技术领域
[0001] 本
发明涉及多肽类
生物药物领域，具体地说，涉及一种鹿茸多肽混合物及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]
炎症是当病原体侵袭
机体时，机体发生的一种重要的防御反应。过量的炎症反应会导致发生一些慢性炎症
疾病，如类
风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、咽炎和肠道炎性疾病等。目前
治疗或干预慢性炎症疾病的方法，包括甾体类和非甾体类抗炎药。然而，这些药物疗效有限，且存在较多严重的并发症和
副作用，如胃肠道不适、肾毒性、增加心脏病发作的危险率等。因此，开发具有炎症防治功效的食品功能因子，对防治炎症、提高食品的附加值、开发相关
功能性食品和保健品均具有重要意义。
[0003]
蛋白质经胃肠消化、
发酵或体外
水解，在蛋白酶的作用下可产生一些具有特殊生理调节作用的生物活性肽。同时，寡肽的吸收具有快速、不易饱和、耗能低、与
氨基酸的吸收无竞争等特点。近年来，抗炎肽引起了科研人员的关注。已有报道发现一些从蛋白质的水解物中分离的多肽具有抗炎作用，如三文鱼多肽、大豆多肽、菜豆多肽、螺旋藻多肽和贝类多肽等，可以有效减少促炎细胞因子和增加抗炎因子的表达。
[0004] 鹿茸是我国传统名贵中药，可用于功能性食品和保健品，具有生精补髓、养血益阳、强筋健骨、延年益寿等功效。蛋白质是鹿茸中最主要的化学成分，占干重的52％以上。鹿茸多肽具有免疫调节、抗炎、促进
细胞增殖及修复神经损伤等生物学效应，作为鹿茸的功能成分之一已经得到认可。然而，现有对于鹿茸的研究多集中于脂溶性成分及天然存在的生物活性肽，而常常忽视对高含量的蛋白质的开发和利用，且鲜有对鹿茸蛋白水解物功能活性的报道。因此，高效利用鹿茸蛋白资源，制备源自鹿茸蛋白的抗炎多肽，开发相关的功能性食品和保健品具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
[0005] 为了解决
现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种鹿茸多肽混合物及其制备方法与应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种鹿茸多肽混合物，所述鹿茸多肽混合物的主要组分为Ala-His-Gly，Ala-His-Trp-Lys，Val-His，Leu-Ala-Gln，Ile-Ala，Ala-Tyr，Ala-Leu和Thr-Leu。
[0007] 进一步地，所述多肽混合物的制备方法包括如下步骤：
[0008] 1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；
[0009] 2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；
[0010] 3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。
[0011] 进一步地，所述胃蛋白酶的添加量为鹿茸蛋白
质量的1/500，所述胰酶的添加量为鹿茸蛋白质量的1/250。
[0012] 进一步地，所述步骤3)具体为：
[0013] a.将分子量小于3kDa的多肽组分进行浓缩使用大孔
吸附树脂进行分离纯化，采用
乙醇梯度洗脱，测定各220nm吸收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组分；
[0014] b.将上述组分用凝胶过滤色谱柱进行分离，采用去离子水洗脱，测定各220nm吸收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组分；
[0015] c.将上述组分用半制备型反相HPLC进行分离，采用含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液梯度洗脱，测定各220nm吸收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组分，即得。
[0016] 针对步骤3)，本发明提供一个具体实施方式如下：
[0017] a.将分子量小于3kDa的多肽组分进行浓缩，使用大孔吸附树脂DA201-C(2.6×40cm)进行分离纯化，上样量为10mL，样品浓度为30mg/mL，采用乙醇梯度洗脱，洗脱流速为3mL/min。首先用去离子水洗脱2个柱体积，然后用乙醇梯度(0～100％乙醇)洗脱3个柱体积，最后再用无水乙醇洗脱2个柱体积。混合物中的多肽按疏水性被流动相依次洗脱下来，用紫外检测器监测洗脱液在220nm吸收峰，收集洗脱体积在600～1150mL的组分，冻干成粉末；
