一株酿酒酵母及其应用
阅读：988发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株酿酒酵母及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株酿酒 酵母 及其应用。本发明公开的 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CCTCC NO：M 20191077。本发明公开的酿酒酵母能够以L-苯丙 氨 酸为底物，高效合成β-苯 乙醇 ，同时仅产生少量乙醇。本发明的酿酒酵母具有工业化潜 力 ，所得β-苯乙醇产品绿色、天然、环保，可用于食品、日化等高端领域，具有广阔的应用前景。，下面是一株酿酒酵母及其应用专利的具体信息内容。
1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CCTCC NO：M 20191077。
2.一种制备β-苯乙醇的方法，包括将权利要求1所述的酿酒酵母在发酵培养基中进行发酵培养，从而将底物L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：培养温度28-30℃，发酵pH为4.0-6.0，转速600-1000rpm，溶氧在20％-50％，通气比1-1.5vvm。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中包含有机碳源、氮源、酿酒酵母生长所需的营养盐和L-苯丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述有机碳源为葡萄糖。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述氮源为尿素和/或酵母粉。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于：所述营养盐包含钾盐、镁盐、钙盐、铜盐、锰盐、铁盐和/或锌盐。
8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基含有葡萄糖1-
6g/L，L-苯丙氨酸5-30g/L，酵母粉1-6g/L，尿素2-8g/L，磷酸二氢钾2-8g/L，硫酸镁1-3g/L，氯化钙0.2-1.5g/L，硫酸铜0.01-0.1g/L，硫酸锰0.01-0.1g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，氯化锌
0.1-1g/L，余量为水，pH 4.5-6.0。
9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其特征在于：所述酿酒酵母是通过种子液按照
2-10％的接种量接入所述发酵培养基中进行所述发酵培养的；
所述种子液是将权利要求1所述的酿酒酵母在种子培养基中进行种子培养得到的；
优选地，所述种子培养的条件为：培养温度30℃，转速200rpm；
优选地，所述种子培养基含有酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水。
10.权利要求1所述的酿酒酵母和/或其菌悬液、发酵液、代谢产物在制备β-苯乙醇中的应用。
一株酿酒酵母及其应用
技术领域
背景技术
[0002] β-苯乙醇(PEA)又名2-苯乙醇、β-苯基乙醇，是一种具有淡雅清甜玫瑰花香的无色粘稠液体，其广泛存在于水仙、风信子、茉莉花、百合、玫瑰等植物的精油中。β-苯乙醇是全球第二大需求量的香料品种，因其具有独特、持久、细腻的玫瑰香味及对碱的稳定性，被广泛地应用于食品、日化和化妆品行业。
[0003] β-苯乙醇虽然广泛存在于很多植物中，但其含量极低，从植物中提取β-苯乙醇生产周期长、步骤复杂、成本昂贵，因此无法进行大规模的工业化生产以满足市场需求。目前，工业上β-苯乙醇生产主要采用苯或苯乙烯为原料的化学合成法。但其原料苯和苯乙烯都是致癌物质，对人体健康和环境都有危害。此外，化学合成β-苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物，影响了产品质量。近年来，微生物发酵法生产β-苯乙醇，具有生产周期短、安全性高、成本低、生产过程污染少等优势，已成为国内外研究的热点。中国专利申请CN109370929A中公开的酿酒酵母的发酵液中β-苯乙醇产量为7.8g/L，达到较优水平，但同时生成大量乙醇，生产β-苯乙醇的经济性较差。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提高微生物发酵生产β-苯乙醇的产量，同时有效控制发酵液中的乙醇含量。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CCTCC NO：M 20191077。本发明提供的酿酒酵母为酿酒酵母WHSW-22(Saccharomyces cerevisiae WHSW-22)，已于2019年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 20191077。酿酒酵母WHSW-22在YPD固体平板上的菌落形态为：表面光滑、湿润、粘稠，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落为乳白色。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明还提供一种制备β-苯乙醇的方法，包括将上述酿酒酵母在发酵培养基中进行发酵培养，将底物L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇的步骤。
[0009] 在一些实施方案中，上述方法中，所述有机碳源为葡萄糖。
[0010] 在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述氮源为尿素和/或酵母粉。
