技术领域
[0001] 本
发明涉及海洋藻类的优良品系鉴定，特别涉及鉴定龙须菜鲁龙1号良种的特异性SNP标记及其应用。
背景技术
[0002] 龙须菜是一种重要的产琼胶经济海藻。迄今为止，我国成功选育的龙须菜国家级
水产品种已有3个，分别为：1998年审定通过的龙须菜981，2014年审定通过的龙须菜2007和2015年审定通过的龙须菜鲁龙1号。其中，鲁龙1号是中国海洋大学海洋
生物遗传学与育种教育部重点实验室隋正红教授团队与莆田市水产推广站历时六年培育而成，藻体细长，
颜色鲜红，分枝多，生长优势十分明显，并且藻体富有弹性，抗
风浪能
力强，同时生长速度比其他品种更快，产量更高，经济效益显著。龙须菜新品种的成功选育极大推动了其大规模栽培业的发展。目前龙须菜已经在山东、福建、广东、浙江和辽宁等地广泛栽培，是继海带和紫菜之后的新兴海藻栽培物种。龙须菜栽培成为我国第二大海藻栽培产业。但3个良种在外观形态上难以区分，在大规模栽培过程中容易产生种苗混杂现象。之前通过测定生长性状和生理生化指标来加以区别，但试验周期长，操作繁琐。
[0003] 分子标记是继形态标记、细胞学标记和生化标记后产生并发展起来的一种新的遗传标记，所反映出的遗传变异种类十分丰富，不易受环境影响，且DNA序列的
稳定性使得分子标记具有良好的重复性。分子标记技术可用来进行种质鉴定。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)指由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。作为最新一代的分子标记，SNP比过去的分子标记更加多态，数目也更多，利于分析。伴随高通量测序技术的发展，利用全基因组测序筛查SNP已成为最直接并且可获得最完整基因组水平单
碱基遗传变异信息的方法。
[0004]
专利号为ZL201310243064.X，专利名称为“鉴定龙须菜981良种的特异性探针及其应用”的发明专利，所提供的技术方案虽然通过AFLP分子标记技术开发出两条981良种的特异性核苷酸序列，但只能用以区分良种981和良种2007，无法区分出良种鲁龙1号。
发明内容
[0005] 基于上述背景技术，本发明通过在良种981、2007和鲁龙1号中开发最新一代SNP分子标记，筛选获得鲁龙1号良种的特异性SNP标记，从分子水平上将其与良种981和良种2007区分开来，解决龙须菜在栽培过程中产生的种苗混杂现象，避免对龙须菜栽培产业造成重大损失。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0007] 鲁龙1号龙须菜的特异性SNP标记，具体包括如下步骤：
[0009] 采用天根
植物基因组DNA提取
试剂盒进行良种981、2007和鲁龙1号的基因组DNA的提取，具体步骤如下：
[0010] (1)缓冲液GP1预热：提取工作开始之前，先用65℃水浴对缓冲液GP1进行预热，并在其中加入0.1％的β-巯基
乙醇。而研钵、研杵和药匙则需要利用液氮预冷。
[0011] (2)藻体
研磨：藻体经无菌处理后，称取约100mg，放入预冷的研砵中，加入液氮充分研磨，使藻体完全
破碎成粉末即可。研磨的过程中一定要注意及时添加液氮，并且缓慢加入，防止粉末被快速
气化的液氮带出，造成浪费。
[0012] (3)藻体裂解：用药匙将藻体粉末转移到(1)中预热的缓冲液GP1中，并迅速颠倒混匀，水浴30～40min进行裂解，水浴过程中每隔5min要进行一次颠倒混匀，保证裂解充分。
[0013] (4)离心：裂解结束后，加入700ml氯仿，迅速颠倒混匀，13800g离心5min。
[0014] (5)上层透明水相转移：将离心后的上层透明水相转移到新的离心管内，注意吸取时不要混入蛋白层，在新离心管中加入700μl缓冲液GP2，颠倒混匀。
[0015] (6)离心：将新离心管内混匀后的液体全部转移到
吸附柱CB3中，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。
[0016] (7)离心：完成上述操作后，向吸附柱CB3中加入500ml缓冲液GD，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。
[0017] (8)离心：向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。该步骤重复两次。
[0018] (9)离心：将吸附柱CB3于13800g离心2min，将收集管中的液体弃去。
[0019] (10)吸附柱CB3晾干：将吸附柱CB3置于超净
工作台内晾干至无残留酒精气味。需要严格注意吸附柱的管口和底部不能触碰到其他未经灭菌处理的地方，防止污染。
