一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
阅读：1034发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。该方法以公猪全基因组DNA为模板，通过PCR扩增KDM5B基因，随后进行琼脂糖凝胶 电泳 ，根据电泳结果鉴定KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633位点存在35‑bp插入/缺失多态性。KDM5B基因35‑bp插入/缺失多态性不同基因型与40日龄长白猪公猪睾丸短轴长、睾丸重等繁殖性状之间显著相关，KDM5B基因35‑bp插入/缺失多态性位点能够作为提高长白猪公猪繁殖性状的分子标记，故本发明有利于长白猪公猪繁殖性状的标记辅助选择(MAS)，有利于快速建立遗传资源优良的公猪种群。，下面是一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用专利的具体信息内容。
1.公猪KDM5B基因存在的35-bp插入/缺失多态性位点：NC_010452.3:g.52599-52633delAAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG的检测方法在长白猪公猪繁殖性状睾丸重、睾丸短轴长分子标记辅助选择育种中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型可以作为提高长白猪公猪繁殖性状的分子标记。
3.一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以公猪全基因组DNA为模板，引物对P1为引物，通过PCR扩增公猪KDM5B基因片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果确定公猪KDM5B基因NC_010452.3:g.52599-52633位35-bp插入/缺失多态性位点的基因型；所述琼脂糖凝胶电泳结果分别为：插入/插入基因型表现为279bp一条带；缺失/缺失基因型表现244bp一条带；
插入/缺失基因型表现为279bp和244bp两条带；
所述的引物对P1为：
上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’；
下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’。
4.一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增猪KDM5B基因NC_010452.3:g.52599-52633位35-bp插入/缺失多态性位点的引物对P1，所述的引物对P1为：
上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’；
下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’。
一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失多态性的检测，特别涉及一种快速、准确检测公猪KDM5B基因NC_010452.3:g.52599_52633位点35-bp插入/缺失多态性的方法。
背景技术
[0002] 猪作为中国人最主要的肉类消费品，在中国存栏量巨大。培育具有优良生产性状的种质资源是供给充足猪肉的保障。通过研究猪基因组遗传信息，寻找与繁殖性能、抵抗力、畜产品品质、饲料转化率等性状相关基因的多态性，并将这些基因多态信息应用在猪分子育种领域，有利于培育和改良出更多具有优良生产性能的品种。
[0003] 猪是一种重要的模式动物，应用在人类疾病研究和器官移植等领域。同时猪也是一种重要的经济动物，全球猪肉产量在过去十年上涨60％，目前猪肉占全球肉产品总量的三分之一左右。农业部公布的数据显示，2015年全国生猪出栏量为70,825万头，猪肉产量达到5,487万吨，占年肉产品总产量的65％，占全球猪肉总产量的49.9％，总产值为13,325亿元。在我国，大力发展养猪业不仅能满足人民日益增长的消费需求，也可以促进经济的快速发展。
[0004] 提供足够数量和质量的畜产品需要优良的种质资源作为保证，而育种技术关系到培育品种是否优良。相对于以表型和表型值为基础的传统育种方法，运用以DNA多态为基础的分子育种技术，可以对那些传统育种方法难以进行选择的重要经济性状(繁殖性状、畜产品品质性状等)进行改良。
[0005] 得益于近几十年来生物学技术的快速发展，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)已经成为现代育种技术体系的重要组成部分。该技术首先检测重要基因的DNA多态性，随后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后挑选与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。MAS技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体遗传组成，提高家畜育种的定向性，育种值估计的准确性，缩短培育年限。
[0006] MAS极大地推动了分子育种技术的发展。寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点、分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是MAS技术应用的前提和关键。目前，很多分子遗传标记已经应用在分子育种领域，而新一代的遗传图谱标记仍在不断地被发掘。
[0007] 天然的遗传变异形式可以归纳为以下三种，单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)、插入/缺失(Insertions and Deletions，Indels)以及基因组结构变异(Structural Variations，SVs)。Indel是指在近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失。目前将Indel定义为50bp以下插入和缺失的总称。尽管Indel在人类基因组所有染色体上均有分布，且含量仅次于SNPs，但对它的研究程度远不如SNPs和SVs深入。
