一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法
阅读：1056发布：2020-06-04
专利汇可以提供一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于检测Pb2+浓度的 试剂 盒 及检测方法，该试剂盒包括以下组分：菁染料、Pb2+标准溶液、DNA双链、酸性缓冲溶液和中性缓冲溶液。检测方法包括：分别绘制中性、酸性条件下Pb2+检测标准曲线；将待测样品、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20‑40℃孵育15‑25min，然后测定其在448nm处的吸光度或在616nm处的 荧光 强度，根据检测出的吸光度或荧光强度来判断待测样品的酸度情况，然后结合中性或酸性条件下Pb2+检测标准曲线计算出Pb2+浓度。该试剂盒体系简单，检测方法灵敏度高，检出限低，准确性高，同时还能反映出待测样品的酸度情况，进而为铅离子的迁移速率的判断提供了简便方法。，下面是一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：菁染料、Pb2+标准溶液、DNA双链、酸性缓冲溶液和中性缓冲溶液；
其中，DNA双链包括能形成G-四链体结构的DNA单链以及与其互补且能形成i-motif结构的DNA单链；
能够形成G-四链体的DNA单链的序列为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基；
能够形成i-motif的DNA单链的序列为：5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数，m1-m4代表X的个数且为0-3的整数，X表示A、T或G碱基；
菁染料的结构式为：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
2.根据权利要求1所述的用于检测Pb2+浓度的试剂盒，其特征在于，菁染料的结构式为：
3.根据权利要求1所述的用于检测Pb2+浓度的试剂盒，其特征在于，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为：5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
4.根据权利要求1所述的用于检测Pb2+浓度的试剂盒，其特征在于，能够形成i-motif的DNA单链的序列为：5′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′、5′-
CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′、5′-CCCACCCACCCACCC-3′、5′-
CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′、5′-CCAACCACACCAACC-3′或5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-
3′。
5.根据权利要求1所述的用于检测Pb2+浓度的试剂盒，其特征在于，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液；酸性缓冲溶液为浓度为10mM，pH＝4.0的Tris-HAc缓冲溶液；中性缓冲溶液为浓度为10mM，pH＝7.0的Tris-HAc缓冲溶液。
6.采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测Pb2+浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将中性缓冲溶液、Pb2+标准溶液、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在448nm处的吸光度，绘制中性条件下Pb2+检测标准曲线；
(2)将酸性缓冲溶液、Pb2+标准溶液、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，绘制酸性条件下Pb2+检测标准曲线；
(3)将待测样品、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在448nm处的吸光度或在616nm处的荧光强度，若检测到有吸光度，则说明待测样品偏中性，根据结合中性条件下Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；若检测到较强的荧光强度，则说明待测样品偏酸性，结合酸性条件下Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度。
7.根据权利要求6所述的检测Pb2+浓度的方法，其特征在于，检测过程中菁染料的终浓-6
度为4×10 mol/L。
8.根据权利要求6所述的检测Pb2+浓度的方法，其特征在于，检测过程中DNA双链的浓度为2×10-6mol/L。
2+
一种用于检测Pb 浓度的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法。
背景技术
[0002] 金属铅，物理化学性质优良，几千年前人们就发现了它易开采、柔软易加工的特点。目前，铅被广泛应用在合金，建筑材料及电池等工业。铅的毒性自 19世纪后期开始被关注，主要表现为神经毒性，心血管毒性和生殖毒性，且对儿童的危害尤其严重。其毒理机制为破环酶的正常构型使酶丧失催化功能；干扰人体内金属离子代谢进而影响细胞正常生理功能。作为环境监测中的重要污染物，监控土壤、废水及工业废料中的铅对人类健康与生态平衡意义重大。
[0003] 有研究表明，土壤中Pb2+的危害不仅取决于其浓度，同时也取决于铅离子的迁移速率。农产品生长过程中会通过根系吸收土壤中的铅，迁移速率越大，铅在植物中的富集程度越高危害也越大。pH值是影响迁移速率的重要因素之一，监测土壤中铅离子的同时，对铅离子的pH环境进行分析也具有实际意义。
[0004] 传统仪器分析方法，如原子吸收法(AAS)、电子耦合等离子体法(ICP)、电子耦合等离子质谱法(ICP-MS)等，对铅离子的检测具有很高的选择性与灵敏度。随着生物技术的发展，科学工作者们开发出了各种方便快捷，适用于现场分析的生物传感装置，许多的生物传感器件已应用于重金属离子的检测工作中。上述方法对于铅离子的浓度有很强的检测能力，但现存的无论是仪器分析方法还是生物传感器都不能很好的对样本中铅离子的其他污染相关信息(如pH 值)进行评估，在实际的样本分析中存在一定的局限性。
