一种用于乳腺癌的lncRNA诊治标志物
阅读：2发布：2021-06-10
专利汇可以提供一种用于乳腺癌的lncRNA诊治标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于 乳腺癌 的lncRNA诊治标志物，具体的涉及lncRNA标志物AC092071.1，本发明通过高通量测序技术结合 生物 信息学分析首次发现了AC092071.1在乳腺癌患者中表达上调，并通过QPCR以及体外细胞实验进一步验证了AC092071.1与乳腺癌的发生发展相关，提示AC092071.1可作为生物标志物应用于乳腺癌的诊断和 治疗 。，下面是一种用于乳腺癌的lncRNA诊治标志物专利的具体信息内容。
1.长链非编码RNA AC092071.1在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测AC092071.1基因的表达水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。
4.一种体外检测样品中AC092071.1表达水平的产品，其特征在于所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，其特征在于，所述制剂、芯片或试剂盒包括针对AC092071.1的特异性引物对或探针。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述特异性引物对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测，优选的，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
7.AC092071.1在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。
8.AC092071.1在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括AC092071.1的抑制剂；优选的，所述抑制剂为siRNA。
10.一种治疗乳腺癌的药物，其特征在于，所述药物包括AC092071.1的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。
一种用于乳腺癌的lncRNA诊治标志物
技术领域
背景技术
[0002] 乳腺癌起源于乳腺上皮组织，是威胁女性身心健康的严重疾病，99％的乳腺癌来自女性。乳腺癌细胞间连接比较松散，癌细胞脱落后容易通过血液和淋巴结转移，最终威胁生命。乳腺癌的发病机制尚不十分明确，通过临床研究和流行病学研究，乳腺癌的发生是一个多因素共同作用的过程，由多种遗传变异产生，是多种异常的癌基因、抑癌基因作用的累积的结果，主要表现在以下几个方面:(一)生殖因素经研究表明，乳腺癌的发生与卵巢激素的分泌关系密切。月经初潮较早和绝经较晚都会使女性雌激素负荷增加，成为乳腺癌的危险因素之一。主要与女性卵巢激素分泌时间长短有关。(二)家族聚积性与遗传因素乳腺癌患者的一级亲属与一般人群相比，患乳腺癌的危险性增加2～3倍。(三)饮食因素经研究表明，高脂饮食与高热量饮食会增加乳腺肿瘤发病率。经研究发现体重的增加与乳腺癌的发病率密切相关，尤其是在女性绝经后。(四)乳腺疾病史非典型增生则随增生的严重程度增加而癌变的相对危险性随之增高，因此将非典型增生称为癌前病变。
[0003] 随着分子生物学(基因芯片技术)的飞速发展，已经从基因水平上发现乳腺癌具有不同的分子亚型，其中包括Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型、基底细胞样及三阴性等分子亚型。而目前在国际上被公认的乳腺癌分子亚型主要包括4个种类:三阴性、HER-2过表达型、Luminal A型和Luminal B型。不同分子分型的乳腺癌各具特色，不仅是判断乳腺癌患者预后的重要因素，也是指导术后辅助治疗的重要依据。尽管Luminal A型公认的预后相对较好的类型，但其中仍有部分患者预后较差，因此有必要对Luminal A型乳腺癌进行进一步的深入研究。
[0004] 长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)是一类缺乏蛋白编码功能的核苷酸转录本，包含200至100000核苷酸，具有高度保守的序列元件和特定的空间二级结构，存在于细胞核或胞浆内。LncRNAs在表观遗传调控、选择性剪接、RNA衰变、细胞分化、细胞周期控制及癌细胞转移和耐药性等细胞调控过程中发挥着重要的作用(Lau,E.,Non-coding RNA:Zooming in on 1ncRNA functions.Nat Rev Genet,2014.15(9):p.574-5.)。随着对lncRNAs研究的深入，越来越多的证据表明lncRNAs参与各种生物过程和疾病发病机理，尤其是肿瘤发生，在多种人类肿瘤中，lncRNAs都普遍存在着差异表达的现象(Gao,K.,et al.,Long non-coding RNA ZFAS 1 is an unfavourable prognostic factor and promotes glioma cell progression by activation of the Notch signaling pathway.Biomed Pharmacother,2017.87:p.555-560.)。到目前为止，lncRNAs在肿瘤方面已取得了不小的进展，如HOTAIR和GWS5，已经分别被确定为致癌基因和抑癌因子。HOTAIR使ER蛋白高表达，从而提高了染色质的占用率，加强了下游基因调控。GAS5作为竞争性内源RNA通过对miR-21的分子海绵的作用来抑制肿瘤的扩散然而，lncRNAs的数量十分庞大，只有少数与癌症相关的lncRNAs被报道出来，且针对lncRNAs在乳腺癌中的研究仍处于起步阶段。因此，那些对乳腺癌发生和发展以及分型至关重要的新型的lncRNAs还有待被研究者们不断发现及探索。
发明内容
[0006] 本发明的目的之二，提供一种乳腺癌的诊断方法，通过检测lncRNA AC092071.1的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌。
[0007] 本发明的目的之三，提供一种与乳腺癌的发生发展密切相关的基因，为乳腺癌尤其是Luminal A型乳腺癌的科学研究提供了理论依据。
[0008] 本发明的目的之四，为乳腺癌的精准治疗提供分子靶标。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 本发明提供了长链非编码RNA AC092071.1在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。其中，AC092071.1位于人19号染色体上，包括AC092071.1基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的AC092071.1，以及源自细胞中加工的任何形式的AC092071.1。该术语涵盖AC092071.1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如AC092071.1基因，人AC092071.1的基因序列，以及来自任何其它脊椎动物来源。一种代表性生的AC092071.1的序列如ENST00000597260.1所示，熟悉本领域的技术人员可以了解，对测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因组进行比对，只要测序片段可以比对到相关的基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，AC092071.1的不同的转录产物同样包含在本发明中。
[0012] 进一步，所述产品包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测AC092071.1基因的表达水平。
[0013] 所述测序技术核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
[0014] 所述核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
[0015] 所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