[0008] Indel可以划分为5个主要类别：①单个碱基对的插入或缺失；②只一个碱基对的扩增；③2-15bp的扩增；④转座子插入；⑤随机DNA序列的插入或缺失。其中第五类Indel所占比例最高，转座子插入所占比例最少。
[0009] 2006年，Devine等首次在人类基因组上确定并定位了415436个Indel序列。2008年，Kidd等在人类基因组上报道了796273个Indel序列。但两个实验团队得到的序列只有10％是相同的，这样低的重复率说明Indel序列还远远没有被完全发现。截止2015年，千人基因组计划(The 1000Genomes Project)宣布在人类基因组上发现360万个Indel序列。
[0010] Indel通过改变DNA序列影响相关因子与DNA的结合，或影响RNA序列，又或影响RNA剪接位点等方式改变基因表达。在已知的Indel序列中，只有一小部分长度偏短的序列位于编码区域，这些序列大多会影响基因表达。有些位于启动子区的Indel可以改变DNA序列的相位与间隔，影响相关因子与DNA结合。出现在转录因子结合区域或者增强子区域的Indel，可能会抑制甚至终止基因表达。目前已经发现Indel能够改变人类表型导致疾病。在基因突变导致的人类疾病中，至少有1％由Indel引起。例如CFTR基因三个碱基对删除导致囊性肺纤维病变；FMR1基因启动子区三倍重复扩增导致脆性X综合征；在血友病、多发性神经纤维瘤和癌症患者基因组中发现存在转座子插入。近几年《Genome Research》等杂志报道了Indel在物种进化方面的研究，发现Indel是造成物种间基因组多样性的原因之一，并认为其可能在生物进化中扮演重要角色，促进物种形成。
[0011] 与其他分子标记相比，基因组同一位点发生相同长度Indel突变的概率小，可看作同一来源，所以Indel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。与SNPs分型系统相比，Indel分型技术对设备和技术要求较低，更简便。
[0012] 目前，Indel在作物育种领域有较多应用。鉴定粳稻与籼稻在水稻育种中具有重要价值。通过对不同品种水稻相关Indel位点等位基因频率进行分析，不仅能准确鉴定水稻粳、籼属性，也有利于籼粳杂交稻的培育。Hayashi等将抗稻瘟品种与不抗稻瘟品种作为双亲，杂交后分析比对子代水稻相关基因序列，由此开发的Indel标记可以筛选抗瘟水稻。此外，Indel分子标记广泛应用在其他作物育种领域，如栽培番茄、黄瓜等。
[0013] 近年来，Indel在家畜育种领域越来越受到重视。研究显示，一些位于生产性状相关基因上的Indel序列，会显著影响相关基因的表达。繁殖方面，猪Tex14基因27外显子上存在一段51bp的插入序列，该插入序列会导致猪生精障碍。约克夏猪催乳素受体基因3’非翻译区(3’-UTR)存在一段Indel序列，若该序列存在，会使催乳素受体基因的表达下调75％。日本和牛雌激素受体2A基因上游序列存在一段3bp Indel，该序列存在会促进雌激素受体的转录，提高雌性个体的生殖能力。生产方面，二酰基甘油酰基转移酶基因3’-UTR存在一段
13bp的Indel序列。该序列存在时，二酰基甘油酰基转移酶的表达明显升高，提高猪脂肪沉积能力，使背膘增厚、瘦肉率降低。通过研究家畜基因组遗传信息，人们能够发现影响性状基因的变异位点，这些变异位点的鉴定对家畜育种具有重要意义。赖氨酸特异性去甲基化酶5B(Lysine(K)-Specific Demethylase 5B，KDM5B)基因又称JARID1B或PLU-1，该基因编码一个能够使组蛋白H3K4一甲基化(me1)、二甲基化(me2)和三甲基化(me3)去甲基化的酶。
通常认为，组蛋白H3K4甲基化标记可以促进基因转录，KDM5B作为去甲基化酶去除组蛋白甲基化标记，会抑制一些基因的转录。猪KDM5B基因位于10号染色体上，基因全长85905bp，编码的蛋白含1552个氨基酸残基，属于含有JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。
13bp的Indel序列。该序列存在时，二酰基甘油酰基转移酶的表达明显升高，提高猪脂肪沉积能力，使背膘增厚、瘦肉率降低。通过研究家畜基因组遗传信息，人们能够发现影响性状基因的变异位点，这些变异位点的鉴定对家畜育种具有重要意义。赖氨酸特异性去甲基化酶5B(Lysine(K)-Specific Demethylase 5B，KDM5B)基因又称JARID1B或PLU-1，该基因编码一个能够使组蛋白H3K4一甲基化(me1)、二甲基化(me2)和三甲基化(me3)去甲基化的酶。
通常认为，组蛋白H3K4甲基化标记可以促进基因转录，KDM5B作为去甲基化酶去除组蛋白甲基化标记，会抑制一些基因的转录。猪KDM5B基因位于10号染色体上，基因全长85905bp，编码的蛋白含1552个氨基酸残基，属于含有JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。
[0014] KDM5B结构域从N端到C端依次是：JmjN，ARID，PHD1，JmjC，锌指结构域，PLU1，PHD2和PHD3。在这些结构域中，JmjN和JmjC两个结构域参与组蛋白H3K4甲基化标记的去除。ARID结构域是一个DNA结合结构域，结合CCGCCC和GCACC序列。PLU1是一段保守的结构域。研究证明，KDM5B发挥催化活性所必需的结构域包括：JmjN、JmjC结构域以及锌指结构域，而ARID和PHD结构域是非必需的。Fe2+和α-酮戊二酸是KDM5B完成去甲基反应所必需的辅助因子，这两种辅助因子与JmjN-JmjC结构域结合。KDM5B的催化机制通过羟基化作用实现。Fe2+为分子氧提供共振结构，产生一个超氧化自由基，该自由基攻击α-酮戊二酸，通过一系列的中间反应过程，最终产生甲醇胺进而释放甲醛，实现脱甲基的作用。