[0005] 综上所述，开发出在测定样本中的目标物的同时，能够对样本其他信息进行分析的检测方法是目前分析科学领域的发展趋势之一。
发明内容
[0006] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法，该试剂盒体系简单，检测方法灵敏度高，检出限低，准确性高，同时还能反映出待测样品的酸度情况。
[0007] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种用于检测Pb2+浓度的试剂盒，包括以下组分：菁染料、Pb2+标准溶液、 DNA双链、酸性缓冲溶液和中性缓冲溶液；
[0009] 其中，DNA双链包括能形成G-四链体结构的DNA单链以及与其互补且能形成i-motif结构的DNA单链；
[0010] 菁染料的结构式为：
[0011]
[0012] 其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、 Se、Te。
[0013] 进一步地，菁染料的结构式为：
[0014]
[0015]
[0016] 进一步地，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为： 5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数， b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基。
[0017] 进一步地，能够形成G-四链体的DNA单链的序列为：5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、 5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、 5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
[0018] 进一步地，能够形成i-motif的DNA单链的序列为： 5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数， m1-m4代表X的个数且为0-3的整数，X表示A、T或G碱基。
[0019] 进 一步 地 ，能 够 形 成i - m ot i f的 D N A单 链 的 序列 为 ： 5 ′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′、 5′-CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′、 5′-CCCACCCACCCACCC-3′、5′-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′、 5′-CCAACCACACCAACC-3′或5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-3′。
[0020] 进一步地，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液；酸性缓冲溶液为浓度为10mM， pH＝4.0的Tris-HAc缓冲溶液；中性缓冲溶液为浓度为10mM，pH＝7.0的Tris-HAc 缓冲溶液。
[0021] 采用上述试剂盒检测Pb2+浓度的方法，包括以下步骤：
[0022] (1)将中性缓冲溶液、Pb2+标准溶液、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在448nm处的吸光度，绘制中性条件下Pb2+检测标准曲线；
[0023] (2)将酸性缓冲溶液、Pb2+标准溶液、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，绘制酸性条件下Pb2+检测标准曲线；
[0024] (3)将待测样品、DNA双链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在448nm处的吸光度或在616nm处的荧光强度，若检测到有吸光度，则说明待测样品偏中性，根据结合中性条件下Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；若检测到较强的荧光强度，则说明待测样品偏酸性，结合酸性条件下Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度。
[0025] 上述较强的荧光强度的意思是以50×10-9mol/L的PbCl2标准溶液作为对照，按照上述检测方法，测定其在616nm处的荧光强度，以此荧光强度为基准，高于其荧光强度20％，则表示有较强的荧光强度，低于其荧光强度20％，则表示荧光强度很弱，可忽略不计，即在616nm处无荧光强度。
[0026] 当吸光度值小于0.02时，则可忽略不计，表示无吸光度。
[0027] 进一步地，检测过程中菁染料的终浓度为4×10-6mol/L。
[0028] 进一步地，检测过程中DNA双链的浓度为2×10-6mol/L。
[0029] 本发明提供的用于检测Pb2+浓度的试剂盒及检测方法，具有以下有益效果：
[0030] (1)灵敏度高，具体体现在铅离子和氢离子对DNA的二级结构均有明显的调控作用，即DNA二级结构在低浓度的铅离子或氢离子条件下能够发生结构转化，同时，菁染料对于不同的DNA二级结构有良好的识别反应能力，可将 DNA结构的变化转变为可识别的光学信号。
[0031] (2)本发明检测方法在检测Pb2+浓度的同时，还可实现对待测样品其他相关信息的分析(如待测样品的酸度情况)，具体体现在氢离子在此方法中用于调控DNA二级结构，产生可检测的信号，同时氢离子也能直接衡量样品的酸性，即混合溶液在616nm处有相对较强的荧光强度，说明待测样品偏酸性，若混合溶液在448nm处有相对较大的吸光值，说明待测样品为偏中性，这样就可以大致判断Pb2+所处环境的酸度，进而为铅离子的迁移速率的判断提供了简便方法。附图说明
[0032] 图1为中性条件下制作的Pb2+检测标准曲线图。
[0033] 图2为酸性条件下制作的Pb2+检测标准曲线图。
具体实施方式
[0034] 本发明提供的用于检测Pb2+浓度的试剂盒，包括以下组分：
[0035] (1)试剂I为菁染料溶液，用于识别体系中特殊的DNA二级结构，并将其转换为可检测的荧光信号，检测过程中其终浓度为4×10-6mol/L。
[0036] 上述试剂I(菁染料)的结构式如下：
[0037]
