技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物监测技术领域，尤其涉及一种食源性小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 小肠结肠炎耶尔森菌，是一种革兰氏阴性杆菌，存在于各种环境中。作为一种食源性的致病菌，小肠结肠炎耶尔森菌的宿主广泛，可通过污染的食物和
水源传播，能致人和其他多种动物发生胃肠炎、关节炎、败血症及结节性红斑等病。耶尔森菌是导致小肠结肠炎的主要因素，且传染能
力强，人畜之间均可传播，是一种非常重要的
人畜共患病病原。目前，小肠结肠炎耶尔森菌的检验方法主要基于传统的生理生化方法检测，其检测周期长，耗费大量的人力和物力，且整体检验结果会受到环境等其他因素的影响，从而导致整体检验结果并不精准。环介导等温核酸扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种新型核酸快速等温扩增技术，可在等温条件下快速、高效、高特异性地扩增序列，具有检测速度快、成本低等特点。
发明内容
[0003] 本发明要解决目前缺乏快速准确检测小肠结肠炎耶尔森菌的试剂盒的技术问题，提供一种食源性小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测试剂盒，该试剂盒不仅操作简单、检测速度快、现场可视，而且灵敏性高、特异性强，适用于食源性小肠结肠炎耶尔森菌的快速精准检测。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0005] 在本发明的一个方面，提供了一种食源性小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对食源性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因设计的引物，所述引物包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、以及SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
[0006] 优选的，所述试剂盒还包含10×ThermoPol反应缓冲液、dNTP
混合液、MgSO4溶液、DNA聚合酶。
[0007] 优选的，所述试剂盒还包含显色试剂如SYBR Green I。
[0008] 本发明中，所述试剂盒采用等温扩增进行检测反应，等温扩增的步骤包括：60℃～70℃恒温孵育50～70分钟，80℃～90℃灭活3～8分钟。
[0009] 在本发明的另一方面，提供了一种用于食源性小肠结肠炎耶尔森菌LAMP检测的引物，其特异性扩增食源性小肠结肠炎耶尔森菌ail基因，所述引物包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、以及SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
[0010] 在本发明的另一方面，还提供了上述LAMP检测试剂盒的用途，用于对食品进行食源性小肠结肠炎耶尔森菌的检测。
[0011] 采用本发明的试剂盒，可以在
基层现场实时、快速、准确地检测食品中是否含有小肠结肠炎耶尔森菌，方便快捷地实现食品的安全监测。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了上述LAMP检测试剂盒的用途，用于实验室对食源性小肠结肠炎耶尔森菌进行鉴定。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种对食品进行食源性小肠结肠炎耶尔森菌检测的方法，包括以下步骤：
[0015] 增菌样品DNA提取；
[0016] 采用上述LAMP检测试剂盒对样品DNA进行检测；
[0017] 结果判定：肉眼观察反应管中反应液是否有沉淀，如果有沉淀，表明食品含有食源性小肠结肠炎耶尔森菌；或在紫外灯下观察反应液的
颜色，如果呈现黄绿色
荧光为阳性。
[0018] 本发明中，术语“引物”表示当与DNA的一条链
配对时在有合适的聚合试剂存在下能启动引物延伸合成产物的寡核苷酸。为使扩增效率最大，引物优选单链。引物的长度取决于许多因素，包括：应用领域、所采用的
温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。本领域技术人员可以根据本发明的小肠结肠炎耶尔森菌ail特征基因和具体需求自主设计引物。
[0019] 本发明食源性小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测试剂盒，其检测灵敏度可达2.8×102CFU/mL，比普通PCR高1000倍，而且还具有特异性好、结果可视等优点，适用于实验室和