[0015] KDM5B可调节胚胎干细胞的自我更新，维持发育基因的表达以及造血干细胞自我更新。KDM5B在调节间充质细胞转化成肌源性细胞或成骨性细胞的过程中发挥重要作用。在家畜研究领域，KDM5B对猪胚胎移植前的发育十分重要。研究显示，KDM5B调节H3K4me3和H3K27me3的动态平衡，这种平衡能够保证猪胚胎的正常发育。KDM5B与雄激素受体联系，促进雄激素受体转录活性。而雄激素受体会直接影响雄激素发挥生理作用，与生殖密切相关。
[0016] 综上所述，KDM5B基因可能会对公猪繁殖性状产生影响。目前，KDM5B基因在公猪遗传变异领域内的研究匮乏，该基因Indel与繁殖性状之间的关联研究更是空白。
发明内容
[0017] 本发明的目的在于提供一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，从而加快良种选育速度。
[0018] 本发明通过以下技术方案实现：
[0019] 一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测公猪全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增公猪KDM5B基因片段；再对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳的结果鉴定公猪KDM5B基因NC_010452.3:g.52599-52633内含子区35-bp插入/缺失多态性；
[0020] 所述的引物对P1为：
[0021] 上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’；
[0022] 下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’。
[0023] 所述PCR的扩增反应程序为：
[0024] 95.0℃预变性3min；95.0℃变性30s，63.9℃复性30s，72.0℃延伸25s，35个循环；之后72.0℃延伸10min，4℃保存扩增产物。
[0025] 所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。
[0026] 根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定公猪KDM5B基因内含子区35-bp插入/缺失多态性为：插入/插入(II)基因型表现为279bp一条带；缺失/缺失(DD)基因型表现244bp一条带；插入/缺失(ID)基因型表现为279bp和244bp两条带。
[0028] 公猪KDM5B基因第52599_52633位的II基因型可以作为公猪(例如长白猪)的DNA标记在辅助选择育种中应用。
[0029] 所述的第52599_52633位II基因型标记可作为提高公猪(例如长白猪)睾丸重和睾丸短轴长的分子标记。
[0030] 与现有技术比较，本发明的有益效果体现在：
[0031] 本发明根据公猪KDM5B基因序列设计引物，以公猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后获得公猪KDM5B基因的部分序列。
[0032] 针对公猪KDM5B基因第52599_52633位的插入/缺失多态性，本发明通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测该位点插入/缺失多态性。
[0033] 本发明对公猪插入/缺失多态性位点进行基因型和基因频率分析，对上述插入/缺失多态性位点与公猪繁殖性状(睾丸重、睾丸长轴长、睾丸短轴长)进行关联分析，结果表明该位点能够作为公猪(例如长白猪)睾丸重和睾丸短轴长的分子标记，选择具有插入/插入(II)基因型的个体，有利于快速建立遗传资源优良的公猪种群，从而加快具有优良繁殖性状的公猪的良种选育速度。附图说明
[0034] 图1为引物对P1扩增公猪KDM5B基因产物用2％琼脂糖凝胶电泳的结果；M表示Marker。
[0035] 图2为公猪KDM5B基因PCR扩增产物测序图；A表示基因型为DD，B表示基因型为II，黑色方框标出的部分表示 35-bp缺失序列：NC_010452.3:g.5259952633delAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG。
[0036] 图3为公猪KDM5B基因35-bp Indel序列分析图；图中黑色方框中的序列为上下游引物序列，阴影部分的序列为Indel序列，参考序列为NCBI网站上公布的猪KDM5B基因序列NC_010452.3。
具体实施方式
[0037] 本发明利用PCR扩增方法对公猪KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633位点突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与公猪繁殖性状(睾丸重、睾丸长轴长、睾丸短轴长)进行关联分析，验证其是否可以作为公猪分子育种中辅助选择的分子标记。下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0038] 1.实验药品与试剂
[0039] 1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker(购自天根生化科技(北京)有限公司)。
[0040] 1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
[0041] 1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。具体的溶液与缓冲液如下：
[0042] 1)采集睾丸样品所用溶液：PBS缓冲液：NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO40.24g,加超纯水至1000mL，调整pH至7.4，高压灭菌，4℃保存。
[0043] 2)提取组织样DNA所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。