[0020] (11)离心制得DNA溶液：将晾干的吸附柱CB3转移到新的离心管中，然后向吸附膜的中间部位垂直悬空滴加洗脱缓冲液TE或ddH2O，体积在50～100ml范围内。室温下静置2～5min，13800g离心2min，离心管中所得液体即为DNA溶液。
[0021] (12)去除RNA：加入RNA酶，37℃消化40min，以去除DNA溶液中的RNA。
[0022] (13)DNA检测：0.8％琼脂糖凝胶
电泳检测所提取的DNA，电泳条件为稳压100V，电泳时间为为40min。使用核酸
蛋白质检测仪检测DNA的A 260/A280和A260/A230，并且使用Qubit 2.0测定DNA浓度。
[0023] 2、基因组重测序文库构建与测序
[0024] 所提取的基因组DNA经质量检测合格后用于基因组重测序文库构建，具体流程如下：
[0025] (1)使用仪器Covaris M220对基因组DNA进行随机打断，电泳回收300～500bp
片段。
[0026] (2)利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit制备文库：首先在DNA片段两端加接头A和B，然后筛选去除接头自连片段，随后利用琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段，最后利用氢
氧化钠变性，产生单链DNA片段。
[0027] (3)利用TruSeq PE Cluster Kit制备cluster：DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥”，然后进行PCR扩增，产生DNA簇，最后DNA
扩增子线性
化成为单链。
[0028] (4)利用Illumina HiSeq 4000测序平台进行双末端(PE150)测序。
[0029] 3、测序数据质控
[0030] 上机测序后产生大量原始测序数据，其中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据以保证后续分析的顺利进行，具体步骤如下：
[0031] (1)去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads。
[0032] (2)将序列末端质量较低(质量值小于20)的碱基
修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10的碱基，则将整条序列剔除，否则保留。
[0033] (3)去除含N比率超过10％的reads。
[0034] (4)将去除接头及质量修剪后长度小于50bp的序列舍弃。
[0035] 4、比对参考基因组
[0036] 以龙须菜已发表的genome survey组装结果序列作为参考基因组，利用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对
软件将高质量reads比对回参考基因。接着利用SAMtools(http://samtools.sourceforge.net/)软件去除PCR-duplication产生的测序片段，再利用本地脚本计算出测序片段的深度与
覆盖度，从而获得数据的比对情况。
[0037] 5、SNP检测与分型
[0038] 基于测序所得高质量数据与参考基因组序列比对的结果，利用GATK软件来检测SNP位点，结合每个碱基的测序质量，计算每个位点可能的碱基类型，再通过贝叶斯统计原理推断其中具有最大可能性的类型，判断该位点碱基是否具有多态性，然后过滤质量值小于20的位点，最终得到高可信度的SNP数据集。
[0039] 6、特异性SNP标记的筛选
[0040] 将鲁龙1号，981和2007这3个样品的SNP数据集去除任一样品中基因型缺失的位点，然后筛选出鲁龙1号与其余2个良种的基因型均不相同的位点，即鲁龙1号的特异性SNP标记，共2个。
[0041] 7、特异性SNP标记的引物设计及Sanger测序检验
[0042] 将上述2个SNP位点比对回参考基因组，由于2个SNP之间相差8bp，因此取包含2个SNP在内的前后各200bp共计400bp序列，设计出1对引物如下：
[0043] 引物正向序列为：AAGGTAGCAGGAGCGTTCGTAAGC；
[0044] 引物反向序列为：GCGATGGCGTTATTGAACCAACCC；
[0045] 该引物扩增产物长度为325bp。
[0046] 以鲁龙1号、981、2007的基因组DNA为模板，分别用该引物进行PCR扩增。
[0047] PCR反应条件为：94℃预变性5min；35个循环内94℃变性1min，60℃
退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸5min；4℃，保存。