[0018] b.将上述组分用凝胶过滤色谱柱Sephadex G-15(1.6×70cm)进行分离，上样量为5mL，样品浓度为5mg/mL，采用去离子水洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积，混合物中的多肽按分子量大小依次被洗脱下来，用紫外检测器监测洗脱液在220nm吸收峰，收集洗脱体积在60～120mL的组分，冻干成粉末；
[0019] c.将上述组分用半制备型反相HPLC分离，分离时使用ODS色谱柱(Eclipse XDB-C187μm，21.2×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液梯度洗脱，上样量为3mL，样品浓度为10mg/mL，流动相A为含0.1％TFA的乙腈，流动相B为含0.1％TFA的超纯水；洗脱条件为：0～10min 1％A；10～60min 1～45％A；60～70min 45～100％A；
70～85min 100％A；85～90min 100～0％A；洗脱流速为5mL/min，用紫外检测器监测洗脱液在220nm吸收峰，收集洗脱时间在22～26min的组分，冻干成粉末，即得所述多肽混合物。
[0020] 进一步地，所述抗炎活性的测定方法如下：
[0021] 1、收集组分，冻干成粉末，配制成质量百分比浓度为0.05％的样品溶液测定其抗炎作用。
[0022] 2、制备3×105个/mL的RAW264.7巨噬细胞悬液，按100μL/孔加入到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2的
培养箱中培养3小时。之后吸弃上清，按100μL/孔加DMEM完全培养基和10μL LPS溶液(终浓度为10μg/mL)，样品组添加10μL不同的样品溶液，空白以PBS代替样品，然后将培养板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24小时。采用经典的-Griess法检测培养液中NO含量，通过NO2与磺酸及
萘乙烯二胺
盐酸盐反应生成粉红色偶氮化合物，于
波长550nm比色，间接测得NO含量。NO含量越低，表明样品的抗炎作用越强。
[0023] 按照上述分离，使用液相色谱偶联
串联质谱技术鉴定所述鹿茸多肽混合物中多肽的氨基酸序列，共得到了八个多肽序列，如表1所示。
[0024] 表1本发明所述鹿茸多肽混合物中的八个多肽序列
[0025]编号 分子量 氨基酸序列 含量(％)
1 283.1 Ala-His-Gly 3.9
2 540.3 Ala-His-Trp-Lys 4.1
3 254.1 Val-His 5.1
4 316.1 Leu-Ala-Gln 5.7
5 252.1 Ala-Tyr 7.6
6 202.1 Ile-Ala 22.3
7 232.1 Thr-Leu 15.1
8 202.1 Ala-Leu 4.5
[0026] 进一步地，所述步骤1)具体为：将鹿茸蛋白与水混合，得到
混合液，在37±1℃，pH＝1.5～2.0的条件下，利用胃蛋白酶水解2～4小时，再在37±1℃，pH＝5.0～8.0的条件下，利用胰酶水解4～8小时。
[0027] 其中，所述混合液中鹿茸蛋白的质量百分比为2％～5％。
[0028] 进一步地，所述步骤2)具体为：将鹿茸蛋白水解物进行离心分离，收集上清液，并将获得的上清液采用3kDa
超滤膜进行分离，收集下层清液，得到分子量小于3kDa的多肽组分。
[0029] 本发明还提供了前述鹿茸多肽混合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0030] 1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；
[0031] 2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；
[0032] 3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。
[0033] 其中，所述的灭酶处理为采用加热的方法使蛋白酶失活，例如，沸水浴加热10分钟。
[0034] 进一步地，所述鹿茸蛋白为从鹿茸及其副产物中提取得到的蛋白。
[0035] 具体为：取新鲜鹿茸或鹿茸副产物经
冷冻干燥后低温