[0045] 2.设计公猪KDM5B基因Indel引物
[0046] 在NCBI上检索猪KDM5B基因的序列，并利用Primer 5.0设计PCR引物对P1(图3)，其引物序列如下：
[0047] 上游引物：5’-GGCGACTGGTGAGCACTA-3’(18nt)；
[0048] 下游引物：5’-AATTACTTCAAGCCAACCAAACAG-3’(24nt)；
[0049] 用上述引物对P1对公猪基因组进行PCR扩增，能够扩增包含公猪KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633delAAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG位点不同的Indel基因型片段。理论上，当52599nt与52633nt之间的序列缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条244bp大小的条带；52599nt与52633nt之间的序列插入时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会有一条279bp大小的条带。52599nt与52633nt之间的插入/缺失时，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后会出现279bp和244bp两条带。如图1扩增后电泳结果所示，第1泳道为Marker(由大到小依次是500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp)，2-10泳道为检测样本。根据理论分析结果，II基因型表现为一条279bp大小的条带，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第3、7、10泳道，测序峰图为图2B所示；ID基因型表现为279bp和244bp两条带，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第2、5、6、8、9泳道；DD基因型表现为一条244bp大小的条带，琼脂糖凝胶电泳结果如图1中第4泳道，测序峰图为图2A所示。
[0050] 3.引物对P1扩增猪KDM5B基因片段
[0051] 3.1公猪睾丸组织样本的采集
[0052] 实验所用的动物为2个品种共计381个样本，其中15和40日龄大白猪样品共319份，40日龄长白猪样品62份均采自陕西省安康市国家生猪养殖场。采用随机采样方式采取个体睾丸组织样品，这些样品为放在PBS缓冲液中保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。
[0053] 表1公猪睾丸样本采集表
[0054]
[0055] 3.2组织样品DNA的分离、提取
[0057] ②加入600μL SE缓冲液，浓度为20mg/mL的蛋白酶K 20mL，口底颠倒混匀，37.0℃水浴消化过夜，最好保证组织较均匀地分布在组织提取液中；
[0058] ③第二天将2.0mL离心管从水浴锅中取出，待溶液冷却至室温，加入6mol/L的NaCl200μL充分混匀，随后加入1mL Tris饱和酚，盖紧管盖，放在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，随后4℃12000r/min离心10min；
[0059] ④离心完毕后，取大约600μL上清液至一个新的2.0mL离心管中，随后加入Tris饱和酚和氯仿各0.5mL，盖紧管盖，在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，4℃12000r/min离心10min；
[0060] ⑤离心完毕后，取上清液500μL左右加入到一个新的2.0mL离心管中，加入1mL氯仿，盖紧管盖，在冰上缓慢地口底颠倒离心管，持续20min，随后4℃12000r/min离心10min；
[0061] ⑥离心完毕后，取大约300μL上清液至一个新的1.5mL离心管中，加入1mL预冷的无水乙醇，盖紧管盖，缓慢地口底颠倒离心管数分钟，随后-20℃放置半小时，出现白色絮状DNA沉淀；
[0062] ⑦4℃12000r/min离心10min，弃掉上清。加入1mL 70％乙醇，盖紧管盖，在冰上缓慢地来回颠倒离心管10min，4℃12000r/min离心10min，小心倒掉乙醇；
[0063] ⑧再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地口底颠倒离心管，然后4℃12000r/min离心3-5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；
[0064] ⑨待干燥后，加入30-50μL灭菌超纯水溶解。从溶解后的原液中吸取1μL至PCR管中，用灭菌水稀释十倍，随后用核酸定量仪测OD260和OD280比值，检测提取DNA的浓度和纯度。
[0065] 3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA
[0067] ②制作2％浓度的琼脂糖凝胶。称取0.80g琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE 40mL使其悬浮，微波炉中加热。待煮沸至溶液透明，没有半透明的颗粒存在是拿出，待其冷却至不烫手时(约60℃)加入终浓度为0.5μg/mL的EB，轻微摇动；
[0068] ③混匀后立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，用移液器枪头移出；
[0069] ④约30-40min后凝胶完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中；
[0070] ⑤向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2-5mm；
[0072] ⑦在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。