[0012] 在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养基含有葡萄糖1-6g/L，L-苯丙氨酸5-30g/L，酵母粉1-6g/L，尿素2-8g/L，磷酸二氢钾2-8g/L，硫酸镁1-3g/L，氯化钙0.2-1.5g/L，硫酸铜0.01-0.1g/L，硫酸锰0.01-0.1g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，氯化锌0.1-1g/L，余量为水，pH 4.5-6.0。
[0014] 所述种子液是将上述酿酒酵母在种子培养基中进行种子培养得到的；
[0015] 优选地，所述种子培养的条件为：培养温度30℃，转速200rpm；
[0016] 优选地，所述种子培养基含有酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水。
[0017] 为解决上述技术问题，本发明还提供上述酿酒酵母和/或其菌悬液、发酵液、代谢产物在制备β-苯乙醇中的应用，优选在生物转化L-苯丙氨酸生产β-苯乙醇中的应用。
[0018] 本发明的酿酒酵母WHSW-22可以优选以葡萄糖为碳源，经过发酵过程将L-苯丙氨酸转化成β-苯乙醇。另外，本发明提供的发酵生产β-苯乙醇的方法可高效、专一地合成β-苯乙醇(发酵液中其含量可以高达12.5g/L)，并控制乙醇产量(含量低至0.89g/L)，更适用于β-苯乙醇的工业化生产。
[0019] 本发明公开的酿酒酵母能够以L-苯丙氨酸为底物高效合成β-苯乙醇，同时仅产生少量乙醇。本发明的酿酒酵母具有工业化潜力，所得β-苯乙醇产品绿色、天然、环保，可用于食品、日化等高端领域，具有广阔的应用前景。
[0020] 保藏说明
[0021] 菌种名称：酿酒酵母WHSW-22
[0022] 拉丁名：Saccharomyces cerevisiae WHSW-22
[0023] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0024] 保藏机构简称：CCTCC
[0025] 地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学
[0026] 保藏日期：2019年12月20日
[0028] 图1是β-苯乙醇标准品的HPLC图谱。
[0029] 图2是酿酒酵母WHSW-22发酵液的HPLC图谱。
[0030] 图3是β-苯乙醇标准品的特征峰ESCI/MS图谱。
[0031] 图4是酿酒酵母WHSW-22发酵液中的β-苯乙醇的特征峰ESCI/MS图谱。
[0032] 图5是酿酒酵母WHSW-22的平板菌落形态。
[0033] 图6是酿酒酵母WHSW-22的光学显微镜下形态。
[0034] 图7是酿酒酵母WHSW-22的进化树。
具体实施方式
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0038] 实施例1：酿酒酵母WHSW-22的筛选
[0039] 1、培养基的制备
[0040] 选择性筛选固体培养基：酵母粉3g/L、蛋白胨7g/L、葡萄糖5g/L、氯化钠4g/L、β-苯乙醇8g/L、琼脂粉15g/L，pH 7.2。
[0041] β-苯乙醇发酵培养基：葡萄糖4g/L、L-苯丙氨酸20g/L、酵母粉3g/L、尿素5g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁2g/L、氯化钙1.0g/L、硫酸铜0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、硫酸亚铁0.5g/L、氯化锌0.5g/L，余量为水，pH 6.0。
[0042] 2、菌种筛选
[0043] 将烟台山公园采集的表层土壤用研钵研碎后取1g样品于50mL水中，200rpm室温震荡30min，取混悬液，按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释倍数用无菌水进行稀释，得到不同浓度的稀释土壤菌液。取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到选择性筛选固体培养基，30℃静置培养72小时后挑取单菌落，将单菌落接种到β-苯乙醇发酵培养基中，30℃、200rpm震荡培养72小时，得到发酵液。
[0044] 3、高效液相色谱检测β-苯乙醇含量
[0045] β-苯乙醇标准曲线绘制
[0046] 标准β-苯乙醇溶液：准确称取0.1000gβ-苯乙醇(精确至0.1mg)于100mL玻璃容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。
[0047] 标准工作曲线溶液：准确吸取0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL标准β-苯乙醇溶液于10mL容量瓶中，纯水定容至刻度，混匀，此溶液现配现用。
[0049] 将步骤2得到的发酵液在10000rpm条件下离心，收集上清液并用0.22μm微孔滤膜过滤处理，再将滤液进行高效液相色谱仪(Agilent，美国)检测，检测条件如下：
[0050] 色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm,10μm；Ailite，中国)；
[0051] 流动相：甲醇:水＝50:50(体积比)；
[0052] 流动相流速：0.7mL/min；
[0053] 柱温：30℃；
[0054] 检测波长：254nm；
[0055] 进样量：10μL。
[0056] 样品中β-苯乙醇浓度经β-苯乙醇标准曲线计算得到。
[0057] 将其中β-苯乙醇产量最高的一株菌命名为酿酒酵母WHSW-22。
[0058] β-苯乙醇标准品的HPLC图谱如图1所示，其出峰时间为16.07min。酿酒酵母WHSW-22的发酵液的HPLC图谱如图2所示，酿酒酵母WHSW-22的发酵液中的β-苯乙醇的出峰时间为
16.07min，与β-苯乙醇标准品的出峰时间一致。
16.07min，与β-苯乙醇标准品的出峰时间一致。
[0059] 进一步地，针对酿酒酵母WHSW-22的发酵液中的β-苯乙醇的特征峰进行ESCI/MS分析，结果如图4所示。图4表明，该特征峰中所含的物质的分子量为105，与图3显示的β-苯乙醇标准品的特征峰ESCI/MS图谱一致，确定发酵液中的物质为β-苯乙醇。
[0060] 实施例2：酿酒酵母WHSW-22的鉴定