粉碎制成粉末。称取100g粉末加入800mL蛋白提取液(100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0.02mol/L EDTA-2Na+1％蛋白酶
抑制剂)，4℃浸提36h，然后于4500rpm离心30分钟，收集上清液。经梯度盐析、
透析、冷冻干燥得鹿茸
水溶性蛋白，低温密封保存。
[0036] 本发明还提供了含有前述鹿茸多肽混合物的功能性食品或保健品或药物。
[0037] 本发明还提供了前述鹿茸多肽混合物在制备具有抗炎活性的功能性食品或保健品或药物中的应用。
[0038] 本发明的有益效果在于：
[0039] 本发明提供的具备抗炎活性的鹿茸多肽混合物，原料成本低，鹿茸蛋白可来源于炸茸水、鹿茸胶、鹿茸皮、鹿茸渣等鹿茸精加工中的副产物，鹿茸精残渣常用作畜禽
饲料添加剂，从而使成品具有较高的附加值。
[0040] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，能够显著抑制炎症巨噬细胞NO的生成，具有很强的抗炎作用，在对由慢性炎症诱发的疾病的防治和
辅助治疗方面具有较好的应用前景。该产品可用于功能性食品、保健品、动物食品及饲料等，应用范围广，具有很高的社会和经济效益。
[0041] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，从蛋白酶解液中获取，安全性高，生产条件温和，生产条件易于控制及成本低，易于开发利用。
[0042] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，主要由2～4个氨基酸的多肽组成，分子量小，更易被消化道吸收和直接利用。
附图说明
[0043] 图1为本发明所述的鹿茸蛋白水解液小于3kDa超滤组分经大孔吸附树脂DA201-C分离的洗脱曲线(A)及各分离组分的抗炎作用(B)。
[0044] 图2为图1中组分F2经Sephadex G-15凝胶过滤层析分离的谱图(A)及各分离组分的抗炎作用(B)。
[0045] 图3为图2中组分G2经半制备反相高效液相分离(RP-HPLC)的谱图(A)及各分离组分的抗炎作用(B)，组分H3的抗炎作用最强。
[0046] 图4为图3中组分H3所含八种主要多肽的串联质谱图。
具体实施方式
[0047] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048] 实施例1酶法制备含抗炎肽的鹿茸蛋白水解物
[0049] 一、鹿茸水溶性蛋白的制备
[0050] 取新鲜鹿茸或鹿茸副产物经冷冻干燥后低温粉碎制成粉末。称取100g粉末加入800mL蛋白提取液(100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0.02mol/L EDTA-2Na+1％蛋白酶抑制剂)，4℃浸提36h，然后于4500rpm离心30分钟，收集上清液。经梯度盐析、透析、冷冻干燥得鹿茸水溶性蛋白，低温密封保存。
[0051] 二、用酶法制备含抗炎肽的鹿茸蛋白水解物
[0052] 将鹿茸蛋白与水混合，得到混合液，使得鹿茸蛋白在混合液中的质量百分比为2.5wt％，用10mol/L的盐酸调节混合液的pH值至2.0，然后加入胃蛋白酶(pepsin)，酶与鹿茸蛋白的质量比为1：500，于37℃进行水解反应2.0小时；在此
基础上用胰酶继续进行酶解，用10mol/L NaOH调节胃蛋白酶水解产物的pH值为6.9，酶与鹿茸蛋白的质量比为1：
250，于37℃继续水解4小时，水解结束时，将水解物于沸水浴中加热10分钟，停止酶解反应，得到鹿茸蛋白水解物。
[0053] 将得到的鹿茸蛋白水解物进行离心分离，收集上清液，并将获得的上清液采用3kDa超滤膜进行分离，将所有分子量大于超滤膜截留分子量的多肽留在膜上，除去脂肪和大分子蛋白、多肽及杂质等，收集下层清液，得到分子量小于3kDa的多肽组分，然后冻干，得到冻干粉。
[0054] 将上述得到的冻干粉配制成质量百分比浓度为0.01～0.2％的水溶液，测定其抗炎作用。
[0055] 抗炎作用的测定方法：制备3×105个/mL的RAW264.7巨噬细胞悬液，按100μL/孔加入到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养3小时。之后吸弃上清，按100μL/孔加DMEM完全培养基和10μL LPS溶液(终浓度为10μg/mL)，样品组添加10μL不同浓度的样品溶液，空白以PBS代替样品，然后将培养板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24小时。采用经典的Griess法检测培养液中NO含量，NO含量越低，表明样品的抗炎作用越强。
