一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY及其应用
阅读：963发布：2024-02-25
专利汇可以提供一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一株分泌抗西地那非单克隆 抗体 的杂交瘤细胞株YY及其应用，属于 食品安全 免疫检测领域。本 发明 的分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13100。所述杂交瘤细胞株YY可以分泌产生对西地那非具有较好亲和 力 和较高灵敏度，对西地那非的50%抑制浓度IC50为0.48μg/L，可用于制备西地那非的免疫检测 试剂 盒 以及胶体金 试纸 条，为中成药和保健食品中西地那非的检测提供有力的检测方法及手段。，下面是一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY及其应用专利的具体信息内容。
一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 西地那非(Sildenafil，Sild), 全名枸橼酸西地那非，是万艾可(又名“伟哥”)的主要活性药物成分。西地那非是对环磷酸鸟苷（cGMP）特异的5型磷酸二酯酶(PDE5)选择性抑制剂，可用于治疗阴茎勃起功能障碍(ED)。近年来，中成药及保健食品中非法添加化学药品事件屡禁不止，补肾壮阳类中成药及保健品因其庞大的服用人群和巨大的市场销售量，更是成为非法添加的重灾区，因此，如何建立节省费用、针对性强、效率高的快检方法、严厉打击假劣药品、控制药品质量是做好药品监管的重要保障。
[0003] 目前西地那非检测多采用理化方法如紫外光谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法等，紫外光谱法和薄层色谱法因干扰难以排除，方法受到限制。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明的目的在于提供一种对西地那非具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对西地那非具有较好的亲和力和灵敏度，可以用来建立西地那非酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法。
[0005] 本发明的技术方案：一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13100，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。
[0006] 抗西地那非单克隆抗体，其是由保藏编号CGMCC No.13100杂交瘤细胞株YY分泌产生。
[0007] 所述抗西地那非单克隆抗体的应用，用于中成药及保健食品中西地那非残留的检测。
[0008] 本发明提供的YY细胞株的制备基本步骤为：
[0010] （2）小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
[0011] （3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株YY；
[0012] （4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
[0013] 本发明的有益效果：（1）本发明获得的抗西地那非单克隆抗体，对西地那非有较好的检测灵敏度和亲和力；（2）一种新的合成西地那非免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。
[0014] 生物材料样品保藏：一株分泌抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13100，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。附图说明
[0015] 图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。
[0016] 图2是西地那非单克隆抗体的标准抑制曲线。
具体实施方式
[0017] 本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0018] 本发明通过将西地那非完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对西地那非有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0019] 实施例1：抗西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株YY的制备
[0020] 1、西地那非半抗原的合成：取500mg西地那非和90mg氨基乙酸溶解在20mL的甲醇中，边搅拌边加入236.4mg 的三乙基胺。混合物在70℃反应4小时。 反应结束后，将50ml 蒸馏水加入反应物中终止反应。之后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和NaCl溶液清洗三次， Na2SO4除去有机相中的水，过硅胶柱，真空干燥得黄色固体粉末，即得西地那非半抗原。
[0021] 2、完全抗原的合成：取3mg西地那非半抗原，加入4.5mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.6mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），使用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化4h；另取10mg KLH（钥孔血蓝蛋白）溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CB溶液（碳酸盐缓冲溶液）中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，-20℃分装保存。
[0022] 3、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取西地那非完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。
[0023] 4、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
[0025] （2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
[0026] （3）将脾细胞和SP2/0细胞按照2～10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
[0027] 5、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用西地那非为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对西地那非有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YY。
[0028] 6、单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
[0029] 使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2a型，具体如表1所示。
[0030] 表1. 西地那非单克隆抗体的亚型鉴定
[0031]
[0032] 使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对西地那非的IC50为 0.48μg/L，并验证了其对他达拉非等的IC50及交叉反应率，具体如表2所示。
[0033] 表2西地那非单克隆抗体对西地那非、伐地那非、红地那非、豪莫西地那非、他达拉非的IC50及交叉反应率
[0034]
[0035] 7、抗体应用：将杂交瘤细胞株YY通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于西地那非ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
[0036] （1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的西地那非包被作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
[0037] （2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
[0038] （3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的西地那非标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1：16000稀释的抗西地那非单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；
[0039] （4）每孔加入100 μL 用含0.1% 明胶的PBS 1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；
[0040] （5）每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450nm测吸光值；
[0041] （6）添加回收及样品前处理：取1g胶囊样品内容物添加三个不同剂量的西地那非标准品，分别为2ng、5 ng、10ng。然后将内容物加 0.01M盐酸 20mL， 超声提取 30min，滤过, 滤渣同法提取 2 次；合并 3 次提取液，用氨水调pH 9，氯仿萃取 3 次，每次 20mL，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣用含10%甲醇的PBS定容至5mL，摇匀、待检。(药丸或片剂取相同量, 同上法操作)。采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为89%、91%、92%。
[0042] 溶液的配置：
[0043] 碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
[0044] 磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，3.62 g Na2HPO4·12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
[0045] PBST：含0.05% Tween20的PBS；
[0046] TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1：5混合即为TMB显色液，现用现混。
[0047] 综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
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