[0016] 本发明提供了一种体外检测样品中lncRNA AC092071.1表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。所述“样品”包括细胞、组织或体液。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所选样本为组织。
[0017] 进一步，所述制剂、芯片或试剂盒包括针对AC092071.1的特异性引物对或探针。
[0018] 进一步，所述特异性引物对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
[0019] 在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
[0020] 所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
[0021] 本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。
[0022] 进一步，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0023] 本发明提供了AC092071.1在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。
[0024] 正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。
[0025] 在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
[0026] 优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌的风险或与有助于评估乳腺癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌风险的个体、具有乳腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
[0027] 用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
[0028] 本发明提供了AC092071.1在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0029] 进一步，所述药物包括AC092071.1的抑制剂。所述抑制剂包括以AC092071.1为靶序列、且能够抑制AC092071.1表达水平的试剂，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物等。
[0030] 优选的，所述抑制剂为小干扰RNA(siRNA)。
[0031] 本发明提供了一种治疗乳腺癌的药物，所述药物包括AC092071.1的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。其中，所述抑制剂包括以AC092071.1为靶序列、且能够抑制AC092071.1表达水平的试剂，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物等。
[0032] 优选的，所述核酸抑制物为siRNA。
[0033] 在本发明的具体实施方式中，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。
[0035] 本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括AC092071.1基因在内的多个基因(例如，与乳腺癌相关的多个基因)的表达水平，将乳腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高乳腺癌诊断的准确率。
[0036] 本发明中的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。
[0037] 本发明中的术语“治疗”是指可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。
[0038] 本发明的优点和有益效果：
[0039] 本发明发现了一种诊断乳腺癌的分子标志物，通过检测标志物AC092071.1的表达水平即可对早期乳腺癌进行判断，从而进行早期干预，提高患者的生存率。
[0041] 图1是利用QPCR检测AC092071.1基因在乳腺癌组织中的表达情况图。
[0042] 图2是利用QPCR检测siRNA沉默AC092071.1的情况图。
[0043] 图3是利用CCK检测AC092071.1对MCF-7细胞的增殖影响图。
[0044] 具体的实施方式
[0045] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0046] 实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物
[0047] 1、样品收集
[0048] 分别收集4例Luminal A型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，病人信息如表1所示。
[0049] 表1样本信息
[0050]
[0051] 2、RNA样品的制备及质量分析
[0052] 使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，步骤如下：
[0053] 1)将新鲜的或超低温冻存的动物组织样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。将研磨成粉末状的样品加入到含有裂解Buffer RL的1.5ml灭菌离心管中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。
[0054] 2)将裂解液在12,000rpm，4℃离心5min。
[0055] 3)小心吸取上清液到新的1.5ml RNase Free Tube中。
[0056] 4)加入与液体等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。
[0057] 5)立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中。
[0058] 6)12,000rpm，离心1min，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2ml收集管中。
[0059] 7)将500μl的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。
[0060] 8)将600μl的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。
[0061] 9)重复步骤8)。
[0062] 10)将RNA Spin Column重新安置于2ml收集管上，12,000rpm离心2min。
[0063] 11)将RNA Spin Column安置于1.5ml的无RNA酶收集管上，在RNA Spin Column膜中央处加入50～200μl的RNase Free dH2O或0.1％DEPC处理水，室温静置5min。
[0064] 12)12,000rpm离心2min洗脱RNA。
[0065] 13)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。
[0066] 3、cDNA文库的构建及测序
[0067] 1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；
[0068] 2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；
[0069] 3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；
[0070] 4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；
[0071] 5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；
[0072] 6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；
[0073] 7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；