[0056] 结果：上述得到的冻干粉在质量百分比浓度为0.01～0.2％时，均对炎症巨噬细胞NO生成有抑制作用。当质量百分比浓度为0.05％时，对炎症巨噬细胞NO生成量的抑制率为25.5％；当质量百分比浓度增加至0.2％时，对炎症巨噬细胞NO生成量的抑制率可达73.7％。
[0057] 实施例2分离获得鹿茸多肽混合物并鉴定其组成
[0058] 将实施例1中得到的冻干粉用少量去离子水溶解，用大孔吸附树脂DA201-C(2.6×40cm)进行分离，上样量为10mL，样品浓度为30mg/mL，采用乙醇梯度洗脱，洗脱流速为3mL/min。首先用去离子水洗脱2个柱体积，然后用乙醇梯度(0～100％乙醇)洗脱3个柱体积，最后再用无水乙醇洗脱2个柱体积。混合物中的肽按疏水性由弱到强依次洗脱下来，在220nm检测洗脱液中多肽的浓度，将混合物中的多肽成三个组分，如图1(A)所示，并检测各个组分对应的抗炎作用(抗炎作用的测定方法与实施例1中相同)，如图1(B)所示，收集抗炎作用最高的组分F2，然后冻干成粉末。
[0059] 将组分F2的冻干粉用去离子水溶解，上样到用去离子水平衡后的Sephadex G-15(1.6×70cm)色谱柱上进行分离纯化。上样量为5mL，样品浓度为5mg/mL，采用去离子水洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱4个柱体积，混合物中的肽按分子量由大到小依次洗脱下来，在220nm检测洗脱液中多肽的浓度，将混合物中的多肽分成四个组分，如图2(A)所示，并检测各个组分对应的抗炎作用(抗炎作用的测定方法与实施例1中相同)，如图2(B)所示，收集抗炎作用最高的组分G2，然后冻干成粉末。
[0060] 将组分G2进一步用半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化。分离时使用ODS色谱柱(Eclipse XDB-C187μm，21.2×250mm)，上样量为3mL，样品浓度为10mg/mL，流动相A为含0.1％TFA的乙腈，流动相B为含0.1％TFA的超纯水；洗脱条件为：0～10min 1％A；10～60min 1～45％A；60～70min 45～100％A；70～85min 100％A；85～90min100～0％A；洗脱流速为5mL/min，220nm下检测多肽的出峰时间，将混合物中的多肽分成十个组分，如图3(A)所示，测定各分离组分的抗炎作用，如图3(B)所示，收集抗炎作用最高的组分H3，然后用冻干机冻干。
[0061] 分离得到抗炎组分H3后，采用液相色谱偶联串联质谱技术对混合物中多肽的氨基酸序列进行鉴定，鉴定出八种多肽，氨基酸序列分别为：Ala-His-Gly，Ala-His-Trp-Lys，Val-His，Leu-Ala-Gln，Ile-Ala，Ala-Tyr，Ala-Leu和Thr-Leu，如图4所示。
[0062] 实施例3制备含有本发明所述鹿茸多肽混合物的抗炎保健饮料
[0063] 抗炎保健饮料配方如下(以质量百分比计)：
[0064]
[0065]
[0066] 食用香精适量
[0067] 纯净水补充至100％。
[0068] 源自鹿茸蛋白的抗炎肽混合物，既增强了金
银花保健饮料的抗炎功能，又提高了产品蛋白质含量，是绿色、安全、健康的功能性食品配料。
[0069] 实施例4制备含有本发明所述鹿茸多肽混合物的清咽抗炎含片
[0070] 清咽抗炎含片配方如下(以质量百分比计)：
[0071]
[0072] 经包埋处理，混料制粒，干燥压片等过程制得产品。源自鹿茸蛋白的抗炎肽混合物在含服的过程中可被快速吸收，功效显著，主要起润喉消炎止痒的作用。
[0073] 实施例5制备含有本发明所述鹿茸多肽混合物的保健成犬粮
[0074] 成犬粮配方为(以质量百分比计)：鸡肉10％，大米20％，
豆粕18％，玉米20％，鱼粉10％，面粉10％，食用油7％，在此基础上添加1-2％的抗炎肽混合物，再添加微量元素、维生素、
防腐剂和
诱食剂，经
挤压膨化制得成品犬粮。
[0075] 源自鹿茸蛋白的抗炎肽混合物作为新型
宠物食品或饲料添加剂，既能有效缓解动物的各种炎症，如皮炎，肠胃炎症等，又能帮助动物补充蛋白质，同时起到促进生长及增强免疫
力的作用。
[0076] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