[0048] PCR扩增后用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，目的条带明显且无非特异性扩增条带，随后进行Sanger测序。
[0049] 本发明的有益效果为：通过开发鲁龙1号良种的特异性SNP标记，从分子水平上将其与良种981和良种2007区分开来，解决龙须菜在栽培过程中产生的种苗混杂现象，避免对龙须菜栽培产业造成重大损失。
附图说明
[0050] 图1为鲁龙1号良种的特异性SNP标记图；
[0051] 图2为PCR反应体系图，以鲁龙1号、981、2007的基因组DNA为模板，分别用该引物进行PCR扩增；
[0052] 图3示出鲁龙1号特异性SNP标记zcs1的Sanger测序检验结果，图中A、B、C分别代表鲁龙1号、981和2007；A1/A2、B1/B2、C1/C2分别代表每个良种的2个平行样；虚线框内是zcs1在不同样品中的Sanger测序峰，根据峰图读取出zcs1的碱基型并用黑色字体标识；
[0053] 图4示出鲁龙1号特异性SNP标记zcs2的Sanger测序检验结果，图中A、B、C分别代表鲁龙1号、981和2007；A1/A2、B1/B2、C1/C2分别代表每个良种的2个平行样；虚线框内是zcs2在不同样品中的Sanger测序峰，根据峰图读取出zcs2的碱基型并用黑色字体标识。
具体实施方式
[0054] 为了便于理解，下面结合附图通过
实施例对本发明作进一步详细说明。
[0055] 鲁龙1号龙须菜的特异性SNP标记，具体包括如下步骤：
[0056] 1.基因组DNA提取与质量检测
[0057] 采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行良种981、2007和鲁龙1号的基因组DNA的提取，具体步骤如下：
[0058] (1)提取工作开始之前，先用65℃水浴对缓冲液GP1进行预热，并在其中加入0.1％的β-巯基乙醇。而研钵、研杵和药匙则需要利用液氮预冷。
[0059] (2)藻体经无菌处理后，称取约100mg，放入预冷的研砵中，加入液氮充分研磨，使藻体完全破碎成粉末即可。研磨的过程中一定要注意及时添加液氮，并且缓慢加入，防止粉末被快速气化的液氮带出，造成浪费。
[0060] (3)用药匙将藻体粉末转移到(1)中预热的缓冲液GP1中，并迅速颠倒混匀，水浴30～40min，水浴过程中每隔5min要进行一次颠倒混匀，保证裂解充分。
[0061] (4)裂解结束后，加入700ml氯仿，迅速颠倒混匀，13800g离心5min。
[0062] (5)将离心后的上层透明水相转移到新的离心管内，注意吸取时不要混入蛋白层，在新离心管中加入700μl缓冲液GP2，颠倒混匀。
[0063] (6)将新离心管内混匀后的液体全部转移到吸附柱CB3中，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。
[0064] (7)完成上述操作后，向吸附柱CB3中加入500ml缓冲液GD，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。
[0065] (8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，13800g离心1min，将收集管中的液体弃去。该步骤重复两次。
[0066] (9)将吸附柱CB3于13800g离心2min，将收集管中的液体弃去。
[0067] (10)将吸附柱CB3置于超净工作台内晾干至无残留酒精气味。需要严格注意吸附柱的管口和底部不能触碰到其他未经灭菌处理的地方，防止污染。
[0068] (11)将晾干的吸附柱CB3转移到新的离心管中，然后向吸附膜的中间部位垂直悬空滴加洗脱缓冲液TE或ddH2O，体积在50～100ml范围内。室温下静置2～5min，13800g离心2min，离心管中所得液体即为DNA溶液。
[0069] (12)加入RNA酶，37℃消化40min，以去除DNA溶液中的RNA。
[0070] (13)0.8％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA，电泳条件为稳压100V，电泳时间为为40min。使用核酸蛋白质检测仪检测DNA的A 260/A280和A260/A230，并且使用Qubit 2.0测定DNA浓度。
[0071] 2.基因组重测序文库构建与测序
[0072] 所提取的基因组DNA经质量检测合格后用于基因组重测序文库构建，具体流程如下：
[0073] (1)使用仪器Covaris M220对基因组DNA进行随机打断，电泳回收回收300～500bp片段；
