNA水溶液按混合液按顺序加入；
[0044] (11)将上步制备好的混合液0.36mL装到第8步去离心取上清后的离心管中，混匀；
[0045] (12)30℃培养30min后，再在42℃培养40min；
[0046] (13)3000～4000rpm离心1min，去上清，用200uL的无菌水中重悬，涂营养缺陷型平板。将上述涂布了菌液的平板，在30℃培养48h，挑取在尿嘧啶缺陷性平板上生长的单菌落，然后挑选单菌落接种于YNB液体培养基中，30℃培养12h，后提取质粒(使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的酵母质粒提取试剂盒)，双酶切验证正确后送去测序，验证正确的即为菌株W303-1ApY26-CERT。
[0047] 实施例2：各菌株生长性能的测定
[0048] (1)平板生长实验：将验证正确的菌株的菌液以体积比1％的接种量接种于新鲜的YNB培养基中30℃、200rpm培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD600＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图1)。
[0049] (2)生长曲线测定：菌株具体活化方式同步骤(1)，将活化后的菌液转接到相应的YNB液体培养基中(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)，控制起始OD600＝0.1，30℃200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图2)。
[0050] (3)菌株对不同浓度丁醇耐受性：
[0051] 平板生长实验和生长曲线分析丁醇对菌株W303-1A，PY26-CERT生长的影响。正常条件下(YNB+0％丁醇)，过表达CERT并不影响菌株的生长；在浓度为1％的丁醇条件下，过表达CERT促进了菌株的生长，基因CERT能够调节细胞对丁醇的耐受能力。
[0052] 实施例3：各菌株细胞膜鞘脂成分检测
[0053] (1)将菌株W303-1A，PY26-CERT单菌落培养至OD600为1，以体积比1％的接种量接种于不同丁醇浓度条件下(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)30℃、200rpm过夜培养，各取1mL菌液在4℃、5000rpm离心5min，将5mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(体积比为2:1)加入上述收集的菌体中，并将体系中加入1mL的酸洗玻璃珠后快速混匀；
[0054] (2)往混合液中加入1mL预冷的(4℃)0.034％MgCl2溶液，并充分混匀；
[0055] (3)室温下1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；
[0056] (4)往提取物中加入2mL甲醇/水/氯仿(体积比48:47:3)混合液，并快速涡旋振荡；
[0057] (5)室温下1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；
[0058] (6)将下有机相转移至另一离心管中；往残留的下有机相的玻璃珠中加入2mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(2:1)混合液、1mL甲醇/水/氯仿(体积比48:47:3)混合液，并快速涡旋振荡；
[0059] (7)室温、1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；
[0061] (9)往干燥后的脂质内加入1mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(体积比2:1)混合液，并转移至玻璃管中，并用UHPLC-QTOF-MS检测各菌株中复杂鞘脂成分的变化情况。
[0062] 结果如图3所示：在1％丁醇处理条件下过表达CERT显著增强了细胞膜上磷酰基神经酰胺(IPC)、甘露酰肌醇神经酰胺(MIPC)、甘露酰二肌醇神经酰胺(M(IP)2C)的含量，使得这三种神经酰胺在重组菌中的含量较野生型酿酒酵母分别提高了20％、65％、和56％。以上结果表明，基因CERT能够调节细胞膜上复杂鞘脂的组分。
[0063] 实施例4：各菌株细胞膜完整性的测定
[0064] 本实验采用测定被SYTOX-green染色的方法来表征细胞膜完整性。具体方法是取对数期培养的酵母细胞1g，用无菌水清洗两次后，然后用0％，1％，2％丁醇于30℃处理4h，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，加入SYTOX-green(成品购自于Sigma Aldrich公司)避光处理20min，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，过尼龙滤网膜加入到流式小管中，用流式细胞仪检测被SYTOX-green染色的细胞占被检测总细胞的比例，(测定条件参见Wu C,et al,CgHog1-mediated CgRds2 phosphorylation alters glycerophospholipid composition to coordinate osmotic stress in Candida glabrata.2019,85(6):e02822-02818.)。
[0065] 结果如图4所示：(1)在正常条件下(YNB+0％丁醇)，出发菌株W303-1A，过表达菌株PY26-CERT细胞膜完整性无明显差异；(2)在1％丁醇条件下，过表达菌株PY26-CERT较pY26-NVJ2菌株提高25％，较对照组(野生型)提高27.8％。结果表明神经酰胺转运蛋白对于酵母提高细胞膜完整性有重要作用。其抗丁醇胁迫作用可能是通过提高菌株的细胞膜完整性来适应丁醇胁迫的。
[0066] 对比例1
[0067] 菌株具体构建方式参见实施例1，区别在于，将CRET基因替换为来源于酿酒酵母的Nvj2基因(为酿酒酵母本源编码神经酰胺转运蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，构建得到含Nvj2的重组菌pY26-Nvj2，利用P3/P4为引物，以酿酒酵母W303-1A基因组为模板扩增Nvj2(酿酒酵母本源的神经酰胺转运蛋白)，并通过限制性内切酶SacIⅠ和NotⅠ消化将Nvj2扩增片段连接到质粒PY26上，并由强启动子TEF1启动转录翻译。
[0068] P3：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGCTAGCTTGAAGGTATTTC(SEQ ID NO.5)
[0069] P4：TCCCCGCGGTCACAGTTTGGGCTCTCG(SEQ ID NO.6)，(下划线处为酶切位点)[0070] 参见实施例2，测定菌株的生长性能：
[0071] (1)平板生长实验结果：在正常条件下(YNB+0％丁醇)下各菌株的生长能力基本一致，并无显著差异；在YNB+1％丁醇条件下，pY26-CERT菌株较对菌株与pY26-NVJ2菌株的生长能力显著提升；在YNB+2％丁醇条件下，各菌株的生长能力均有减弱，且各菌株间的生长差异并不显著(图1)。
[0072] (2)生长曲线测定结果：在正常条件下(YNB+0％丁醇)下各菌株的最终生物量基本一致，并无显著差异；在YNB+1％丁醇条件下，pY26-CERT菌株较对菌株与pY26-NVJ2菌株的最终生物量分别提高了19.7％、18.4％；在YNB+2％丁醇条件下，各菌株的生长能力均有减弱，且各菌株间的生长差异并不显著(图2)。
[0073] (3)菌株对不同浓度丁醇耐受性：过表达NVJ2对细胞的生长并无促进作用，与对照组无显著差异。
[0074] 对比例2
[0075] 具体实施方式参见实施例3，对重组菌pY26-NVJ2、pY26-CERT分别在0％丁醇、1％丁醇、2％丁醇条件下的细胞膜鞘脂成分进行检测，结果在1％丁醇条件下pY26-CERT菌株的鞘脂水平较pY26-NVJ2具有显著变化，pY26-CERT菌株的IPC含量较pY26-NVJ2提高了9.28％，MIPC含量提高了33.3％，M(IP)2C含量提高了38.6％；而在0％丁醇、2％丁醇条件下的鞘脂含量并无显著变化(图3)。
[0076] 对比例3
[0077] 具体实施方式参见实施例4，对菌株细胞膜完整性进行测定，结果显示1％丁醇条件下pY26-CERT菌株的细胞膜完整性较pY26-NVJ2具有显著变化，其中pY26-CERT菌株的细胞膜完整性较pY26-NVJ2提高了27.8％，而在0％丁醇、2％丁醇条件下的细胞膜完整性并无显著变化(图4)。
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