[0038] 其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、 Se、Te。
[0039] (2)试剂II为浓度为10mM，pH＝7.0的Tris-HAc缓冲溶液，记为缓冲液1。
[0040] (3)试剂III为浓度为10mM，pH＝4.0的Tris-HAc缓冲溶液，记为缓冲液2。
[0041] (4)试剂IV为PbCl2溶液(Pb2+标准溶液)，用于诱导富G序列形成G-四链体的特殊结构并与菁染料发生作用，检测过程中其终浓度为0-3×10-6mol/L。
[0042] (5)试剂V为富含G碱基的DNA单链(Pb2+响应序列)，用于形成G-四链体的特殊结构，检测过程中其终浓度为2×10-6mol/L。
[0043] 富G序列通式为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；
[0044] 其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3 的整数，Y表示A、T或C碱基。
[0045] (6)试剂VI为富含C碱基的DNA单链(H+响应序列)，用于形成i-motif 结构，检测过-6程中其终浓度为2×10 mol/L。
[0046] 富C序列通式为：5′-Cn1Xm1Cn2Xm2Cn3Xm3Cn4Xm4-3′；
[0047] 其中，n1-n4代表C的个数且为大于2的整数，m1-m4代表X的个数且为 0-3的整数，X表示A、T或G碱基。
[0048] (7)试剂VII为富含G碱基的DNA单链和富含C碱基的DNA单链按体积比为1:1形成的DNA互补链，检测过程中其终浓度为2×10-6mol/L。
[0049] 检测方法具体见以下实施例：
[0050] 实施例1中性条件中Pb2+检测标准曲线的绘制
[0051] 取9只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8和9，分别做以下处理：
[0052] 在1号EP管中加入940μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
[0053] 在2号EP管中加入937.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和2.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
[0054] 在3号EP管中加入935μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII和5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
[0055] 在4号EP管中加入932.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和7.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
[0056] 在5号EP管中加入930μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII和10μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
[0057] 在6号EP管中加入927.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂-6VII和12.5μL 100×10 mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
[0058] 在7号EP管中加入925μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII和15μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×-6
10 mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
10 mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
[0059] 在8号EP管中加入922.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和17.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
[0060] 在9号EP管中加入920μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII和20μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
[0061] 将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在448nm处的吸光度。以各个溶液中Pb2+的终浓度为横坐标，各浓度条件下的吸光度为纵坐标作标准曲线，结果如图1所示，并在0.5至1.75×10-6M的浓度范围下进行线性拟合。
[0062] 线性系数R2＝0.99963，表明在该Pb2+浓度范围内，检测得到的吸光度与Pb2+浓度之间有很好的线性关系。
[0063] 通过线性拟合，得到回归方程为y＝0.05363x-0.01018。其中x为体系中Pb2+的浓度，y为对应Pb2+浓度下的吸光度。根据检测所得吸光度即可计算出对应的 Pb2+浓度。
[0064] 实施例2酸性条件中Pb2+检测标准曲线的绘制
[0065] 取11只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别做以下处理：
[0066] 在1号EP管中加入940μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂-6VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10 mol/L 的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
[0067] 在2号EP管中加入939.5μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和0.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为-6100×10 mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