[0074] 8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；
[0075] 9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；
[0076] 10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。
[0077] 11)文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；
[0078] 12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。
[0079] 4、生物信息学分析
[0080] 1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
[0081] 2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92；
[0082] 3)stringtie定量lncRNA的表达量并标准化输出；
[0083] 4)edgeR包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异变动lncRNA的筛选标准是|log2FC|>1且pvalue<0.05。
[0084] 5、结果
[0085] 测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，AC092071.1在乳腺癌患者中表达显著上调，提示AC092071.1可能作为检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。
[0086] 表2测序数据
[0087]
[0088] 实施例2 QPCR测序验证AC092071.1基因的差异表达
[0089] 1、按照实施例1的收集方式收集的25例Luminal A型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对AC092071.1基因差异表达进行大样本QPCR验证。
[0090] 2、RNA提取
[0091] Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，具体步骤参见实施例1。
[0092] 3、QPCR
[0093] 根据AC092071.1和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如表3所示。
[0094] 表3扩增引物
[0095]
[0096] 使用TaKaRa One Step TB GreenTM Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒(Code No.RR066A)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表4所示。在Thermal CyclerTime System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。
[0097] 表4 QPCR反应体系和反应条件
[0098]
[0099]
[0100] 4、结果
[0101] QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，AC092071.1在乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中AC092071.1在26例样本中表达显著上调，在24例样本中无显著变化，26例上调样本中有23例为乳腺癌组织，3例为正常组织，具体情况如表5所示。提示可通过检测AC092071.1的水平判断受试者是否患有乳腺癌，当AC092071.1的水平显著增加时，受试者患有乳腺癌或者存在患有乳腺癌的风险，通过AC092071.1与乳腺癌之间的关系可以设计降低AC092071.1水平的siRNA或者shRNA来治疗乳腺癌。
[0102] 表5 AC092071.1在疾病中的阳性情况表
[0103]
[0104] 实施例3 AC092071.1在乳腺癌细胞系中的表达情况
[0105] 1、细胞培养
[0106] 培养Luminal A型乳腺癌的MCF-7细胞系，于5％CO2，37℃的恒温培养箱中进行培养，所有细胞培养基中加10％胎牛血清以及1％P/S。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶进行常规消化，按1:3的比例将细胞进行传代。
[0107] 2、siRNA序列
[0108] 本申请所用的siRNA-NC、siRNA-AC092071.1购自上海吉码制药技术有限公司，沉默AC092071.1的序列如表6所示。
[0109] 表6 siRNA序列
[0110]
[0111] 3、转染
[0112] 使用Invitrogen公司的LipofectaminTM2000试剂进行细胞转染，将实验分为三组：对照组(MCF-7)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2)，其中阴性对照组siRNA与AC092071.1基因的序列无同源性。
[0113] 细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，用无血清的OPTI-MEM转染液冲洗转染细胞两次后，每孔中加入1500μl OPTI-MEM转染液，6孔板放回细胞培养箱中继续培养，转染时培养基内含有血清。将使用无血清的OPTI-MEM稀释的siRNA与LipofectamineTM试剂混匀后孵育15min，将孵育好的转染复合物加入细胞中于培养箱中进行培养，6h后弃掉转染液，细胞放回到培养箱内继续培养。
[0114] 4、QPCR检测AC092071.1的表达水平
[0115] 1)RNA的提取
[0116] 使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取培养细胞中的总RNA。
[0117] 2)QPCR检测步骤同实施例2
[0118] 5、结果
[0119] siRNA1-2小分子对AC092071.1都有较好的沉默效果，其中siRNA1的沉默效果最为显著(P<0.05)(图2)，因此选择siRNA1作为沉默序列应用于后续的功能验证，本实验中所有细胞实验均重复3次。
[0120] 实施例4 CCK-8法检测AC092071.1基因对乳腺癌细胞增殖的影响
[0121] 用siRNA1转染的乳腺癌细胞作为实验组，siRNA-NC转染的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为3000个，每组设置5个复孔。分别用于24h、48h、72h、96h检测时间点检测。每隔24h细胞孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，连续测到96h。根据检测的OD值的平均值，绘制生长曲线。
[0122] 生长曲线结果显示，实验组在转染siRNA1后，细胞的增殖能力明显低于对照组(图3)，说明AC092071.1影响乳腺癌细胞的增殖，改变AC092071.1的表达水平可以改变乳腺癌细胞的增殖能力。
[0123] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种锂离子电池复合正极材料及其制备方法 | 2020-05-25 | 2 |
| 一种全自动荧光标记单细胞悬液制备装置及配套上样管 | 2020-06-17 | 1 |
| 用于产生视黄酸的试剂 | 2020-10-18 | 2 |
| 食源性小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测试剂盒及其应用 | 2020-12-16 | 0 |
| 多孔烧结片及其制造方法 | 2021-07-12 | 1 |
| α，ω二取代二羟基环戊基化合物的固体形式及其制备和使用方法 | 2022-06-15 | 0 |
| 一种基于Cytb基因序列的和贝氏的分子鉴别方法 | 2021-01-14 | 1 |
| 一种用于乳腺癌的lncRNA诊治标志物 | 2021-06-10 | 2 |
| 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 | 2020-09-25 | 2 |
| 一种阿尔茨海默症小鼠模型及评价方法 | 2021-10-11 | 1 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