[0061] 1、菌株的形态学和生理生化特征
[0062] 酿酒酵母WHSW-22在YPD固体平板上的菌落形态如图5所示。WHSW-22菌落表面光滑、湿润、粘稠，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落为乳白色。光学显微镜下观察其形态均呈球状，出芽生殖，如图6所示。
[0063] 2、菌株WHSW-22 18S rDNA鉴定
[0064] (1)提取酿酒酵母WHSW-22的基因组，用双蒸水稀释成50ng/μL作为模板DNA，采用如下引物对进行PCR扩增以扩增其18S rDNA：
[0065] EF3:5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’(SEQ ID NO:1)；
[0066] EF4:5’-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3’(SEQ ID NO:2)。
[0067] PCR扩增体系：1μL 10μmol/L的EF3、1μL 10μmol/L的EF4、4μL dNTP混合液(dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度均为10mmol/L)、5μL 10×PCR Buffer、1μL模板DNA、0.5μL 5U/μL的Taq DNA聚合酶，双蒸水补足体积至50μL。
[0069] (2)将PCR扩增产物经过纯化后进行测序，测序结果如SEQ ID NO:3所示。
[0070] (3)通过将SEQ ID NO:3与GenBank中已有的18S rDNA序列进行Blast相似性比较确定菌株的种属。结合菌株的形态学特征和18S rDNA比对结果，最终将菌株确定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母WHSW-22的进化树如图7所示。
[0071] 酿酒酵母WHSW-22(Saccharomyces cerevisiae WHSW-22)已于2019年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 20191077。
[0072] 实施例3
[0073] 挑取1环酿酒酵母WHSW-22接入种子培养基(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃、200rpm振荡培养24h后按2％(体积比)的接种量接入装有3L发酵培养基(葡萄糖3g/L、L-苯丙氨酸5g/L、酵母粉1g/L、尿素2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁
1g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸铜0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸亚铁0.1g/L、氯化锌0.1g/L，余量为水，pH 5.0)的7L发酵罐中，控制发酵温度为28℃，pH为4.0，转速为600rpm，通气比为
1vvm，溶氧20％，发酵48h。
1g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸铜0.01g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸亚铁0.1g/L、氯化锌0.1g/L，余量为水，pH 5.0)的7L发酵罐中，控制发酵温度为28℃，pH为4.0，转速为600rpm，通气比为
1vvm，溶氧20％，发酵48h。
[0074] 将发酵液进行实施例1的HPLC分析，测得β-苯乙醇含量为3.9g/L，使用HPLC以类似的方法测得乙醇含量为1.75g/L。
[0075] 实施例4
[0076] 挑取1环酿酒酵母WHSW-22接入种子培养基(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃、200rpm振荡培养24h后按10％(体积比)的接种量接入装有5L发酵培养基(葡萄糖1g/L、L-苯丙氨酸30g/L、酵母粉6g/L、尿素3g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁3g/L、氯化钙1.5g/L、硫酸铜0.1g/L、硫酸锰0.1g/L、硫酸亚铁1g/L、氯化锌1g/L，余量为水，pH4.5)的7L发酵罐中，控制发酵温度为30℃，pH为5.0，转速为1000rpm，通气比1.5vvm，溶氧30％，发酵48h。
[0077] 将发酵液进行实施例1的HPLC分析，测得β-苯乙醇含量为8.53g/L，乙醇含量为1.31g/L。
[0078] 实施例5
[0079] 挑取1环酿酒酵母WHSW-22接入种子培养基(酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃、200rpm振荡培养24h后按5％(体积比)的接种量接入装有4L发酵培养基(葡萄糖6g/L、L-苯丙氨酸20g/L、酵母粉1g/L、尿素8g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁
2g/L、氯化钙1.5g/L、硫酸铜0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、硫酸亚铁0.5g/L、氯化锌0.5g/L，余量为水，pH 6.0)的7L发酵罐中，控制发酵温度为29℃，pH为6.0，转速为800rpm，通气比
1.2vvm，溶氧50％，发酵48h。
2g/L、氯化钙1.5g/L、硫酸铜0.05g/L、硫酸锰0.05g/L、硫酸亚铁0.5g/L、氯化锌0.5g/L，余量为水，pH 6.0)的7L发酵罐中，控制发酵温度为29℃，pH为6.0，转速为800rpm，通气比
1.2vvm，溶氧50％，发酵48h。
[0080] 将发酵液进行实施例1的HPLC分析，测得β-苯乙醇含量12.5g/L，乙醇含量为0.89g/L。
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