[0068] 在3号EP管中加入939μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和1μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
[0069] 在4号EP管中加入937.5μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和2.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
[0070] 在5号EP管中加入935μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
[0071] 在6号EP管中加入932.5μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和7.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
[0072] 在7号EP管中加入930μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII-6和10μL 100×10 mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
[0073] 在8号EP管中加入927.5μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和12.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度-6为100×10 mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
[0074] 在9号EP管中加入925μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和15μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
[0075] 在10号EP管中加入920μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和20μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10；
[0076] 在11号EP管中加入910μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和30μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10；
[0077] 将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。以各个溶液中Pb2+的终浓度为横坐标，各浓度条件下的荧光强度为纵坐标作标准曲线，结果如图2所示，并在0.5至1.5×10-6M的浓度范围下进行线性拟合。
[0078] 线性系数R2＝0.99897，表明在该Pb2+浓度范围内，检测得到的荧光强度与 Pb2+浓度之间有很好的线性关系。
[0079] 通过线性拟合，得到回归方程为y＝141.05012x+24.97509。其中x为体系中 Pb2+的浓度，y为对应Pb2+浓度下的荧光强度。根据检测所得荧光强度即可计算出对应的Pb2+浓度。
[0080] 实施例3
[0081] 在实施例1的条件下进行Pb2+浓度测定，验证本发明检测方法检测Pb2+浓度的能力。
[0082] 取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
[0083] 在1号EP管中加入932.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和7.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
[0084] 在2号EP管中加入930μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII和10μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
[0085] 在3号EP管中加入922.5μL试剂II，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和17.5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
[0086] 将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在448nm处的吸光度。将2+ 2+
各个吸光度代入Pb 检测标准曲线方程中，即按下式计算该吸光度下对应的Pb 浓度：
各个吸光度代入Pb 检测标准曲线方程中，即按下式计算该吸光度下对应的Pb 浓度：
[0087] y＝0.05363x-0.01018
[0088] 重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，计算结果见表1。
[0089] 表1中性条件Pb2+回收试验统计结果
[0090]
[0091] 由统计计算结果可见，该方法对Pb2+有较好的检测能力。
[0092] 实施例4
[0093] 在实施例2的条件下进行Pb2+浓度测定，验证本发明检测方法检测Pb2+浓度的能力。
[0094] 取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
[0095] 在1号EP管中加入935μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和5μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
[0096] 在2号EP管中加入932.5μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂-6VII和7.5μL 100×10 mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为
100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2