[0073] 3.4DNA的纯化
[0074] ①500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL，55℃保温10h左右；
[0075] ②等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次；
[0076] ③12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；
[0077] ④加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；
[0078] ⑤倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。
[0079] 3.5分光光度法检测DNA
[0080] 用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-40℃。
[0081] 3.6PCR扩增
[0082] PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR MasterMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)6.0μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为100ng/μL猪基因组DNA)0.5μL；去离子水5.0μL；共12.5μL体积的PCR扩增体系。
[0083] 3.7PCR反应的程序
[0084] PCR扩增反应程序为：95.0℃，预变性3min；95.0℃，变性30s；63.9℃复性30s；72.0℃延伸25s，35个循环之后，72.0℃延伸10min，4.0℃保存扩增产物。
[0085] 3.8扩增PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
[0086] ①制作2％的琼脂糖凝胶，点样后110V电压电泳35min；
[0087] ②待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD凝胶成像系统成像；
[0088] ③根据琼脂糖凝胶电泳成像分析Indel多态性。
[0089] 利用BIO-RAD凝胶成像系统照相分析，判断Indel的多态性：
[0090] 公猪基因组KDM5B基因35-bp Indel多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：ID基因型表现为279bp和244bp两条带，II基因型表现为279bp一条带，DD基因型表现为244bp一条带。
[0091] 4.公猪KDM5B基因indel位点的频率统计分析
[0092] 基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。PTT＝NTT/N，其中PTT代表某一位点的TT基因型频率；NTT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
[0093] 基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PT＝(2NTT+NTa1+NTa2+NTa3+NTa4+……+NTan)/2N
[0094] 式中，PT表示等位基因T频率，NTT表示群体中具有TT基因型的个体数量，NTai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1～an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。不同品种公猪KDM5B基因35-bp Indel位点的等位基因型频率及等位基因频率如表2所示。长白猪、大白猪的等位基因“I”的频率分别为0.419和0.671，相应的等位基因“D”的频率为0.581和0.329，等位基因“I”和“D”的频率大于1％，属于稳定存在的Indel类型。
[0095] 表2公猪KDM5B基因35-bp Indel基因频率及基因型频率分布表
[0096]
[0097] 5.公猪KDM5B基因Indel位点基因效应的关联分析
[0098] 基因型数据：PCR扩增后根据琼脂糖凝胶电泳判断的基因型。
[0099] 生产数据：40日龄长白猪公猪、15日龄和40日龄大白猪公猪的睾丸重、睾丸长轴长、睾丸短轴长数据。
[0100] 关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，环境等因素与生产性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝μ+G+E，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；E：随机误差。
[0101] 结果表明：公猪KDM5B基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对公猪繁殖性状(睾丸重、睾丸短轴长)均有显著影响。
[0102] 由表3可以看出，在对62头40日龄长白猪公猪群体的研究中，KDM5B基因35-bp Indel多态性对40日龄长白猪公猪的睾丸重(P＝0.028)和睾丸短轴长(P＝0.013)均具有显著影响(P<0.05)。
[0103] 因此，KDM5B基因NC_010452.3:g.52599_52633位点35-bp Indel是长白猪公猪繁殖性状筛选的Indel遗传标记。
[0104] 表3KDM5B基因35-bp Indel位点与40日龄长白猪公猪繁殖性状关联分析
[0105]
[0106] 注：平均数±标准差右上角的不同字母(a，b)代表差异的显著性(*P<0.05)[0107] 因此，选择具有II基因型的个体，从而加快具有优良繁殖性状的公猪的良种选育速度。
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