食品安全监测现场基层实时、快速、准确的检测小肠结肠炎耶尔森菌。
附图说明
[0020] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0021] 图1是本发明
实施例1食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌最佳引物筛选以及引物实用性鉴定结果图；
[0022] 图2是本发明实施例2采用LAMP检测食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌体系的特异性鉴定结果图；
[0023] 图3是本发明实施例3采用LAMP检测食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌体系的灵敏性鉴定结果图。
具体实施方式
[0024] 实施例1食源性小肠结肠炎耶尔森菌LAMP检测方法的建立
[0025] 选取编码去粘附侵袭位点的ail基因为检测的靶基因(小肠结肠炎耶尔森菌的ail全基因序列如SEQ ID NO.1所示)，设计了2组检测引物，分别由内引物FIP/BIP和外引物F3/B3组成，引物序列见下表1。
[0026] 表1引物序列
[0027]
[0028] 提取食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌的DNA为模板，并设立水为模板作为阴性对照，进行LAMP扩增反应，反应产物进行结果检测。
[0029] LAMP扩增中的各组分构成比例如下表2所示。
[0030] 表2 LAMP扩增反应中各组分的构成
[0031]
[0032] 将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增。扩增步骤为：65℃恒温孵育1h，85℃灭活5min。SYBR Green I也可在聚合酶灭活后加入。
[0033] 结果观察：肉眼观察并比较各EP管中反应液的浑
浊度，出现浑浊的就是含有小肠结肠炎耶尔森菌；同时在紫外灯下观察EP管中反应液的颜色，如果在紫外灯光下发黄绿色荧光的就是小肠结肠炎耶尔森菌；另外，取LAMP扩增产物10.0μL与上样缓冲液混匀，在2％琼脂糖凝胶
电泳上进行结果分析鉴定。
[0034] 实施例1的结果见附图1，根据ail特异性基因设计的2组LAMP引物中，ail(1)引物组不仅可以与目的菌株的DNA结合并发生扩增反应，且不与阴性对照菌株DNA结合并发生扩增反应(图1A)；而ail(2)引物组不具有唯一性，能与阴性对照菌株DNA结合并发生扩增反应(图1B)；因此选择ail(1)引物组作为小肠结肠炎耶尔森菌LAMP检测体系的引物。
[0035] 图1中，A和B分别为针对ail基因所筛选合成2对LAMP引物可行性鉴定结果图，其中图1A为ail(1)基因，图1B为ail(2)基因；泳道1-7分别为：肠出血性大肠杆菌O157:H7ATCC43889、沙
门氏菌SL7207、金黄色葡萄球菌标准菌株SA29213、金黄色葡萄球菌分离株SAFX02、单细胞增生李斯特菌株标准株LMF2365、单细胞增生李斯特菌分离株FX01和食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌ATCC23715的基因组DNA，M表示2000bp的DNA Marker。
[0036] 实施例2 LAMP检测食源性小肠结肠炎耶尔森菌的特异性
[0037] 提取小肠结肠炎耶尔森菌株ATCC23715的基因组DNA，并以肠出血性大肠杆菌O157:H7ATCC43889、沙门氏菌SL7207、金黄色葡萄球菌标准菌株SA29213、金黄色葡萄球菌分离株SAFX02、单细胞增生李斯特菌株标准株LMF2365、单细胞增生李斯特菌分离株FX01、空肠弯曲杆菌HU-CJFX01、肠毒性大肠杆菌ETEC-2、肠毒性大肠杆菌ETEC-4、肠毒性大肠杆菌ETEC-5和肠毒性大肠杆菌ETEC-6非小肠结肠炎耶尔森菌ATCC23715的基因组DNA，和水为阴性对照，进行LAMP扩增反应。
[0038] LAMP以筛选出的ail(1)引物组进行扩增，反应体系如下表3。
[0039] 表3 LAMP扩增反应体系
[0040]
[0041] 将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增，扩增步骤为：65℃恒温孵育1h，85℃灭活5min。
[0042] 取LAMP扩增产物15.0μL，加入1.0μL SYBR Green I，通过肉眼观察及365nm的紫外光下进行观察；同时，取LAMP扩增产物10.0μL与上样缓冲液混匀，在2％琼脂糖凝胶电泳上对以上结果进行验证。