[0074] (2)利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit制备文库：首先在DNA片段两端加接头A和B，然后筛选去除接头自连片段，随后利用琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段，最后利用氢氧化钠变性，产生单链DNA片段；
[0075] (3)利用TruSeq PE Cluster Kit制备cluster：DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥”，然后进行PCR扩增，产生DNA簇，最后DNA扩增子线性化成为单链；
[0076] (4)利用Illumina HiSeq 4000测序平台进行双末端(PE150)测序。
[0077] 3.测序数据质控
[0078] 上机测序后产生大量原始测序数据，其中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据以保证后续分析的顺利进行，具体步骤如下：
[0079] (1)去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；
[0080] (2)将序列末端质量较低(质量值小于20)的碱基修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10的碱基，则将整条序列剔除，否则保留；
[0081] (3)去除含N比率超过10％的reads；
[0082] (4)将去除接头及质量修剪后长度小于50bp的序列舍弃。
[0083] 质量过滤中使用
软件包括：SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)。
[0084] 4.比对参考基因组
[0085] 以龙须菜已发表的genome survey组装结果序列作为参考基因组，利用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对软件将高质量reads比对回参考基因组。接着利用SAMtools(http://samtools.sourceforge.net/)软件去除PCR-duplication产生的测序片段，再利用本地脚本计算出测序片段的深度与覆盖度，从而获得数据的比对情况。
[0086] 5.SNP检测与分型
[0087] 基于测序所得高质量数据与参考基因组序列比对的结果，利用GATK(http://www.broadinstitute.org/gatk/)软件来检测SNP位点，结合每个碱基的测序质量，计算每个位点可能的碱基类型，再通过贝叶斯统计原理推断其中具有最大可能性的类型，判断该位点碱基是否具有多态性，如果是，即得到与参考序列相同和不同的碱基类型。过滤质量值小于20的位点，最终得到高可信度的SNP数据集。
[0088] 6.特异性SNP标记的筛选
[0089] 如图1所示，将鲁龙1号，981和2007这3个样品的SNP数据集去除任一样品中基因型缺失的位点，然后筛选出鲁龙1号与其余2个良种的基因型均不相同的位点，即鲁龙1号的特异性SNP标记，共2个。
[0090] 7.特异性SNP标记的引物设计及Sanger测序检验
[0091] 将上述2个SNP位点比对回参考基因组，由于2个SNP之间相差8bp，因此取包含2个SNP在内的前后各200bp共计400bp序列，设计出1对引物如下：
[0092] 引物正向序列为：AAGGTAGCAGGAGCGTTCGTAAGC；
[0093] 引物反向序列为：GCGATGGCGTTATTGAACCAACCC；
[0094] 该引物扩增产物长度为325bp。
[0095] 以鲁龙1号、981、2007的基因组DNA为模板，分别用该引物进行PCR扩增，PCR反应体系如图2。
[0096] PCR反应条件为：94℃预变性5min；35个循环内94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸5min；4℃，保存。
[0097] PCR扩增后用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，目的条带明显且无非特异性扩增条带，随后进行Sanger测序。特异性标记zcs1的测序结果如图3所示，鲁龙1号的测序峰图在该SNP位点处显示为两个峰C和T，而981和2007均只有一个单峰C，而且两次平行样的结果一致，验证了重测序SNP分型结果，证明zcs1是鲁龙1号的特异性标记。
[0098] 如图4，鲁龙1号的测序峰图在该SNP位点处显示为一个单峰G，981和2007在该位点均显示两个峰G和T。两次平行实验的结果相一致，验证了重测序SNP分型的结果，说明zcs2是鲁龙1号的特异性标记。可将zcs1和zcs2标记结合起来共同鉴定鲁龙1号。