100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2
[0097] 在3号EP管中加入930μL试剂III，然后加入20μL浓度为100×10-6mol/L 的试剂VII和10μL 100×10-6mol/L的试剂IV，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
[0098] 将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。将各个荧光强度代入Pb2+检测标准曲线方程中，即按下式计算该荧光强度下对应的Pb2+浓度：
[0099] y＝141.05012x+24.97509
[0100] 重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，计算结果见表2。
[0101] 表2酸性条件Pb2+回收试验统计结果
[0102]
[0103] 由统计计算结果可见，该方法对Pb2+有较好的检测能力。
[0104] 其中，实施例1-4中使用的试剂I的菁染料的结构式如下：
[0105]
[0106] DNA双链是通过以下方式制得的，即将富C序列的DNA单链和富G序列的DNA单链等体积混合，于90℃加热2-15min，再自然冷却至室温；
[0107] 其中，富C序列的DNA单链浓度为50×10-6mol/L，序列为： 5′-CCACCACCACCACAACCACCACCAAA-3′；
[0108] 富G序列的DNA单链浓度为50×10-6mol/L，序列为5′-GGTGGTGGTGGT-3′。
[0109] 但本发明并不限于上述菁染料结构和DNA序列，还可以为以下结构的菁染料和DNA序列：
[0110] 菁染料结构：
[0111]
[0112] DNA序列：
[0113] 5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′；
[0114] 5′-CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA-3′；
[0115] 5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′；
[0116] 5′-CCCACCCACCCACCC-3′；
[0117] 5′-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3′；
[0118] 5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′；
[0119] 5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′；
[0120] 5′-CCAACCACACCAACC-3′；
[0121] 5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′；
[0122] 5′-ACTCCCACCCCTCCCACCCCTT-3′。
[0123] 实施例5水溶液样本中Pb2+浓度的检测
[0125] 表3 Pb2+浓度检测结果
[0126] 本发明检测方法 原子吸收法 紫外可见分光光度法
样品1 0.73mg/L 0.50mg/L 0.42mg/L
样品2 0.70mg/L 0.41mg/L 0.28mg/L
样品3 0.74mg/L 0.35mg/L 0.32mg/L
样品1 0.73mg/L 0.50mg/L 0.42mg/L
样品2 0.70mg/L 0.41mg/L 0.28mg/L
样品3 0.74mg/L 0.35mg/L 0.32mg/L
[0127] 由表3可知，采用本发明方法检测电镀废水中Pb2+浓度，其准确性明显比传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法要高，平行样品之间的差异相对较小。
[0128] 此外，测定Pb2+浓度时，混合溶液在616nm处有荧光强度，说明电镀废水偏酸性，若混合溶液在448nm处有吸光值，说明电镀废水偏中性。同时采用pH 试纸等再测定电镀废水，测试结果可知，采用本发明方法判断结果与pH试纸测定结果相同。
[0129] 若电镀废水中Pb2+浓度很高，应当对电镀废水进行稀释，才能准确测定其 Pb2+浓度，当稀释倍数依次增加，即废水中Pb2+浓度依次降低时，采用传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法均检测不出废水中的Pb2+，而采用本发明检测方法仍然能够检测得到，继续对废水进行稀释，稀释倍数再次增加10倍时，采用本发明检测方法仍然能够检测到较少量Pb2+，继续稀释2倍和4倍，稀释4 倍时才检测不出Pb2+，说明本发明检测方法的灵敏度明显比传统方法高，检出限低。
[0130] 本发明检测方法，不仅仅是能检测电镀废水中的Pb2+浓度，还可以检测其他水溶液样本，如城市生活废水、其他工业废水、血清、尿液等，此外还可以检测固体中的Pb2+浓度，如土壤等。
[0131] 采用本发明试剂盒和检测检测待测样品中Pb2+浓度时，还可以反映出Pb2+所处的待测样品偏酸性还是中性，为铅离子的迁移速率的判断提供了简便方法。
[0132] 注：本发明中所出现的菁染料，其结构式、分子式和命名分别如下：
[0133] 1、
[0134] 结构式：
[0135] 分子式为：C38H45N3O6S4；
[0136] 命名：3,3′-双(3-磺酸基-丙基)-4,5,4′,5′-二苯基-9-甲基-三碳苯并噻唑菁染料三乙胺盐。
[0137] 2、
[0138] 结构式：
[0139] 分子式为：C39H57BrN2O2；
[0140] 命名：3,3′-双甲基-4,4′-双己基-5,5′-双甲基-9-己基-三碳苯并 唑菁染料溴盐。
[0141] 3、
[0142] 结构式：
[0143] 分子式为：C38H55IN2S2；
[0144] 命名：3,3′-双丙基-5,5′-双己基-9-异丙基-三碳菁苯并噻唑染料碘盐。
[0145] 4、
[0146] 结构式：
[0147] 分子式为：C40H40ClN3；
[0148] 命名：3,3′-双异丙基-4,5-二吡啶基-4′,5′-二苯基-9-间二甲基苯基-三碳苯并吡咯菁染料氯盐。
[0149] 5、
[0150] 结构式：
[0151] 分子式为：C34H39IN2OS；
[0152] 命名：3-甲基-4,5-二苯基苯并 唑--3′-丙基-4′,5′-二环庚烷基苯并噻唑-9-丁基-三碳菁染料碘盐。
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