[0043] 实施例2的结果如附图2所示，以小肠结肠炎耶尔森菌ail基因作为检测靶基因建立的LAMP检测方法具有良好的特异性。图2中，A为食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌ail致病菌基因ail(1)基因反应产物加入1μL SYBR Green I在自然光下观察结果图；B为食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌ail致病菌基因ail(1)基因反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳分析图；C为在
波长365nm紫外光下观察结果图。样品6为食源性小肠结肠炎耶尔森菌ATCC23715基因组DNA，样品1-5、7-13均为非小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA(作为参照)，具体分别为：肠出血性大肠杆菌O157:H7 ATCC43889、沙门氏菌SL7207、金黄色葡萄球菌标准菌株SA29213、金黄色葡萄球菌分离株SAFX02、单细胞增生李斯特菌株标准株LMF2365、单细胞增生李斯特菌分离株FX01、空肠弯曲杆菌CJFX01、肠毒性大肠杆菌ETEC-2、肠毒性大肠杆菌ETEC-4、肠毒性大肠杆菌ETEC-5、肠毒性大肠杆菌ETEC-6和空白对照，样品14为水作为空白对照。
[0044] 实施例3 LAMP检测食源性小肠结肠炎耶尔森菌的灵敏度
[0045] 取对数生长期的食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌ATCC23715菌液，用生理盐水进行10倍系列稀释，并进行平板菌落计数，推算原菌液浓度。通过平板菌落计
算法测得食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌的原菌液浓度为2.8×109CFU/mL。
[0046] 用浓度已知的食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌对其进行10倍梯度稀释，分别为2.8×109CFU/mL、2.8×108CFU/mL、2.8×107CFU/mL、2.8×106CFU/mL、2.8×105CFU/mL、2.8×104CFU/mL、2.8×103CFU/mL、2.8×102CFU/mL、2.8×101CFU/mL和2.8×100CFU/mL，并对10倍梯度稀释菌液提取基因组DNA，以每个食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌稀释梯度菌液提取的基因组DNA为模板，分别进行LAMP和普通PCR扩增检测，并设立以水为模板作为阴性对照。
[0047] LAMP以筛选出的ail(1)引物组进行扩增，反应体系同上述表3。。将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增，扩增步骤为：65℃恒温孵育1h，85℃灭活5min。
[0048] 普通PCR以ail(1)引物组中F3和B3作为扩增引物对，其反应体系如下表4。
[0049] 表4普通PCR反应体系
[0050]
[0051] 将上述混合物加入到PCR管中，在PCR仪上进行扩增，扩增步骤为：94℃预变性5min；94℃变性40s，52℃
退火40s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min。
[0052] 取10.0μL的LAMP扩增产物与上样缓冲液混匀后，于2％的琼脂糖凝胶电泳上进行结果分析鉴定；普通PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进行结果分析鉴定。
[0053] 实施例3的结果表明(见附图3)，普通PCR对基因灵敏度为2.8×105CFU/mL，而LAMP反应体系的基因灵敏度可达2.8×102CFU/mL，是普通PCR灵敏度的1000倍。图3中，A为LAMP检测食源性致病菌小肠结肠炎耶尔森菌体系建立的灵敏度测定结果图，B：普通PCR基因灵敏度测定结果图；图中1-10泳道浓度分别为2.8×109CFU/mL、2.8×108CFU/mL、2.8×107CFU/mL、2.8×106CFU/mL、2.8×105CFU/mL、2.8×104CFU/mL、2.8×103CFU/mL、2.8×
102CFU/mL、2.8×101CFU/mL和2.8×100CFU/mL，11泳道为阴性对照，M为2000bp的Maker；普通PCR基因灵敏度可达2.8×105CFU/mL，而本发明构建的LAMP检测该菌ail(1)引物反应体系的基因灵敏度可达2.8×102CFU/mL，相对于普通PCR灵敏度相比高出1000倍。
[0054] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
